CN105176858B - 一种嗜酸乳酸杆菌与醋酸杆菌混合发酵的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域，具体公开了一种嗜酸乳酸杆菌与醋酸杆菌混合发酵方法。本发明先制备乳酸杆菌种子和醋酸杆菌种子，然后在MRS基础培养基中加入2.8～3.1%葡萄糖、1.8～2.1%可溶性淀粉和0.4～0.7%低聚果糖，按4.8～5.1%的接种量接种乳杆菌种子，36～39℃厌氧发酵15～18h，向发酵液中加入3.3～3.6%无水乙醇，并按8～11%的接种量接种醋酸杆菌种子，28～31℃厌氧混合发酵45～48h，终止发酵。本发明混合发酵方法能够方便快捷地混合发酵嗜酸乳酸杆菌与醋酸杆菌，提高产品活菌的含量、保持菌体的高活性，解决了传统的乳酸杆菌与醋酸杆菌只能单独发酵的技术难题，同时也避免了传统的醋酸杆菌发酵周期很长，达数周之久，设备的利用率低的缺点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体地，涉及两种兼性厌氧微生物的高密度混合发酵方法，更具体地，涉及一种嗜酸乳酸杆菌与醋酸杆菌混合发酵方法。
背景技术
乳酸杆菌是人们熟知的具有促进肠道免疫调节的有益微生物，生理功能主要表现为：阻止病原菌对肠道的入侵和定植，抑制病原菌，抗感染，维持肠道的微生态平衡，预防和抑制肿瘤的发生，增强机体免疫力，促进消化，合成氨基酸和维生素，降低胆固醇，抑制内毒素的生产，延缓衰老和抗辐射等。大量事实证明，只要肠道中乳酸杆菌的数量减少或丢失，出现菌群失调，就可能导致某种疾病的发生;只要肠道中乳酸杆菌的数量增加，区系得到平衡，就可以促进机体健康和治疗某种疾病。可见，增加机体肠道中乳酸杆菌的数量是预防和治疗某些疾病的一种重要措施。
嗜酸乳杆菌是乳酸菌家族中极为重视研究与开发的益生菌之一, 被视为第三代酸乳发酵剂菌种, 嗜酸乳杆菌是人体肠道中的重要微生物, 与人体健康息息相关。当其在乳品中达到一定数量时,可起到健康保健作用,比如生物屏障作用、抗癌作用、增强机体免疫力和延缓机体衰老作用等。
利用微生物造醋我国从古代就有记载，《齐民要术》中就记载了30多种不同的做醋方法。镇江香醋、山西陈醋，都是驰名中外的佳品。 醋是由醋酸杆菌发酵产生的。生产醋的酿造过程和酒基本相似，这种细菌能将酒进一步氧化成醋酸。造酒时如果条件掌握不好，醋酸杆菌就会将美酒变成醋酸。所以，酿酒师傅总是把酒桶盖的严严实实，不让醋酸杆菌混入酒桶。就现阶段醋酸发酵的现状, 醋酸发酵应区分为两大类, 即食醋工业发酵和醋酸工业发酵。虽然两类发酵的原理相同, 均是在醋酸发酵阶段以酒精为基质, 醋酸菌参与产物的生成, 但两者又有许多不同之处。
食醋在人们日常饮食调味中具有相当重要的作用,据不完全统计,目前我国食醋的年产量约为250 万吨。食醋兼具很多的医疗和保健功能。清代王世熊在《随居饮食谱》中将食醋保健功能归纳为:开胃、 养颜、 强筋、 暖骨、 醒酒、 消食、 下气、 解鱼蟹鳞介诸毒。现代医学研究表明,食醋对于高血压、糖尿病等疾病都有很好的疗效。
但在目前市场上仅有乳酸杆菌和醋酸杆菌各自单独发酵生产的产品，而2者混合发酵产品却未见报道。乳酸杆菌和醋酸杆菌各自有其独特的功能，而2者混合发酵，不但可以提高口感，且可以提高设备的利用率，获得新型的更加醇厚，功能更全面的具有保健功能的产品。然而乳酸杆菌和醋酸杆菌各自的发酵培养体系完全不同，成为制约两者混合发酵的一个瓶颈。
发明内容
本发明的目的是针对现有的嗜酸乳酸杆菌与醋酸杆菌只能单独发酵的技术难题，提供一种嗜酸乳酸杆菌与醋酸杆菌混合发酵方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方法予以实现的：
一种嗜酸乳酸杆菌与醋酸杆菌混合发酵方法，包括如下步骤：
S1.乳酸杆菌种子制备：将嗜酸乳酸杆菌接种于MRS基础液体培养基，36～39℃培养22～25h，作为种子备用；
S2.醋酸杆菌种子制备：将醋酸杆菌接种于醋酸杆菌基础液体培养基，28～31℃摇床培养22～25h，作为种子备用；
S3.乳酸杆菌和醋酸杆菌混合发酵：在S1的MRS基础培养基中加入2.8～3.1%葡萄糖、1.8～2.1%可溶性淀粉和0.4～0.7%低聚果糖，按4.8～5.1%的接种量接种步骤S1的乳杆菌种子，36～39℃厌氧发酵15～18h，向发酵液中加入3.3～3.6%无水乙醇，并按8～11%的接种量接种步骤S2的醋酸杆菌种子，28～31℃厌氧混合发酵45～48h，终止发酵；
所述MRS基础液体培养基配方为：蛋白胨5～20g/L，葡萄糖15～30g/L，酵母膏3～6g/L，醋酸钠4～7g/L，磷酸二氢钾2～5g/L，pH=6.0～6.3；
所述醋酸杆菌基础液体培养基配方为：葡萄糖20～50g/L，酵母膏9～12g/L，磷酸二氢钠2～5g/L，柠檬酸0.9～1.2g/L，pH=6.0～6.3。
乳酸杆菌和醋酸杆菌各自的发酵培养体系完全不同，成为制约两者混合发酵的一个瓶颈，因此，目前市场上仅有乳酸杆菌和醋酸杆菌各自单独发酵生产的产品，而2者混合发酵产品却未见报道。本发明利用特殊的混合发酵培养体系，以先培养嗜酸乳酸杆菌，达到一定的酸度后，再接种醋酸杆菌，基于所述技术，可成功实现高密度混合发酵的目的。
优选地，所述嗜酸乳酸杆菌与醋酸杆菌来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号分别为CGMCC1.2467、CGMCC1.2033。
优选地，所述MRS基础液体培养基配方为：蛋白胨15g/L，葡萄糖25g/L，酵母膏5g/L，醋酸钠6g/L，磷酸二氢钾4g/L，pH=6.2。
优选地，所述醋酸杆菌基础液体培养基配方为：葡萄糖40g/L，酵母膏11g/L，磷酸二氢钠4g/L，柠檬酸1.1g/L，pH=6.2。
优选地，S1所述接种后培养条件为38℃培养24h。
优选地，S2所述接种后培养条件为30℃培养24h。
优选地，S3中向MRS基础培养基中加入3%葡萄糖、2%可溶性淀粉和0.6%低聚果糖。
优选地，S3中按5%的接种量接种步骤S1的乳杆菌种子，38℃厌氧发酵17h。
优选地，S3中向发酵液中加入3.5%无水乙醇。
优选地，按10%的接种量接种步骤S2的醋酸杆菌种子，30℃厌氧混合发酵47h。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明混合发酵方法能够方便快捷地混合发酵嗜酸乳酸杆菌与醋酸杆菌，提高产品活菌的含量、保持菌体的高活性，解决了传统的乳酸杆菌与醋酸杆菌只能单独发酵的技术难题，同时也避免了传统的醋酸杆菌发酵周期很长，达数周之久，设备的利用率低的缺点。该专利混合发酵出来的制品口感醇厚，发酵总时间不到3天，设备利用率高，且简单易行。经本发明所发酵的菌种经发酵可达到8.7×1011CFU/ml。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
以下实施例中所用的嗜酸乳酸杆菌与醋酸杆菌来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号分别为CGMCC1.2467、CGMCC1.2033，但是嗜酸乳酸杆菌与醋酸杆菌的来源并不局限于这两种。
实施例1
一种嗜酸乳酸杆菌与醋酸杆菌混合发酵方法，具体步骤如下：
S1. 乳酸杆菌种子制备：将嗜酸乳酸杆菌接种于MRS基础液体培养基（配方见表1），36℃培养22h，作为种子备用。
S2. 醋酸杆菌种子制备：将醋酸杆菌接种于醋酸杆菌基础液体培养基（配方见表2），28℃摇床培养22h，作为种子备用。
S3. 乳酸杆菌和醋酸杆菌混合发酵：在表1的MRS基础培养基中加入2.8%葡萄糖、1.8%可溶性淀粉和0.4%低聚果糖，按4.8%的接种量接种步骤S1的乳酸杆菌种子，36℃厌氧发酵15h，向发酵液中加入3.3%的无水乙醇，并按8%的接种量接种步骤S2的醋酸杆菌种子，28℃厌氧混合发酵45h，终止发酵。
表1.乳酸杆菌MRS基础液体培养基
表2.醋酸杆菌基础液体培养基
实施例2
一种嗜酸乳酸杆菌与醋酸杆菌混合发酵方法，具体步骤如下：
S1. 乳酸杆菌种子制备：将嗜酸乳酸杆菌接种于MRS基础液体培养基（配方见表3），37℃培养23h，作为种子备用。
S2. 醋酸杆菌种子制备：将醋酸杆菌接种于醋酸杆菌基础液体培养基（配方见表4），29℃摇床培养23h，作为种子备用。
S3. 乳酸杆菌和醋酸杆菌混合发酵：在表3的MRS基础培养基中加入2.9%葡萄糖、1.9%可溶性淀粉和0.5%低聚果糖，按4.9%的接种量接种步骤S1的乳杆菌种子，37℃厌氧发酵16h，向发酵液中加入3.4%无水乙醇，并按9%的接种量接种步骤S2的醋酸杆菌种子，29℃厌氧混合发酵46h，终止发酵。
表3.乳酸杆菌MRS基础液体培养基
表4.醋酸杆菌基础液体培养基
实施例3
一种嗜酸乳酸杆菌与醋酸杆菌混合发酵方法，具体步骤如下：
S1.乳酸杆菌种子制备：将嗜酸乳酸杆菌接种于MRS基础液体培养基（配方见表5），38℃培养24h，作为种子备用。
S2. 醋酸杆菌种子制备：将醋酸杆菌接种于醋酸杆菌基础液体培养基（配方见表6），30℃摇床培养24h，作为种子备用。
S3. 乳酸杆菌和醋酸杆菌混合发酵：在表5的MRS基础培养基中加入3.0%葡萄糖、2.0%可溶性淀粉和0.6%低聚果糖，按5.0%的接种量接种步骤S1的乳杆菌种子，38℃厌氧发酵17h，向发酵液中加入3.5%无水乙醇，并按10%的接种量接种步骤S2的醋酸杆菌种子，30℃厌氧混合发酵47h，终止发酵。
表5.乳酸杆菌MRS基础液体培养基
表6.醋酸杆菌基础液体培养基
实施例4
一种嗜酸乳酸杆菌与醋酸杆菌混合发酵方法，具体步骤如下：
S1.乳酸杆菌种子制备：将嗜酸乳酸杆菌接种于MRS基础液体培养基（表7），39℃培养25h，作为种子备用。
S2.醋酸杆菌种子制备：将醋酸杆菌接种于醋酸杆菌基础液体培养基（表8），31℃摇床培养25h，作为种子备用。
S3.乳酸杆菌和醋酸杆菌混合发酵：在表7的MRS基础培养基中加入3.1%葡萄糖、2.1%可溶性淀粉和0.7%低聚果糖，按5.1%的接种量接种步骤S1的乳杆菌种子，39℃厌氧发酵18h，向发酵液中加入3.6%无水乙醇，并按11%的接种量接种步骤S2的醋酸杆菌种子，31℃厌氧混合发酵48h，终止发酵。
表7.乳酸杆菌MRS基础液体培养基
表8.醋酸杆菌基础液体培养基
实施例5
产品品质测定
1、活菌量：分别采用本发明实施例1～4所述方法和常规方法进行单独发酵嗜酸乳酸杆菌（CGMCC1.2467）与醋酸杆菌(CGMCC1.2033)，发酵后的产品采用稀释平板计数方法测定产品活菌含量，测定结果见表9（结果是3次实验的平均值）。
表9单独和混合发酵的活菌对比
从表9可知，经本发明发酵方法处理的产品，活菌含量大幅度提高，其活菌含量可以达到3.8×1011～ 2.4 ×1012 CFU/ml。
2、产品的酸度：按步骤1的方法，再检测同样发酵时间64h，单独发酵和混合发酵的成品酸度、醋酸和乳酸含量，见表10。按常规方法单独发酵所得成品乳酸和醋酸含量均远低于实施例1～4。这是由于常规醋酸发酵时间要数周之久，才能达到一定的醋酸含量和风味，但设备的利用率极低。而乳酸杆菌和醋酸杆菌混合发酵，不但提高设备的利用率，而且活菌含量也大幅度升高，产品风味和质量也有保证。
表10单独和混合发酵的成品对比
综上所述，利用本发明技术能大幅度提高设备利用率，相应也提高了产品的有效成份浓度及活菌含量，这将极有利于降低发酵企业的成本，也能提高单位体积发酵罐的利用率。
Claims (9)
1.一种嗜酸乳酸杆菌与醋酸杆菌混合发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.乳酸杆菌种子制备：将嗜酸乳酸杆菌接种于MRS基础液体培养基，36～39℃培养22～25h，作为种子备用；
S2.醋酸杆菌种子制备：将醋酸杆菌接种于醋酸杆菌基础液体培养基，28～31℃摇床培养22～25h，作为种子备用；
S3.乳酸杆菌和醋酸杆菌混合发酵：在S1的MRS基础培养基中加入2.8～3.1％葡萄糖、1.8～2.1％可溶性淀粉和0.4～0.7％低聚果糖，按4.8～5.1％的接种量接种步骤S1的乳杆菌种子，36～39℃厌氧发酵15～18h，向发酵液中加入3.3～3.6％无水乙醇，并按8～11％的接种量接种步骤S2的醋酸杆菌种子，28～31℃厌氧混合发酵45～48h，终止发酵；
所述MRS基础液体培养基配方为：蛋白胨5～20g/L，葡萄糖15～30g/L，酵母膏3～6g/L，醋酸钠4～7g/L，磷酸二氢钾2～5g/L，pH＝6.0～6.3；
所述醋酸杆菌基础液体培养基配方为：葡萄糖20～50g/L，酵母膏9～12g/L，磷酸二氢钠2～5g/L，柠檬酸0.9～1.2g/L，pH＝6.0～6.3；
所述嗜酸乳酸杆菌与醋酸杆菌来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号分别为CGMCC1.2467、CGMCC1.2033。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MRS基础液体培养基配方为：蛋白胨15g/L，葡萄糖25g/L，酵母膏5g/L，醋酸钠6g/L，磷酸二氢钾4g/L，pH＝6.2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醋酸杆菌基础液体培养基配方为：葡萄糖40g/L，酵母膏11g/L，磷酸二氢钠4g/L，柠檬酸1.1g/L，pH＝6.2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1所述接种后培养条件为38℃培养24h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2所述接种后培养条件为30℃培养24h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3中向MRS基础培养基中加入3％葡萄糖、2％可溶性淀粉和0.6％低聚果糖。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3中按5％的接种量接种步骤S1的乳杆菌种子，38℃厌氧发酵17h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3中向发酵液中加入3.5％无水乙醇。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按10％的接种量接种步骤S2的醋酸杆菌种子，30℃厌氧混合发酵47h。
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