CN105170209B - 一种表面图案化修饰的基片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表面图案化修饰的基片，包括衬底以及图案化的纳米薄层，所述衬底表面带有亲水基团，所述纳米薄层为厚度小于1μm的PDMS薄层；所述图案化的纳米薄层与所述衬底键合，形成没有纳米薄层的亲水区域和具有纳米薄层的疏水区域，所述亲水区域用于吸附微流体，所述微流体为水、溶液或者悬浊液，所述微流体在所述基片表面投影的形状与对应的亲水区域的形状相同。本发明还公开了该基片的制备方法以及在制备阵列芯片中的应用。通过本发明，利用一种简单快速的工艺对基片表面进行图案化的修饰，该基片在微阵列芯片的制备中具有广阔的应用前景。

Description

一种表面图案化修饰的基片及其制备方法

技术领域

本发明属于表面改性领域，更具体地，涉及一种表面图案化修饰的基片及其制备方法。

背景技术

近年来，微流体系统在化学工程、生物工程以及转化医学等领域产生重大影响。这种微流体系统结合材料科学，化学工程，微机电加工等技术可以对样品进行进样、预处理、加样、取样、反应、检测等一系列的操作。通过建立大规模集成的操作系统，使得分析、筛选通量更高，更为简单有效。因其是在微米尺度的操作，同时还能节约样品成本，提高每一单元实验的准确度。微流体系统的发展，带来的将是筛选和检测成本的大幅下降和效率的提高。因为发展微流体系统有极其巨大的经济价值，尤其是在药物筛选，转化医学等高精尖成本巨大的行业之中。

表面图案化修饰技术，作为微流体技术中的一个部分，近年来也受到了很多学者的重视。然而现有技术中多是通过微接触压印、或者等离子体处理等方式，来实现亲疏水区域的图案化修饰，如专利文献CN200580042844公开了一种通过表面处理以图案化改性的方法，通过孔眼掩膜限定亲疏水区域之后，再进行疏水或者亲水修饰，最后用后处理除去孔眼掩膜，从而使得衬底表面有图案化的亲疏水特性。然而这些方式多是通过对衬底表面活性基团的化学修饰来改变表面性质，其亲疏水性质并不稳定，同时操作步骤也相对繁琐。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种表面图案化修饰的基片及其制备方法与应用，其目的在于通过在衬底的部分表面覆盖PDMS薄膜，从而图案化的改变衬底表面的亲疏水性状，从而制备出能应用于微阵列芯片的基片，从而解决现有技术中图案化的疏水修饰不稳定的问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种表面图案化修饰的基片，包括衬底以及图案化的纳米薄层，所述衬底表面带有亲水基团，所述纳米薄层为厚度小于1μm的PDMS(聚二甲基硅氧烷)薄膜；所述图案化的纳米薄层与所述衬底键合，形成没有纳米薄层的亲水区域和具有纳米薄层的疏水区域，所述亲水区域用于吸附微流体，所述微流体的形状为微液滴、微液流或者微液滴与微液流的组合，所述微流体的成分为水、溶液、悬浊液或者凝胶。

优选地，所述衬底表面带有的亲水基团为硅氧基、羟基、羧酸基、磺酸基、磷酸基、氨基或季铵基。

作为进一步优选地，所述衬底为玻璃、表面带有二氧化硅氧化层的硅片以及石英片。

优选地，所述溶液为药物溶液、荧光素溶液以及凝胶因子溶液，所述悬浊液为细胞悬浊液、细菌悬浊液或者纳米颗粒悬浊液。

优选地，所述亲水区域的形状为圆形、规则多边形或者线形，且圆形以及规则多边形的直径或者线形的宽度小于等于5mm。

按照本发明的另一个方面，提供了一种上述基片的制备方法，包括以下步骤：

(1)根据所需疏水区域与亲水区域的形貌，设计并制备出PDMS印章，所述PDMS印章包括凸起部和凹陷部，所述凸起部与所需疏水区域形貌一致；

(2)将所述PDMS印章与衬底用等离子体处理，使得PDMS印章与衬底表面产生自由基；

(3)将所述PDMS印章的凸起部与所述衬底表面键合后剥离，使得衬底表面与所述凸起部键合的区域残留一层厚度小于1μm的PDMS薄膜，形成疏水区域，其他区域即为亲水区域，制得所述基片。

其中，键合的时间与等离子体处理的电压、时间、气体的组分，以及氧等离子体设备的老化程度都有关，可能为1s～2h之间不等。

优选地，所述步骤(2)中等离子体处理所用的气体为惰性气体，空气，含氧元素的气体(如O₂、O₃、CO和CO₂)，或者含氮元素的气体(如N₂、HN₃、NO₂和NO)。

作为进一步优选地，所述步骤(2)中等离子体处理所用的气体为O₂或者O₃。

作为进一步优选地，在等离子体处理的电压为420V，等离子体处理所用的气体为O₂，且流量为600mL/min～800mL/min，等离子体处理时间为60s～90s时，键合的时间为10s～30s。

按照本发明的另一方面，还提供了一种包括上述基片的微阵列芯片，所述基片包括多个亲水区域，所述亲水区域表面吸附有第一微液滴，所述第一微液滴为水、溶液、悬浊液或者微凝胶。

优选地，所述第一微液滴为第一微凝胶，所述第一微凝胶由包含凝胶因子的液态的第一微液滴固化后形成。

作为进一步优选地，所述微阵列芯片还包括第二凝胶，所述第二凝胶为利用甲基丙烯酸甲酯硅油或等离子体使得所述疏水区域亲水化以后，吸附第二液滴并使其固化后形成，第二液滴包含凝胶因子。

当所述第二微液滴添加的量相对较少时，第二凝胶填充于基片表面第一微凝胶周围的其它区域，第一微凝胶的上表面高于第二凝胶的上表面；当所述第二微液滴添加的量相对较多时，第二凝胶同时将覆盖于第一凝胶之上，其上表面的高度超越第一凝胶且与基片表面平行。

作为进一步优选地，所述亲水区域表面吸附有N层的微凝胶颗粒，所述N层的微凝胶颗粒分别由第一微凝胶、第二微凝胶至第N微凝胶组成，所述第i-1微凝胶的上表面吸附有第i微凝胶，且第i微凝胶与第i-1微凝胶包含的组分不同，其中，N为大于等于2的整数，i为2到N的任意整数。

按照本发明的另一方面，还提供了一种凝胶颗粒，所述凝胶颗粒为N层的微凝胶颗粒，从下至上由第一微凝胶至第N微凝胶组成，且第i微凝胶与第i-1微凝胶包含的组分不同，其中，N为大于等于2的整数，i为2到N的任意整数。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有下列有益效果：

1、衬底表面的亲疏水性质通过覆盖纳米级的PDMS薄膜进行改变，彻底的改变了表面的物理特性，不同于传统的化学方法，其亲疏水性质的修饰更加稳定；

2、PDMS印章与衬底键合后直接剥离即可制备得到所述基片，无需复杂的后处理工艺，简单快速、成本低廉；

3、PDMS印章和衬底为可逆键合，不对PDMS印章的结构进行根本性的破坏，PDMS印章可多次使用，加工成本低；

4、基片表面图案化的亲水区域，可以用于吸附液滴，从而制备获得多种微阵列芯片并加以应用。

附图说明

图1是实施例1中玻璃基片的制备过程示意图；

图2是实施例4中微流体芯片的荧光检测示意图；

图3是实施例6中微液滴阵列形成的示意图；

图4是实施例6中药物浓度梯度微液滴阵列形成的示意图；

图5是实施例7中细胞密度梯度微液滴阵列形成的示意图；

图6是实施例8中荧光浓度梯度微液滴阵列的验证结果；

图7是实施例9中细胞密度梯度微液滴阵列的验证结果；

图8是实施例12中细胞密度梯度和药物浓度梯度正交微阵列形成的示意图；

图9是实施例16中双组分微凝胶阵列形成的示意图；

图10是实施例20中互补的多组分化学微环境形成的示意图；

图11是实施例20中互补的多组分化学微环境的荧光检测结果；

图12是实施例21中立体微凝胶阵列形成的示意图；

图13是实施例21中立体微凝胶阵列的荧光成像检测图；

在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中：其中1-玻璃基片；2-PDMS印章；3-疏水区域；4-亲水区域；5-缓冲液液滴6-吸管；7-药物a溶液液滴；8-药物浓度梯度液滴阵列的形成；9-细胞a悬液；10-细胞密度梯度微液滴阵列的形成；11-浓度梯度正交微液滴阵列的形成；12-细胞b悬液；13-双组分微凝胶阵列；14-含有Fluorescein的凝胶液滴15-含有罗丹明的凝胶液滴；16-z轴方向为不同细胞组分的凝胶液滴。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供了一种表面图案化修饰的基片的制备方法，具体步骤如下：

(1)根据所需的亲水区域和疏水区域的形貌设计出光刻掩膜；当使用阴模光刻胶，如AZ-50时，掩膜的形貌与所需疏水区域的形貌相同，使用阳模光刻胶，如SU-8时，掩膜的形貌与所需亲水区域的形貌相同；然后，利用阴模光刻或者阳模光刻，制备出具有相应形貌的PDMS(聚二甲基硅氧烷)印章，所述PDMS印章包括凸起部与凹陷部，所述凸起部的形貌对应疏水区域，所述凹陷部的形貌对应亲水区域；

(2)将所述PDMS印章与衬底用等离子体处理，使得PDMS印章与衬底表面产生自由基；其中，所述衬底为表面光滑且带有亲水基团的衬底；所述亲水基团为烷氧基、羟基、羧酸基、磺酸基、磷酸基、氨基或季铵基；所述衬底优选为玻璃、表面带有二氧化硅氧化层的硅片以及石英片；所述基片应用于微流体时，衬底多选用玻璃，应用于半导体器件时，则多选用带有二氧化硅氧化层的硅片；等离子体处理所用的气体为惰性气体，空气，含氧元素的气体(如O₂、O₃、CO和CO₂)，或者含氮元素的气体(如N₂、HN₃、NO₂和NO)等提高衬底与PDMS表面自由能的等离子气体，优选为O₂或者O₃；

(3)将所述PDMS印章的凸起部与所述基片表面键合后剥离，使得该基片表面与所述凸起部键合的区域残留一层厚度小于1μm的PDMS薄膜，从而转换为疏水区域，所述基片表面未与所述凸起部键合的区域即为亲水区域。

其中，步骤(3)中键合的时间与等离子体处理的电压、时间、气体的组分，以及氧等离子体设备的老化程度都有关，可能为1s～2h之间不等。其中，等离子体处理中所用的电压、处理时间、气体流量、气体中含氧等离子的比例，与键合的时间负相关，而等离子体设备的老化程度与键合的时间正相关。当设备运转良好，等离子体处理的电压为420V，等离子体处理所用的气体为O₂，流量为600mL/min～800mL/min，等离子体处理时间为60s～90s时，键合的时间为10s～30s。

按照上述方法制备的表面图案化修饰的基片包括衬底以及图案化的纳米薄层，所述衬底表面带有亲水基团，所述纳米薄层为厚度小于1μm的PDMS薄膜；所述图案化的纳米薄层与所述衬底键合，形成没有纳米薄层的亲水区域和具有纳米薄层的疏水区域，所述亲水区域用于吸附微流体，所述微流体为水、溶液、悬浊液或者凝胶，所述微流体在所述基片表面投影的形状与对应的亲水区域的形状相同；其中，所述微流体为微液滴、微液流或者微液滴与微液流的组合。

其中，溶液优选为药物溶液、荧光素溶液以及凝胶因子溶液等常用于微流体芯片中的溶液，悬浊液优选为细胞悬浊液、细菌悬浊液或者纳米颗粒悬浊液。

其中，当亲水区域为圆形或者规则多边形时，微流体为微液滴，当亲水区域为线形时，微流体为微液流。若微流体由多个微液滴组成，则吸附于所有独立亲水区域的多个微液滴组成了微液滴阵列。

所述微流体的体积与对应的亲水区域的面积的相关性还需要考虑其它因素，如液滴的成分、亲水区域的面积等。例如，当微流体的成分均匀，亲水区域的形状为圆形、规则多边形、线形、且尺寸较小时(直径或者宽度5mm以下)，其相关性最好。当微流体包含表面活性剂时，微流体的表面张力变小，从而微流体的体积与对应的亲水区域的面积的相关性变小，而当液滴中包含凝胶因子时，液滴的内聚力变大，从而能使在亲水区域的面积较大时，微流体的体积还能与对应的亲水区域的面积具有较好的相关性。

本发明还提供了一种包括该基片的微阵列芯片，其中，所述基片包括多个亲水区域，所述亲水区域表面吸附有第一微液滴，微液滴可利用滴管或者移液器添加于基片上，也可以利用亲水区域的吸附力从包含液滴的容器中取得。

优选地，如果第一微液滴含有凝胶因子，将其固化则可得到微凝胶，则该微凝胶与基片构成了微阵列芯片。其中，凝胶因子的种类不同，固化的方法也不同。例如当凝胶因子为低温琼脂糖时，可以在琼脂糖的熔点之上的温度对液滴进行操作，待冷却后即自行固化；当凝胶因子为PEGDA(聚乙二醇双丙烯酸酯)时，紫外光照射即可进行固化；凝胶因子为海藻酸盐时，可通过添加CaCl₂溶液进行固化。

凝胶的机械强度和孔隙大小则与凝胶因子分子的大小和凝胶因子的浓度有关。通过对凝胶因子的分子大小和浓度进行选择，可以制备不同机械强度的微凝胶，从而使得凝胶有不同的透过率。例如当研究对象为细菌或细胞的迁移时，需要孔隙较大的微凝胶，而在固定细胞前提下，进行小分子药物的研究时，则需要孔隙较小的微凝胶。

微液滴与微凝胶有着各自的优点，微液滴处于开放式的环境，方便随时对样品进行操作；而微凝胶由于形成了一个相对封闭的内环境，更适于进行某一特定环境对细胞作用的研究，在实际研究中，可以根据需求进行选择。

优选地，所述微阵列芯片包括第一微凝胶和第二凝胶，所述第一微凝胶为所述亲水区域吸附第一微液滴固化后形成，所述第二凝胶为利用甲基丙烯酸甲酯硅油或等离子体使得所述疏水区域亲水化以后，吸附第二液滴并使其固化后形成，所述第一微液滴和第二液滴包含凝胶因子；当所述第二液滴添加的量相对较少时，第二凝胶填充于基片表面第一微凝胶周围的其它区域，第一微凝胶的上表面高于第二凝胶的上表面；当所述第二液滴添加的量相对较多时，第二凝胶同时将覆盖于第一微凝胶之上，其上表面的高度超越第一凝胶且与基片表面平行。

优选地，所述微阵列芯片的亲水区域表面吸附有N层的凝胶颗粒，所述N层的凝胶颗粒分别由第一微凝胶、第二微凝胶至第N微凝胶组成，第1微凝胶吸附于亲水区域表面，第i微凝胶吸附于第i-1微凝胶上表面，且第i微凝胶与第i-1微凝胶包含的组分不同，其中，N为大于等于2的整数，i为2到N的任意整数；该微阵列芯片的制备方法具体如下：先将第一微液滴固化成为第一微凝胶，然后，向多个第一微凝胶的上表面添加第二液滴，使第二液滴吸附于多个第一微凝胶的上表面形成多个第二微液滴，然后将多个第二微液滴固化形成多个第二微凝胶；重复上述过程直至向多个第N-1微凝胶的上表面添加第N液滴，并形成多个第N微凝胶，第一微凝胶至第N微凝胶从下至上组成了N层的微凝胶颗粒，所述基片以及多个N层的微凝胶颗粒构成了所述微阵列芯片；其中，N为大于等于2的整数，且第二液滴至第N液滴含有凝胶因子。

当第一微液滴至第N微液滴的成分不同时，所述凝胶颗粒为N层的各向异性微凝胶颗粒。例如，当第一微液滴中含有四氧化三铁纳米颗粒时，制备所得的立体微凝胶颗粒则为各向异性的磁性微凝胶颗粒。又或者，第一微液滴和第三微液滴中含有不同成分的药品，而第二微液滴中含有细胞，所述立体凝胶颗粒则成为从接触基片的一面，至远离基片的一面含有不同组分的凝胶颗粒。按照上述方案制备所得的凝胶颗粒具有以下特点，所述凝胶颗粒为N层的微凝胶颗粒，从下至上由第一微凝胶至第N微凝胶组成，且第i微凝胶与第i-1微凝胶包含的组分不同，其中，N为大于等于2的整数，i为2到N的任意整数。

实施例1玻璃基片的制备

步骤一：软光刻技术制作阳模

将光刻胶SU-8(1070)甩于洗净烘干的硅片上(700r 18s，2500r 60s)，前烘除去SU-8胶中的溶剂(65℃15min,95℃2hour)，使SU-8阳模与硅片更好地贴合，然后进行光刻(3.5mJ/cm²)，光刻采用的掩膜板是根据阳模的形状来设置的，其中光刻的时间为60s；然后置于热平板上进行后烘(65℃15min,95℃2hour)，使阳模与硅片更加贴合，之后经显影液显影后，再进行坚膜(135℃)1小时以上，达到SU-8与硅片的紧密贴合的效果，即可得具微结构的SU-8阳模，测得其高度约20μm。

步骤二：PDMS印章的制备

制作出阳模后，再用快速成型方法将阳模的微结构复制到PDMS印章上。即将PDMS单体与交联剂按10:1混合，待混合完全后然后将PDMS倒于阳模上，将固化后的PDMS揭起并切边即可得到厚约1cm的PDMS印章，PDMS印章的凸起部和阳模的形状相同。

步骤三：基片的制备

选择玻璃基片1作为基片，将PDMS印章2和玻璃基片1清洗干净并用氧等离子体处理后(电压为420V，流量为800mL/min，处理时间为80s)，将PDMS印章2与玻璃基片1键合10秒，然后立即将PDMS印章2剥下，使得玻璃基片与凸起部键合的区域残留一层纳米级的PDMS薄膜。玻璃基片1表面原本是亲水性质，但此时该区域由于覆盖PDMS薄膜变成了疏水区域3；而键合时与PDMS印章2上凹陷部相对的区域依然保持为亲水区域4。玻璃基片1的亲水区域4的大小和形状和PDMS印章2上凹陷部的大小和形状完全相同，如图1所示。

通过设计阳模或阴模，可以加工与亲水区域具有相应形貌的PDMS印章，进而得到带有所需亲水区域形状的基片。PDMS印章上除了带有微孔还可以带有微沟道，或者带有微孔和微沟道的组合。

实施例2

以所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，步骤一中采用AZ-50为光刻胶为AZ50,掩膜板根据PDMS印章凹陷部来设置，并利用AZ-50相应的制备工艺制备PDMS印章。

实施例3

以所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，所述基片为表面有二氧化硅氧化层的硅片。

实施例4

以所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，所述PDMS印章上为微沟道(如图2a所示)，或者微孔和微沟道的组合(如图2b所示)，将含有4μM(10^-6mol/L)Fluorescein的液滴添加于玻璃基片1之上，从显微镜下观察可见，液滴吸附于亲水区域表面而形成微流体，如图2所示，其中图2a的标尺长度为400μm，图2b的标尺长度为600μm。

实施例5

以所述的相同步骤重复实施例4，区别在于，所述微沟道为长20毫米宽200微米的长条形亲水区域。将缓冲液液滴用吸管添加于玻璃基片上，由于玻璃基片表面的亲疏水性的差异，液滴自动附着形成长20毫米宽200微米的微液流。将微电极分别插入长条形微液流的两端。利用微移液枪将蛋白质样品加样于液滴区域的一端。加样样品后，立刻在蛋白质样品一端加上0V电压，另一端加上110V电压。在样品中蛋白质的等电点大于液滴的pH时，蛋白质从加样端泳向另一端，在电泳过程中，带电荷不同的蛋白质逐渐分开。

实施例6药物浓度梯度微液滴阵列芯片

步骤一：以实施例1所述方法分别加工两片玻璃基片1，分别为第一玻璃基片1和第二玻璃基片1，亲水区域的形状都为圆形，阵列都为17×17的矩形阵列，上下或左右相邻两个亲水区域圆心的距离都为2毫米。其中第一玻璃基片1的亲水区域的直径都为1毫米；而第二玻璃基片1亲水区域x轴方向的直径相同，y轴方向的亲水区域直径随行数的增加而增加(第1行直径为400μm，每行增加50μm，直至最后一行直径为800μm)。

步骤二：将缓冲液液滴5用吸管6滴加于第一玻璃基片1上，由于玻璃基片1上的亲疏水性的差异，液滴无法附着于疏水区域3，亲水区域4则自动吸附液滴，从而形成相应大小和形状的微液滴阵列，成为第一微流体芯片，如图3所示。用同样的方法将药物a溶液液滴7滴加于第二玻璃基片1上，制备获得第二微流体芯片。

步骤三：将两片微流体芯片面对面放置，通过显微镜对准使得两块玻璃基片1中的微液滴阵列对应；接着，我们通过将两块玻璃基片1上的微液滴彼此接触，将缓冲液微液滴阵列5和药物溶液微液滴阵列6互相混合，相对应的液滴通过扩散作用而浓度趋向一致；由于第二玻璃基片1上的微液滴6含有药物a，而第一玻璃基片1上的微液滴5不含药物，这个过程相当于第二玻璃基片1上的药物a微液滴被稀释，由于药物a微液滴的大小不同，而缓冲液微液滴的大小相同，所以同一列中的药物a微液滴被稀释的倍数也不同，从而形成了药物a的浓度梯度；待药物扩散后，将两组玻璃基片1分离从而分裂微液滴，由于玻璃基片1表面亲水区域的面积不变，分裂后的微液滴保持融合前的体积，从而第一玻璃基片1上形成了体积相同而药物浓度不同的微液滴阵列8，如图4所示。

实施例7细胞密度梯度微液滴阵列芯片

以所述的相同步骤重复实施例6，区别在于，以第三微流体芯片取代第二微流体芯片，以第三玻璃基片1取代第二玻璃基片1，以细胞a悬液9取代药物溶液，第三玻璃基片1位于同一列的亲水区域4直径相同，位于同一行的亲水区域4直径随列数的增加而增加(第1列直径为400μm，每列增加50μm，直至最后一列800μm)，第三玻璃基片1与吸附于表面的细胞密度梯度微液滴10构成了微阵列芯片，制备过程如图5所示。制备所得的微液滴阵列具有体积相同而细胞密度不同的微液滴。

实施例8荧光浓度梯度微液滴阵列芯片

以所述的相同步骤重复实施例6，区别在于，所述缓冲液液滴含有质量分数为10％的PEGDA溶液，药物溶液含有10％的PEGDA以及4μM(10^-6mol/L)Fluorescein，微液滴阵列的融合时间为3分钟，分裂后用500mW紫外线高于液滴50mm照射20秒固化成微凝胶，并进行荧光定量对Fluorescein的浓度进行检测，其化学浓度梯度结果如图6所示。其中横坐标表示微凝胶的行序，纵坐标表示微凝胶中Fluorescein的浓度，可以看到，每一行的微凝胶中的荧光素的浓度依次增加，形成了较好的化学浓度梯度。

实施例9

以所述的相同步骤重复实施例8，区别在于，以浓度为1.5×10⁶/ml的钙黄绿素染色的细胞取代荧光素，并用荧光成像的方法进行细胞计数，结果见图7。其中横坐标表示微凝胶的列序，纵坐标表示微凝胶中细胞的密度，可以看到，每一列的微凝胶中的细胞的密度依次增加，形成了较好的细胞密度梯度。

实施例10

以所述的相同步骤重复实施例9，区别在于细胞悬液中不含有PEGDA。形成微液滴阵列为从吸附玻璃基片的一端至远离玻璃基片的一端，机械强度逐渐变大的微凝胶形成的微阵列，该机械强度梯度微凝胶的性质可用于诱导干细胞分化。

实施例11

以所述的相同步骤重复实施例9，区别在于缓冲液液滴中不含有PEGDA，所形成凝胶液滴阵列为在z轴方向从下至上，机械强度逐渐变大的微凝胶形成的微阵列。

实施例12浓度梯度正交微液滴阵列芯片

步骤一：以实施例6所述方法在第一玻璃基片1上制备获得药物浓度梯度微阵列芯片。

步骤二：以所述的相同步骤重复实施例6，区别在于，以步骤一制得的药物浓度梯度微阵列芯片取代第一微流体芯片，以实施例7中的第三微流体芯片取代第二微流体芯片，结果如图8所示，在第一玻璃基片1上形成了细胞密度和化学浓度正交梯度环境微液滴阵列11，位于同一行的微液滴中所含的药物a浓度随列序依次增加，而所含的细胞a密度相同；位于同一列的微液滴中所含的药物a浓度相同，所含的细胞a密度随行序依次增加。此微阵列芯片可用于药物浓度对细胞作用的研究，如用于研究细胞的群体耐受性和群体凋亡。

实施例13

以所述的相同步骤重复实施例12，区别以于，以药物b溶液取代第三玻璃基片表面的细胞悬液，第一玻璃基片上形成的微液滴阵列为ab两种药物浓度梯度的正交阵列。

实施例14

以所述的相同步骤重复实施例12，区别在于，以质量分数为20％的PEGDA取代药物a，步骤二之后用500mW紫外线高于液滴50mm照射20秒固化成凝胶液滴，同一行的微液滴机械强度随着列序逐渐增加。

该微阵列芯片可以应用于生物力学研究和干细胞分化研究，如充间质干细胞(MSC)在不同强度的凝胶中分化成不同的细胞，在较高的强度环境下分化成骨细胞，随着凝胶的机械强度下降，还可以分化成软骨细胞，肌腱细胞，韧带细胞，肌腱细胞，神经细胞等等。

实施例15

以所述的相同步骤重复实施例12，并在步骤二之后，将第一玻璃基片和第四玻璃基片相对放置，使对应的微液滴融合；分离第一玻璃基片和第四玻璃基片，使融合的微液滴分裂，分离后的第一玻璃基片与吸附于表面的微液滴构成了所述微阵列芯片；所述第四玻璃基片表面吸附有与第一玻璃基片数量和排列相同的微液滴阵列，而该微液滴阵列为浓度均一的细胞悬液。则在形成的微阵列芯片上，微液滴阵列为含有浓度均一的细胞，且两种药物浓度梯度为正交排列的微阵列。

该微阵列芯片可用于研究药物对细胞的协同作用。例如当药物a为化疗药物，药物b为多药耐药反转药物，所述细胞悬液为肿瘤细胞悬液时，所述微阵列芯片用于研究化疗药物和多药耐药反转药物协同治疗肿瘤。

实施例16双组分微凝胶阵列芯片

步骤一：以所述的相同步骤重复实施例6，区别在于，第一玻璃基片1亲水区域阵列为17×17，上下或左右相邻两个中心的距离都为1200μm，亲水区域直径为400μm；而第二玻璃基片1的亲水区域阵列为34×17，每个亲水区域直径为150μm，一行的每两个亲水区域成对放置，成为一个亲水区域组，其对称点距上下或左右的对称点距离为1200μm，相对的亲水区域中心间距350μm。

步骤二：将缓冲液液滴滴加于第一玻璃基片1上，形成大小和形状相同的缓冲液液滴；用移液器或者毛细管划过第二玻璃基片1上的奇数行的亲水区域以滴加细胞a悬液9，再在偶数行用同样的方法滴加细胞b悬液12，便形成交错排列的细胞悬液阵列，每一对吸附于同一亲水区域组的微液滴组成一个液滴岛。这三种液滴中都含有质量分数为10％的PEGDA。

步骤三：将两组微液滴阵列面对面放置，通过显微镜对准使得第一玻璃基片1的亲水区域中心，与第二玻璃基片1中对称点一一对应；接着，我们通过将两块基片上的微液滴彼此接触使对应的微液滴混合而成分趋向一致，5分钟后分开并立刻用500mW紫外线高于样品50mm照射20秒使液滴固化，由于第二玻璃基片1上的成对微液滴之间有一定的间隔且细胞的扩散需要一定时间，固化后的微凝胶阵列中的异种细胞并未完全混合，而是每个微凝胶含有两个相对独立的细胞体系，如图9所示的双组分微凝胶阵列芯片13。

该芯片能用于可控的空间排列两种细胞，不同种类的细胞空间位置可控的排列可以诱导产生一些特殊的细胞行为学上的变化，比如迁移和分化，用于构建高通量的药物筛选模型，如两种细胞悬液中的细胞分别为内皮细胞(ECs)，和诱导充间质干细胞(MSC)，所述微阵列芯片用于研究ECs对MSC的诱导迁移及分化。

实施例17

以所述的相同步骤重复实施例16，区别在于，三种液滴中都不含有PEGDA，而第二玻璃基片的亲水区域阵列为34×17，奇数行的亲水区域每行的直径相同，每一列，亲水区域直径随行数的增加而增加(第1行直径为50μm，每行增加10μm，直至最后一行直径为210μm)，用于吸附药物溶液；偶数行的亲水区域每列的直径相同，每一行，亲水区域直径随列数的增加而增加(第1列直径为50μm，每列增加10μm，直至最后一列直径为210μm)，用于吸附细胞悬液，所形成的微阵列芯片功能与实施12类似，为细胞密度梯度和药物浓度梯度正交微阵列芯片。

实施例18

以所述的相同步骤重复实施例17，区别在于，第一玻璃基片亲水区域直径为800μm；而第二玻璃基片1的亲水区域阵列为51×17，同一行上的每三个亲水区域为一组，分别作为左、中、右亲水区域，同一组上的左、中、右亲水区域的中心间隔250μm，每个亲水区域的中心对称点与相邻亲水区域的中心对称点间距为1200μm；其中左亲水区域x轴方向的直径相同，y轴方向的直径随行数的增加而增加(第1行直径为50μm，每行增加10μm，直至最后一行直径为210μm)，用于吸附药物a溶液；右亲水区域y轴方向的直径相同，x轴方向的直径随列数的增加而增加(第1列直径为50μm，每列增加10μm，直至最后一列直径为210μm)，用于吸附药物b溶液，中亲水区域则直径都为50μm。所形成的微阵列芯片与实施15类似，微液滴阵列为含有浓度均一的细胞，且两种药物浓度梯度的正交排列的微阵列。实施例19

以所述的相同步骤重复实施例16，区别在于，而第二玻璃基片上的亲水区域组包括两个到四个不规则排列的第二亲水区域，当第一玻璃基片和第二玻璃基片相对放置时，一个亲水区域组中的所有第二亲水区域在第一玻璃基片上的投影都和一个第一基片表面的第一亲水区域有重合区域，使得相对应的第二液滴岛中所有的第二微液滴都与一个第一微液滴融合，而该第一亲水区域和其它不相对应的第二亲水区域没有重合部分，从而使得该第一微液滴不会与其它第二微液滴融合。

实施例20互补的多组分化学微环境芯片

步骤一：以实施例1所述方法加工一片玻璃基片1，亲水区域阵列为41×41，每一个单独的亲水性微区域阵列大小为直径800μm，相邻两个亲水区域中心的距离为1200μm。

步骤二：将温度为35℃，Fluorescein浓度为500nM的2％低温琼脂糖溶液的液滴14滴加于玻璃基片1上，由于玻璃基片1上的亲疏水性的差异，疏水性区域液滴无法附着，亲水性区域则自动附着形成相应大小和形状的液滴，固化后则形成凝胶阵列。

步骤三：待琼脂糖凝胶冷却到20℃以下固化后，我们将甲基丙烯酸甲酯硅油(methacrylatesilane)滴加在玻璃基片1表面，几分钟后洗掉甲基丙烯酸甲酯硅油，原来的疏水区域则转为亲水性；此时再将质量体积比为10％的PEGDA(聚乙二醇双丙烯酸酯,分子量1000)、光引发剂2-hydroxy-1-(4-(hydroxyethoxy)phenyl)-2-methyl-1-propanone(Irgacure 2959,Ciba Geigy,0.05％w/v)以及500nM罗丹明15滴加于玻璃基片1上，待附着均匀后用500mW紫外线高于样品50mm照射20秒固化，如图10所示。

用荧光成像对微阵列中同一行相邻的八个液滴在液滴中心的连线的延长线进行检测，结果如图11所示，可以看到，两种成分通过扩散形成了互补的作用效果。

该微阵列芯片可用于研究凝胶微环境之间的相互作用，例如，每一个微凝胶中的信号分子如何扩散，以至调控相邻的微环境，或者每一个微凝胶中的药物缓释，从而影响周围的细胞。

实施例21立体微凝胶阵列芯片

步骤一：以实施例4所述方法加工一片玻璃基片1，亲水区域阵列为41×41，每一个单独的亲水区域直径为400μm，相邻两个亲水区域中心的距离为800μm。

步骤二：将含有10％的PEGDA的细胞a悬液加于第一玻璃基片1上，由于玻璃基片1上的亲疏水性的差异，疏水性区域液滴无法附着，亲水性区域则自动附着形成相应大小和形状的微液滴,然后500mW紫外线高于液滴50mm照射20秒使液滴固化成凝胶微液滴。

步骤三：将含有10％的PEGDA的细胞b悬液滴加于玻璃基片1之上，由于凝胶颗粒为亲水性，其它区域依然保持疏水性，第二层凝胶将形成于第一层凝胶之上，再用同样的方法进行固化后便形成具有两层不同细胞分子的立体凝胶微液滴阵列16，如图12所示。

用荧光成像的方法对凝胶微液滴阵列的侧面进行检测，结果如图13所示，图中的矩形边框宽度为300μm，由于细胞a和细胞b分别用DiI(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)和DiO(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine,4-chlorobenzenesul-fonate salt)进行了染色，可以看到上下两层有分布均匀的荧光，证明该方法可以制备获得z轴方向分布均匀的凝胶微液滴。

实施例22

以所述的相同步骤重复实施例21，区别在于，每一个单独的亲水性微区域阵列大小为直径10μm，以四氧化三铁纳米颗粒的凝胶悬浊液取代细胞a悬液，以凝胶溶液取代细胞b悬液。将立体凝胶微阵列从玻璃基片上取下，获得直径为10μm的盘状凝胶颗粒，且盘状的底端具有磁性纳米颗粒。

实施例23

以所述的相同步骤重复实施例21，区别在于，以药物b溶液替代细胞b悬液，在步骤三之后，再进行步骤四：

将含有10％的PEGDA的细胞b悬液滴加于玻璃基片1之上，第三层凝胶将形成于第二层凝胶之上，再用同样的方法进行固化后便形成具有三层立体凝胶液滴阵列，从底层至顶层的成分分别含有细胞a、药物b和细胞b，该微阵列芯片可同时观察药品对两种细胞的作用效果。

实施例24

以所述的相同步骤重复实施例21，区别在于，在步骤三之后，再进行步骤四：

将含有10％的PEGDA的细胞c悬液滴加于玻璃基片1之上，第三层凝胶将形成于第二层凝胶之上，再用同样的方法进行固化后便形成具有三层立体凝胶液滴阵列，从底层至顶层的成分分别含有细胞a、b和c。

该微阵列芯片可用于组织工程或者药物模型，如在z轴方向分别排列组成不同种类的皮肤细胞，包括上皮细胞、成纤维细胞以及肥大细胞，或者血管细胞，包括血管上皮细胞、纤维细胞和肌肉细胞。

实施例25

以所述的相同步骤重复实施例24，区别在于，在步骤四之后，再将药物a溶液添加于第三层凝胶之上，形成的立体液滴阵列，从底层至顶层的成分分别含有细胞a、药物b、细胞b和药物a，该微阵列芯片可同时观察药品对两种细胞的作用效果，以及两种药物对细胞b的作用效果。

从以上实施例可以证实，我们可以对每一个微凝胶微环境在空间上的组成进行精确控制，不仅可以XY轴方向上定义不同的组分，还能在Z轴方向定义不同的组分。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种微阵列芯片，其特征在于，包括基片，所述基片包括衬底以及图案化的纳米薄层，所述图案化的纳米薄层与所述衬底键合，形成没有纳米薄层的亲水区域和具有纳米薄层的疏水区域，所述亲水区域表面吸附有第一微凝胶；所述微阵列芯片还包括第二凝胶，所述第二凝胶为利用甲基丙烯酸甲酯硅油或等离子体使得所述疏水区域亲水化以后，吸附第二液滴并使其固化后形成，第二液滴包含凝胶因子。

2.如权利要求1所述的微阵列芯片，其特征在于，所述亲水区域表面吸附有N层的微凝胶颗粒，所述N层的微凝胶颗粒分别由第一微凝胶、第二微凝胶至第N微凝胶组成，第i-1微凝胶的上表面吸附有第i微凝胶，且第i微凝胶与第i-1微凝胶包含的组分不同，其中，N为大于等于2的整数，i为2到N的任意整数。