CN112194568A - 一种长链三萜类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种式I所示化合物、或其药学上可接受的盐、或其光学异构体、或其立体异构体、或其溶剂合物。本发明的化合物结构新颖，能明显改善心衰斑马鱼的心衰指标。本发明化合物可以作为改善结构性心脏病变和心脏前负荷和后负荷的先导化合物，在制备预防和/或治疗心衰的药物上，具有非常良好的应用前景。

Description

一种长链三萜类化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于药物制备领域，具体涉及一种长链三萜类化合物及其制备方法和用途。

背景技术

近17年来，冠心病是最常见的心血管疾病之一，严重威胁人类健康。目前冠心病的治疗药物存在种种局限，冠心病药物研发方兴未艾。在寻找新型药物的过程中，天然产物备受关注。据《开宝本草》记载，传统中药盐肤木(Rhus chinensis Mill.)，其树白皮主破血止血，根茎能活血化瘀。以盐肤木为原药材的闽产单味制剂——舒冠通糖浆(国药准字Z35020635)，治疗冠心病临床疗效确凿。1973至1978年，全国十余个单位对舒冠通糖浆的临床作用进行验证，共治疗冠心病346例，临床总有效率达80％以上。药理研究表明，盐肤木提取物可明显改善冠心病动物模型的血液流变性，采用盐肤木提取物静脉注射实验犬，可使其冠状血流量增加59.7％，血管阻力降低51％，心肌耗氧量减少24.2％。

然而，盐肤木根治疗冠心病的药效物质基础至今未明。迄今为止，国内外学者对盐肤木根的化学成分亦研究不足，除了黄酮、酚酸、鞣质外，已报道的三萜仅12个(比如KimGS,Jeong TS,Kim YO,Baek NI,Cha SW,Lee JW,Song KS.Human acyl-CoA:Cholesterolacyltransferase-inhibiting dammarane triterpenes from Rhus chinensis.J KoreanSoc for Appl Biol Chem 2010；53:417–21)。

因此，研究盐肤木根中的化学成分，寻找能够有效治疗冠心病的药物，具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够有效治疗心血管疾病的新的化合物。

本发明提供了式I所示化合物、或其药学上可接受的盐、或其光学异构体、或其立体异构体、或其溶剂合物：

式I中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆各自独立地选自

其中，y选自0～5的整数，R_a选自H、C1-10烷基、C1-10烷氧基、C2-10烯基、C2-10炔基、羟基、羧基、氨基、卤素；

m、n各自独立地选自0～5的整数。

进一步地，所述化合物的结构如式II所示：

其中，R₇、R₈、R₉、R₁₀各自独立地选自H、羟基、甲基、甲氧基、羧基、氨基、卤素。

进一步地，所述化合物的结构为：

本发明还提供了上述式III所示化合物的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(1)取盐肤木根，经干燥、粉碎，用醇类溶液提取后，将提取液减压浓缩，得总浸膏；

(2)用水悬浮总浸膏，然后用石油醚进行萃取，取石油醚相，采用硅胶柱进行梯度洗脱，洗脱液为体积比(70～0)：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶液，保留体积比9：1的二氯甲烷与甲醇混合溶液洗脱出的液体，命名为Fr.7；

(3)取步骤(2)所得Fr.7，采用硅胶柱进行梯度洗脱，洗脱液为体积比(15～0)：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶液，保留体积比8：1的二氯甲烷与甲醇混合溶液洗脱出的液体，命名为Fr.7H，

(4)取步骤(3)所得Fr.7H，采用MCI柱分离提纯，洗脱液为体积浓度95％的甲醇水溶液，即得。

进一步地，步骤(1)中，所述醇类溶液为95％甲醇，提取温度为70℃回流提取，提取次数为4次，每次提取时间为6小时。

本发明还还提供了上述化合物在制备预防和/或治疗心血管疾病药物上的用途。

进一步地，所述心血管疾病选自心衰、冠心病。

本发明中，Fr.表示fraction，意为组分。

前缀C x-y表示任何含“x”至“y”个碳原子的基团。因此，例如，C1-5烷基是指包含任何含1～5个碳原子的直链或支链的烷基。

“取代”是指分子中的1个、2个或多个氢原子被其它不同的原子或分子所替换，包括该分子中同位原子或异位原子上的1个、2个或多个取代。

本文采用质谱引导分离，并应用现代波谱技术(NMR、MS)结合ECD、DFT密度泛函数计算法等方法，制得了具有罕见结构的新化合物。不同于常规的达玛烷型三萜，本发明的化合物为独特带17α-侧链的达玛烷型三萜。

本发明所用混合溶剂的比例均为体积比。

实验结果表明，本发明化合物能明显改善心衰斑马鱼的心衰指标。本发明化合物可以作为改善结构性心脏病变和心脏前负荷和后负荷的先导化合物，在制备预防和/或治疗心衰的药物上，具有非常良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为供试品处理4.5小时后斑马鱼心脏扩大和静脉窦淤血面积改善表型图(心脏和静脉窦瘀血部位分别以红色和黄色虚线框标记)：(A)空白对照；(B)模型对照组；(C)阳性对照组(0.8μg/mL)；(M)给药组：化合物11在浓度为其最大耐受浓度(MTC)处理斑马鱼；以及供试品在浓度为其MTC时处理后，斑马鱼的心脏面积(N)以及静脉窦瘀血面积(O)；与模型对照组比较：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图2为各实验组在浓度为其MTC时处理后，斑马鱼心输出量(A),血流速度(B)和心率(C)；与模型对照组比较：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

1实验试剂

柱色谱硅胶(100–200目、200–300目，青岛海洋化工厂)；MCI填料(75–150μm,日本三菱化工有限公司)；ODS反相硅胶(50μm,加拿大Silicycle公司)；薄层色谱板(GF254，0.20–0.25mm，青岛海洋化工厂)；甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙腈、甲醇(色谱纯，德国MERCK公司)；Milli-Q超纯水(美国Millipore公司)。

2实验仪器

高分辨三重四极杆液质联用仪(美国waters公司)；LC-20A分析兼具半制备高效液相色谱仪(日本岛津公司)；ELSD-LTⅡ蒸发光散射检测器(日本岛津公司)；安捷伦XDB C18色谱柱(250×4.6mm,5μm)；2545AutoPurification自动纯化系统(美国waters公司)；WFH-203B三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司)；Autopol IV自动旋光仪；HitachiU-2900E紫外可见分光光度计；Avatar 360ESP FTIR红外光谱仪；JASCO-810分光偏振仪；DRX-500MHz核磁共振仪(德国Bruker公司)；Daltonics micrOTOF-QII高分辨质谱仪(德国Bruker公司)；DBS-160F电脑自动部份收集器(上海精科实业有限公司)；多功能提取浓缩设备(上海顺仪科技有限公司)；RE-2000A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；RV 10旋转蒸发仪(德国IKA公司)；中型旋转蒸发仪(南京贝帝实验仪器有限公司)；万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-500E台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

3实验药材

盐肤木药材于2017年3月采集自云南省腾冲市，经云南省农业科学院方波博士鉴定为漆树科盐肤木属盐肤木(Rhus chinensis Mill)的干燥根，其凭证标本(No.20170310002)存放于福建中医药大学药学院标本室。

4量子化学计算方法

Confab用于搜索低能构象。进一步用PM7(MOPAC2016)^]方法进行优化。选取4kcal/mol的能量窗,进一步使用密度泛函理论法(DFT)进行优化，其方法为B3LYP方法结合6-31G*基组。碳谱数据基于¹³C NMR was calculated on

B97x-D方法结合6-31G*基组以及气态下。ECD计算基于B3LYP理论结合/6-311G*基组,用SpecDis v1.71软件处理。所得的碳谱，ECD以及原子空间距离的计算值均为基于吉布斯自由能的玻尔兹曼平均值。所有的DFT计算均使用Gaussian09软件处理。

实施例1、本发明化合物的制备

取盐肤木根(43.03kg)，经干燥、粉碎，用95％甲醇于70℃回流提取4次，每次6小时，减压浓缩，得甲醇总浸膏(6.61kg)。用水悬浮甲醇浸膏，用石油醚进行萃取，选取石油醚部位浸膏，采用硅胶柱(100–200目，120cm*15cm)，用二氯甲烷/甲醇(70:1–0:1)进行梯度洗脱。根据TLC展开系统的结果进行综合分析与判断，对收集液进行合并，最终得到13个亚组分(Fr.1–13)。基于我们构建的TLC联合HPLC-DAD/ELSD/MS化合物检测方法以及对各亚组分进行LC-MS化学轮廓分析，根据测定结果确定所需要分离的目标组分。

取Fr.7(137.52g,硅胶柱二氯甲烷/甲醇9:1洗脱部位)采用硅胶柱(100–200目)进行分离，选择二氯甲烷/甲醇(15:1–0:1)进行梯度洗脱，得到11个亚组分(Fr.7A–Fr.7K)。取Fr.7H(4.7g,硅胶柱二氯甲烷/甲醇8:1洗脱部位)，继续通过MCI柱(即微孔树脂柱)更进一步进行精细分离，选择90％甲醇/水体系洗脱，得到本发明化合物(7.60mg)。

本发明化合物的结构确认：

本发明化合物为白色无定形粉末。ESIMS显示其分子离子峰为m/z 497.3948[M+Na]⁺，计算值为497.3607(C₃₀H₅₀O₃Na)，因此推出其分子式为C₃₀H₅₀O₃，不饱和度为6。根据氢谱、碳谱和DEPT谱结果分析，¹H NMR (CDCl₃,500MHz)δ:5.53(1H,t,J＝6.1Hz,H-3),5.13(2H,m,H-11,H-11′),4.29(2H,brs,H-13),4.19(2H,brs,H-1),2.19(2H,q,J＝6.3Hz,H-4),2.08(2H,q,J＝6.3Hz,H-7,H-7′),2.02(4H,m,H-5,H-5′),1.99(2H,m,H-12),1.60(6H,brs,H-14,H-15)；¹³CNMR (CDCl₃,125MHz)δ:137.17(C,C-2,C-2′),135.08(C,C-10,C-10′),134.17(C,C-6,C-6′),131.01(CH,C-3,C-3′),125.20(CH,C-7,C-7′),124.54(CH,C-11,C-11′),67.74(CH₂,C-1,C-1′),60.14(CH₂,C-13,C-13′),39.79(CH₂,C-9,C-9′),39.45(CH₂,C-5,C-5′),28.33(CH₂,C-12,C-12′),26.64(CH₂,C-8,C-8′),26.09(CH₂,C-4,C-4′),16.18(CH₃,C-14,C-14′or C-15,C-15′),16.15(CH₃,C-14,C-14′or C-15,C-15′)。确定本发明化合物的结构如下：

以下通过实验例证明本发明化合物的有益效果。

1实验仪器解剖显微镜(SZX7,OLYMPUS,Japan)；与显微镜相连的相机(TK-C1481EC)；精密电子天平(CP214,OHAUS,America)；六孔微板(Nest Biotech,Shanghai,China)；心跳血流分析系统(Zebralab3.3(PB2084C)。

2实验试剂与药物甲基纤维素(Aladdin,Shanghai,China)；二甲基亚砜(DMSO,Sigma,批号：BCBN0845V)；盐酸维拉帕米(批号：L1303078，上海晶纯实业有限公司)；地高辛(批号：K1417048，上海晶纯实业有限公司)；邻联茴香胺(Sigma，批号：MKBG4648V)；普纳替尼(批号：13771，MedChemExpress)；阿司匹林(批号：059K0199，上海晶纯实业有限公司)化合物用DMSO配制成50mg/mL的母液备用，-20℃储存；临用时用DMSO按需稀释，最终工作液中DMSO浓度为0.1％。

其中，LCZ696是一种双效血管紧张素受体-脑啡肽酶抑制剂(ARNI)，在增强心脏的保护性神经内分泌系统(NP系统，钠尿肽系统)的同时，抑制有害系统(RAAS系统，肾素-血管紧张素-醛固酮系统)。在史上最大型PARADIGM-HF研究中，LCZ696被证明在临床研究中疗效显著超越标准治疗药物依那普利。2015年获美国FDA批准，2017年获中国NMPA批准上市。依那普利是血管紧张素转换酶抑制药；地高辛是Na⁺/K⁺ATP酶抑制剂，是心脏正性肌力药物；氢氯噻嗪是一种利尿药；美托洛尔是一个选择性β1肾上腺素受体拮抗剂。厄贝沙坦是血管收缩素受体拮抗剂^[46]。以上药物都是目前治疗心力衰竭的一线药物。

3实验动物

斑马鱼与人的基因具有超过71％的同源性。斑马鱼在信号通路和对药物的反应上，与人类有极高的相似度。此外，斑马鱼的其他特征，如：体外受精、繁殖能力强、发育快速等，使之成为一个广受欢迎的心脑血管药物筛选模型。经200μM维拉帕米诱导0.5小时后，斑马鱼出现了心包水肿、静脉瘀血、心动过缓以及血液循环受阻等症状。这些症状与冠心病病人的临床症状几乎一致，可以很好的模拟冠心病发病状态。

本发明采用的野生型AB系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。共1500尾，年龄为受精后2天。以上斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为480～510μS/cm；pH为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6mg/L CaCO₃)，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。

4实验方法

成年AB品系斑马鱼由杭州环特生物科技股份有限公司提供。将所选化合物溶解在100％DMSO中配置成母液，给药时将母液用养鱼用水稀释，最终工作液中DMSO浓度为0.1％w/v。200μM盐酸维拉帕米处理斑马鱼0.5小时，诱导斑马鱼心衰模型。0.1％DMSO处理的实验组作为正常对照组。采用临床常规治疗心衰药物地高辛(0.8μg/mL)作为阳性对照药。再采用其它文献报道的六个临床常用心衰药物LCZ696、依那普利、地高辛、氢氯噻嗪、厄贝沙坦、美托洛尔作为对照药。

预防斑马鱼心衰的评价实验方法完全参照之前文献(Zhu XY,Wu SQ,Guo SY,YangH,Xia B,Li P,Li CQ.A zebrafish heart failure model for assessing therapeuticagents.Zebrafish 2018；15:243–53.)。首先，测定化合物的MTC。接下来，评价所测化合物浓度在其MTC时对斑马鱼心衰的预防作用。各实验组按照文献方法给药处理后，分析统计心脏扩张面积(A1)和静脉窦瘀血面积(A2)，心输出量(CO)，血流速度(BFV)和心率(HR)。预防斑马鱼心衰的评价实验方法在文献方法(Zhu XY,Liu HC,Guo SY,Xia B,Song RS,Lao QC,Xuan YX,Li CQ.A zebrafish thrombosis model for assessing antithromboticdrugs.Zebrafish 2016；13:335–44)基础上进行了一些修改。

P<0.05代表具有统计学意义。

供试品对于心脏扩大、静脉窦瘀血、心输出量、血流速度、心率的改善作用分别采用formula-1～formula-5进行计算。formula-1(2):心脏扩大改善作用(％)＝[A₁₍₂₎(模型组)-A₁₍₂₎(化合物组)]/[A₁₍₂₎(模型组)–A₁₍₂₎(空白组)]×100％；formula-3:心输出量增加作用(％)＝[CO(化合物组)-CO(模型组)]/[CO(空白组)-CO(模型组)]×100％；formula-4:血流速度增加作用(％)＝[BFV(化合物组)-BFV(模型组)]/[BFV(空白组)-BFV(模型组)]×100％；formula-5:心率增加作用(％)＝[HR(化合物组)-HR(模型组)]/[HR (空白组)-HR(模型组)]×100％。

实验例1、本发明化合物对斑马鱼心力衰竭的预防作用

首先，测试了本发明化合物在斑马鱼心衰模型中的最大耐受浓度(MTC)，为0.5μg/mL。随后，评价该化合物浓度为其MTC时对斑马鱼心力衰竭形成的预防作用。

根据表1可知，本发明化合物在其MTC时表现了显著的对斑马鱼心衰的预防作用(P<0.01，P<0.001)。根据图1和图2可知，本发明化合物对心脏扩大及静脉窦瘀血面积有改善作用，对心输出量(CO，图2A)、斑马鱼背部主动脉血流速度(BFV，图2B)和心率(HR，图2C)有增加作用；而且，与模型组比较，本发明化合物能更加显著的改善以上五个心衰指标(P<0.01，P<0.001)。而CO作为评估心脏射血功能的重要指标，会受到结构性心脏病变和心脏超载前负荷和后负荷的影响。所以，本发明化合物能明显改善心衰斑马鱼的心衰指标，可以作为改善结构性心脏病变和心脏前负荷和后负荷的先导化合物。

为了更好的评价本发明化合物对斑马鱼心衰的改善作用，我们将临床常规治疗心衰的阳性对照药物地高辛(0.8μg/mL)以及文献报道的六个临床常用心衰药物LCZ696、依那普利、地高辛、氢氯噻嗪、厄贝沙坦、美托洛尔(在同浓度(0.5μg/mL)或更高浓度(10μg/mL)下)对斑马鱼心衰的改善作用与本发明化合物进行比较(图1、图2)。

结果表明，本发明化合物对CO和BFV的增加作用，明显优于对照药依那普利(10μg/mL)、美托洛尔及厄贝沙坦(0.5μg/mL)。而且，本发明化合物的使用量低于阳性对照药物的情况下，本发明化合物对心脏扩大的改善作用、对经脉淤血改善作用、心输出量增加作用、血流速度增加作用，以及心率增加作用均与阳性对照药物地高辛相当。说明本发明化合物能够在低剂量使用下，显著改善心衰斑马鱼的心衰指标，本发明化合物能够对斑马鱼心力衰竭形成起到显著的预防和/或治疗作用。

表1化合物对于斑马鱼心衰的预防作用以及其与文献报道的常规心衰药物作用比较

与模型组比较:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

综上，本发明化合物能明显改善心衰斑马鱼的心衰指标标。本发明化合物可以作为改善结构性心脏病变和心脏前负荷和后负荷的先导化合物，在制备预防和/或治疗心衰的药物上，具有非常良好的应用前景。

Claims (7)

1.式I所示化合物、或其药学上可接受的盐、或其光学异构体、或其立体异构体、或其溶剂合物：

式I中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆各自独立地选自

其中，y选自0～5的整数，R_a选自H、C1-10烷基、C1-10烷氧基、C2-10烯基、C2-10炔基、羟基、羧基、氨基、卤素；

m、n各自独立地选自0～5的整数。

2.根据权利要求1所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其光学异构体、或其立体异构体、或其溶剂合物，其特征在于：所述化合物的结构如式II所示：

其中，R₇、R₈、R₉、R₁₀各自独立地选自H、羟基、甲基、甲氧基、羧基、氨基、卤素。

3.根据权利要求2所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其光学异构体、或其立体异构体、或其溶剂合物，其特征在于：所述化合物的结构为：

4.权利要求3所述化合物的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(1)取盐肤木根，经干燥、粉碎，用醇类溶液提取后，将提取液减压浓缩，得总浸膏；

(2)用水悬浮总浸膏，然后用石油醚进行萃取，取石油醚相，采用硅胶柱进行梯度洗脱，洗脱液为体积比(70～0)：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶液，保留体积比9：1的二氯甲烷与甲醇混合溶液洗脱出的液体，命名为Fr.7；

(3)取步骤(2)所得Fr.7，采用硅胶柱进行梯度洗脱，洗脱液为体积比(15～0)：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶液，保留体积比8：1的二氯甲烷与甲醇混合溶液洗脱出的液体，命名为Fr.7H，

(4)取步骤(3)所得Fr.7H，采用MCI柱分离提纯，洗脱液为体积浓度95％的甲醇水溶液，即得。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述醇类溶液为95％甲醇，提取温度为70℃回流提取，提取次数为4次，每次提取时间为6小时。

6.权利要求1-3任一项所述化合物在制备预防和/或治疗心血管疾病药物上的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述心血管疾病选自心衰、冠心病。

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