CN105175252A

CN105175252A - 一种二萜类化合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN105175252A
Application number: CN201510687804.8A
Authority: CN
Inventors: 田凯; 黄相中; 江志勇; 李艳红; 孙静贤; 夏福婷; 王韦
Original assignee: Yunnan Minzu University
Current assignee: Yunnan Minzu University
Priority date: 2015-10-22
Filing date: 2015-10-22
Publication date: 2015-12-23
Anticipated expiration: 2035-10-22
Also published as: CN105175252B

Abstract

本发明公开了一种二萜类化合物及其制备方法与应用，所述的二萜类化合物是以黑果土当归根为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C₂₀H₂₈O₂，命名为对映-6,8(14),15-海松三烯酸(<i>ent</i>-pimar-6,8(14),15-trien-19-oic？acid)，具有下述结构式：。制备方法是以黑果土当归根为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离获得。应用为二萜类化合物在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用和在制备预防和/或治疗人肺腺癌、人前列腺癌或人急性髓系白血病药物中的应用。本发明所述的二萜类化合物对人肺腺癌、人前列腺癌或人急性髓系白血病药物中的应用有显著的抑制作用，提示其具有良好的抗癌活性，可以作为抗癌活性成分或先导化合物。

Description

一种二萜类化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种二萜类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

楤木属植物(Aralia)全世界共有40余种，主要分布在亚洲和北美，我国有28种，其中20种可供药用，分布几乎遍布全国，资源丰富。该属植物主要以根、根皮入药,有祛风除湿,利尿消肿,活血止痛的作用。用于肝炎，淋巴结肿大，肾炎水肿，糖尿病，白带，胃痛，风湿关节痛，腰腿痛，跌打损伤。对楤木属植物的化学成分及药理研究主要集中在辽东楤木(A.elata(Miq.)Seem.)、黄毛楤木(A.decaisneanaHance.)、棘茎楤木(A.echinocaulisHand.-Mazz.)、龙眼独活(A.fargesiiFranch.)、东北土当归(A.continentalisKitag.)、食用土当归(A.cordataThunb.)等(郑玲玲，裴凌鹏.楤木属植物研究进展[J].中国民族医药杂志,2010,6(6):57-59)。目前从楤木属植物中已分离出二萜、三萜皂苷、脂肪油、有机酸、香豆素、黄酮、聚炔烯、木脂素、甾醇等单体化合物数百种。药理研究表明该属植物有抗炎、抗菌、抗肿瘤、降血糖、调节血脂、保护肝脏及保护心血管等作用。

黑果土当归(AraliadumetorumHand.-Mazz)在云南称“牛角七”，“白九股牛”，“蜜油参”。民间以根入药，入脾、胃二经。中草药，2001，32(9):847-850）报道，该植物有补中益气、托毒外出、消炎的功效，用于淋巴腺炎、慢性化脓性骨髓炎和疖痈等症。目前对黑果土当归植物化学成分以及药理活性的研究报道较少。本发明试图对黑果土当归中二萜类化合物的抗肿瘤作用做进一步深入研究，以期发现其中的细胞毒活性天然产物，为筛选高效、低毒的抗肿瘤药物提供依据。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种二萜类化合物；第二目的在于提供所述二萜类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述二萜类化合物的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的二萜类化合物是以黑果土当归根为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C₂₀H₂₈O₂，命名为对映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)，具有下述结构式：

。

本发明的第二目的是这样实现的，是以黑果土当归根为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离获得，具体为：

A、浸膏提取：将黑果土当归根晾干粉碎得到0.05~0.15cm粒径大小的颗粒，加入黑果土当归根重量比4~8倍的体积百分浓度80~95%乙醇溶液于65~74℃下回流提取3~5次，每次1~3h，合并提取液，提取液过滤，减压浓缩提取液至比重为1.1~1.3得到浸膏a；

B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比2~4倍量的水，依次用与水等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂进行萃取，每种溶剂萃取4~6次，蒸去溶剂分别得到石油醚萃取物b、乙酸乙酯萃取物c和正丁醇萃取物d；

C、硅胶柱层析：将石油醚萃取物b上硅胶柱，装柱硅胶为100~200目，用量为萃取物b重量6~8倍量；用体积比为25:1~0:1的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；

D、高效液相色谱分离：将C步骤中以2:1配比的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液采用半制备高效液相色谱仪分离纯化，即得所述的二萜类化合物对映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)。

本发明二萜类化合物是首次被分离出来的，通过核磁共振和其他波谱技术测定方法确定为二萜类化合物，并表征其具体结构为：

化合物对映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)，为白色无定型粉末(溶剂为氯仿)，-48.0°(c0.11,CHCl₃);IR(KBr)谱在3245-2500,1708,1636,910,863cm^-1有吸收，表明分子中存在羧基、羟基和双键。HRESI-MS谱显示其准分子离子峰m/z299.2020[M-H]^-(calcd.299.2011)，结合NMR谱确定其分子式为C₂₀H₂₈O₂，不饱和度为7。¹HNMR(附图1，数据归属见表1)显示分子中有3个甲基单峰，分别为δ_H1.32(3H,s),1.07(3H,s)及0.61(3H,s))，有1个单取代双键信号（δ5.71(1H,dd,J=17.6,10.4Hz,H-15),4.96(1H,dd,J=10.4,2.0Hz,H-16a),4.86(1H,dd,J=17.6,2.0Hz,H-16b)），有1个三取代双键信号（δ5.23(1H,s,H-14)），有1个顺式二取代双键信号（δ6.07(1H,dd,J=11.2,2.4Hz,H-6),6.03(1H,brd,J=11.2Hz,H-7)）;¹³CNMR(附图2，数据归属见表1)显示分子中有20个碳，其中有5个季碳(含1个羧基碳和1个烯碳)，6个次甲基(含4个烯碳)，6个亚甲基(含1个烯碳)及3个甲基。结合HSQC相关谱(附图3)，并对比文献数据可证实，该化合物与已知化合物ent-pimar-8(14),15–19-oicacid结构相似，区别在于分子中多了1个双键(δ_C127.4及128.2)，少了2个亚甲基(δ_C24.3及36.5)；在HMBC谱(附图6)中可看到H-6(δ6.07)与C-5(δ55.5)有相关，H-7(δ6.03)与C-8(δ135.9)有相关，证实C-6及C-7位为一双键。进一步经HMBC相关(附图4)、COSY相关(附图5)和ROESY(附图6)及与文献(KangO.H.;ChaeH.S.;ChoiJ.G.;OhY.C.;LeeY.S.;KimJ.H.;SeungM.J.;JangH.J.;LeeJ.H.;ShinD.H.;KwonD.Y.EuropeanJournalofPharmacology,2008,601,179-185)对比证实，使化合物的结构最终得到确认，化合物具有下述结构式：

通过SCIFINDER数据库检索和文献查询证实该化合物为新化合物。

表1本发明化合物的¹H-和¹³C-NMR(CDCl₃)数据

本发明的第三目的是这样实现的，所述的二萜类化合物在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。

所述的二萜类化合物在制备预防和/或治疗人肺腺癌、人前列腺癌或人急性髓系白血病药物中的应用。

本发明所述的二萜类化合物进行了细胞毒活性测试，实验结果显示出良好的抑制人肺腺癌、人前列腺癌及人急性髓系白血病细胞株活性，可为医用工业提供有应用价值的新化合物或先导化合物。

本发明的优点：

1、本发明中的二萜类化合物对人肺腺癌、人前列腺癌或人急性髓系白血病细胞株有显著的抑制作用，提示其具有良好的抗癌活性，可以作为抗癌活性成分或先导化合物。

2、本发明中的二萜类化合物可为天然存在的有机化合物，原料来源广泛，并且化合物制备操作流程简单，所获得的化合物纯度高，随后的工业化生产易实现。

附图说明

图1是本发明化合物的核磁共振氢谱（¹HNMR)；

图2是本发明化合物的核磁共振碳谱（¹³CNMR)；

图3是本发明化合物的HSQC相关谱；

图4是本发明化合物的HMBC相关谱；

图5是本发明化合物的COSY相关谱；

图6是本发明化合物的ROESY相关谱。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。

本发明所述的二萜类化合物，是以黑果土当归根为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C₂₀H₂₈O₂，命名为对映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)，具有下述结构式：

。

本发明所述的二萜类化合物的制备方法，是以黑果土当归根为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离获得，具体为：

A步骤所述的过滤是经80~120μm的滤纸进行过滤。

A步骤所述的减压浓缩是在50℃以下的温度条件下用旋转蒸发仪进行减压浓缩。

B步骤中所述的蒸去溶剂是采用旋转蒸发仪蒸去溶剂。

C步骤中所述的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂的体积配比为25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1和0:1。

D步骤所述的高效液相色谱分离纯化包括以下步骤：

1）将C步骤中以2:1配比的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液经半制备高效液相色谱仪，以体积配比为80:20的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，分别收集6~13min，15~21min，22~29min，32~39min，41~46min的色谱峰，多次累加后蒸干，依次合并相同部分得到5个流分；

2）将步骤1）中的第32~39min色谱峰的流分经半制备高效液相色谱，以体积配比为78:22的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，收集42~44min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到所述的二萜类化合物对映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)。

本发明的应用为所述的二萜类化合物在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。

本发明的应用为所述的二萜类化合物在制备预防和/或治疗人肺腺癌、人前列腺癌或人急性髓系白血病药物中的应用。

下面以具体实施例对本发明做进一步说明：

实施例1化合物的制备

材料来源：黑果土当归采于云南昆明，经云南民族大学民族医药学院杨青松副教授鉴定为AraliadumetorumHand.-Mazz，标本保存于云南民族大学民族医药学院标本馆。

采用以下步骤：

（1）将10Kg黑果土当归根晾干粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得黑果土当归粉，将黑果土当归粉在65℃的温度下每次用60Kg80%浓度的乙醇回流提取4次，每次2小时，合并乙醇提取液，备用；

（2）将步骤（1）制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏1380g，备用；

（3）将（2）中的1380g浸膏混悬于4500ml水中，依次用4500ml石油醚、4500ml乙酸乙酯以及4500ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取5次，再用旋转蒸发仪蒸去溶剂，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物390g、112g、405g；

（4）将（3）中的石油醚萃取物（150g）经100-200目硅胶柱色谱，用体积比25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱得到Fr.1-Fr.8共8个组分，Fr.1为6.4g，Fr.2为6.5g，Fr.3为3.1g，Fr.4为16.1g，Fr.5为3.2g，Fr.6为60.8g，Fr.7为2.8g，Fr.8为39.3g，Fr.7（1.5g）经半制备高效液相色谱仪，以体积配比为80:20的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，分别收集6~13min，15~21min，22~29min，32~39min，41~46min的色谱峰，多次累加后蒸干，依次合并相同部分得到5个流分（Fr.7-1-Fr.7-5)，Fr.7-1为0.5g，Fr.7-2为0.3g，Fr.7-3为0.2g，Fr.7-4为0.2g，Fr.7-5为0.05g，Fr.7-4经半制备高效液相色谱，以体积配比为78:22的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，收集42~44min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到目标化合物对映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)(14mg)。

实施例2化合物的制备

采用以下步骤：

（1）将10Kg黑果土当归根晾干粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得黑果土当归粉，将黑果土当归粉在67℃的温度下每次用60Kg84%浓度的乙醇回流提取3次，每次2.5小时，合并乙醇提取液，备用；

（2）将步骤（1）制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏1340g，备用；

（3）将（2）中的1340g浸膏混悬于4000ml水中，依次用4000ml石油醚、4000ml乙酸乙酯以及4000ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取4次，再用旋转蒸发仪蒸去溶剂，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物372g、103g、396g；

（4）将（3）中的石油醚萃取物（150g）经100-200目硅胶柱色谱，用体积比25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱得到Fr.1-Fr.8共8个组分，Fr.1为6.8g，Fr.2为6.9g，Fr.3为3.7g，Fr.4为17.3g，Fr.5为2.8g，Fr.6为58.2g，Fr.7为2.9g，Fr.8为37.0g，Fr.7（1.5g）经半制备高效液相色谱仪，以体积配比为80:20的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，分别收集6~13min，15~21min，22~29min，32~39min，41~46min的色谱峰，多次累加后蒸干，依次合并相同部分得到5个流分（Fr.7-1-Fr.7-5)，Fr.7-1为0.5g，Fr.7-2为0.3g，Fr.7-3为0.3g，Fr.7-4为0.2g，Fr.7-5为0.05g，Fr.7-4经半制备高效液相色谱，以体积配比为78:22的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，收集42~44min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到目标化合物对映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)(16mg)。

实施例3化合物的制备

采用以下步骤：

（1）将10Kg黑果土当归根晾干粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得黑果土当归粉，将黑果土当归粉在69℃的温度下每次用60Kg88%浓度的乙醇回流提取5次，每次2小时，合并乙醇提取液，备用；

（2）将步骤（1）制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏1410g，备用；

（3）将（2）中的1410g浸膏混悬于4500ml水中，依次用4500ml石油醚、4500ml乙酸乙酯以及4500ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取5次，再用旋转蒸发仪蒸去溶剂，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物395g、117g、411g；

（4）将（3）中的石油醚萃取物（150g）经100-200目硅胶柱色谱，用体积比25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱得到Fr.1-Fr.8共8个组分，Fr.1为7.2g，Fr.2为7.4g，Fr.3为3.9g，Fr.4为17.8g，Fr.5为3.1g，Fr.6为57.3g，Fr.7为3.2g，Fr.8为36.3g，Fr.7（1.5g）经半制备高效液相色谱仪，以体积配比为80:20的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，分别收集6~13min，15~21min，22~29min，32~39min，41~46min的色谱峰，多次累加后蒸干，依次合并相同部分得到5个流分（Fr.7-1-Fr.7-5)，Fr.7-1为0.5g，Fr.7-2为0.3g，Fr.7-3为0.2g，Fr.7-4为0.2g，Fr.7-5为0.1g，Fr.7-4经半制备高效液相色谱，以体积配比为78:22的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，收集42~44min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到目标化合物对映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)(19mg)。

实施例4化合物的制备

采用以下步骤：

（1）将10Kg黑果土当归根晾干粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得黑果土当归粉，将黑果土当归粉在71℃的温度下每次用60Kg92%浓度的乙醇回流提取4次，每次2小时，合并乙醇提取液，备用；

（2）将步骤（1）制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏1480g，备用；

（3）将（2）中的1480g浸膏混悬于5000ml水中，依次用5000ml石油醚、5000ml乙酸乙酯以及5000ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取6次，再用旋转蒸发仪蒸去溶剂，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物387g、111g、408g；

（4）将（3）中的石油醚萃取物（150g）经100-200目硅胶柱色谱，用体积比25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱得到Fr.1-Fr.8共8个组分，Fr.1为7.5g，Fr.2为7.7g，Fr.3为4.2g，Fr.4为18.2g，Fr.5为3.2g，Fr.6为61.3g，Fr.7为3.3g，Fr.8为34.2g，Fr.7（1.5g）经半制备高效液相色谱仪，以体积配比为80:20的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，分别收集6~13min，15~21min，22~29min，32~39min，41~46min的色谱峰，多次累加后蒸干，依次合并相同部分得到5个流分（Fr.7-1-Fr.7-5)，Fr.7-1为0.4g，Fr.7-2为0.4g，Fr.7-3为0.25g，Fr.7-4为0.2g，Fr.7-5为0.05g，Fr.7-4经半制备高效液相色谱，以体积配比为78:22的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，收集42~44min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到目标化合物对映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)(21mg)。

实施例5化合物的制备

采用以下步骤：

（1）将10Kg黑果土当归根晾干粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得黑果土当归粉，将黑果土当归粉在74℃的温度下每次用60Kg95%浓度的乙醇回流提取5次，每次2小时，合并乙醇提取液，备用；

（2）将步骤（1）制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏1520g，备用；

（3）将（2）中的1520g浸膏混悬于4500ml水中，依次用4500ml石油醚、4500ml乙酸乙酯以及4500ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取5次，再用旋转蒸发仪蒸去溶剂，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物420g、130g、450g；

（4）将（3）中的石油醚萃取物（150g）经100-200目硅胶柱色谱，用体积比25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱得到Fr.1-Fr.8共8个组分，Fr.1为9.5g，Fr.2为8.8g，Fr.3为3.5g，Fr.4为18.0g，Fr.5为3.7g，Fr.6为65.3g，Fr.7为3.6g，Fr.8为35.3g，Fr.7（1.5g）经半制备高效液相色谱仪，以体积配比为80:20的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，分别收集6~13min，15~21min，22~29min，32~39min，41~46min的色谱峰，多次累加后蒸干，依次合并相同部分得到5个流分（Fr.7-1-Fr.7-5)，Fr.7-1为0.4g，Fr.7-2为0.2g，Fr.7-3为0.2g，Fr.7-4为0.3g，Fr.7-5为0.1g，Fr.7-4经半制备高效液相色谱，以体积配比为78:22的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，收集42~44min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到目标化合物对映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)(24mg)。

实施例6本发明化合物的结构鉴定

取实施例1制备的二萜类化合物对映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)，为白色无定型粉末（溶剂为氯仿）；测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。

-48.0°(c0.11,CHCl₃);IR(KBr)谱在3245-2500,1708,1636,910,863cm^-1有吸收，表明分子中存在羧基、羟基和双键。HRESI-MS谱显示其准分子离子峰m/z299.2020[M-H]^-(calcd.299.2011)，结合NMR谱确定其分子式为C₂₀H₂₈O₂，不饱和度为7。¹HNMR(附图1，数据归属见表1)显示分子中有3个甲基单峰，分别为δ_H1.32(3H,s),1.07(3H,s)及0.61(3H,s))，有1个单取代双键信号（δ5.71(1H,dd,J=17.6,10.4Hz,H-15),4.96(1H,dd,J=10.4,2.0Hz,H-16a),4.86(1H,dd,J=17.6,2.0Hz,H-16b)），有1个三取代双键信号（δ5.23(1H,s,H-14)），有1个顺式二取代双键信号（δ6.07(1H,dd,J=11.2,2.4Hz,H-6),6.03(1H,brd,J=11.2Hz,H-7)）;¹³CNMR(附图2，数据归属见表1)显示分子中有20个碳，其中有5个季碳(含1个羧基碳和1个烯碳)，6个次甲基(含4个烯碳)，6个亚甲基(含1个烯碳)及3个甲基。结合HSQC相关谱(附图3)，并对比文献数据可证实，该化合物与已知化合物ent-pimar-8(14),15–19-oicacid结构相似，区别在于分子中多了1个双键(δ_C127.4及128.2)，少了2个亚甲基(δ_C24.3及36.5)；在HMBC谱(附图6)中可看到H-6(δ6.07)与C-5(δ55.5)有相关，H-7(δ6.03)与C-8(δ135.9)有相关，证实C-6及C-7位为一双键。进一步经HMBC相关(附图4)、COSY相关(附图5)和ROESY(附图6)及与文献(KangO.H.;ChaeH.S.;ChoiJ.G.;OhY.C.;LeeY.S.;KimJ.H.;SeungM.J.;JangH.J.;LeeJ.H.;ShinD.H.;KwonD.Y.EuropeanJournalofPharmacology,2008,601,179-185)对比证实，使化合物的结构最终得到确认，命名为对映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)。

实施例7

取实施例2制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C₂₀H₂₈O₂。确认实施例2制备的化合物为所述的二萜类化合物对映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)。

实施例8

取实施例3制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C₂₀H₂₈O₂。确认实施例3制备的化合物为所述的二萜类化合物对映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)。

实施例9

取实施例4制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C₂₀H₂₈O₂。确认实施例4制备的化合物为所述的二萜类化合物对映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)。

实施例10

取实施例5制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C₂₀H₂₈O₂。确认实施例5制备的化合物为所述的二萜类化合物对映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)。

实施例11本发明化合物抗肿瘤活性检测

取实施例1~5所制备的任一二萜类化合物进行抗肿瘤活性检测试验，试验情况如下：

采用改良MTT法评价本发明化合物对肿瘤细胞的增值抑制作用：

取备用的肿瘤细胞悬液接种于96孔培养板，90μL/孔，继续培养24h后加入不同浓度的受试样品，10μL/孔，使其终浓度为100、10、1、0.1、0.01μg/mL，每个浓度均设3个复孔。顺铂（DDP）为阳性对照，等体积RPMI1640培养基为阴性对照。同时设化合物100、10μg/mL时相应的DMSO浓度为溶媒对照，以消除DMSO对细胞生长的影响。加药后继续置于37℃，5%CO₂培养箱培养72h，每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，继续培养4h，每孔加入三联液[10%SDS-5%异丁醇—0.012mol/LHCl（W/V/V）]100μL溶解甲臜。用酶标仪在570nm波长下测定各孔的OD值。

按下列公式计算细胞增值抑制率：

抑制率（%）=（OD值对照孔—OD值给药孔）/OD值对照孔×100%

数据统计分析：采用MicrosoftExcel2003计算抑制率，采用logit法，SPSS11.5软件包计算半数抑制浓度IC₅₀。

计算半数抑制浓度IC₅₀，对人肺腺癌细胞株(A549)、人前列腺癌细胞株(PC3)及人急性髓系白血病细胞株(HL60)的半数抑制浓度(IC₅₀)测定结果分别为5.6±0.7μM，5.1±0.9μM，8.9±0.9μM，表明本发明的化合物具有较好的抗肿瘤活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种二萜类化合物，其特征在于所述的二萜类化合物是以黑果土当归根为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C₂₀H₂₈O₂，命名为对映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)，具有下述结构式：

。

2.一种权利要求1所述的二萜类化合物的制备方法，其特征在于是以黑果土当归根为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离获得，具体为：

3.根据权利要求2所述的二萜类化合物的制备方法，其特征在于A步骤所述的过滤是经80~120μm的滤纸进行过滤。

4.根据权利要求2所述的二萜类化合物的制备方法，其特征在于A步骤所述的减压浓缩是在50℃以下的温度条件下用旋转蒸发仪进行减压浓缩。

5.根据权利要求2所述的二萜类化合物的制备方法，其特征在于B步骤中所述的蒸去溶剂是采用旋转蒸发仪蒸去溶剂。

6.根据权利要求2所述的二萜类化合物的制备方法，其特征在于C步骤中所述的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂的体积配比为25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1和0:1。

7.根据权利要求2所述的二萜类化合物的制备方法，其特征在于D步骤所述的高效液相色谱分离纯化包括以下步骤：

8.一种权利要求1所述的二萜类化合物在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。

9.一种权利要求1所述的二萜类化合物在制备预防和/或治疗人肺腺癌、人前列腺癌或人急性髓系白血病药物中的应用。