CN105142672B - 经修饰的抗体、抗体-缀合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含GlcNAc‑S(A)x取代基的抗体，其中S(A)x为包含x个官能团A的糖衍生物，其中A独立地选自叠氮基、酮基和炔基以及x为1、2、3或4，其中所述GlcNAc‑S(A)x取代基是通过所述GlcNAc‑S(A)x取代基的N‑乙酰葡糖胺的C1键合至所述抗体，以及其中所述N‑乙酰葡糖胺任选地被岩藻糖基化。本发明还涉及一种抗体‑缀合物，具体来说涉及一种根据式(20)或(20b)的抗体‑缀合物，其中AB为抗体，S为糖或糖衍生物，D为目的分子，以及其中所述N‑乙酰葡糖胺任选地被岩藻糖基化(b为0或1)。本发明还涉及一种制备经修饰的抗体的方法、一种制备抗体‑缀合物的方法以及所述抗体缀合物作为药剂的用途。此外，本发明涉及一种包括叠氮修饰的抗体和接头‑缀合物的组件试剂盒，其中所述接头‑缀合物包含(杂)环炔基和一个或多个目的分子。

Description

经修饰的抗体、抗体-缀合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及经修饰的抗体，特别是用一种或多种叠氮化物、炔烃和/或酮官能团修饰的抗体。本发明的经修饰的抗体可被缀合到目的分子上，以形成抗体-缀合物。所述目的分子可例如是活性物质。因此本发明也涉及抗体-药物缀合物(ADC)。本发明还涉及用于制备本发明的经修饰的抗体的方法以及用于制备本发明的抗体-缀合物的方法。
背景技术
抗体-缀合物，即通过接头缀合到目的分子上的抗体，是本领域已知的。人们对其中所述目的分子是药物(例如，细胞毒性化学物)的抗体-缀合物具有极大的兴趣。抗体-药物-缀合物是本领域已知的，并且由通过合成的接头和细胞毒性化学物共价结合的重组抗体组成(S.C.Alley et al，Curr.Opin.Chem.Biol.2010，14，529-537，以引用的方式纳入)。抗体-药物-缀合物(ADC)(也称为免疫毒素)的主要目的是将针对肿瘤相关的抗原的单克隆抗体的高特异性与“小的”细胞毒性药物(通常为300至1000Da)的药理效力结合。ADC的实例包括吉妥珠单抗-奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)(Mylotarg；和刺孢霉素缀合的抗-CD33mAb，Pfizer/Wyeth)；布妥昔单抗-维多汀(brentuximab vedotin)(SGN-35，Adcetris，由布妥昔单抗组成的靶向CD30的ADC，其和MMAE(单甲基阿里他汀(monomethylauristatin))共价连接，Seattle Genetics)；曲妥珠单抗(trastuzumab)-DM1缀合物(T-DM1)。
本领域的一个进展包括极其有效的毒素的出现，尤其是紫杉烷(taxane)、刺孢霉素(calicheamycin)、美登木素(maytansin)、吡咯并苯并二氮杂卓(pyrrolobenzodiazepine)、多卡米星(duocarmycin)和阿里他汀(auristatin)。这些物质的低的纳摩尔到皮摩尔毒性是相对于较早期施用的毒素的主要改进。另一个重要的技术进展包括使用优化的接头，所述接头在细胞质中是可水解的、对蛋白酶具有抗性或对其敏感、或对和高细胞毒性药物相关的多重耐药外排泵具有抗性。
现有技术中已知的ADC通常是通过将所述接头-毒素分别通过乙酰化或烷基化缀合到抗体氨基酸赖氨酸或半胱氨酸的侧链上来制备。
对于赖氨酸，缀合优选地发生在具有最高的空间可接近性(stericaccessibility)、最低的pKa或其组合的赖氨酸侧链上。该方法的缺点是对缀合的位点控制(site-control)很低。
基于抗体中通常不存在游离的半胱氨酸的事实，通过半胱氨酸的烷基化获得对位点-特异性更好的控制，由此提供了这样的选择：只对那些通过还原步骤被选择性释放的或作为游离的半胱氨酸被特异性地改造进入抗体的半胱氨酸进行烷基化(如在所谓的Thiomabs中)。通过还原进行的选择性的半胱氨酸释放通常是通过用还原剂(例如TCEP或DTT)处理完全抗体来进行，导致二硫键转变成两个游离的巯基(主要在抗体的铰链区)。然后将所释放的巯基用亲电试剂烷基化——通常基于和接头-毒素连接的马来酰亚胺，这通常进行得很快并且具有高度的选择性。关于将额外的(游离的)半胱氨酸改造进入抗体，获得了针对所加入的半胱氨酸的位置的增强的位点控制，并且不需要还原步骤，由此理想地避免了多个二硫键裂解和多个烷基化作用。此外，在此策略中，使用马来酰亚胺化学进行游离半胱氨酸的烷基化，但是不能得到完全的同质性
同时，通过用马来酰亚胺进行烷基化获得的ADC的一个缺点在于由于烷基化的逆转——即逆向-迈克尔反应(retro-Michael reaction)，通常所得的缀合物是不稳定的，由此导致接头-毒素从抗体中释放。基于半胱氨酸-马来酰亚胺烷基化作用的缀合显然不是开发ADC的理想技术，所述ADC优选地不应表现出过早地释放毒素。
本领域已知叠氮化物(N3基团，也称为叠氮基)可与末端炔烃(铜催化的)或与环炔烃(借助环张力)进行选择性环加成。与炔烃反应产生的三唑类对水解或其他降解途径不敏感。本领域还已知酮类可与羟胺类或肼类进行选择性缀合，分别产生肟或腙。肟和腙在中性条件下也是相对惰性的，但是可在更低的pH下进行水解。
将叠氮化物引入蛋白质的几种方法最近已被van Delft et al.,ChemBioChem.2011，12，1309(以引用的方式纳入)综述：(a)化学选择性的重氮转移反应，(b)酶法转化，(c)在营养缺陷型细菌中表达和(D)遗传编码。化学选择性的重氮转移反应(a)对于抗体具有有限的适用性，因为这些通常发生在蛋白质的N-末端，而在抗体中重链和轻链的N-末端都在抗体的结合区中。在营养缺陷型细菌中表达(c)和遗传编码(D)虽然很强大，但是对于非专业的实验室来说是非常复杂的策略，而且不能用于对现有的重组抗体进行直接后修饰，因此通常是不适用的。
关于蛋白质的酶法转化(b)，过去几年已经报道了几种能够使用非天然的含叠氮化物的底物实现这种转化的酶，例如转谷氨酰胺酶、硫辛酸连接酶、转肽酶(sortase)、FGE等(综述参见Bertozzi et al.，Angew.Chem.Int.Ed.2009，48，6974，以引用的方式纳入)。但是，毫无例外地，这些酶需要蛋白质中的特异性识别序列，所述序列需要被特异性地改造，并且缀合可能被限制在蛋白质的末端。
可普遍适用于所有单克隆抗体的潜在的通用策略包括与Fc-连接的聚糖的特异性的酶缀合，所述Fc-连接的聚糖天然存在于哺乳动物(或酵母)细胞培养物中表达的所有抗体上。几种基于该概念的策略是本领域已知的，如通过氧化末端半乳糖或通过将(非天然的)唾液酸转移至相同的半乳糖部分。但是，出于ADC的目的，这样的策略是欠佳的，因为聚糖总是被形成为亚型的复杂的混合物，其可包含不同水平的半乳糖基化(G0、G1、G2)，并因此会提供对药物-抗体比例(DAR，见下文)控制不佳的ADC。
图1示出了在每条重链上包含一个聚糖的抗体。这些聚糖以就半乳糖基化(G0、G1和G2)和岩藻糖基化(G0F、G1F和G2F)而言不同的亚型存在。
在以引用的方式纳入本文的WO 2007/133855(马里兰大学生物技术研究所)中，公开了用于制备同质的糖蛋白或糖肽的化学酶法，其包括包含如下的两阶段策略：首先对接近完整的聚糖树进行修剪(在endo A或endo H的作用下)，只留下核心N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)部分(所谓的GlcNAc-蛋白)，然后进行再糖基化事件(event)，其中在包括内切糖苷酶(ENGase)的催化剂的存在下，低聚糖部分被转移到GlcNAc-蛋白上以产生同质的糖蛋白或糖肽。公开了用于经叠氮化物-官能化的糖蛋白的策略，其中GlcNAc-蛋白在ENGase的存在下与包含两个6-叠氮基甘露糖部分的四糖噁唑啉反应，由此同时在聚糖中引入了两个叠氮化物。然后所述经叠氮化物-官能化的糖蛋白可在催化剂(例如，Cu(I)催化剂)的存在下与含有目的官能部分X的末端炔烃在“点击化学”环化加成反应中进行催化反应。没有公开所述点击化学的实际实例。
在以引用的方式纳入本文的J.Am.Chem.Soc.2008，130，13790中，Wang等人公开了通过铜催化的点击化学将经末端炔烃-修饰的三糖有效双连接至经双-叠氮基修饰的核糖核酸酶B。
在以引用的方式纳入本文的J.Am.Chem.Soc.2012，134，8030中，Davis等人公开了在糖基合酶EndoS的存在下，低聚糖噁唑啉在完整抗体的核心-岩藻糖基化的以及未岩藻糖基化的核心-GlcNAc-Fc结构域上的转移。
在以引用的方式纳入本文的J.Am.Chem.Soc.2012，134，12308中，Wang等人公开了在糖基合酶突变体EndoS-D233A和EndoS-D233Q的存在下，包含两个6-叠氮基甘露糖部分的四糖噁唑啉在完整抗体(利妥昔单抗)的核心-岩藻糖基化的以及未岩藻糖基化的核心-GlcNAc-Fc结构域上的转移。该方法示意性地示于图2中，并产生了包含四个叠氮基的抗体。提到了随后使用点击化学进行所述经叠氮基修饰的IgG的缀合但是没有公开。
但是，在WO 2007/133855，J.Am.Chem.Soc.2012，134，8030和J.Am.Chem.Soc.2012，134，12308中公开的糖基合酶策略的缺点是所需的含叠氮基的低聚糖噁唑啉的较长且复杂的合成。此外，所述含叠氮基的低聚糖噁唑啉包含两个叠氮基。到目前为止，还没有证明此方法是否适用于在抗体聚糖上只引入一个叠氮基。
Qasba等人在以引用的方式纳入本文的J.Biol.Chem.2002，277，20833中公开了突变型半乳糖基转移酶GalT(Y289L)、GalT(Y289I)和GalT(Y289N)可将GalNAc酶法连接至非还原性的GlcNAc糖(β-苄基-GlcNAc)。
以引用的方式纳入本文的WO 2004/063344(国立卫生研究院)公开了突变型半乳糖基转移酶GalT(Y289L)、GalT(Y289I)和GalT(Y289N)。公开了这样一种方法——其中首先通过使用半乳糖苷酶进行处理将复杂的聚糖(如在单克隆抗体(罗美华(Rituxan)、类克(remicade)、赫赛汀(Herceptin))上的那些)转化成抗体上的G0聚糖，以去除所有的链末端的半乳糖。随后使这些G0抗体在GalT(Y289L)的存在下经过GalNAc-UDP，产生具有显著更同质的聚糖结构的抗体。
Qasba等人在以引用的方式纳入本文的Bioconjugate Chem.2009，20，1228中公开了WO 2004/063344中公开的方法也适用于在N-乙酰基上被取代的非天然的GalNAc-UDP变体。经β-半乳糖苷酶处理的具有G0糖形的单克隆抗体在包含C2-取代的叠氮基乙酰胺基部分(GalNAz)的半乳糖部分转移到聚糖的末端GlcNAc残基上之后被完全半乳糖基化为G2糖形，产生了四叠氮基-取代的抗体，即每条重链两个GalNAz部分。该方法示意性地示于图3中。没有公开所述四叠氮基-取代的抗体与目的分子的缀合。还公开了包含C2-取代的酮基(C2-酮基-Gal)的半乳糖部分向G0糖形聚糖的末端GlcNAc残基的转移，以及C2-酮基-Gal与氨氧基生物素的连接。在所有情况下，GalT(Y289L)突变体被用于GalNAc-UDP(或GalNAz-UDP)向抗体的转移，但是没有公开使用突变体GalT(Y289N)或GalT(Y289I)。
在WO 2004/063344和Bioconjugate Chem.2009，20，1228中公开的方法的缺点是四叠氮基-取代的抗体和目的分子的缀合将产生每个聚糖通常带有两个目的分子的抗体-缀合物(假设所述缀合会以完全转化来进行)。在一些情况下，例如当所述目的分子是亲脂性毒素时，每个抗体中太多目的分子的存在是不想要的，因为这可导致聚集体形成(BioProcess International 2006，4，42-43，以引用的方式纳入)。
以引用的方式纳入本文的WO 2007/095506和WO 2008/029281(InvitrogenCorporation)公开了形成糖蛋白缀合物的方法，其中使所述糖蛋白在GalT(Y289L)突变体的存在下与UDP-GalNAz接触，导致GalNAz整合在抗体碳水化合物的末端非还原性的GlcNAc上。然后，随后的使用末端炔烃的铜催化的点击化学或Staudinger连接可被用于将报告分子、固体载体或载体分子缀合到所连接的叠氮化物部分上。WO 2007/095506和WO 2008/029281还公开了如果抗体上不存在末端GlcNAc糖，Endo H、Endo A或Endo M酶可被用于产生截短的以N-乙酰葡糖胺残基封端的链。
本领域中已知的抗体-缀合物通常具有几个缺点。对于抗体药物-缀合物，带有毒素的抗体的载量的一个量度是由药物-抗体比例(DAR)给出，其给出了每个抗体上活性物质分子的平均数量。但是，DAR没有给出关于这种ADC的同质性的任何指示。
用于制备现有技术中已知的抗体-缀合物的方法通常产生DAR在1.5和4之间的产物，但是实际上这样的产物包含带有很多目的分子的抗体-缀合物的混合物，所述目的分子在0个到8个或更多个内变化。换言之，所形成的现有技术中已知的抗体-缀合物的DAR通常具有高的标准偏差。
例如，吉妥珠单抗-奥唑米星是50％的缀合物(0至8个刺孢霉素部分/IgG分子，平均为2或3个，随机连接至抗体的溶剂暴露的赖氨酰残基上)和50％的非缀合的抗体(Brosset al.，Clin.Cancer Res.2001，7，1490；Labrijn et al.，Nat.Biotechnol.200927，767，都以引用的方式纳入)的异质混合物。但是同样地，对于布妥昔单抗-维多汀、T-DM1和临床上的其他ADC，具体多少药物被连接至任何给定的抗体(药物-抗体比例，DAR)仍是不可控制的，所获得的ADC为缀合物的统计学分布。不论每个抗体上最佳药物数目是例如两个、四个或更多个，通过具有窄的标准偏差的位点特异性缀合将其以可预测的数目和可预测的位置进行连接仍然是有问题的。
发明内容
本发明涉及制备经修饰的抗体的方法，所述方法包括使包含核心N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)取代基的抗体在合适的催化剂的存在下与式S(A)x-P的化合物接触，其中所述核心N-乙酰葡糖胺取代基任选地被岩藻糖基化；其中所述催化剂包含突变型的来自半乳糖基转移酶的催化结构域；其中S(A)x是包含x个官能团A的糖衍生物，其中A独立地选自叠氮基、酮基和炔基且x为1、2、3或4；其中P选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)和胞苷二磷酸(CDP)；并且其中经修饰的抗体被定义为包含GlcNAc-S(A)x取代基的抗体，所述GlcNAc-S(A)x取代基通过所述GlcNAc-S(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1键合至抗体。任选地，所述GlcNAc-S(A)x取代基的GlcNAc是被岩藻糖基化的。
本发明也涉及包含GlcNAc-S(A)x取代基的经修饰的抗体，其中GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；其中S(A)x为包含x个官能团A的糖衍生物，其中A选自叠氮基、酮基和炔基且x为1、2、3或4；其中所述GlcNAc-S(A)x取代基通过所述GlcNAc-S(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1键合至抗体，并且其中所述N-乙酰葡糖胺任选地被岩藻糖基化。
本发明也涉及制备抗体-缀合物的方法，所述方法包括将本发明的经修饰的抗体与接头-缀合物反应，其中所述接头-缀合物包含官能团B和一个或多个目的分子，其中所述官能团B是能够与所述经修饰的抗体上的GlcNAc-S(A)x取代基的官能团A反应的官能团。
另外，本发明涉及制备抗体-缀合物的方法，所述方法包括将本发明的经修饰的抗体与接头-缀合物反应，其中所述接头-缀合物包含(杂)环炔基或末端炔基以及一种或多种目的分子。
本发明还涉及通过用于制备本发明的抗体-缀合物的方法可获得的抗体-缀合物。
本发明的经修饰的抗体、抗体-缀合物及其制备方法与本领域中已知的方法、经修饰的抗体和抗体-缀合物相比具有若干优势。
如上所述，已知的用于将接头-毒素实体缀合至抗体的方法在位点-特异性和化学计量的控制方面仍需要改进。尽管ADC具有导向其靶标的能力，估计进入肿瘤细胞的药物的量通常小于给药剂量的2％。此问题被本领域中已知的ADC的不可预测的缀合结果放大。重要的是避免过少缀合(underconjugated)的抗体——其降低了效力，以及高度缀合的种类——其可能具有显著降低的循环半衰期、与靶蛋白的减弱的结合、以及增加的毒性。
对于抗体-药物缀合物，抗体上目的分子(例如药物，活性物质)的载量的量度为所谓的药物与抗体比例(DAR)，其给出了根据统计分布计算的每个抗体上活性物质分子的平均数量。特定类型的ADC的理论最大值等于锚定位点的数目。如上所述，现有技术中已知的制备ADC的方法通常产生包含每个抗体-缀合物上存在不同数量的目的分子的抗体-缀合物的混合物的产物，以及具有高标准偏差的DAR。
本发明的经修饰的抗体和抗体-缀合物的优点之一在于这些抗体和抗体-缀合物在位点-特异性和化学计量方面都是同质的。所述经修饰的抗体和抗体-缀合物以非常接近理论值且具有非常低的标准偏差的DAR得到。这也意指本发明的抗体-缀合物产生了更一致的产物用于临床前测试。
在一个优选的实施方案中，本发明的经修饰的抗体和抗体-缀合物在位点-特异性和化学计量方面都是同质的。在本文中，当缀合仅在预定位点以预定的药物-抗体比例进行时，认为抗体或抗体-缀合物是同质的。当抗体的缀合在抗体的不同位点进行时，抗体-缀合物是异质的，产生了具有不可预测的药物-抗体比例的产物的混合物。在后一种情况下，所述药物-抗体比例是整个抗体-药物缀合物组的平均值。
在另一个优选的实施方案中，所述本发明的抗体-缀合物的DAR在其理论值的10％以内。
本发明的方法和抗体的另一个优点涉及减少生产过程中的浪费，由此增强了公司的成本管理(cost-of-goods)。
此外，通过环加成反应，将本发明的经叠氮化物-修饰的抗体偶联到包含炔基的接头-缀合物上时，或将本发明的经炔烃-修饰的抗体偶联到包含叠氮化物部分的接头-缀合物上时，所得到的三唑类不易受到水解或其他降解途径的影响。当将本发明的经酮类-修饰的抗体偶联到包含羟胺或肼类的接头-缀合物上时，所得到的肟或腙在中性条件下也是相对惰性的。
因此，其他优点是本发明的抗体-缀合物的稳定性，以及将叠氮基、酮基或炔基引入至抗体的直接且普遍适用的方法。
如上所述，如图3中所示，在突变型半乳糖基转移酶Y289L的存在下，非天然糖与和抗体连接的低聚聚糖的末端GlcNAc的酶缀合是本领域已知的。
但是，到目前为止，还未证明本领域中已知的突变型半乳糖基转移酶适用于糖核苷酸或糖衍生物核苷酸向抗体上的核心-GlcNAc-取代基的转移，以及这种策略适用于抗体-缀合物的产生。在现有技术中已知的方法中，糖核苷酸或糖衍生物核苷酸被转移到和抗体键合的低聚糖或多糖聚糖的末端GlcNAc上。
此外，到目前为止，还未证明本领域中已知的突变型半乳糖基转移酶适用于糖核苷酸或糖衍生物核苷酸向内糖(internal sugar)和糖衍生物的转移。使用本发明的方法，现在可将包含官能团(如一个或多个叠氮基、酮基和/或炔基)的糖衍生物转移到存在于抗体上的核心-GlcNAc取代基上，而不管所述GlcNAc是否是岩藻糖基化的。有利地，因此，在本发明的方法之前去除岩藻糖不是必须的，因为包含核心-GlcNAc和核心-GlcNAc(Fuc)取代基的抗体混合物可用于本方法。
附图说明
图1显示了抗体聚糖G2F、G1F、G0F、G2、G1和G0的不同糖形。
图2显示了在突变型EndoS-D233A的存在下将包含两个叠氮基的四糖转移到核心-GlcNAc取代基上的方法，产生了包含四个叠氮基的经修饰的抗体，如J.Am.Chem.Soc.2012，134，12308所公开。
图3显示了将GalNAz转移至抗体聚糖的末端GlcNAc残基的方法，产生了包含四个叠氮基的经修饰的抗体，如Bioconjugate Chem.2009，20，1228所公开。
图4显示了制备经叠氮化物修饰的抗体的方法的优选实施方案，其中在GalTY289L催化剂的存在下，包含核心-GlcNAc取代基的任选取代的抗体与GalNAz-UDP反应。
图5显示了在Endo S催化剂的存在下各糖形的混合物的去糖基化。
图6显示了制备抗体-缀合物的方法的一个优选方案，其中经叠氮化物-修饰的抗体缀合至包含一个或多个目的分子的接头-缀合物。
图7显示了合成不可切割的接头BCN-多柔比星缀合物28a和28b的反应方案。
图8显示了合成DIBAC-生物素缀合物30的反应方案。
图9显示了从Fmoc-瓜氨酸31开始合成可切割的接头BCN-vc-PABA-多柔比星缀合物33的反应方案。
图10a显示了可切割的BCN-缀合物向vc-PABA-MMAE(37a)、vc-PABA-MMAF(37b)、不可切割的BCN-MMAF缀合物(38)、可切割的BCN-vc-PABA-美登木素生物碱(maytansinoid)缀合物(38)和马来酰亚胺-vc-PABA-美登木素生物碱缀合物(40)的合成的反应方案。
图10b显示了不可切割的BCN-MMAF缀合物57的结构。
图11显示了合成可切割的DIBAC-vc-PABA-MMAF 41的反应方案。
图12显示了合成三种环辛炔-多柔比星缀合物42-44的反应方案。
图13显示了三种官能化的生物素化的试剂45-47的结构。
图14显示了合成2-修饰的UDP-GalNAc衍生物52-54的反应方案以及6-叠氮基修饰的UDP-Gal(55)和UDP-GalNAc(56)的结构。
图15显示了(A)曲妥珠单抗、(B)在用endo S修剪后的曲妥珠单抗、(C)与UDP-GalNAz 52进行半乳糖基转移酶处理之后的以及(D)在与BCN-MMAF 37b缀合之后的MS图。
图16显示了混合血浆IgG(A)、用endo S修剪后的(B)以及与UDP-GalNAz 52进行半乳糖基转移酶处理之后(C)的MS图。
图17显示了进行endo S-修剪，然后与UDP-GalNAz 52进行半乳糖基转移酶处理，最后通过铜催化与炔烃-生物素45进行缀合后的MS图。
图18显示了进行endo S-修剪的曲妥珠单抗(A)与UDP-GalNAc 53进行半乳糖基转移酶处理之后的MS图以及(B)与叠氮基-生物素46进行铜催化的缀合之后的MS图，产生了50％的转化。
图19显示了endo S-修剪的曲妥珠单抗(A)与UDP-GalNLev 55进行半乳糖基转移酶处理后的MS图和(B)在与羟胺-生物素47的肟缀合之后的MS图。
图20显示了曲妥珠单抗(泳道1和5)、在修剪的和与UDP-GalNAz 52进行半乳糖基转移酶处理后的曲妥珠单抗(泳道2和6)、通过用BCN-生物素25处理trast(GalNAz)2得到的曲妥珠单抗缀合物(泳道3和7)以及通过在Cu(I)-催化的点击反应中用炔烃-生物素45对trast(GalNAz)2进行处理得到的曲妥珠单抗缀合物(泳道4和8)在还原条件下(泳道1-4)和非还原条件下(泳道5-8)的SDS-PAGE。泳道4和8中的几个条带表示由于铜催化的点击缀合而形成了共价的和/或还原的片段形式，以及聚集体的形式，而其在泳道3和7中张力引发的缀合中全部不存在。
图21显示了源自曲妥珠单抗(GalNAz)2和BCN-MMAF 37b的曲妥珠单抗(MMAF)2缀合物的尺寸排阻色谱图。
图22显示了在IgG-耗尽的人血浆中源自28a的曲妥珠单抗(多柔比星)2的时间依赖性MS图。
图23显示了未处理的或经过5次冻融循环的不同mAb或ADC的聚集水平。
图24显示了一系列ADC对SK-BR-3细胞系的体外细胞毒性。
图25显示了一系列ADC对SK-OV-3细胞系的体外细胞毒性。
图26显示了一系列ADC对MDA-MB-231细胞系(对照)的体外细胞毒性。
图27显示了111In-标记的源自37b的曲妥珠单抗(MMAF)2、源自39的曲妥珠单抗(美登木素生物碱)2、去糖基化的曲妥珠单抗(通过对曲妥珠单抗的endo S修剪得到)和天然的曲妥珠单抗的血液清除率。
图28显示了111In-标记的源自37b的曲妥珠单抗(MMAF)2、源自39的曲妥珠单抗(美登木素生物碱)2、去糖基化的曲妥珠单抗(通过对曲妥珠单抗的endo S修剪得到)和天然的曲妥珠单抗的生物分布。给小鼠注射25μg并在注射后21天解剖。组织吸收表示为％ID/g。
图29显示了小鼠异种移植物模型的体内功效。评估的ADC为N297缀合至vc-美登木素生物碱的曲妥珠单抗(3mg/kg和9mg/kg)，并且与T-DM1(9mg/kg)进行比较。通过在雌性SHO小鼠中皮下植入肿瘤代码(tumor code)(HBx-13B)，来选择癌症患者来源的异种移植物(PDX)模型。在第0天、第4天、第7天、第11天和第14天测量肿瘤。
图30显示了小鼠异种移植物模型的体内功效。评估的ADC为N297缀合至vc-美登木素生物碱的曲妥珠单抗(3mg/kg和9mg/kg)、N297缀合至vc-MMAF的曲妥珠单抗(3mg/kg和9mg/kg)，并且与T-DM1(9mg/kg)进行比较。通过在雌性SHO小鼠中皮下植入肿瘤代码(HBx-13B)，来选择癌症患者来源的异种移植物(PDX)模型。对于vc-美登木素生物碱ADC和T-DM1在第0、4、7、11、14、18和21天测量肿瘤，对于载体在0、3、7和10天测量肿瘤。
图31显示了使用nanoLC联合超高分辨率的QTOF MS(maXis 4G)(nanoLC-MS)对(A)天然曲妥珠单抗、(B)trast(GalNAz)2、(C)与BCN-生物素25缀合后的trast(GalNAz)2和(D)与炔烃-生物素45进行铜催化缀合后的trast(GalNAz)2的轻链(LC)进行的完整蛋白质种类的详细质谱分析。然而(A)-(C)的基峰是相同的，在铜催化剂下形成的曲妥珠单抗缀合物(D)在23441.5处显示了一个清晰的肩峰，以及另一个肩峰在23459.5处，这表明形成了显著量(>20％)的氧化的和/或脱酰胺基的副产物。
具体实施方式
定义
在本说明书和权利要求书中使用的动词“包含”及其变化形式以其非限制性的意义使用，以意指包括该词之后的项，但不排除未具体提及的项。
此外，用不定冠词“一”或“一个”提及元素时不排除存在超过一个所述元素的可能性，除非上下文明确要求有且只有一个元素。因此，不定冠词“一”或“一个”通常意指“至少一个”。
本说明书和权利要求书中所公开的化合物可包含一个或多个不对称中心，并且可存在所述化合物的不同的非对映异构体和/或对映异构体。除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括所有的非对映异构体及其混合物。此外，除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括单独的对映异构体，以及对映异构体的任何混合物、外消旋体或其他形式。当一种化合物的结构被描述为具体的对映异构体时，应理解，本申请的发明不限于该具体的对映异构体。
所述化合物可以不同的互变异构的形式存在。除非另有说明，本发明的化合物意指包括所有的互变异构形式。当化合物的结构被描述为具体的互变异构体时，应理解，本申请的发明不限于该具体的互变异构体。
本说明书和权利要求书中所公开的化合物还可以外型(exo)和内型(endo)非对映异构体存在。除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括化合物的单独的外型和单独的内型非对映异构体，以及其混合物。当化合物的结构被描述为具体的内型或外型非对映异构体时，应理解，本申请的发明不限于该具体的内型或外型非对映异构体。
此外，本说明书和权利要求书中所公开的化合物可以顺式和反式异构体存在。除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括化合物的单独的顺式异构体和单独的反式异构体，以及其混合物。例如，当化合物的结构被描述为顺式异构体时，应理解，相应的反式异构体或顺式和反式异构体的混合物未被排除在本申请的发明之外。当化合物的结构被描述为具体的顺式或反式异构体时，应理解，本申请的发明不限于该具体的顺式或反式异构体。
本说明书和权利要求书中所公开的化合物还可以位置异构体存在。除非另有说明，对本说明书和权利要求书中任何化合物的描述意指包括化合物的位置异构体以及其混合物。当化合物的结构被描述为具体的位置异构体时，应理解，本申请的发明不限于该具体的位置异构体。
未取代的烷基具有通式CnH2n+1并且可以是直链或支链的。未取代的烷基也可包含环状部分，并因此具有伴随的通式CnH2n-1。任选地，所述烷基被一个或多个在本文中进一步指定的取代基取代。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、2-丙基、叔丁基、1-己基、1-十二烷基等。
芳基包含六至十二个碳原子并可包括单环和双环结构。任选地，所述芳基可被一个或多个在本文中进一步指定的取代基取代。芳基的实例为苯基和萘基。
杂芳基包含五至十二个碳原子，其中一至四个碳原子被选自氧、氮、磷和硫的杂原子取代。杂芳基可具有单环结构或双环结构。任选地，所述杂芳基可被一个或多个在本文中进一步指定的取代基取代。合适的杂芳基的实例包括吡啶基、喹啉基、嘧啶基、吡嗪基、吡唑基、吡咯基、呋喃基、苯并呋喃基、吲哚基、嘌呤基、苯丙噁唑基、噻吩基、磷唑基(phospholyl)和噁唑基。
芳基烷基和烷基芳基包含至少七个碳原子并且可包括单环和双环结构。任选地，所述芳基烷基和烷基芳基可被一个或多个在本文中进一步指定的取代基取代。芳基烷基为例如苄基。烷基芳基为例如4-叔丁基苯基。
炔基包含一个或多个碳碳三键。包含一个三键的未取代的炔基具有通式CnH2n-3。末端炔基是其中所述三键位于炔基的末端位置的炔基。任选地，所述炔基被一个或多个在本文中进一步指定的取代基取代，和/或被选自氧、氮和硫的杂原子间断。炔基的实例包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、辛炔基等。
环炔基是环状的炔基。包含一个三键的未取代的环炔基具有通式CnH2n-5。任选地，环炔基被一个或多个在本文中进一步指定的取代基取代。环炔基的实例为环辛炔基。
杂环炔基是被选自氧、氮和硫的杂原子间断的环炔基。任选地，杂环炔基被一个或多个在本文中进一步指定的取代基取代。杂环炔基的实例为氮杂环辛炔基(azacyclooctynyl)。
(杂)芳基包括芳基和杂芳基。烷基(杂)芳基包括烷基芳基和烷基杂芳基。(杂)芳基烷基包括芳基烷基和杂芳基烷基。(杂)炔基包括炔基和杂炔基。(杂)环炔基包括环炔基和杂环炔基。
(杂)环炔烃化合物在本文被定义为包含(杂)环炔基的化合物。
本说明书和权利要求中所公开的化合物中的几种可被描述为稠合的(杂)环炔烃化合物，即(杂)环炔烃化合物，其中第二环结构被稠合，即被增环至(杂)环炔基。例如在稠合的(杂)环辛炔化合物中，环烷基(例如环丙基)或芳烃(例如苯)可被增环至(杂)环辛炔基。所述稠合的(杂)环辛炔化合物中的(杂)环辛炔基的三键可位于三个可能位置中的任一个，即位于环辛炔部分的第2、3或4位(根据“IUPAC有机化学命名法”，A31.2条进行编号)。对本说明书和权利要求书中的任何稠合的(杂)环辛炔的描述意指包括所述环辛炔部分的所有三个单独的位置异构体。
当烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基、(杂)芳基烷基、(杂)环炔基被任选地取代时，所述基团独立地且任选地被一个或多个取代基取代，所述一个或多个取代基独立地选自C1–C12烷基、C2–C12烯基、C2–C12炔基、C3–C12环烷基、C1–C12烷氧基、C2–C12烯氧基、C2–C12炔氧基、C3–C12环烷氧基、卤素、氨基、氧代基和甲硅烷基，其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和环烷氧基被任选地取代，所述烷基、烷氧基、环烷基和环烷氧基任选地被多个选自O、N和S的杂原子中的一个间断，其中甲硅烷基由式(R6)3Si-表示，其中R6独立地选自C1–C12烷基、C2–C12烯基、C2–C12炔基、C3–C12环烷基、C1–C12烷氧基、C2–C12烯氧基、C2–C12炔氧基和C3–C12环氧烷基，其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和环烷氧基被任选地取代，所述烷基、烷氧基、环烷基和环烷氧基任选地被多个选自O、N和S的杂原子中的一个间断。
抗体是由免疫系统产生的蛋白质，其能够识别并结合特异性抗原。术语抗体在本文是以其最广泛的意义使用并具体包括单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段以及双链和单链抗体。术语“抗体”在本文也意指包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和特异性结合癌抗原的抗体。术语“抗体”意指包括完全抗体，以及抗体片段，例如来自经裂解的抗体的Fab片段、F(ab’)2、Fv片段或Fc片段，scFv-Fc片段，小抗体，双特异性抗体(diabody)或scFv。此外，所述术语包括抗体的遗传改造的衍生物。抗体、抗体片段和经遗传改造的抗体可通过本领域已知的方法得到。合适的市售抗体包括，阿昔单抗(abciximab)、利妥昔单抗(rituximab)、巴利昔单抗(basiliximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、阿达木单抗(adalimumab)、托西莫单抗-I131(tositumomab-I131)、西妥昔单抗(cetuximab)、替伊莫单抗(ibrituximab tiuxetan)、奥马佐单抗(omalizumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、帕木单抗(panitumumab)、依库珠单抗(eculizumab)、培化舍珠单抗(certolizumab pegol)、戈利木单抗(golimumab)、卡那奴单抗(canakinumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、乌司奴单抗(ustekinumab)、托珠单抗(tocilizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、地舒单抗(denosumab)、贝利木单抗(belimumab)、伊匹木单抗(ipilimumab)和布妥昔单抗(brentuximab)。
本文使用的一般术语“糖”指示单糖，例如葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)和岩藻糖(Fuc)。本文使用的术语“糖衍生物”表示单糖的衍生物，即包含取代基和/或官能团的单糖。糖衍生物的实例包括氨基糖和糖酸，例如葡糖胺(GlcN)、半乳糖胺(GalN)N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰神经氨酸(NeuNAc)和N-乙酰胞壁酸(MurNAc)、葡糖醛酸(GlcA)和艾杜糖醛酸(IdoA)。糖衍生物的实例也包括本文表示为S(A)x的化合物，其中S为糖或糖衍生物，并且其中S包括x个官能团A。
核心-N-乙酰葡糖胺取代基(核心-GlcNAc取代基)在本文被定义为通过C1键合至抗体的GlcNAc，优选通过和抗体的天冬酰胺氨基酸的侧链上的酰胺氮原子的N-糖苷键。所述核心-GlcNAc取代基可存在于抗体的天然糖基化位点处，但其也可被引入到抗体的不同位点上。在本文，核心-N-乙酰葡糖胺取代基为单糖取代基，或(如果所述核心-GlcNAc取代基被岩藻糖基化)二糖核心-(Fucα1-6)GlcNAc取代基——也称为GlcNAc(Fuc)。在本文，“核心-GlcNAc取代基”不会与“核心-GlcNAc”混淆。核心-GlcNAc在本文被定义为内部GlcNAc——其为包括两种以上的糖的多聚糖或低聚糖的一部分，即通过其多聚糖或低聚糖被键合至抗体的GlcNAc。
因此，如本文所定义的包含核心-N-乙酰葡糖胺取代基的抗体为这样的抗体——即其包含如上定义的单糖核心-GlcNAc取代基，或者(如果所述核心-GlcNAc取代基被岩藻糖基化)二糖核心-GlcNAc(Fuc)取代基。
如果GlcNAc-S(A)x取代基中的核心-GlcNAc取代基或GlcNAc被岩藻糖基化，岩藻糖最普遍是通过α-1,6连接至核心-GlcNAc取代基的C6。岩藻糖基化的核心-GlcNAc取代基是指核心-GlcNAc(Fuc)，岩藻糖基化的GlcNAc-S(A)x取代基是指GlcNAc(Fuc)-S(A)x。
术语“治疗”("treatment"、"treating"等)是指获得所需的药理和/或生理效果。该效果在完全地或部分地预防疾病或其症状方面可能是预防性的，和/或在疾病和/或由该疾病引起的副作用的部分或完全治愈方面可能是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖对哺乳动物(尤其是人)中的疾病的任何治疗，并包括预防疾病在受试者中发生，所述受试者可能易感染疾病但是还未被诊断出患有此病；抑制疾病，即阻止其发展；缓解疾病，即引起疾病的消退。
制备经修饰的抗体的方法
本发明涉及制备经修饰的抗体的方法，包括使一种包含核心N-乙酰葡糖胺取代基(核心-GlcNAc取代基)的抗体与式S(A)x-P的化合物在合适的催化剂的存在下接触，其中所述核心-GlcNAc取代基为任选地被岩藻糖基化的；其中所述催化剂包含来自半乳糖基转移酶的突变型催化结构域；其中S(A)x为包含x个官能团A的糖衍生物，其中A独立地选自叠氮基、酮基和炔基，x为1、2、3或4；其中P选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)和胞苷二磷酸(CDP)；且其中经修饰的抗体被定义为包含GlcNAc-S(A)x取代基的抗体，所述GlcNAc-S(A)x取代基通过所述GlcNAc-S(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1与该抗体键合。
在一个优选实施方案中，包含核心-N-乙酰葡糖胺取代基(核心-GlcNAc取代基)的抗体为单克隆抗体(mAb)。优选地，所述抗体选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体。更优选地，所述抗体为IgG抗体，最优选地，所述抗体为IgG1抗体。当所述抗体为完全抗体(wholeantibody)时，该抗体优选地在每条重链上包含一个或更多、更优选一个核心-GlcNAc取代基，所述核心-GlcNAc取代基为任选地被岩藻糖基化的。因此，所述完全抗体优选地包含两个或更多、优选两个任选地被岩藻糖基化的核心-GlcNAc取代基。当所述抗体为单链抗体或抗体片段时，例如Fab片段，所述抗体优选地包含一个或更多的核心-GlcNAc取代基，其是任选地被岩藻糖基化的。
在包含核心-GlcNAc取代基(即所述方法的起始材料)的抗体中，所述核心-GlcNAc取代基可被置于该抗体上的任何位置，只要所述取代基不阻挡该抗体的抗原结合位点。在一个实施方案中，所述核心-GlcNAc取代基位于该抗体的Fc片段中，更优选CH2结构域中。在另一实施方案中，所述核心-GlcNAc取代基位于该抗体的Fab片段上。
在一个实施方案中，包含核心-GlcNAc取代基的抗体——其中所述核心-GlcNAc取代基为任选地被岩藻糖基化的——为式(1)的抗体，其中AB代表抗体，GlcNAc为N-乙酰葡糖胺，Fuc为岩藻糖，b为0或1，y为1至20。
在一个优选实施方案中，y为1至10，更优选y为1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选y为1、2、3或4，最优选地y为1或2。
方案1示出了根据本发明的方法的一个实施方案，其中该方法的起始物质为包含一个任选地被岩藻糖基化的核心-GlcNAc取代基的抗体(1a，y为1)；和另一个实施方案，其中所述起始材料为包含两个任选地被岩藻糖基化的核心-GlcNAc取代基的抗体(1b，y为2)，其中AB代表抗体，其中b为0或1。S(A)x和P如上定义。
对抗体(1a)的修饰产生了包含一个GlcNAc-S(A)x取代基(2)的经修饰的抗体，对抗体(1b)的修饰产生了包含两个GlcNAc-S(A)x取代基(3)的经修饰的抗体。
用于根据本发明的方法的几个合适的催化剂是本领域已知的。用于具体方法的合适的催化剂为一种催化剂，因为在该具体方法中所述具体糖衍生物核苷酸S(A)x-P为底物。优选地，所述催化剂选自半乳糖基转移酶，更优选地，选自β(1,4)-半乳糖基转移酶或α(1,3)-N-半乳糖基转移酶，甚至更优选地，选自包含突变型催化结构域的β(1,4)-半乳糖基转移酶或α(1,3)-N-半乳糖基转移酶。
合适的催化剂为例如包含来自β(1,4)-半乳糖基转移酶I的突变型催化结构域的催化剂。本文中，催化结构域指折叠成结构域的氨基酸片段，所述结构域能够在根据本发明的具体方法中催化具体糖衍生物核苷酸S(A)x-P与核心-GlcNAc取代基的连接。催化结构域可具有在野生型酶中发现的氨基酸序列，或具有不同于野生型序列的氨基酸序列。本文中，具有不同于野生型序列的氨基酸序列的催化结构域被称为突变型催化结构域。所述突变可例如不仅包括单个氨基酸变化(点突变)，还包括多个氨基酸变化(例如1至10个，优选1至6个，更优选1、2、3、4个，甚至更优选1或2个氨基酸)，或一个或以上的氨基酸(例如1至10个，优选1至6个，更优选1、2、3、4个，甚至更优选1或2个)的缺失或插入。所述突变型催化结构域可存在于全长酶例如β(1,4)-半乳糖基转移酶I酶中，也可存在于例如多肽片段或包含所述突变型催化结构域的重组多肽中，任选地连接至其他的氨基酸。
本文中，β(1,4)-半乳糖基转移酶I也被称为GalT。这样的突变型GalT催化结构域例如公开于WO 2004/063344(美国国立卫生研究院)，其以引用的方式纳入本文。WO 2004/063344公开了GalT的Tyr-289突变，其被称为Y289L、Y289N和Y289I。制备所述突变型催化结构域Y289L、Y289N和Y289I的方法详细公开于WO 2004/063344，第34页，l.6–第36页，l.2，其以引用的方式纳入本文。
催化葡萄糖-β(1,4)-N-乙酰葡糖胺键形成的突变型GalT结构域公开于WO 2004/063344，第10页，l.25-第12页，l.4(其以引用的方式纳入本文)。催化N-乙酰基半乳糖胺-β(1,4)-N-乙酰葡糖胺键形成的突变型GalT结构域公开于WO 2004/063344，第12页，l.6-第13页，l.2(其以引用的方式纳入本文)。催化N-乙酰葡糖胺-β(1,4)-N-乙酰葡糖胺键和甘露糖-β(1,4)-N-乙酰葡糖胺键形成的突变型GalT结构域公开于WO 2004/063344，第12页，l.19-第14页，l.6(其以引用的方式纳入本文)。所述公开的突变型GalT结构域可被包含于全长GalT酶中，或包含于包含所述催化结构域的重组分子中，如WO 2004/063344，第14页，l,31–第16页，l.28中所公开的，其以引用的方式纳入本文。
另一个突变型GalT结构域为例如Y284L，由Bojarová et al.,Glycobiology2009,19,509公开，其以引用的方式纳入本文。在284位处的突变涉及酪氨酸残基。
另一个突变型GalT结构域为例如R228K，由Qasba et al.,Glycobiology 2002,12,691中公开，其以引用的方式纳入本文，其中Arg228被赖氨酸取代。
在一个制备根据本发明的经修饰的抗体的方法的优选实施方案中，所述催化剂为包含来自β(1,4)-半乳糖基转移酶(优选牛β(1,4)-半乳糖基转移酶)的突变型催化结构域的催化剂。在又一优选实施方案中，所述催化剂为包含GalT突变型催化结构域的催化剂，所述GalT突变型催化结构域选自Y289L、Y289N、Y289I、Y284L和R228K，优选Y289L。在一个具体实施方案中，所述催化剂为包含来自β(1,4)-半乳糖基转移酶的突变型催化结构域的催化剂，优选地选自GalT Y289L、GalT Y289N和GalT Y289I，更优选GalT Y289L或GalT Y289N，最优选GalT Y289L。
在另一个实施方案中，所述催化剂为包含来自牛β(1,4)-半乳糖基转移酶的突变型催化结构域的催化剂，选自GalT Y289F、GalT Y289M、GalT Y289V、GalT Y289G、GalTY289I和GalT Y289A，优选地选自GalT Y289F和GalT Y289M。GalT Y289F、GalT Y289M、GalTY289V、GalT Y289G、GalT Y289I和GalT Y289A可以通过定点诱变方法提供，以类似于WO2004/063344中、Qasba et al.,Prot.Expr.Pur.2003，30，219中和Qasba et al.,J.Biol.Chem.2002,277,20833(其全部以引用的方式纳入)中公开的关于Y289L、Y289N和Y289I的方法进行。在GalT Y289F中，289位的酪氨酸(Y)被苯丙氨酸(F)取代，GalT Y289M中该酪氨酸被甲硫氨酸(M)取代，GalT Y289V中被缬氨酸(V)取代，GalT Y289G中被甘氨酸(G)取代，GalT Y289I中被异亮氨酸(I)取代，Y289A中被丙氨酸(A)取代。
另一类型合适的催化剂为基于α(1,3)-N-半乳糖基转移酶(也被称为a3Gal-T)的催化剂，优选α(1,3)-N-乙酰半乳糖胺基转移酶(也被称为3GalNAc-T)，如WO 2009/025646中所公开的，其以引用的方式纳入本文。a3Gal-T的突变可拓宽该酶的供体特异性，并使之成为a3GalNAc-T。a3GalNAc-T的突变可拓宽酶的供体特异性。α(1,3)-N-乙酰半乳糖胺基转移酶的多肽片段和催化结构域公开于WO 2009/025646，第26页，l.18–第47页，l.15和第77页，l.21–82页，l.4(其皆以引用的方式纳入本文)。
在一个实施方案中，所述催化剂为野生型半乳糖基转移酶，更优选野生型β(1,4)-半乳糖基转移酶或野生型β(1,3)-N-半乳糖基转移酶，甚至更优选野生型β(1,4)-半乳糖基转移酶I。本文中，β(1,4)-半乳糖基转移酶也被称为GalT。甚至更优选地，所述β(1,4)-半乳糖基转移酶选自牛β(1,4)-Gal-T1、人β(1,4)-Gal-T1、人β(1,4)-Gal-T2、人β(1,4)-Gal-T3和人β(1,4)-Gal-T4。甚至更优选地，所述β(1,4)-半乳糖基转移酶为β(1,4)-Gal-T1。当所述催化剂为野生型β(1,3)-N-半乳糖基转移酶时，优选人β(1,3)-Gal-T5。
当糖衍生物S(A)x中的官能团A存在于所述糖衍生物的C2或C6位，优选C6位时，特别优选其中催化剂为野生型半乳糖基转移酶的实施方案。在此实施方案中，还优选的是Su(A)x包含一个官能团A，即优选x为1。以下更详细地描述P、Su(A)x和Su(A)x-P。
因此，本发明还涉及制备经修饰的糖蛋白的方法，该方法包括：使包含核心N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)取代基的抗体与式S(A)x-P的化合物在合适的催化剂的存在下接触，其中所述催化剂为野生型半乳糖基转移酶；其中S(A)x是包含x个官能团A的糖衍生物，其中A独立地选自叠氮基、酮基和炔基且其中x为1；其中P选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)和胞苷二磷酸(CDP)；且其中经修饰的抗体被定义为包含GlcNAc-S(A)x取代基的抗体，所述GlcNAc-S(A)x取代基通过所述GlcNAc-S(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1键合至该抗体。
制备根据本发明的经修饰的抗体的方法优选地是在合适的缓冲溶液中进行，例如磷酸盐、缓冲盐水(例如，磷酸盐-缓冲盐水、tris-缓冲盐水)、柠檬酸盐、HEPES、tris和甘氨酸。合适的缓冲液是本领域已知的。优选地，所述缓冲溶液为磷酸盐-缓冲盐水(PBS)或tris缓冲液。
该方法优选地是在约4至约50℃的温度范围内实施，更优选在约10至约45℃的范围内，甚至更优选在约20至约40℃的范围内，最优选在约30至约37℃的范围内。
该方法优选地是在约5至约9的pH范围内实施，优选在约5.5至约8.5的范围内，更优选在约6至约8的范围内。最优选地，该方法是在约7至约8的pH范围内实施。
在根据本发明的方法中，可使用抗体混合物作为起始抗体，所述混合物包括：包含一个或以上核心-GlcNAc取代基和/或一个或以上核心-GlcNAc(Fuc)取代基的抗体。例如，当所述起始抗体混合物包括在每条重链上带有一个任选地被岩藻糖基化的核心-GlcNAc取代基的完全抗体时，所述完全抗体可包含两个核心-GlcNAc取代基，或两个核心-GlcNAc(Fuc)取代基，或一个核心-GlcNAc取代基和一个核心-GlcNAc(Fuc)取代基。
单糖核心-GlcNAc取代基中的GlcNAc处于末端位置，而二糖核心-GlcNAc(Fuc)取代基中的GlcNAc处于内部位置，通过C1键合至所述抗体并通过C6键合至Fuc。因此，如上所述，所述半乳糖基转移酶突变型酶催化剂同样能够识别内糖和糖衍生物作为受体，在根据本发明的方法中糖衍生物S(A)x被连接至核心-GlcNAc取代基，不论所述GlcNAc是否是岩藻糖基化的。因此，有利地，在进行根据本发明的方法之前去除岩藻糖不是必须的，因为可以在该方法中使用包括核心-GlcNAc和核心-GlcNAc(Fuc)取代基的抗体混合物。然而，如果需要，可以在进行根据本发明的方法前从任何核心-GlcNAc(Fuc)取代基中去除岩藻糖，例如，如本技术领域中已知的，在α-岩藻糖苷酶的存在下通过去岩藻糖基化(defucosylation)进行。
S(A)x被定义为包含x个官能团A的糖衍生物，其中A独立地选自叠氮基、酮基和炔基，且其中x为1、2、3或4。
叠氮基为叠氮化物官能团-N3。酮基为-[C(R7)2]oC(O)R6基团，其中R6为甲基或任选地取代的C2-C24烷基，R7独立地选自氢、卤素和R6，以及o为0-24，优选0-10，更优选0、1、2、3、4、5或6。优选地，R7为氢。炔基优选地为如上定义的末端炔基或(杂)环炔基。在一个实施方案中，所述炔基为-[C(R7)2]oC≡C-R7基团，其中R7和o为如上定义的；R7优选地为氢。
糖衍生物S(A)x可包含一个或更多的官能团A。当S(A)x包含两个或更多的官能团A时，独立地选择每个官能团A，即一个S(A)x可包含不同的官能团A，例如叠氮基和酮基等。在一个优选实施方案中，x为1或2，更优选地x为1。在另一个优选的实施方案中，官能团A为叠氮基或酮基，更优选叠氮基。
糖衍生物S(A)x源自糖或糖衍生物S，例如氨基糖或以其他方式衍生的糖。糖和糖衍生物的实例包括半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、葡萄糖醛酸(Gcu)和岩藻糖(Fuc)。氨基糖为一种糖，其中羟基(OH)被氨基取代，实例包括N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。以其他方式衍生的糖的实例包括葡萄糖醛酸(Gcu)和N-乙酰神经氨酸(唾液酸)。
糖衍生物S(A)x优选地源自半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、葡萄糖醛酸(Gcu)、岩藻糖(Fuc)和N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，优选地选自GlcNAc、Glc、Gal和GalNAc。更优选地，S(A)x源自Gal或GalNAc，最优选地，S(A)x源自GalNAc。
S(A)x中的一个或更多个官能团A可以用几种方式与糖或糖衍生物S连接。所述一个或更多的官能团A可键合至所述糖或糖衍生物的C2、C3、C4和/或C6，替代羟基(OH)。应该注意的是，由于岩藻糖在C6上缺乏OH-基团，如果A键合至Fuc的C6，那么A取代H-原子的位置。
当A为叠氮基时，优选地，A键合至C2、C4或C6。如上所述，S(A)x中的一个或更多个叠氮化物取代基可键合至所述糖或糖衍生物S的C2、C3、C4或C6，替代羟基(OH)，或者，在6-叠氮基岩藻糖(6-AzFuc)的情况下，替代氢原子。可替代地或额外地，氨基糖衍生物的N-乙酰基取代基可被叠氮基乙酰基取代基取代。在一个优选的实施方案中，S(A)x选自2-叠氮基乙酰胺基半乳糖(GalNAz)、6-叠氮基-6-脱氧半乳糖(6-AzGal)、6-叠氮基-6-脱氧-2-乙酰胺基半乳糖(6-AzGalNAc)、4-叠氮基-4-脱氧-2-乙酰胺基半乳糖(4-AzGalNAc)、6-叠氮基-6-脱氧-2-叠氮基乙酰胺基半乳糖(6-AzGalNAz)、2-叠氮基乙酰胺基葡萄糖(GlcNAz)、6-叠氮基-6-脱氧葡萄糖(6-AzGlc)、6-叠氮基-6-脱氧-2-乙酰胺基葡萄糖(6-AzGlcNAc)、4-叠氮基-4-脱氧-2-乙酰胺基葡萄糖(4-AzGlcNAc)和6-叠氮基-6-脱氧-2-叠氮基乙酰胺基葡萄糖(6-AzGlcNAz)，更优选地选自GalNAz、4-AzGalNAc、GlcNAz和6-AzGlcNAc。以下示出S(A)x-P的实例，其中A为叠氮基。
当A是酮基时，优选地A键合至C2替代S的OH-基团。可替代地，A可键合至氨基糖衍生物，优选2-氨基糖衍生物的N-原子。然后，所述糖衍生物包含-NC(O)R6取代基。R6优选地为C2-C24烷基，任选地被取代。更优选地，R6为乙基。在一个优选实施方案中，S(A)x选自2-脱氧-(2-氧丙基)半乳糖(2-酮基Gal)、2-N-丙酰基半乳糖胺(2-N-丙酰基GalNAc)、2-N-(4-氧戊酰基)半乳糖胺(2-N-LevGal)和2-N-丁酰基半乳糖胺(2-N-丁酰基GalNAc)，更优选2-酮基GalNAc和2-N-丙酰基GalNAc。以下示出S(A)x-P的实例，其中A为酮基。
当A为炔基时，优选末端炔基或(杂)环炔基，优选地，所述炔基存在于2-氨基糖衍生物上。其中A为炔基的S(A)x的一个实例为2-(丁-3-酸氨基)-2-脱氧-半乳糖。以下示出了S(A)x-P的一个实例，其中A为炔基。
式S(A)x-P的化合物，其中核苷单磷酸或核苷二磷酸P与糖衍生物S(A)x连接，是本领域中已知的。例如Wang et al.，Chem.Eur.J.2010,16,13343–13345、Piller et al.,ACSChem.Biol.2012,7,753、Piller et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.2005,15,5459-5462和WO2009/102820，其全部以引用的方式纳入本文，公开了许多化合物S(A)x-P以及它们的合成。
在一个优选实施方案中，S(A)x-P中的核苷单磷酸或二磷酸P选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)、胸苷二磷酸(TDP)、胞苷二磷酸(CDP)和胞苷单磷酸(CMP)，优选UDP。
以下示出了与叠氮基-、酮基-和炔基-取代的糖和糖衍生物连接的尿苷二磷酸，S(A)x-UDP，的几个实例(5-10)。
优选地，S(A)x-P选自GalNAz-UDP(5)、6-AzGal-UDP(6)、6-AzGalNAc-UDP(7)、4-AzGalNAz-UDP、6-AzGalNAz-UDP、6-AzGlc-UDP、6-AzGlcNAz-UDP、2-酮基Gal-UDP(8)、2-N-丙酰基GalNAc-UDP(9，其中R6为乙基)和2-(丁-3-酸氨基)-2-脱氧-半乳糖-UDP(10)。
最优选地，S(A)x-P为GalNAz-UDP(5)或4-AzGalNAc-UDP(7)。GalNAz-UDP(5)和6-AzGalNAc-UDP(7)的合成公开于Piller et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.2005，15，5459-5462和Wang et al.，Chem.Eur.J.2010，16，13343–13345，其皆以引用的方式纳入本文。
2-酮基Gal-UDP(8)的合成公开于Qasba et al.，J.Am.Chem.Soc.2003，125，16162，特别是在辅助信息(Supporting Information)中，其皆以引用的方式纳入本文。
2-(丁-3-酸氨基)-2-脱氧-半乳糖-UDP的合成公开于WO 2009/102820，其以引用的方式纳入本文。
如上所述，在修饰根据本发明的抗体的方法中，S(A)x-P可以是作为合适的半乳糖基转移酶催化剂的底物的任何糖衍生物核苷酸。
图4示出了根据本发明的方法的一个优选实施方案。图4显示了在抗体的每条重链上包含一个任选地被岩藻糖基化的(b＝0或1)核心-GlcNAc取代基的单克隆抗体(mAb)。这些核心-GlcNAc(b＝0)和核心-GlcNAc(Fuc)(b＝1)取代基分别被转变为GlcNAc-GalNAz和GlcNAc(Fuc)-GalNAz取代基。所述转变是通过在存在突变型GalT Y289L酶作为催化剂的情况下与GalNAz-UDP(5)的反应进行。
本发明通常涉及制备经修饰的抗体的方法，该方法包括：
(a)提供包含任选地被岩藻糖基化的核心N-乙酰葡糖胺取代基(核心-GlcNAc取代基)的抗体，随后
(b)使所述抗体与式S(A)x-P的化合物在合适的催化剂的存在下接触，其中所述催化剂包含来自半乳糖基转移酶的突变型催化结构域；其中S(A)x是包含x个官能团A的糖衍生物，其中A独立地选自叠氮基、酮基和炔基且x为1、2、3或4；其中P选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)和胞苷二磷酸(CDP)；且其中经修饰的抗体被定义为包含GlcNAc-S(A)x取代基的抗体，所述GlcNAc-S(A)x取代基是通过所述GlcNAc-S(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1键合至所述抗体。
包括任选地被岩藻糖基化的核心-GlcNAc取代基的抗体可以用各种方式提供。所述抗体(例如完全抗体、抗体片段、遗传改造的抗体等)可通过本领域技术人员已知的方法提供。例如，Fab或Fc片段可通过用木瓜蛋白酶将基本上完整的免疫球蛋白分子的蛋白质水解消化或通过免疫球蛋白的重链和轻链的所需部分的重组表达制备。
在一个实施方案中，根据本发明的方法还包括抗体聚糖在糖苷内切酶的存在下的去糖基化(所述抗体聚糖具有核心N-乙酰葡糖胺)，以获得包含核心N-乙酰葡糖胺取代基的抗体，其中所述核心N-乙酰葡糖胺和所述核心N-乙酰葡糖胺取代基是任选地被岩藻糖基化的。根据该聚糖的性质，可选择合适的糖苷内切酶。所述糖苷内切酶优选地选自Endo S、Endo A、Endo F、Endo M、Endo D和Endo H酶和/或其组合，其选择取决于聚糖的性质。在又一优选实施方案中，所述糖苷内切酶为Endo S、Endo S49、Endo F或其组合。在又一优选实施方案中，所述糖苷内切酶为Endo S、Endo F或其组合。在又一优选实施方案中，所述糖苷内切酶为Endo S。在另一个优选实施方案中，所述糖苷内切酶为Endo S49。
本文中，具有核心N-乙酰葡糖胺的抗体聚糖被定义为包含聚糖的抗体，所述聚糖是通过任选地被岩藻糖基化的GlcNAc(所述核心-GlcNAc)的C1键合至该抗体。除所述核心-GlcNAc和任选的岩藻糖之外，所述聚糖包括至少另一种糖或糖衍生物。
图5示出了所述方法的去糖基化步骤的一个优选实施方案，其中抗体糖形G2F、G1F、G0F、G2、G1和G0和可能地更多的糖形比如三天线聚糖(triantennary glycan)的混合物被转变为包含任选地被岩藻糖基化的(b为0或1)的核心N-乙酰葡糖胺取代基的抗体。图1示出了糖形G2F、G1F、G0F、G2、G1和G0。
因此，本发明还涉及制备经修饰的抗体的方法，该方法包括：
(a)具有核心N-乙酰葡糖胺的抗体聚糖在糖苷内切酶的存在下的去糖基化，以得到包含核心N-乙酰葡糖胺取代基的抗体，其中所述核心N-乙酰葡糖胺取代基为任选地被岩藻糖基化的，随后
(b)使所述抗体与式S(A)x-P的化合物在合适的催化剂的存在下接触，其中所述催化剂包含来自半乳糖基转移酶的突变型催化结构域；其中S(A)x是包含x个官能团A的糖衍生物，其中A独立地选自叠氮基、酮基和炔基且x为1、2、3或4；其中P选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)和胞苷二磷酸(CDP)；且其中经修饰的抗体被定义为包含GlcNAc-S(A)x取代基的抗体，所述GlcNAc-S(A)x取代基是通过该GlcNAc-S(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1键合至所述抗体。
本发明还涉及制备经修饰的抗体的方法，该方法包括：
(a)具有核心N-乙酰葡糖胺的抗体聚糖在糖苷内切酶的存在下的去糖基化，以得到包含核心N-乙酰葡糖胺取代基的抗体，其中所述核心N-乙酰葡糖胺取代基为任选地被岩藻糖基化的；其中所述核心N-乙酰葡糖胺取代基是通过N-糖苷键键合至所述抗体的天冬酰胺的侧链上的酰胺氮原子；且其中所述糖苷内切酶为Endo S、Endo S49、Endo F或其组合；随后
(b)使所述抗体与式S(A)x-P的化合物在合适的催化剂的存在下接触，其中所述催化剂包含来自半乳糖基转移酶的突变型催化结构域；其中S(A)x是包含x个官能团A的糖衍生物，其中A独立地选自叠氮基、酮基和炔基且x为1、2、3或4；其中P选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)和胞苷二磷酸(CDP)；
其中经修饰的抗体被定义为包含GlcNAc-S(A)x取代基的抗体，所述GlcNAc-S(A)x取代基是通过该GlcNAc-S(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1键合至所述抗体。
在一个优选实施方案中，所述糖苷内切酶选自Endo S、Endo F或其组合。在又一优选实施方案中，所述糖苷内切酶为Endo S、Endo F或其组合。在一个甚至更优选实施方案中，所述糖苷内切酶为Endo S。在另一个优选实施方案中，所述糖苷内切酶为Endo S49。在另一个优选实施方案中，所述糖苷内切酶选自Endo S、Endo S49、Endo F和/或其组合。更优选地，所述糖苷内切酶为Endo S或Endo S49。最优选地，所述糖苷内切酶为Endo S或EndoF。
Endo S、Endo A、Endo F、Endo M、Endo D和Endo H是本领域技术人员已知的。EndoS49记载于WO 2013/037824(Genovis AB)，其以引用的方式纳入本文。Endo S49是从酿脓链球菌(Streptococcus poyogenes)NZ131分离的并为Endo S的同系物。Endo S49对天然IgG具有特异性的糖苷内切酶活性并比Endo S裂解更多种类的Fc聚糖。
在一个优选实施方案中，所述核心N-乙酰葡糖胺存在于所述抗体的天然N-糖基化位点上。在又一优选实施方案中，所述抗体为IgG且所述核心N-乙酰葡糖胺存在于IgG的天然N-糖基化位点上。在又一优选实施方案中，所述抗体为IgG，所述核心N-乙酰葡糖胺存在于IgG的天然N-糖基化位点上，且所述天然位点为IgG的N297N-糖基化位点。所述N297N-糖基化位点存在于IgG抗体的重链的Fc区域中。
当所述核心N-乙酰葡糖胺存在于IgG抗体的天然N-糖基化位点上时，优选地所述糖苷内切酶选自Endo S、Endo S49和Endo F及其组合。更优选地，所述糖苷内切酶为EndoS、Endo S49或Endo F，甚至更优选Endo S或Endo F，最优选Endo S。如本领域中已知的那样，Endo H、Endo M、Endo F1比较不适合用于聚糖的去糖基化，所述聚糖存在于IgG抗体的天然位点上。特别地，它们比较不适合用于存在于N297处的聚糖的去糖基化。
经修饰的抗体
本发明还涉及通过制备根据本发明的经修饰的抗体的方法得到的抗体。上文详细描述所述用于制备经修饰的抗体的方法以及其优选实施方案。
本发明还涉及包含GlcNAc-S(A)x取代基的抗体，其中GlcNAc为N-乙酰葡糖胺，其中S(A)x是包含x个官能团A的糖衍生物，其中A独立地选自叠氮基、酮基和炔基且x为1、2、3或4；其中所述GlcNAc-S(A)x取代基是通过所述GlcNAc-S(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1键合至所述抗体，且其中所述N-乙酰葡糖胺为任选地被岩藻糖基化的。本文中，这样的抗体也被称为经修饰的抗体。
在一个实施方案中，根据本发明的经修饰的抗体为式(4)的抗体，其中AB代表抗体，GlcNAc为N-乙酰葡糖胺，Fuc为岩藻糖，b为0或1，y为1至20，其中S(A)x为包含x个官能团A的糖衍生物，其中A独立地选自叠氮基、酮基和炔基且x为1、2、3或4。在一个优选实施方案中，y为1至10，更优选地，y为1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选地，y为1、2、3或4，最优选地，y为1或2。
经修饰的抗体的GlcNAc-S(A)x取代基中的糖衍生物S(A)x例如可通过β(1,4)-糖苷键键合至所述GlcNAc的C4或通过α(1,3)-糖苷键键合至所述GlcNAc的C3。所述GlcNAc-S(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺是通过C1键合至所述抗体，优选地通过N-糖苷键键合至所述抗体的天冬酰胺的侧链中的酰胺氮原子(GlcNAcβ1-Asn)。所述GlcNAc-S(A)x取代基上的GlcNAc是任选地被岩藻糖基化的。所述经修饰的抗体的GlcNAc-S(A)x取代基上的糖衍生物S(A)x是通过β(1,4)-糖苷键键合至GlcNAc的C4，还是通过α(1,3)-糖苷键键合至所述GlcNAc的C3，取决于制备所述经修饰的抗体的方法中使用的催化剂。当所述方法是在β(1,4)-半乳糖基转移酶催化剂的存在下进行时，然后结合是通过β(1,4)-糖苷键经由S(A)x的C1和GlcNAc的C4发生。当所述方法是在α(1,3)-半乳糖基转移酶催化剂的存在下进行时，然后结合是通过α(1,3)-糖苷键经由S(A)x的C1和GlcNAc的C3发生。
当A为叠氮基官能团时，所述经修饰的抗体被称为经叠氮化物修饰的抗体。当A是酮基官能团时，所述经修饰的抗体被称为经酮基修饰的抗体。当A为炔基官能团时，所述经修饰的抗体被称为经炔烃修饰的抗体。优选地，所述经修饰的抗体为经叠氮化物或酮基修饰的抗体，更优选地，经叠氮化物修饰的抗体。
在一个优选实施方案中，所述S(A)x源自糖或糖衍生物，所述糖或糖衍生物选自半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、葡萄糖醛酸(Gcu)、岩藻糖(Fuc)和N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，优选Gal、GlcNAc、葡萄糖和GalNAc。
在另一个优选实施方案中，S(A)x选自GalNAz、6-AzGal、6-AzGalNAc、4-AzGalNAz、6-AzGalNAz、6-AzGlc、6-AzGlcNAz、2-酮基Gal、2-N-丙酰基GalNAc和2-(丁-3-酸氨基)-2-脱氧-半乳糖。最优选地，S(A)x为GalNAz或4-AzGalNAc。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的经修饰的抗体为经叠氮化物修饰的抗体，即S(A)x中的官能团A为叠氮基。经叠氮化物修饰的抗体可具有以下示出的结构，其中S(A)x(A为叠氮基)被描述为S[(Q)p-N3]x：
其中：
b为0或1；
x为1、2、3或4；
S为糖衍生物；
p为0或1；
Q为-N(H)C(O)CH2-或-CH2-；
y为1-20；
且其中AB为抗体，S为糖或糖衍生物，GlcNAc为N-乙酰葡糖胺。GlcNAc为任选地被岩藻糖基化的(b为0或1)。
所述经叠氮化物修饰的抗体可包含1至20个任选地被岩藻糖基化的取代基GlcNAc-S(A)x(y为1至20)。优选地，y为1至10，更优选地，y为1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选地，y为1、2、3或4，最优选地，y为1或2。
P值和Q的性质取决于存在于所述经叠氮化物修饰的抗体中的叠氮化物-取代的糖衍生物S(A)x。如果S(A)x中的叠氮基存在于该糖或糖衍生物的C2、C3或C4位上，即替代糖-OH-基团，则p为0。如果S(A)x中的叠氮基是2-叠氮基乙酰胺基，即S(A)x为例如GalNAz或GlcNAz，则p为1且Q为-N(H)C(O)CH2-。如果S(A)x中的叠氮基存在于该糖或糖衍生物的C6位上，即替代糖-OH-基团或在6-AzFuc替代H-原子的情况下，则p为1且Q为-CH2-。
优选地，根据本发明的经修饰的抗体为单克隆抗体，更优选地，选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体。甚至更优选地，所述抗体为IgG抗体，最优选地，所述抗体为IgG1抗体。当所述经修饰的抗体为完全抗体时，所述抗体优选地包含两个或更多，更优选两个，GlcNAc-S(A)x取代基，所述GlcNAc-S(A)x取代基为任选地被岩藻糖基化的。然而，如果所述经修饰的抗体是抗体片段，例如Fab或Fc片段，该抗体可能只具有GlcNAc-S(A)x取代基，其为任选地被岩藻糖基化的。
在根据本发明的经修饰的抗体中，所述GlcNAc-S(A)x取代基可位于抗体的任何位置，条件是所述取代基不妨碍抗原与该抗体的抗原结合位点的结合。在一个实施方案中，所述GlcNAc-S(A)x取代基位于该抗体的Fc结构域中，更优选地，位于CH2结构域中。在另一实施方案中，所述GlcNAc-S(A)x取代基位于该抗体的Fab结构域上。在另一实施方案中，所述GlcNAc-S(A)x取代基位于抗体Fab或Fc片段上。
如上所述，制备经修饰的-抗体的方法可提供经修饰的抗体，其包含一个以上GlcNAc-S(A)x取代基。抗体上取代基的数目不仅取决于要被修饰的抗体(例如，完全抗体、单链、片段等)的性质，还取决于存在于要被修饰的抗体上的核心-GlcNAc取代基的数目。
制备抗体-缀合物的方法
本发明还涉及根据本发明的经修饰的抗体用于制备抗体-缀合物(AC)的用途。本文中，抗体-缀合物(AC)被定义为通过接头(L)缀合至目的分子(D)的抗体。根据本发明的抗体-缀合物可通过所述接头(L)缀合至一个或多于一个的目的分子(D)上。
目的分子可为例如报告分子、活性物质、酶、(非催化性的)蛋白质、肽、寡核苷酸、聚糖、叠氮化物或(杂)环炔基部分，优选二价的或双官能的(杂)环炔基部分。目的分子的其他实例包括诊断化合物、氨基酸(包括非天然氨基酸)、多肽、(聚)乙二醇二胺(例如1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷或包含更长乙二醇链的等价物)、聚乙二醇链、聚环氧乙烷链、聚丙二醇链、聚环氧丙烷链和1,x-二氨基烷烃(其中x为烷烃中碳原子的数目)。在一个优选实施方案中，所述目的分子选自氨基酸(特别是赖氨酸)、活性物质、报告分子、叠氮化物和(杂)环炔基部分。在又一优选实施方案中，所述目的分子选自活性物质、报告分子、叠氮化物和(杂)环炔基部分。
活性物质为药理学和/或生物学物质，即具有生物学和/或药学活性的物质，例如药物或前药、诊断剂、蛋白质、肽、氨基酸、聚糖、脂质、维生素、类固醇、核苷酸、核苷、多核苷酸、RNA或DNA。合适的肽标签的实例包括细胞穿透肽如人乳铁蛋白或聚精氨酸。合适的聚糖的实例为低聚甘露糖。
在一个优选实施方案中，所述活性物质选自药物和前药。更优选地，所述活性物质选自药学活性化合物，特别是低至中分子量的化合物(例如约200至约1500Da，优选约300至约1000Da)，例如细胞毒素、抗病毒剂、抗菌剂、肽和寡核苷酸。细胞毒素的实例包括喜树碱类(camptothecin)、星形孢菌素(staurosporin)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、秋水仙碱(colchicine)、甲胺蝶呤(methotrexate)、紫杉烷类(taxanes)、刺孢霉素类(calicheamycins)、多卡米星、美登木素类(maytansines)和美登木素生物碱(maytansinoids)(即美登木素衍生物)、阿里他汀(auristatin)、微管溶素M(tubulysinM)、念珠藻素(cryptophycin)或吡咯并苯并二氮杂卓类(PBD)。阿里他汀类的实例包括多拉司他汀(dolastatin)10、阿里他汀F、单甲基阿里他汀F(MMAF)、阿里他汀E、单甲基阿里他汀E(MMAE)、阿里他汀PE、阿里他汀TP和阿里他汀AQ。美登木素类和美登木素生物碱类的实例包括美登素(mertansine)和安丝菌素(ansamitocin)。
报告分子为一种容易检测其存在的分子，例如诊断剂、染料、荧光团、放射性同位素标记、造影剂、磁共振成像剂或质量标记。荧光团的实例包括Alexa Fluor(例如AlexaFluor 555)、花青染料(例如Cy3或Cy5)、香豆素衍生物、荧光素、罗丹明、别藻蓝素和色霉素的所有种类。
放射性同位素标记的实例包括99mTc、111In、18F、14C、64Cu、131I或123I，其可通过或可不通过螯合部分比如DTPA、DOTA、NOTA或HYNIC连接。
在根据本发明的抗体-缀合物(AC)中，所述目的分子是通过接头(L)与抗体缀合。接头或连接单元是本领域中公知的，并在以下更详细地描述。
本发明还涉及一种制备抗体-缀合物的方法，包括使根据本发明的经修饰的抗体与接头-缀合物反应，其中所述接头-缀合物包含官能团B和一个或多种目的分子，其中所述官能团B为能够与所述经修饰的抗体的GlcNAc-S(A)x取代基的官能团A反应的官能团。所述接头-缀合物优选地具有式B-L(D)r，其中B、L和D为如上文所定义的，且r为1-20，优选地r为1-10，更优选地r为1-8，甚至更优选地r为1、2、3、4、5或6，甚至更优选地r为1、2、3或4，且最优选地r为1或2。
所述经修饰的抗体上的官能团A(A为叠氮基、酮基或炔基)的互补官能团B是本领域中已知的。
当A是叠氮基时，经叠氮化物修饰的抗体和接头-缀合物的连接优选地通过环加成反应进行。那么，官能团B优选地选自炔基，优选末端炔基和(杂)环炔基。
当A为酮基时，经酮基修饰的抗体与接头-缀合物的连接优选地通过与羟胺衍生物或肼类的选择性缀合进行，分别产生肟或腙。那么，官能团B优选地为伯胺基(例如-NH2基团)、氨基氧基(aminooxy)(例如-O-NH2)或肼基(例如-N(H)NH2)基团。那么，所述接头-缀合物分别优选地为H2N-L(D)r、H2N-O-L(D)r或H2N-N(H)-L(D)r，其中L、D和r为如上定义的。
当A为炔基时，经炔烃修饰的抗体与接头-缀合物的连接优选地通过环加成反应进行，优选1,3-偶极环加成。那么，官能团B优选地为1,3-偶极子，比如叠氮化物、硝酮或氧化腈。那么所述接头-缀合物优选地为N3-L(D)r，其中L、D和r为如上定义的。
因此，本发明还涉及一种制备抗体-缀合物的方法，包括使根据本发明的经修饰的抗体与接头-缀合物反应，其中：
a.当所述经修饰的抗体为经叠氮化物修饰的抗体时，所述接头-缀合物包含(杂)环炔基或炔基以及一个或多个目的分子；或
b.当所述经修饰的抗体为经酮基修饰的抗体时，所述接头-缀合物包含伯胺基团、氨基氧基或肼基基团，以及一个或多个目的分子；或
c.当所述经修饰的抗体为经炔烃修饰的抗体时，所述接头-缀合物包含叠氮基和一个或多个目的分子。
在一个优选实施方案中，本发明涉及制备抗体-缀合物的方法，包括使根据本发明的经叠氮化物修饰的抗体与接头-缀合物反应，其中所述接头-缀合物包含(杂)环炔基或末端炔基，以及一个或多个目的分子。
在所述方法中，根据本发明的经叠氮化物修饰的抗体上的叠氮化物通过环加成反应与所述接头-缀合物的炔基(优选末端炔基)或(杂)环炔基反应。包含叠氮化物的分子与包含末端炔基或(杂)环炔基的分子的这个环加成反应为本领域中称作“点击化学(clickchemistry)”的反应之一。在接头-缀合物包含末端炔基的情况下，所述环加成反应需要在合适的催化剂的存在下进行，优选Cu(I)催化剂。然而，在一个优选实施方案中，所述接头-缀合物包含(杂)环炔基，更优选有张力的(strained)(杂)环炔基。当所述(杂)环炔基为有张力的(杂)环炔基时，催化剂的存在不是必须的，且所述反应甚至可通过被称为张力促进的(strain-promoted)叠氮化物-炔烃环加成(SPAAC)的反应自发进行。此为本领域中被称为“无金属点击化学”(metal-free click chemistry)的反应之一。有张力的(杂)环炔基是本领域中已知的并在下面更详细地描述。
因此，在一个优选实施方案中，制备抗体-缀合物的方法包括使经修饰的抗体与接头-缀合物反应，其中所述接头-缀合物包含(杂)环炔基和一个或多个目的分子，其中所述经修饰的抗体为包含GlcNAc-S(A)x取代基的抗体，其中GlcNAc为N-乙酰葡糖胺，其中S(A)x为包含x个官能团A的糖衍生物，其中A为叠氮基且x为1、2、3或4，其中所述GlcNAc-S(A)x取代基通过所述GlcNAc-S(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1键合至所述抗体，且其中所述GlcNAc为任选地被岩藻糖基化的。在又一优选实施方案中，所述(杂)环炔基为有张力的(杂)环炔基。
在又一优选实施方案中，制备抗体-缀合物的方法包括下述步骤：
(i)使包含核心N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)取代基的抗体与式S(A)x-P的化合物在合适的催化剂的存在下接触，其中所述核心N-乙酰葡糖胺取代基为任选地被岩藻糖基化的；其中所述催化剂包含来自半乳糖基转移酶的突变型催化结构域；其中S(A)x是包含x个官能团A的糖衍生物，其中A为叠氮基且x为1、2、3或4；其中P选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)和胞苷二磷酸(CDP)；
以得到一种经修饰的抗体，其中经修饰的抗体被定义为包含GlcNAc-S(A)x取代基的抗体，所述GlcNAc-S(A)x取代基通过所述GlcNAc-S(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1缀合至所述抗体，且其中所述经修饰的抗体为根据式(4)：
其中：
S(A)x和x为如上定义的；AB代表抗体；GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；Fuc为岩藻糖；b为0或1；y为1至20；以及
(ii)使所述经修饰的抗体与接头-缀合物反应，其中所述接头-缀合物包含(杂)环炔基和一个或多个目的分子。
制备根据本发明的抗体-缀合物的方法的这个实施方案的一个优点为，铜催化剂的存在不是必须的。因此，所述方法在缺少铜催化剂的情况下进行。然而，所述方法中铜催化剂的存在具有几个缺点。一般而言，将叠氮化物与末端炔烃缀合的最方便的方法要求Cu(I)的存在。铜(I)通常在原位从Cu(II)产生，其要求加入合适的还原剂(例如DTT、抗坏血酸钠或肼)并加入合适的配体以将铜维持在Cu(I)氧化状态。然而，可能需要对条件的广泛优化和细调以找到有效转化的最佳参数。然而，甚至在这样的条件下，也无法总是完全避免活性氧种类的伴随形成，其反过来可诱导对蛋白质的氧化性损伤，例如甲硫氨酸、组氨酸、半胱氨酸或二硫键的氧化。其他方案已使用铜(I)来源(比如CuBr)用于标记固定的细胞并合成糖蛋白。在这些情况下，CuI在空气中的不稳定性需要极大过量的Cu(大于4mm)和配体以进行有效反应，这也提高了关于蛋白质损伤或沉淀的担忧，以及纯化后残余金属的存在。现发现在铜的存在下包含叠氮化物的抗体与末端炔烃的缀合由于不希望的氨基酸氧化反应导致了广泛的副产物的形成。例如，在铜催化的缀合后的对曲妥珠单抗(trastuzumab)的轻链(LC)的高分辨率质谱分析表明，形成了>20％的、分子量+16/+18的物质(参见图31)。在胰蛋白酶消化后的对曲妥珠单抗重链(HC)肽片段的详细分析表明至少一个特定组氨酸的氧化高达69％，如实施例39中举例说明的。胰蛋白酶消化后的对曲妥珠单抗轻链(LC)肽片段的详细分析表明至少一个特定甲硫氨酸的氧化，这也如实施例39中举例说明的。
以上更详细地描述了目的分子。在一个优选实施方案中，所述目的分子选自活性物质、报告分子、叠氮化物和(杂)环炔基，更优选活性物质、报告分子和叠氮化物。当所述目的分子为(杂)环炔基时，优选地所述部分为(杂)环辛炔部分。(杂)环辛炔基团的优选结构在下面更详细地描述。
制备根据本发明的经修饰的抗体的方法优选地是在约20至约50℃的温度范围内进行，更优选在约25至约45℃的范围，甚至更优选约30至约40℃的范围，最优选约32至约37℃的范围。
所述方法优选地是在约5至约9的pH范围内进行，优选在约5.5至约8.5的范围内，更优选在约6至约8的范围内。最优选地，所述方法是在约7至约8的pH范围内进行。
所述方法优选地是在水中进行。更优选地，所述水为纯化水，甚至更优选超纯水或根据ISO 3696定义的I型水。合适的水为例如水。所述水优选地为经缓冲的，例如用磷酸盐-缓冲盐水或tris缓冲。合适的缓冲液是本领域技术人员已知的。在一个优选实施方案中，所述方法是在用磷酸盐-缓冲盐水或tris缓冲的milliQ水中进行。
优选地，所述接头-缀合物包含(杂)环炔基。在一个优选实施方案中，所述接头-缀合物具有式(11)：
其中：
L为接头；
D为目的分子；
r为1-20；
R1独立地选自氢、卤素、-OR5、-NO2、-CN、-S(O)2R5、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基且其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基是任选地取代的，其中两个取代基R1可被连接在一起以形成增环的环烷基或增环的(杂)芳烃取代基，且其中R5独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
X为C(R1)2、O、S或NR2，其中R2为R1或L(D)r，且其中L、D和r为如上定义的；
q为0或1，条件是如果q为0则X为N-L(D)r；以及
a为0、1、2、3、4、5、6、7或8。
在另一个优选实施方案中，所述接头-缀合物具有式(11b)：
其中：
L为接头；
D为目的分子；
r为1-20；
R1独立地选自氢、卤素、-OR5、-NO2、-CN、-S(O)2R5、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基且其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基为任选地取代的，其中两个取代基R1可被连接在一起形成增环的环烷基或增环的(杂)芳烃取代基，且其中R5独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
X为C(R1)2、O、S或NR2，其中R2为R1或L(D)r，且其中L、D和r为如上定义的；
q为0或1，条件是如果q为0则X为N-L(D)r；
a为0、1、2、3、4、5、6、7或8；
a'为0、1、2、3、4、5、6、7或8；且
a+a'<10。
在又一优选实施方案中，a+a'为4、5、6或7，更优选a+a'为4、5或6，最优选a+a'为5。
在一个优选实施方案中，如果q为1则X为C(R1)2、O、S或NR1。
在另一个优选实施方案中，a为5，即所述(杂)环炔基优选地为(杂)环辛炔基。在另一个优选实施方案中，X为C(R2)2或NR2。当X为C(R2)2时，优选地R2为氢。当X为NR2时，优选地R2为L(D)r。在另一个优选实施方案中，r为1至10，更优选地，r为1、2、3、4、5、6、7或8，更优选地，r为1、2、3、4、5或6，最优选地，r为1、2、3或4。
所述L(D)r取代基可存在于所述(杂)环炔基的C-原子上，或者，在杂环炔基的情况下，存在于所述杂环炔基的杂原子上。当所述(杂)环炔基包含取代基时，例如增环的环烷基，所述L(D)r取代基也可存在于该取代基上。
将接头L的一端连接至(杂)环炔基以及将其另一端连接至目的分子(以得到接头-缀合物)的方法取决于所述接头、所述(杂)环炔基基团和所述目的分子的确切的性质。合适的方法是本领域中已知的。
优选地，所述接头-缀合物包含(杂)环辛炔基基团，更优选有张力(杂)环辛炔基基团。合适的(杂)环炔基部分是本领域中已知的。例如DIFO、DIFO2和DIFO 3公开于US 2009/0068738中，其以引用的方式纳入。DIBO公开于WO 2009/067663中，其以引用的方式纳入。如J.Am.Chem.Soc.2012，134，5381中公开的，DIBO可任选地被硫酸化(S-DIBO)。BARAC公开于J.Am.Chem.Soc.2010,132,3688-3690和US2011/0207147中，其全部以引用的方式纳入。
以下示出包含(杂)环辛炔基基团的接头-缀合物的优选实例。
本领域中已知的其他环辛炔部分为DIBAC(也被称作ADIBO或DBCO)和BCN。DIBAC公开于Chem.Commun.2010，46，97-99中，其以引用的方式纳入。BCN公开于WO 2011/136645中，其以引用的方式纳入。
在一个优选实施方案中，所述接头-缀合物具有式(12)、(13)、(14)、(15)或(16)。
在另一个优选实施方案中，所述接头-缀合物具有式(17)：
其中：
R1、L、D和r为如上定义的；
Y为O、S或NR2，其中R2为如上定义的；
R3独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基基团、C6-C24(杂)芳基基团、C7-C24烷基(杂)芳基基团和C7-C24(杂)芳基烷基基团；
R4选自氢、Y-L(D)r、-(CH2)n-Y-L(D)r、卤素、C1-C24烷基基团、C6-C24(杂)芳基基团、C7-C24烷基(杂)芳基基团和C7-C24(杂)芳基烷基基团，所述烷基基团任选地被选自O、N和S的多个杂原子之一间断，其中所述烷基基团、(杂)芳基基团、烷基(杂)芳基基团和(杂)芳基烷基基团是独立地且任选地取代的；且
n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在又一优选实施方案中，R1为氢。在另一个优选实施方案中，R3为氢。在另一个优选实施方案中，n为1或2。在另一个优选实施方案中，R4为氢、Y-L(D)r或-(CH2)n-Y-L(D)r。在另一个优选实施方案中，R2为氢或L(D)r。在又一优选实施方案中，所述接头-缀合物具有式18：
其中Y、L、D、n和r为如上定义的。
在另一个优选实施方案中，所述接头-缀合物具有式(19)：
其中L、D和r为如上定义的。
在另一个优选实施方案中，所述接头-缀合物具有式(15)：
其中L、D和r为如上定义的。
方案2示出了根据本发明的经叠氮化物修饰的抗体与包含优选类型的环辛炔基的接头-缀合物BCN-L(D)r(17)的环加成反应。
其中R1、R3、R4、S、Q、Y、L、D、b、p、x、n为如上定义的，且y为1-20。
p值和Q的性质取决于所述叠氮化物-取代的糖或糖衍生物S(A)x，所述叠氮化物-取代的糖或糖衍生物S(A)x存在于与接头-缀合物连接的根据本发明的经叠氮化物修饰的抗体中。如果S(A)x中的叠氮化物存在于所述糖或糖衍生物的C2、C3或C4位上(替代糖OH-基团)，则p为0。如果该S(A)x为叠氮基乙酰胺基-糖衍生物，S(A)x为例如GalNAz或GlcNAz，则p为1且Q为-N(H)C(O)CH2-。如果S(A)x中的叠氮化物存在于所述糖或糖衍生物的C6位上，则p为1且Q为-CH2-。
接头(L)，也被称为连接单元，是在本领域中已知的。如本文所描述的接头-缀合物中，L被连接至目的分子及官能团B上，如上文所述的。
在一个优选实施方案中，根据本发明的经修饰的抗体为经叠氮化物修饰的抗体。制备经叠氮化物修饰的抗体的合适的接头-缀合物为包含(杂)环炔基和目的分子的接头-缀合物。用于将所述(杂)环炔基基团和所述目的分子与L连接的许多方法是本领域中已知的。如本领域技术人员清楚的是，对于将(杂)环炔基基团连接至接头的一端以及将目的分子连接至接头的另一端的合适方法的选择取决于所述(杂)环炔基基团、接头和目的分子的确切性质。
所述接头可具有一般结构F1-L(F2)r，其中F1代表能与如上文所述的官能团B上的官能团F反应的官能团，例如(杂)环炔基基团、末端炔基基团、伯胺、氨基氧基基团、偕腙肼基基团(hydrazyl group)或叠氮基基团。F2代表能与目的分子上的官能团F反应的官能团。
由于多于一个目的分子可被键合至接头上，所以多于一个的官能团F2可存在于L上。如上文所述，r为1至20，优选1至10，更优选1至8，甚至更优选1、2、3、4、5或6，甚至更优选1、2、3或4，最优选r为1或2。
L可例如选自直链或支链C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200亚环烷基、C5-C200亚环烯基、C8-C200亚环炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基、C9-C200芳基亚炔基。任选地，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基可被取代，且任选地所述基团可被一个或多个杂原子间断，优选1至100个杂原子，所述杂原子优选地选自O、S和NR5，其中R5独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基。最优选的，所述杂原子为O。
F、F1和F2例如可独立地选自氢、卤素、R5、C4-C10(杂)环炔烃、-CH＝C(R5)2、-C≡CR5、-[C(R5)2C(R5)2O]q-R5(其中Q的范围为1至200)、-CN、-N3、-NCX、-XCN、-XR5、-N(R5)2、-+N(R5)3、-C(X)N(R5)2、-C(R5)2XR5、-C(X)R5、-C(X)XR5、-S(O)R5、-S(O)2R5、-S(O)OR5、-S(O)2OR5、-S(O)N(R5)2、-S(O)2N(R5)2、-OS(O)R5、-OS(O)2R5、-OS(O)OR5、-OS(O)2OR5、-P(O)(R5)(OR5)、-P(O)(OR5)2、-OP(O)(OR5)2、-Si(R5)3、-XC(X)R5、-XC(X)XR5、-XC(X)N(R5)2、-N(R5)C(X)R5、-N(R5)C(X)XR5和-N(R5)C(X)N(R5)2，其中X为氧或硫且其中R5为如上文定义的。
合适的连接单元的实例包括(聚)乙二醇二胺(例如1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷或包含更长乙二醇链的等价物)、聚乙二醇或聚环氧乙烷链(polyethylene oxide chain)、聚丙二醇或聚环氧丙烷链以及1,x-二氨基烷烃，其中x为该烷烃中碳原子的数目。
另一类合适的接头包括可裂解的接头。可裂解的接头是本领域中已知的。例如Shabat et al.，Soft Matter 2012，6，1073(其以引用的方式纳入本文)公开了包括在生物触发时(例如酶裂解或氧化事件)释放的自我分解(self-immolative)部分的可裂解的接头。合适的可裂解的接头的一些实例为在被蛋白酶(例如组织蛋白酶(cathepsin)、血纤维蛋白溶酶(plasmin)或金属蛋白酶(metalloprotease))特异性识别时裂解的肽-接头，或在被糖苷酶(例如葡萄糖苷酸酶(glucoronidase))特异性识别时裂解的基于糖苷的接头，或在贫氧的、缺氧区域内被还原的硝基芳族化合物。
抗体-缀合物
本发明还涉及通过制备根据本发明的抗体-缀合物的方法得到的抗体-缀合物。以上详细描述了所述制备抗体-缀合物的方法和所述方法的优选实施方案。
因此本发明还涉及一种抗体-缀合物，其可通过包括下述步骤的方法得到：
(i)使包含核心N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)取代基的抗体与式S(A)x-P的化合物在合适的催化剂的存在下接触，其中所述的核心N-乙酰葡糖胺取代基为任选地被岩藻糖基化的；其中所述催化剂包含来自半乳糖基转移酶的突变型催化结构域；其中S(A)x是包含x个官能团A的糖衍生物，其中A独立地选自叠氮基、酮基和炔基且x为1、2、3或4；其中P选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)和胞苷二磷酸(CDP)；
以得到经修饰的抗体，其中经修饰的抗体被定义为包含GlcNAc-S(A)x取代基的抗体，所述GlcNAc-S(A)x取代基是通过该GlcNAc-S(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1键合至所述抗体，且其中所述经修饰的抗体为根据式(4)：
其中：
S(A)x和x为如上文定义的；AB代表抗体；GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；Fuc为岩藻糖；B为0或1；y为1至20；和
(ii)使所述经修饰的抗体与接头-缀合物反应，其中：
(a)当所述经修饰的抗体为经叠氮化物修饰的抗体时，所述接头-缀合物包含(杂)环炔基或炔基，以及一个或多个目的分子；或
(b)当所述经修饰的抗体为经酮基修饰的抗体时，所述接头-缀合物包含伯胺基团、氨基氧基或肼基基团，以及一个或多个目的分子；或
(c)当所述经修饰的抗体为经炔烃修饰的抗体时，所述接头-缀合物包含叠氮基以及一个或多个目的分子；
其中目的分子(D)是通过接头(L)缀合至所述抗体上，且其中D和L为如上文定义的。
本发明还涉及根据式(20)的抗体-缀合物：
其中AB为抗体，S为糖或糖衍生物，GlcNAc为N-乙酰葡糖胺，其中y为1-20，且其中L、D、X、R1、Q、a、b、p、r、x、y和q为如上文及其优选实施方案定义的。
本发明还涉及根据式(20b)的抗体-缀合物：
其中AB为抗体，S为糖或糖衍生物，GlcNAc为N-乙酰葡糖胺，其中y为1-20，且其中L、D、X、R1、Q、a、a’、b、p、r、x、y和q为如上文及其优选实施方案定义的。
在式(20)和(20b)的缀合的抗体中，GlcNAc为任选地被岩藻糖基化的(b为0或1)。所述抗体可包含最高达20个缀合的取代基(y为1-20)。优选地，y为1-10，更优选地，y为1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选地，y为1、2、3或4，最优选地，y为1或2。
以上详细描述了所述糖衍生物(S)、所述接头(L)、所述取代基R1的优选结构以及r和a的优选值。
如上文所述，p的值和Q的性质取决于叠氮化物-取代的糖或糖衍生物S(A)x，所述叠氮化物-取代的糖或糖衍生物S(A)x存在于与接头-缀合物连接的根据本发明的经叠氮化物修饰的抗体中。如果S(A)x中的叠氮化物存在于该糖衍生物的C2、C3或C4位上，则p为0。如果S(A)为叠氮基乙酰胺基-糖衍生物，S(A)x为例如GalNAz或GlcNAz，则p为1且Q为-N(H)C(O)CH2-。如果S(A)x中的叠氮化物存在于该糖或糖衍生物的C6位上，则p为1且Q为-CH2-。
上文也更详细地描述了目的分子(D)。所述抗体-缀合物可包含一个以上目的分子。例如，当抗体-缀合物与多于一个接头-缀合物连接时，当一个接头-缀合物包含一个以上目的分子时，或者两者同时发生时，抗体-缀合物包含一个以上目的分子。
优选地，所述目的分子选自活性物质、报告分子、叠氮化物和(杂)环炔烃基。当所述目的分子为活性物质时，所述抗体-缀合物可被称为抗体药物缀合物(ADC)。
在一个优选实施方案中，根据本发明的抗体-缀合物具有式(21)：
其中AB、L、D、Y、S、Q、x、y、b、p、R2、GlcNAc、R1、R3、R4、n和r为如上文定义的，且其中所述N-乙酰葡糖胺为任选地被岩藻糖基化的(b为0或1)。
在又一优选实施方案中，R1、R3和R4为氢且n为1或2，在一个甚至更优选的实施方案中，x为1。
在另一个优选实施方案中，所述抗体-缀合物具有式(22)：
其中AB、L、D、X、S、b、p、x、y、Q和GlcNAc为如上文定义的，且其中所述N-乙酰葡糖胺为任选地被岩藻糖基化的(b为0或1)。
抗体-缀合物22为以数个位置异构体(regioisomer)存在的化合物的实例。以下示出另一个位置异构体。
其中AB、L、D、X、S、b、p、x、y、Q和GlcNAc为如上文定义的，且其中所述N-乙酰葡糖胺为任选地被岩藻糖基化的。
在另一个优选实施方案中，所述抗体-缀合物具有式(15b):
其中AB、L、D、X、S、b、p、x、y、Q和GlcNAc为如上文定义的，且其中所述N-乙酰葡糖胺为任选地被岩藻糖基化的。
图6中示出了根据本发明的抗体-缀合物的另一个优选实施方案。包含两条重链和两条轻链的抗体在每条重链上包括一个任选地被岩藻糖基化的核心-GlcNAc。根据式(17)的接头-缀合物是通过环加成反应与所述抗体连接，所述环加成反应为所述接头-缀合物的环辛炔基基团与根据本发明的具有-GlcNAc-GalNAz取代基的经叠氮化物修饰的抗体上的叠氮化物的环加成反应。
本发明还涉及根据本发明的抗体-缀合物用作药物的用途。上文更详细地描述了所述抗体-缀合物的优选实施方案。
抗体-药物缀合物
当根据本发明的抗体-缀合物中的目的分子为活性物质时，所述抗体-缀合物也被称为抗体药物缀合物(ADC)。因此，本发明还涉及一种抗体-药物缀合物，其中目的分子(D)是通过接头(L)被缀合到所述抗体上；其中所述目的分子(D)为活性物质；且其中活性物质被定义为具有生物学活性和/或药学活性的物质。
本发明还涉及通过制备根据本发明的抗体-缀合物的方法得到的抗体-缀合物，其中目的分子(D)是通过接头(L)被缀合至所述抗体；其中所述目的分子(D)为活性物质；且其中活性物质被定义为具有生物学活性和/或药学活性的物质。上文详细地描述了所述制备抗体-缀合物的方法以及所述方法的优选的实施方案。
在一个优选实施方案中，本发明涉及可通过包括下述步骤的方法得到的抗体-缀合物：
(i)使包含核心N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)取代基的抗体与式S(A)x-P的化合物在合适的催化剂的存在下接触，其中所述的核心N-乙酰葡糖胺取代基为任选地被岩藻糖基化的；其中所述催化剂包含来自半乳糖基转移酶的突变型催化结构域；其中S(A)x是包括x个官能团A的糖衍生物，其中A独立地选自叠氮基、酮基和炔基且x为1、2、3或4；其中P选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)和胞苷二磷酸(CDP)；
以得到经修饰的抗体，其中经修饰的抗体被定义为包含GlcNAc-S(A)x取代基的抗体，所述GlcNAc-S(A)x取代基是通过所述GlcNAc-S(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1键合至该抗体，且其中所述经修饰的抗体为根据式(4)：
其中：
S(A)x和x为如上文定义的；AB代表抗体；GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；Fuc为岩藻糖；b为0或1；和y为1至20；和
(ii)使所述经修饰的抗体与接头-缀合物反应，其中：
(a)当所述经修饰的抗体为经叠氮化物修饰的抗体时，所述接头-缀合物包含(杂)环炔基或炔基，以及一个或多个目的分子；或
(b)当所述经修饰的抗体为经酮基修饰的抗体时，所述接头-缀合物包括伯胺基团、氨基氧基基团或肼基基团，以及一个或多个目的分子；或
(c)当所述经修饰的抗体为经炔烃修饰的抗体时，所述接头-缀合物包含叠氮基和一个或多个目的分子；
其中目的分子(D)是通过接头(L)与所述抗体缀合；其中所述目的分子(D)为活性物质；且其中活性物质被定义为具有生物学活性和/或药学活性的物质。
上文和下文中更详细地描述目的分子(D)和接头(L)。
以上详细描述了所述方法——借此可得到所述抗体-药物缀合物——的步骤(i)和步骤(ii)及其优选实施方案。
所述抗体-药物缀合物优选地是通过根据本发明的方法得到，其中x为1或2，更优选地，x为1。结果是，在根据式(4)的经修饰的抗体中以及在所述抗体-药物缀合物中，每个糖部分S优选地与1或2个，更优选地1个，接头缀合物L(D)r连接。
所述抗体-药物缀合物优选地是通过根据本发明的方法得到，其中y为1、2、3、4、5、6、7或8，更优选地，y为1、2、3或4，甚至更优选地，y为1或2。还优选地，r为1、2、3或4，更优选地，r为1或2，最优选地，r为1。
还优选地，在根据本发明的抗体-药物缀合物中，所述抗体为完全抗体，其中y为2。因此，在此实施方案中，所述抗体-药物缀合物可被连接至2、4或8个目的分子上，更优选地，所述抗体被连接至2或4个目的分子上，最优选地，所述抗体被连接至2个目的分子上。
在又一优选实施方案中，所述抗体选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体，更优选地，所述抗体为IgG抗体，优选IgG1抗体。
在根据本发明的抗体-药物缀合物的另一个实施方案中，所述抗体为抗体片段。在此实施方案中，优选地，y为1。
在又一优选实施方案中，x为1且y为1。在又一优选实施方案中，x为2且y为2。还优选地，r为1。在另一个优选实施方案中，x为1，y为1且r为1。在另一个优选实施方案中，x为1，y为2且r为1。在另一个优选实施方案中，x为2，y为2且r为1。
在一个优选实施方案中，所述抗体-药物缀合物是通过根据本发明的方法获得，其中在步骤(ii)中，所述经修饰的抗体为经叠氮化物修饰的抗体，且其中所述接头-缀合物具有式(11)或(11b):
其中：
D和L为如上文定义的；
r为1-20；
R1独立地选自氢、卤素、-OR5、-NO2、-CN、-S(O)2R5、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基且其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基为任选地取代的，其中两个取代基R1可被连接在一起以形成增环的环烷基或增环的(杂)芳烃取代基，且其中R5独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
X为C(R1)2、O、S或NR2，其中R2为R1或L(D)r，其中L、D和r为如上文定义的；
q为0或1，条件是如果q为0则X为N-L(D)r；
a为0、1、2、3、4、5、6、7或8；
a'为0、1、2、3、4、5、6、7或8；且
a+a'<10。
优选地，a+a'为4、5、6或7，更优选地，a+a'为4、5或6，且最优选地，a+a'为5。
在又一优选实施方案中，根据本发明的抗体-药物缀合物是通过根据本发明的方法获得，其中在步骤(ii)中，所述经修饰的抗体为经叠氮化物修饰的抗体且其中所述接头-缀合物具有式(12)、(13)、(14)、(15)或(16)。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的抗体-药物缀合物可通过根据本发明的方法获得，其中在步骤(ii)中，所述经修饰的抗体为经叠氮化物修饰的抗体且其中所述接头-缀合物具有式(17)：
其中：
R1、L、D和r为如上文定义的；
Y为O、S或NR2，其中R2为如上文定义的；
R3独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
R4选自氢、Y-L(D)r、-(CH2)n-Y-L(D)r、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，所述烷基任选地被多个选自O、N和S的杂原子之一间断，其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基独立地为任选地取代的；且
n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在另一个优选实施方案中，R1为氢。在另一个优选实施方案中，R3为氢。在另一个优选实施方案中，n为1或2。在另一个优选实施方案中，R4为氢、Y-L(D)r或-(CH2)n-Y-L(D)r。在另一个优选实施方案中，R2为氢或L(D)r。在又一优选实施方案中，所述接头-缀合物具有式18：
其中Y、L、D、n和r为如上文定义的。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的抗体-药物缀合物可通过根据本发明的方法获得，其中在步骤(ii)中，所述经修饰的抗体为经叠氮化物修饰的抗体且其中所述接头-缀合物具有式(19)：
其中L、D和r为如上文定义的。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的抗体-药物缀合物可通过根据本发明的方法获得，其中在步骤(ii)中，所述经修饰的抗体为经叠氮化物修饰的抗体且其中所述接头-缀合物具有式(15)：
其中L、D和r为如上文定义的。
体内效能实验显示，根据本发明的抗体-药物缀合物对肿瘤体积有影响。
本发明还涉及根据本发明的抗体-药物缀合物用作药物，其中所述目的分子为活性物质。
本发明还涉及根据本发明的抗体-药物缀合物用于癌症治疗，其中所述目的分子为活性物质。
本发明还涉及根据本发明的抗体-药物缀合物用于乳腺癌治疗，更优选地用于HER2-阳性乳腺癌治疗，其中所述目的分子为活性物质。
本发明还涉及通过给予根据本发明的抗体-药物缀合物治疗癌症的方法。
本发明还涉及通过给予根据本发明的抗体-药物缀合物治疗乳腺癌的方法。
本发明还涉及通过给予根据本发明的抗体-药物缀合物治疗HER2-阳性乳腺癌的方法。
在一个优选实施方案中，在所述抗体-药物缀合物中的抗体为曲妥珠单抗。在又一优选实施方案中，所述目的分子为细胞毒素，优选美登木素生物碱、阿里他汀E、阿里他汀F、多卡米星或吡咯并苯并二氮杂卓。
在根据本发明的抗体-药物缀合物中，所述目的分子为活性物质。如上文所述，活性物质为药理学和/或生物学的物质，即具有生物学活性和/或药学活性的物质，例如药物或前药、诊断剂、蛋白质、肽、氨基酸、聚糖、脂质、维生素、类固醇、聚乙二醇、核苷酸、核苷、多核苷酸、RNA或DNA。合适的肽标签的实例包括细胞穿透肽如人乳铁蛋白或聚精氨酸。合适的聚糖的实例为低聚甘露糖。
在一个优选实施方案中，所述活性物质选自药物和前药。更优选地，所述活性物质选自药学活性化合物，特别是低至中分子量化合物(例如约200至约1500Da，优选约300至约1000Da)，例如细胞毒素类、抗病毒剂、抗菌剂、肽和寡核苷酸。细胞毒素类的实例包括喜树碱类、星形孢菌素、多柔比星、柔红霉素、秋水仙碱、甲胺蝶呤、紫杉烷类、刺孢霉素类、多卡米星、美登木素类和美登木素生物碱(即美登木素衍生物)、阿里他汀类、微管溶素M、念珠藻素或吡咯并苯并二氮杂卓类(PBDs)。阿里他汀类的实例包括多拉司他汀10、阿里他汀F、单甲基阿里他汀F(MMAF)、阿里他汀E、单甲基阿里他汀E(MMAE)、阿里他汀PE、阿里他汀TP和阿里他汀AQ。美登木素和美登木素生物碱类的实例包括美登素和安丝菌素。
在一个优选实施方案中，所述抗体-缀合物中的抗体为特异性结合癌抗原的抗体。特异性结合癌抗原的抗体的实例包括曲妥珠单抗、帕妥珠单抗(pertuzumab)、西妥昔单抗、利妥昔单抗、贝伐单抗、吉瑞昔单抗(girentuximab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、伊珠单抗(inotuzumab)、阿仑珠单抗、托西莫单抗(tositumumab)、伊匹木单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、扎木单抗(zanolimumab)、阿托珠单抗(obinutuzumab)、necitumumab、farletuzumab、维多珠单抗(vedolizumab)、tabalumab、itolizumab伊立珠单抗(itolizumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、sarilumab和雷莫芦单抗(ramicurumab)。
因此，本发明涉及根据本发明的抗体-药物缀合物用作药物，其中所述抗体为特异性结合癌抗原的抗体，且其中所述目的分子为细胞毒素。本发明还涉及根据本发明的抗体-药物缀合物用于癌症治疗，其中所述抗体为特异性结合癌抗原的抗体，且其中所述目的分子为细胞毒素。本发明还涉及根据本发明的抗体-缀合物用于乳腺癌治疗，更优选用于HER2阳性乳腺癌治疗，其中所述抗体为特异性结合癌抗原的抗体，且其中所述目的分子为细胞毒素。
在又一优选实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-缀合物用于癌症治疗，其中所述抗体-缀合物为曲妥珠单抗-(MMAF)2、曲妥珠单抗-(vc-PABA-MMAF)2、曲妥珠单抗(美登木素生物碱)2或曲妥珠单抗-(vc-PABA-美登木素生物碱)2。在又一优选实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-缀合物用于乳腺癌治疗，更优选用于HER2阳性乳腺癌治疗，其中所述抗体-缀合物为曲妥珠单抗-(MMAF)2、曲妥珠单抗-(vc-PABA-MMAF)2、曲妥珠单抗(美登木素生物碱)2或曲妥珠单抗-(vc-PABA-美登木素生物碱)2。
此外，本发明涉及通过给予根据本发明的抗体-药物缀合物治疗癌症的方法。本发明还涉及通过给予根据本发明的抗体-药物缀合物治疗乳腺癌的方法。本发明还涉及通过给予根据本发明的抗体-药物缀合物治疗HER2-阳性乳腺癌的方法。上文描述了所述抗体和目的分子的优选实施方案。
制备抗体-药物缀合物的方法
本发明还涉及制备根据本发明的抗体-药物缀合物的方法，包括下述步骤：
(i)使包含核心N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)取代基的抗体与式S(A)x-P的化合物在合适的催化剂的存在下接触，其中所述核心N-乙酰葡糖胺取代基为任选地被岩藻糖基化的；其中所述催化剂包含来自半乳糖基转移酶的突变型催化结构域；其中S(A)x是包含x个官能团A的糖衍生物，其中A独立地选自叠氮基、酮基和炔基且x为1、2、3或4；其中P选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)和胞苷二磷酸(CDP)；
以得到一种经修饰的抗体，其中经修饰的抗体被定义为包含GlcNAc-S(A)x取代基的抗体，所述GlcNAc-S(A)x取代基是通过所述GlcNAc-S(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1键合至该抗体，且其中所述经修饰的抗体为根据式(4)的抗体：
其中：
S(A)x和x为如上文定义的；AB代表抗体；GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；Fuc为岩藻糖；b为0或1；y为1至20；以及
(ii)使所述经修饰的抗体与接头-缀合物反应，其中：
(a)当所述经修饰的抗体为经叠氮化物修饰的抗体时，所述接头-缀合物包含(杂)环炔基或炔基和一个或多个目的分子；或
(b)当所述经修饰的抗体为经酮基修饰的抗体时，所述接头-缀合物包含伯胺基团、氨基氧基或肼基基团，以及一个或多个目的分子；或
(c)当所述经修饰的抗体为经炔烃修饰的抗体时，所述接头-缀合物包含叠氮基和一个或多个目的分子，
其中目的分子(D)通过接头(L)与该抗体缀合；其中所述目的分子为活性物质；且其中活性物质被定义为具有生物学活性和/或药学活性的物质。
在一个优选实施方案中，所述催化剂为包含来自β(1,4)-半乳糖基转移酶的突变型催化结构域的催化剂，优选地选自GalT Y289L、GalT Y289N和GalT Y289I。在另一个优选实施方案中，所述催化剂为包含来自β(1,4)-半乳糖基转移酶的突变型催化结构域的催化剂，选自GalT Y289F、GalT Y289M、GalT Y289V、GalT Y289G、GalT Y289I和GalT Y289A，优选地选自GalT Y289F和GalT Y289M。
在另一个优选实施方案中，x为1、2、3或4，优选地x为1或2，更优选地x为1。在又一优选实施方案中，y为1、2、3、4、5、6、7或8，优选地y为1、2、3或4，且更优选地y为1或2。
在一个具体的优选实施方案中，所述抗体为完全抗体且y为2，在另一个优选实施方案中，所述抗体为抗体片段且y为1。
在制备根据本发明的抗体-缀合物的方法的优选实施方案中，所述经修饰的抗体为经叠氮化物修饰的抗体，且所述接头-缀合物具有式(11)或(11b)：
其中：
D和L为如上文定义的；
r为1-20；
R1独立地选自氢、卤素、-OR5、-NO2、-CN、-S(O)2R5、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基且其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基是任选地取代的，其中两个取代基R1可被连接在一起形成增环的环烷基或增环的(杂)芳烃取代基，且其中R5独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
X为C(R1)2、O、S或NR2，其中R2为R1或L(D)r，其中L、D和r为如上文定义的；
q为0或1，条件是如果q为0则X为N-L(D)r；且
a为0、1、2、3、4、5、6、7或8；且
a'为0、1、2、3、4、5、6、7或8；且
a+a'<10。
优选地，a+a'为4、5、6或7，更优选地，a+a'为4、5或6，且最优选地，a+a'为5。
在根据本发明的方法的又一优选实施方案中，所述经修饰的抗体为经叠氮化物修饰的抗体，且所述接头-缀合物具有式(12)、(13)、(14)、(15)或(16)。
在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，所述经修饰的抗体为经叠氮化物修饰的抗体，且所述接头-缀合物具有式(17)：
其中：
R1、L、D和r为如上文定义的；
Y为O、S或NR2，其中R2为如上文定义的；
R3独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
R4选自氢、Y-L(D)r、-(CH2)n-Y-L(D)r、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，所述烷基任选地被多个选自O、N和S的杂原子之一间断，其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基为独立地任选地取代的；且
n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在根据本发明的方法的又一优选实施方案中，R1为氢。在另一个优选实施方案中，R3为氢。在另一个优选实施方案中，n为1或2。在另一个优选实施方案中，R4为氢、Y-L(D)r或-(CH2)n-Y-L(D)r。在另一个优选实施方案中，R2为氢或L(D)r。在又一优选实施方案中，所述接头-缀合物具有式18：
其中Y、L、D、n和r为如上文定义的。
在根据本发明的方法的又一优选实施方案中，所述经修饰的抗体为经叠氮化物修饰的抗体，且所述接头-缀合物具有式(19)：
其中L、D和r为如上文定义的。
在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，所述经修饰的抗体为经叠氮化物修饰的抗体，且所述接头-缀合物具有式(15)：
其中L、D和r为如上文定义的。
根据本发明的经修饰的抗体、抗体-缀合物和抗体-药物缀合物
根据本发明的经修饰的抗体、抗体-缀合物、抗体-药物缀合物及其制备方法具有几个超越本领域已知的经修饰的抗体、抗体-缀合物及其制备方法的优点。
如上所述，已知的用于将接头-毒素缀合至抗体的方法仍需要改进，不仅在位点-特异性和化学计量的控制方面，还在缀合方法的效率方面。尽管ADC具有导向(home in)其靶标的能力，估计进入肿瘤细胞的药物的量通常小于给药剂量的2％。此问题被本领域已知的ADC的不可预测的缀合结果放大。此问题被本领域中已知的ADC的不可预测的缀合结果放大。重要的是避免过少缀合(underconjugated)的抗体(其降低了效力)，以及高度缀合的种类(其可能具有显著降低的循环半衰期、减弱的与靶蛋白的结合、以及增加的毒性)。
对于抗体-药物缀合物，目的分子(例如药物，活性物质)向抗体上的负载的量度为所谓的药物与抗体比例(DAR)，其给出了根据统计学分布计算的每个抗体上活性物质分子的平均数量。特定类型的ADC的DAR理论最大值等于锚定位点的数目。如上所述，制备现有技术中已知的ADC的方法通常产生包含每个抗体-缀合物上存在不同数量的目的分子的抗体-缀合物的混合物的产物，以及具有高标准偏差的DAR。
根据本发明的经修饰的抗体和抗体-缀合物的优点之一是，这些抗体和抗体-缀合物在位点-特异性和化学计量方面都是同质的。因此本发明还涉及抗体-药物缀合物，其中所述抗体-药物缀合物是同质的。还优选所述抗体-药物缀合物在位点-特异性和化学计量方面是同质的。还优选所获得的抗体-药物缀合物具有接近理论值的药物与抗体比例(DAR)，并具有低的标准差。
在一个优选实施方案中，根据本发明的经修饰的抗体和抗体-缀合物在位点-特异性和化学计量方面都是同质的。本文中，当缀合仅在预定位点以预定药物-抗体比例发生时，抗体或抗体-缀合物被认为是同质的。当抗体的缀合在抗体的不同位点进行时，抗体-缀合物是异质的，产生了具有不可预测的药物-抗体比例的产物的混合物。在后一种情况下，所述药物-抗体比例将是整个抗体-药物缀合物组的平均数。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的抗体-缀合物具有处于其理论值的10％之内的DAR。
所述经修饰的抗体和抗体-缀合物以非常接近理论值的DAR且非常低的标准差得到。这也意味着根据本发明的抗体-缀合物产生了更一致的产物用于临床前测试。
根据本发明的方法和抗体的另一个优点涉及减少生产中的浪费，由此增强了公司的成本管理(cost-of-goods)。
此外，制备经修饰的抗体和制备根据本发明的缀合的抗体的方法高效地进行。反应动力学是非常有利的，导致了在相对短的时期内几乎完全的转化(特别是当本领域已知的方法比较时)，并且未形成或几乎未形成任何副产物。
此外，通过环加成反应，将本发明的经叠氮化物-修饰的抗体偶联到包含炔基的接头-缀合物上时，或将本发明的经炔烃-修饰的抗体偶联到包含叠氮化物部分的接头-缀合物上时，所得到的三唑类不易受到水解或其他降解途径的影响。当将本发明的经酮类-修饰的抗体偶联到包含羟胺或肼类的接头-缀合物上时，所得到的肟或腙在中性条件下也是相对惰性的。
因此，其他优点是本发明的抗体-缀合物的稳定性，以及将叠氮基、酮基和/或炔基引入至抗体的直接且普遍适用的方法。
如上文所述，根据本发明的抗体-缀合物具有几个优于现有技术已知的抗体-缀合物的优点。本发明的经修饰的抗体、抗体-缀合物及其制备方法的优点之一是这些抗体和抗体-缀合物在位点-特异性和化学计量方面都是同质的。所得的根据本发明的经修饰的抗体和抗体-缀合物具有接近理论值的DAR，并具有非常低的标准差。这也意味着根据本发明的抗体-缀合物产生了更一致的产物用于临床前测试。
根据本发明的抗体缀合物的性质是通过设计、表达带有不同糖基化特征的单克隆抗体和将其加工到抗体-药物缀合物中。可被调节的性质为例如抗肿瘤活性、最大耐受剂量、药代动力学比如血浆清除率、治疗指数，在效力和毒性两方面，药物的衰减(attenuation)、药物结合的稳定性以及在达到靶点后的药物的释放。特别地，在药物的定位和ADC的体内效力之间有关联。
体内和体外实验表明，根据本发明的抗体-缀合物对表达HER2的细胞具有细胞毒性作用。体外实验证明，相对于HER2-阴性细胞系，根据本发明的抗体-药物缀合物能够选择性地杀死表达HER2的细胞系，如图24-26中的总结。体内实验证明，几个根据本发明的抗体-缀合物的单剂量能够从小鼠异种移植物中消除表达HER2的肿瘤，如图29和30所明确示出。此外，已经证明根据本发明的抗体-缀合物具有与天然抗体曲妥珠单抗相同的药代动力学特征，如图27中总结的。
因此，本发明还涉及根据本发明的抗体-缀合物用作药物。本发明还涉及根据本发明的抗体-缀合物用于癌症治疗。本发明还涉及根据本发明的抗体-缀合物用于乳腺癌治疗，更优选用于HER2-阳性乳腺癌治疗。
在一个优选实施方案中，所述抗体-缀合物中的目的分子为活性物质，即具有生物学活性和/或药学活性的物质。优选地，所述活性物质为细胞毒素。细胞毒素类的实例包括喜树碱类、多柔比星、柔红霉素、紫杉烷类、刺孢霉素类、多卡米星、美登木素类和美登木素生物碱(即美登木素衍生物)类、阿里他汀或吡咯并苯并二氮杂卓类(PBD)。细胞毒素类的实例包括喜树碱类、星形孢菌素、多柔比星、柔红霉素、秋水仙碱、甲胺蝶呤、紫杉烷类、刺孢霉素类、多卡米星、美登木素类和美登木素生物碱(即美登木素衍生物)类、阿里他汀、微管溶素M、念珠藻素或吡咯并苯并二氮杂卓类(PBD)。阿里他汀的实例包括多拉司他汀10、阿里他汀F、单甲基阿里他汀F(MMAF)、阿里他汀E、单甲基阿里他汀E(MMAE)、阿里他汀PE、阿里他汀TP和阿里他汀AQ。美登木素类和美登木素生物碱类的实例包括美登素和安丝菌素。
在一个优选实施方案中，所述抗体-缀合物中的抗体为特异性结合癌抗原的抗体。特异性结合癌抗原的抗体的实例包括曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、贝伐单抗、吉瑞昔单抗、吉妥珠单抗、伊珠单抗、阿仑珠单抗、托西莫单抗、伊匹木单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、埃罗妥珠单抗、扎木单抗、阿托珠单抗、necitumumab、farletuzumab、维多珠单抗、tabalumab、伊立珠单抗、奥瑞珠单抗、依帕珠单抗、美泊利单抗、瑞利珠单抗、sarilumab和雷莫芦单抗。
因此，在一个优选实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-缀合物用作药物，其中所述抗体为特异性结合癌抗原的抗体且其中所述目的分子为细胞毒素。在另一个优选实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-缀合物用于癌症治疗，其中所述抗体为特异性结合癌抗原的抗体且其中所述目的分子为细胞毒素。在另一个优选实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-缀合物用于乳腺癌治疗，更优选用于HER2阳性乳腺癌治疗，其中所述抗体为特异性结合癌抗原的抗体且其中所述目的分子为细胞毒素。
在又一优选实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-缀合物用于癌症治疗，其中所述抗体-缀合物为曲妥珠单抗-(vc-PABA-MMAF)2或曲妥珠单抗-(vc-PABA-美登木素生物碱)2。在又一优选实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-缀合物用于乳腺癌治疗，更优选用于HER2阳性乳腺癌治疗，其中所述抗体-缀合物为曲妥珠单抗-(vc-PABA-MMAF)2或曲妥珠单抗-(vc-PABA-美登木素生物碱)2。
此外，本发明涉及通过给予根据本发明的抗体-药物缀合物治疗癌症的方法。本发明还涉及通过给予根据本发明的抗体-药物缀合物治疗乳腺癌的方法。本发明还涉及通过给予根据本发明的抗体-药物缀合物治疗HER2-阳性乳腺癌的方法。以上描述了所述抗体和目的分子的优选实施方案。
组件试剂盒
本发明还涉及一种组件试剂盒，包括根据本发明的经修饰的抗体以及接头-缀合物。所述经修饰的抗体和接头-缀合物及其优选实施方案在上文中更详细的描述。
在一个优选实施方案中，本发明涉及一种组件试剂盒，包括根据本发明的经叠氮化物修饰的抗体以及根据式11的接头-缀合物：
其中R1、X、L、D、a、r和q为如上文定义的。
所述经叠氮化物修饰的抗体和所述接头-缀合物11的优选实施方案在上文中更详细的描述。
实施例
合成
实施例1–4：BCN-多柔比星28a和28b的合成
图7示出了在实施例1-4中实施的从BCN-OSu 23开始合成接头-缀合物BCN-多柔比星28a的反应方案。
实施例1.BCN-胺24的合成
在3小时期间向2,2'-(亚乙基二氧)双(乙胺)(11.78mL，80.5mmol)的DCM(200mL)溶液中滴加BCN-OSu 23(7.82g，26.8mmol)的DCM(100mL)溶液。在加完之后，将混合物搅拌10分钟，然后用饱和NH4Cl水溶液(3×200mL)清洗。有机层用Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。快速柱层析(DCM:MeOH 99:1-93:7+1％Et3N)得到产物24(5.95g，54.7mmol，68％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ5.38(s，1H)，4.13(d，J＝8.1Hz，2H)，3.59(s，4H)，3.56-3.50(m，4H)，3.35(q，J＝5.1Hz，2H)，2.88(t，J＝5.1Hz，2H)，2.32(br s，2H)，2.27-2.15(m，6H)，1.62-1.42(m，2H)，1.33(qn，J＝8.7Hz，1H)，0.97-0.85(m，2H).13C-NMR(CDCl3，75MHz)δ156.4，98.3，68.7(2C)，62.2，45.5，40.3，40.2，28.6，20.9，19.6，17.3.HRMS(ESI+)计算值C17H28N2NaO4(M+Na+)347.1947，实测值347.1952.
实施例2.BCN-生物素25的合成
向BCN衍生物24(0.80g，2.47mmol)的DCM(25mL)溶液中加入生物素-OSu(0.93g，2.71mmol)和Et3N(0.86mL，6.16mmol)。将反应混合物搅拌5小时，随后加入饱和NaHCO3水溶液(20mL)。有机层用饱和NaHCO3水溶液(2×20mL)清洗，用Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。快速柱层析(DCM:MeOH 99:1-92:8)提供了BCN生物素25(1.14g，2.1mmol，84％)。1H-NMR(400MHz，CDCl3):δ6.57(s，1H)，6.44(s，1H)，5.48(s，1H)，5.37(s，1H)，4.52-4.48(m，1H)，4.33-4.30(m,1H)，4.16(d，J＝8Hz，2H)，3.62(s，4H)，3.57(t，J＝5.2Hz，4H)，3.45(q，J＝5.2Hz，2H)，3.40-3.36(m，2H)，3.17-3.12(m，1H)，2.92(dd，J＝8，4.8Hz，1H)，2.72(d，J＝12.8Hz，1H)，2.33-2.18(m，8H)，1.88(br s，1H)，1.80-1.57(m，6H)，1.49-1.33(m，3H)，0.95(t，J＝9.6Hz，2H).13C-NMR(CDCl3，75MHz)δ172.9，163.6，156.4，98.3，69.6，61.3，59.7，55.2，40.3，40.0，38.7，35.5，28.6，27.8，27.6，25.1，21.0，19.7，17.3.HRMS(ESI+)计算值C27H43N4O6S(M+H+)551.2903，实测值551.2911。
实施例3.活性酯26的合成
将BCN-胺24(3.6g，11.1mmol)溶于DCM(150mL)中，并且加入戊二酸酐(1.39g，12.2mmol)和Et3N(4.61mL，33.3mmol)。将反应混合物搅拌2小时，随后加入DSC(4.3g，16.7mmol)。2小时后用H2O(100mL)停止反应，然后用水(2×150mL)清洗有机层，用Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。快速柱层析(EtOAc:MeOH 99:1-94:6)提供了活性酯26(4.63g，8.6mmol，78％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3):δ4.14(d，J＝8.1Hz，2H)，3.59(s，4H)，3.57-3.52(m，4H)，3.44(q，J＝5.1Hz，2H)，3.35(q，J＝4.8Hz，2H).2.83(br s，4H)，2.67(t，J＝7.2Hz，2H)，2.33-2.16(m，7H)，2.08(qn，J＝6.9Hz，2H)，1.65-1.49(m，2H)，1.33(t，J＝9.0Hz，1H)，0.97-0.87(m，2H).
LRMS(ESI+)计算值C26H37N3O9(M+H+)536.26，实测值536.0。
实施例4.BCN-多柔比星缀合物28a的合成
向活性酯26(5mg，0.0093mmol)和多柔比星.HCl(27，10mg，0.017mmol)的DMF(0.5mL)溶液中加入Et3N(5μL，0.036mmol)并将混合物搅拌过夜。减压下去除溶剂，然后用快速柱层析纯化粗产物(DCM:MeOH 99:1-80:20)以提供BCN-多柔比星28a(6mg，0.0062mmol，66％)。LRMS(ESI+)计算值C49H61N3O17(M+H+)964.4，实测值963.9。
实施例4-2.BCN-多柔比星缀合物28b的合成
向H2N-PEG8-COOH(822mg，1.86mmol)的THF:H2O 1:1(20mL)溶液中加入BCN-OSu(23)(651mg，2.23mmol)和Et3N(774μL，5.59mmol)。室温下搅拌反应液1.5小时并酸化至pH1，随后用EtOAc(3x35mL)萃取。将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并在减压下去除溶剂。然后将粗产物溶于干燥的DCM(20mL)中，随后加入DCC(461mg，2.23mmol)和NHS(257mg，2.23mmol)。在室温下搅拌1小时后，过滤反应物并在真空下浓缩滤液。快速层析(MeCN，MeCN:H2O 30:1)提供了BCN-PEG8-COOSu。
1H-NMR(300MHz，CDCl3):δ5.44(br s，1H)，4.14)d，J＝8.1Hz，2H)，3.84(t，J＝6.3Hz，2H)，3.68-3.63(m，30H)，3.56(t，J＝5.2Hz，2H)，3.34(q，J＝5.4Hz，2H)，2.90(t，J＝6.3Hz，2H)，2.85(s，4H)，2.36-2.14(m，6H).1.72-1.49(m，2H)，1.36(qn，J＝8.7Hz，1H)，1.02-0.88(m，2H).
LRMS(ESI+)计算值C34H54N2O14(M+Na+)737.35，实测值737.3。
向多柔比星.HCl(27，500mg，0.862mmol)的无水DMF(10mL)溶液中加入三乙胺(361μL，262mg，2.59mmol)和BCN-PEG8-COOSu(678mg，0.948mmol)的DMF(10mL)溶液。将得到的混合物搅拌22小时并用3g的硅胶浓缩。在通过柱层析纯化后，得到的产物为红色无定形物质(757mg，0.66mmol，77％)。
LRMS(HPLC，ESI–)计算值C57H77N2O22(M-H+)1141.5，实测值1142.2。
实施例5.DIBAC-生物素30的合成(在图8中图解描述)
向胺29(购自ClickChemistryTools)(50mg，0.18mmol)的DMF(2mL)溶液中加入生物素-OSu(62mg，0.18mmol)和Et3N(50μL，0.36mmol)。将反应混合物搅拌3小时，随后在减压下浓缩。快速柱层析(DCM:MeOH 99:1-90:10)提供DIBAC-生物素30(44mg，0.09mmol，49％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3):δ7.66-7.62(m，1H)，7.40-7.24(m，7H)，6.67-6.60(m，1H)，6.53-6.49(m，1H)，5.75(d，J＝8.8Hz，1H)，5.13(dd，J＝2.9，14.0Hz，1H)，4.47-4.43(m，1H)，4.29-4.28(m，1H)，3.68(d，J＝13.9Hz，1H)，3.34-3.30(m，1H)，3.17-3.08(m，2H)，2.92-2.67(m，3H)，2.50-2.42(m，1H)，2.10-1.95(m，2H)，1.73-1.24(m，6H).LRMS(ESI+)计算值C28H30N4O3S(M+H+)503.2，实测值503.1。
实施例6–9:BCN-多柔比星缀合物35的合成
图9示出了在实施例7-10中实施的从Fmoc-瓜氨酸31开始合成BCN-多柔比星缀合物35的反应方案。
实施例6.瓜氨酸衍生物32的合成
在–40℃下将氯甲酸异丁酯(99μL，0.76mmol)和N-甲基吗啉(83μL，0.76mmol)加入Fmoc-瓜氨酸31(300mg，0.76mmol)的THF溶液。将溶液搅拌2小时，随后加入对-氨基苯甲醇(112mg，0,91mmol)和N-甲基吗啉(100μL，0.91mmol)。搅拌1小时后将溶液慢慢升温至室温，2小时后将反应混合物在减压下浓缩。通过快速柱层析(DCM:MeOH 99:1-80:20)纯化得到瓜氨酸衍生物32(346mg，0.69mmol，90％)。LRMS(ESI+)计算值C28H30N4O5(M+H+)503.2，实测值503.1。
实施例7.二肽33的合成
将瓜氨酸衍生物32(100mg，0.20mmol)溶于DMF(1.6mL)，并且加入哌啶(333μL)。2小时后，将反应物在减压下浓缩并将粗产物溶于DMF(2mL)中。加入Alloc-Val-OSu(60mg，0.20mmol)和Et3N(58μL，0.40mmol)，将混合物搅拌过夜并随后在真空下浓缩。通过快速柱层析纯化(DCM:MeOH 99:1-90:10)得到二肽33(65mg，0.14mmol，70％)。LRMS(ESI+)计算值C22H33N5O6(M+H+)464.2，实测值464.0。
实施例8.二肽-多柔比星34的合成
向二肽33(40mg，0.086mmol)的DMF(0.5mL)溶液中加入Et3N(36μL，0.26mmol)和DSC(66mg，0.26mmol)。将反应混合物搅拌过夜，随后在减压下浓缩。通过快速柱层析(DCM:MeOH 99:1-90:10)纯化得到产物(30mg，0.05mmol，58％)，立即将其溶于DMF(0.5mL)中。加入多柔比星.HCl 27(29mg，0.05mmol)和Et3N(20μL，0.15mmol)，将反应混合物搅拌2小时并随后在减压下浓缩。通过快速柱层析纯化(DCM:MeOH 99:1-80:20)提供二肽-多柔比星34(34mg，0.033mmol，66％)。LRMS(ESI+)计算值C50H60N6O18(M+H+)1033.4，实测值1032.9。
实施例9.BCN-多柔比星缀合物35的合成
将二肽-多柔比星34(8mg，0.008mmol)溶于DMF(0.5mL)并加入三苯基硅烷(7μL，0.054mmol)和Pd(PPh3)4(0.6mg，0.0005mmol)。搅拌过夜后，将反应物在减压下浓缩，然后悬浮于DCM(2mL)中。过滤后得到的粗产物为红色固体，将其溶于DMF(0.5mL)中。加入BCN衍生物26(3mg，0.006mmol)和Et3N(2μL，0.014mmol)，然后将反应液搅拌过夜。在减压下去除溶剂并通过快速柱层析纯化(DCM:MeOH 99:1-60:40)提供BCN-多柔比星缀合物35(3mg，0.002mmol，27％)。LRMS(ESI+)计算值C68H88N8O22(M+H+)1369.8，实测值1369.3。
实施例9-2.BCN-vc-PABA-MMAE(37a)的合成
向Val-Cit-PAB-MMAE.TFA(8.0mg，6.5μmol)和三乙胺(3.5μL)的无水DMF(1mL)溶液中加入BCN-PEG2-OSu(2.7mg，6.5μmol)(36)的DMF(0.78mL)溶液。在通过反相HPLC(C18，梯度H2O/MeCN)纯化后得到产物(6mg，4μmol，62％)。LRMS(ESI+)计算值C74H115N11NaO17(M+Na+)1452.84，实测值1452.7。
实施例9-3.BCN-vc-PABA-MMAF(37b)的合成
向Val-Cit-PAB-MMAF.TFA(17.9mg，14.3μmol)的DMF(2mL)溶液中加入BCN-PEG2-OSu(17.9mg，14.3μmol)(36)的DMF(0.78mL)溶液和三乙胺(6.0μL)。通过反相HPLC(C18，梯度H2O/MeCN 1％AcOH)纯化后得到产物(7mg，5μmol，35％)。LRMS(HPLC，ESI+)计算值C74H114N11O18(M+H+)1444.83，实测值1445.44。
实施例9-4.BCN-MMAF(38)的合成
向Val-Cit-PABA-MMAF(7.6mg，0.0074mmol)的DMF(0.2mL)溶液中加入BCN-OSu酯26(8mg，0.015mmol)和Et3N(3μL，2.2mg，0.022mmol)。反应过夜后，将混合物浓缩。通过柱层析(MeOH/DCM 1/3)纯化产生所需产物(3.4mg，0.0022mmol，29％)。LRMS(HPLC，ESI+)计算值C80H125N12O19(M+H+)1557.92，实测值1558.16。
实施例9-5.BCN-vc-PABA-美登木素生物碱(39)的合成
向Val-Cit-PABA-β-丙氨酰基(alaninoyl)-美登木素生物碱(购自Concortis)(27mg，0.022mmol)的MeCN(2mL)悬浮液中加入三乙胺(9.2μL，6.7mg，0.066mmol)和BCN-PEG2OSu碳酸酯(9.2mg，0.022mmol)的MeCN(1mL)溶液。23小时后，将混合物倒入EtOAc(20mL)和水(20mL)的混合物中。在分离后，将有机相干燥(Na2SO4)并浓缩。通过柱层析(EtOAc→MeOH/EtOAc 1/4)纯化后得到22mg(0.015mmol，70％)的所需产物。LRMS(ESI+)计算值C70H97ClN10O20(M+H+)1432.66，实测值1434.64。
实施例9-6.马来酰亚胺-vc-PABA-美登木素生物碱(40)的合成
向Val-Cit-PABA-β-丙氨酰基-美登木素生物碱(13.9mg，0.011mmol)(购自Concortis，San Diego，USA)的无水DMF(1mL)溶液中加入三乙胺(4.5μL，3.3mg，0.033mmol)和6-(马来酰亚胺基)己酸N-琥珀酰亚胺酯(3.9mg，0.013mmol)。在搅拌合适的时间之后，在EtOAc(20mL)和饱和NaHCO3水溶液(10mL)之间分配所得混合物。在分离后，用EtOAc(20mL)萃取水层。将合并的有机相干燥(Na2SO4)并浓缩。通过反相HPLC(C18，梯度H2O/MeCN)纯化后，得到10mg(0.0077mmol)的所需产物。LRMS(HPLC，ESI+)计算值C64H88ClN10O18(M+H+)1390.60，实测值1390.52。
上述实施例9-3至9-6在方案10a中图解描述。
实施例9-7.DIBAC-vc-PABA-MMAF 41的合成(在方案11中图解描述)
在室温下将DIBAC-胺29(购自ClickChemistryTools)(430mg，1.50mmol)溶于DCM(15mL)中并用戊二酸酐(213mg，1.87mmol)和Et3N(647μL，4.67mmol)处理。将反应物搅拌2小时，随后加入DSC(478mg，1.87mmol)。在室温下又搅拌2小时后，加入DCM(30mL)并用H2O(3x 20mL)清洗反应物。将有机相用Na2SO4干燥并在减压下去除溶剂。快速层析(0:100-2:98EtOAc:MeOH)提供DIBAC-OSu酯(368mg，0.75mmol，48％)。
接着，向DIBAC-OSu酯(1mg，0.003mmol)的DMF(0.2mL)溶液中加入vc-PABA-MMAF(2mg，0.002mmol)和三乙胺(1μL，0.007mmol)。将溶液搅拌过夜，随后浓缩。用HPLC(反相，MeCN:H2O+0.1％TFA)纯化得到41(0.9mg，0.0006mmol，33％)。LCMS分析得到一个质量为1510.40的峰(预期值C81H113N12O16＝1510.83)。
实施例9-8–9-11.合成其他多柔比星-环辛炔的一般方案
向0.1M的活化的环辛炔(1-2当量)的DCM/DMF(1:1)溶液中加入多柔比星.HCl(27，1当量)和三乙胺(1.5当量)。将红色溶液搅拌过夜，随后在真空下浓缩。使用DMF作溶剂将粗的混合物预装在硅胶上，随后通过柱层析(DCM→DCM:MeOH 8:2)得到所需产物。
实施例9-9.多柔比星-MFCO 42的合成
依照一般方案使MFCO-OSu酯(购自Berry and Associates，Dexter，Michigan，USA)(3.4mg，0.009mmol)与多柔比星.HCl(27，5mg，0.009mmol)反应产生多柔比星-MCFO 42(5mg，0.006mmol，69％)。LCMS分析给出了一个质量为831.88的峰(预期值C42H49FN2NaO13＝831.31)。
实施例9-10.多柔比星-环辛炔43的合成
将环辛-4-炔-1-醇(Chem.Ber.1986，119，297–312.)转化为其对硝基苯基碳酸酯衍生物(5mg，0.017mmol)，依照一般方案使所述对硝基苯基碳酸酯衍生物与多柔比星.HCl(27，5mg，0.009mmol)反应，以提供多柔比星-环辛炔43(6mg，0.008mmol，94％)。
实施例9-11.多柔比星-DIBO 44的合成
根据一般方案使DIBO OSu碳酸酯(购自LifeTechnologies，5mg，0.013mmol)与多柔比星(27，5mg，0.009mmol)反应，以提供DIBO-多柔比星44(7mg，0.008mmol，90％)。
上述实施例9-8至9-11在方案12中图解描述。
实施例9-12.炔烃-生物素45的合成
向生物素-PEG3-NH2的二氯甲烷(6mL)溶液中加入三乙胺(54μL，39mg，0.39mmol)和戊-4-酸(pent-4-ynoic acid)琥珀酰亚胺酯(25mg，0.13mmol)。在19小时后，将反应混合物浓缩并通过柱层析纯化残余物(5→20％MeOH的DCM溶液)。将纯化的产物溶于DCM，过滤并浓缩，产生的所需产物为白色固体(52mg，0.11mmol，85％)。
实施例9-13.O-烷基羟胺生物素47的合成
向二乙二醇(0.89mL，1g，9.42mmol)的干燥的THF(80mL)溶液中加入PPh3(5.43g，20.7mmol)和N-羟基邻苯二甲酰亚胺。在冷却至0℃之后加入40％DEAD的甲苯溶液(9.44mL，20.7mmol)。将混合物搅拌21小时。将产物过滤出并用EtOAc清洗。得到白色固体的产物(1.73g，4.37g)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)7.85–7.66(m，8H)，4.31–4.20(m，4H)，3.92–3.78(m，4H).
接着，将前面的步骤中得到的1.5g(3.78mmol)的产物溶于7N NH3的MeOH溶液中，加热至40℃并搅拌20h。然后冷却至室温同时将氩气鼓泡通过反应混合物。将反应混合物浓缩，并将残余物溶于DCM(50mL)，过滤并浓缩。通过柱层析纯化残余物(2→5％MeOH的DCM溶液)。产率：0.46g(3.38mmol，89％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ5.51(s，4H)，3.88–3.82(m，4H)，3.71–3.64(m，4H).
上述实施例9-12和9-13在方案13中图解描述。
实施例9-14–9.17：UDP-GalNAc衍生物52-55的合成
图14示出了从51开始合成UDP-GalNAc衍生物52-54的反应方案。化合物55和56购自Glycohub，Inc.(USA)。
实施例9-14.UDP-GalNH251的合成
根据Linhardt et al.，J.Org.Chem.2012，77，1449-1456中描述的用于D-葡糖胺的方法从D-半乳糖胺制备化合物48。
1H-NMR(300MHz，CD3OD):δ5.69(dd，J＝6.84，6.84Hz，1H)，5.43-5.41(m，1H)，5.35(dd，J＝10.9，3.4Hz，1H)，4.54(t，J＝6.48Hz，1H)，4.23-4.12(m，1H)，4.04(dd，J＝10.9，6.1Hz，1H)，3.82(dt，J＝11.1，2.7Hz，1H)，2.12(s，3H)，2.00(s，3H)，1.99(s，3H).LRMS(ESI-)计算值C12H18N3O11(M-H+)410.06，实测值410.1。
接着，根据Baisch et al.Bioorg.Med.Chem.，1997，5，383-391，将化合物48与UMP偶联。
因此，将D-尿苷-5'-单磷酸二钠盐(1.49g，4.05mmol)的H2O(15mL)溶液用DOWEX50Wx8(H+形式)处理30分钟并过滤。滤液在室温下剧烈搅拌，同时逐滴加入三丁胺(0.966mL，4.05mmol)。再次搅拌30分钟之后，将反应混合物冻干并在真空下用P2O5再次干燥5小时。
将得到的三丁铵尿苷-5'-单磷酸盐在氩气气氛中溶于干燥的DMF(25mL)中。加入羰基二咪唑(1.38g，8.51mmol)并将反应混合物在室温下搅拌30分钟。接着，加入干燥的MeOH(180μL)并搅拌15分钟以去除过量的CDI。剩余的MeOH在高真空下去除15分钟。随后，将化合物48(2.0g，4.86mmol)溶于干燥的DMF(25mL)中，并将其逐滴加入至反应混合物中。使反应物在室温下搅拌2天，然后真空浓缩。咪唑-UMP中间体的消耗是通过MS监控。快速层析(7:2:1-5:2:1EtOAc:MeOH:H2O)提供产物49(1.08g，1.51mmol，37％)。
1H-NMR(300MHz，D2O):δ7.96(d，J＝8.0Hz，1H)，5.98-5.94(m，2H)，5.81-5.79(m，1H)，5.70(dd，J＝7.1，3.3Hz，1H)，5.49(dd，J＝15.2，2.6Hz，1H)，5.30(ddd，J＝18.5，11.0，3.2Hz，2H)，4.57(q，J＝6.0Hz，2H)，4.35-4.16(m，9H)，4.07-3.95(m，2H)，2.17(s，3H)，2.08(s，3H)，2.07(s，3H).
LRMS(ESI-)计算值C21H29N5O19P2(M-H+)716.09，实测值716.3。
根据Kiso et al.，Glycoconj.J.，2006，23，565-573将化合物49的去乙酰基化。
如此，将化合物49(222mg，0.309mmol)溶于水(2.5mL)并加入三乙胺(2.5mL)和MeOH(6mL)。将反应混合物搅拌3小时，然后真空浓缩，以提供粗的UDP-2-叠氮基-2-脱氧-D-半乳糖(50)。1H-NMR(300MHz，D2O):δ7.99(d，J＝8.2Hz，1H)，6.02-5.98(m，2H)，5.73(dd，J＝7.4，3.4Hz，1H)，4.42-4.37(m，2H)，4.30-4.18(m，4H)，4.14-4.04(m，2H)，3.80-3.70(m，2H)，3.65-3.58(m，1H).
LRMS(ESI-)计算值C15H23N5O16P2(M-H+)590.05，实测值590.2。
最后，向化合物50的H2O:MeOH 1:1(4mL)溶液中加入Lindlar’s催化剂(50mg)。将反应物在氢气气氛下搅拌5小时并用硅藻土过滤。将过滤器用水清洗(10ml)，并将滤液真空浓缩以提供UDP-D-半乳糖胺(UDP-GalNH2，51)(169mg，0.286mmol，两步的产率92％)。1H-NMR(300MHz，D2O):δ7.93(d，J＝8.1Hz，1H)，5.99-5.90(m，2H)，5.76-5.69(m，1H)，4.39-4.34(m，2H)，4.31-4.17(m，5H)，4.05-4.01(m，1H)，3.94-3.86(m，1H)，3.82-3.70(m，3H)，3.30-3.16(m，1H).LRMS(ESI-)计算值C15H25N3O16P2(M-H+)564.06，实测值564.1。
实施例9-15.UDP-GalNAz 52的合成
根据Hamilton et al，Chem.Eur.J.，2012，18，2361-2365中的方法制备叠氮基乙酸琥珀酰亚胺酯。
将UDP-D-半乳糖胺(51)(82mg，0.145mmol)溶于0.1M NaHCO3(2mL)中并加入叠氮基乙酸琥珀酰亚胺酯(86mg，0.435mmol)和DMF(2mL)。将反应物在室温下搅拌过夜并随后真空浓缩。快速层析(7:2:1-5:2:1EtOAc:MeOH:H2O)提供UDP-GalNAz(52)(34mg，0.052mmol，36％)。
1H-NMR(300MHz，D2O):δ8.73(d，J＝8.1Hz，1H)，5.90-5.82(m，2H)，5.49(dd，J＝6.9，3.3Hz，1H)，4.29-4.05(m，7H)，4.03-3.85(m，4H)，3.72-3.61(m，2H).
LRMS(ESI-)计算值C17H26N6O17P2(M-H+)647.08，实测值647.1。
实施例9-16.UDP-GalNAc-yne 53的合成
根据Rademann et al.，Angew.Chem.Int.Ed.，2012，51，9441-9447中的方法制备戊-4-酸琥珀酰亚胺酯。
将UDP-D-半乳糖胺(51)(53mg，0.094mmol)溶于0.1M NaHCO3(2mL)中，加入戊-4-酸琥珀酰亚胺酯(37mg，0.188mmol)和DMF(2mL)。将反应物在室温下搅拌过夜并真空浓缩。快速层析(7:2:1-5:2:1EtOAc:MeOH:H2O)提供UDP-GalNAc-yne(53)(42mg，0.065mmol，69％)。
1H-NMR(300MHz，D2O):δ7.78(d，J＝8.2Hz，1H)，5.84-5.76(m，2H)，5.39(dd，J＝6.8，3.2Hz，1H)，4.22-4.16(m，2H)，4.14-3.97(m，5H)，3.88-3.85(m，1H)，3.81-3.75(m，1H)，3.63-3.55(m，2H)，2.45-2.28(m，5H)，2.19(t，J＝2.4Hz，1H).
LRMS(ESI-)计算值C20H29N3O17P2(M-H+)644.09，实测值644.1。
实施例9-17.UDP-GalNLev 54的合成
根据Rademann et al.，Angew.Chem.Int.Ed.，2012，51，9441-9447中用于戊-4-酸琥珀酰亚胺酯的方法制备乙酰丙酸琥珀酰亚胺酯。
1H-NMR(300MHz，CDCl3):δ2.81(s，4H)，2.77(s，4H)，2.14(s，3H).
将UDP-D-半乳糖胺(51)(53mg，0.094mmol)溶于0.1M NaHCO3(2mL)中并加入乙酰丙酸琥珀酰亚胺酯(40mg，0.188mmol)和DMF(2mL)。将反应物在室温下搅拌过夜并在减压下去除溶剂。快速层析(7:2:1-5:2:1EtOAc:MeOH:H2O)提供UDP-GalNLev(54)(10mg，0.015mmol，16％)。
1H-NMR(300MHz，D2O):δ7.78(d，J＝8.4Hz，1H)，5.82-5.77(m，2H)，5.36(dd，J＝6.8，3.2Hz，1H)，4.22-4.15(m，2H)，4.13-3.95(m，5H)，3.88-3.84(m，1H)，3.82-3.75(m，1H)，3.64-3.52(m，3H)，2.74-2.61(m，2H)，2.47-2.37(m，2H)，2.05(s，3H).
LRMS(ESI-)计算值C20H31N3O18P2(M-H+)662.10，实测值662.1。
实施例9-18.BCN-MMAF(56)的合成
向MMAF.TFA(8.1mg，0.0096mmol)的DMF(0.3mL)溶液中加入Et3N(5μL，3.6mg，0.036mmol)和BCN-PEG2-OSu(36)(19mg，0.045mmol)。过夜反应后，将混合物浓缩。通过柱层析纯化(DCM→MeOH/DCM 1/3)产生所需产物。LRMS(HPLC，ESI+)计算值C55H87N6O13(M+H+)1039.63，实测值1039.72。
修饰IgG的通用方案
用endo S修剪IgG聚糖
使用来自酿脓链球菌的endo S(购自Genovis，Lund，Sweden)进行IgG聚糖的修剪。在37℃下将IgG(10mg/mL)在25mM Tris(pH 8.0)中与endo S(40U/mL)孵育约16小时。将去糖基化的IgG浓缩并用10mM MnCl2和25mM Tris-HCl(pH 8.0)使用Amicon Ultra-0.5Ultracel-10膜(Millipore)清洗。
质谱分析
将总量约为70μL的50μg(修饰的)IgG、1M Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA和30mMDTT的溶液在37℃下孵育20分钟以还原二硫键，以允许进行轻链和重链的分析。如果存在的话，叠氮基-官能度在这些条件下被还原为胺。还原的样品用milliQ使用Amicon Ultra-0.5Ultracel-10膜(Millipore)清洗三次并浓缩至10μM(修饰的)IgG。通过电喷雾电离飞行时间质谱(ESI-TOF)在JEOL AccuTOF上分析还原的IgG。使用Magtran软件得到解卷积谱。
实施例10.曲妥珠单抗的修剪(图15a+15b)
对曲妥珠单抗进行上述修剪方案。对峰进行解卷积之后，质谱显示出一个轻链峰和两个重链峰。两个重链峰属于：来自核心GlNAc(Fuc)取代的曲妥珠单抗的一个主产物(major product)(49496Da，总重链的90％)；以及来自核心GlcNac取代的曲妥珠单抗的一个次产物(minor product)(49351Da，总重链的±10％)。
实施例11.贝伐单抗的修剪
类似于曲妥珠单抗对贝伐单抗进行处理，导致形成一个主重链产物(50062Da，±90％)以及一些次重链产物(±10％)。
实施例12.西妥昔单抗的修剪
西妥昔单抗与曲妥珠单抗的区别在于其在N88处包含第二个N-糖基化位点。N88处的聚糖位于Fab区域并具有与N297处的聚糖不同的组成(constitution)。类似于曲妥珠单抗对西妥昔单抗进行处理，导致形成质量范围为51600Da-52300Da的重链产物(主峰在51663Da和51808Da处)，表明只有一种聚糖被endo S修剪，推测为N297处的聚糖。
实施例12-1.利妥昔单抗的修剪
类似于曲妥珠单抗对利妥昔单抗进行处理，导致形成一个主要的重链产物(49408Da)。
实施例12-2.尝试用endo H修剪曲妥珠单抗
将曲妥珠单抗与来自褶皱链霉菌(Streptomyces picatus)的内切糖苷酶H(EndoH)(购自New EnglandBioLabs)孵育。将endo H以不断增加的浓度(≤115U/μL)加入至曲妥珠单抗(10mg/mL)的50mM柠檬酸钠溶液(pH 5.5)中并在37℃下孵育16小时。质谱只显示出对应于天然糖基化的重链的峰(50589和50752Da分别对应G0F和G1F亚型)，表明曲妥珠单抗不能使用endo H修剪。
实施例12-3.尝试用endo M修剪曲妥珠单抗
将曲妥珠单抗(10mg/mL)与不断增加浓度的来自冻土毛霉(Mucor hiemalis)的内切-β-N-乙酰葡糖胺酶(endo M，≤231mU/mL)(购自TCI Europe N.V.)的50mM柠檬酸钠(pH6.0)溶液孵育，并在37℃下孵育16小时。质谱显示了对应于天然糖基化重链的主峰(50589和50752Da分别对应G0F和G1F亚型)。此外，观察到来自核心GlcNac取代的重链的次产物(49347Da，总重链的±5％)。这些结果表明只有缺乏核心岩藻糖的曲妥珠单抗糖形可被endo M修剪。
用Gal-T1(Y289L)进行半乳糖衍生物(例如叠氮糖)的糖基转移
使用牛β(1,4)-半乳糖基转移酶[β(1,4)-Gal-T1(Y289L)]的突变体实现通过酶法将半乳糖衍生物(例如包含叠氮基的糖)引入到IgG上。将去糖基化的IgG(如上面所述来制备，10mg/mL)与修饰的UDP-半乳糖衍生物(例如叠氮基修饰的糖-UDP衍生物)(0.4mM)和β(1,4)-Gal-T1(Y289L)(1mg/mL)在10mM MnCl2和25mM Tris-HCl(pH 8.0)中在30℃下孵育16小时。
将官能化的IgG(例如叠氮基-官能化的IgG)与蛋白质A琼脂糖(40μL/毫克IgG)在4℃下孵育2小时。蛋白质A琼脂糖用PBS洗三次，然后IgG用100mM甘氨酸-HCl(pH 2.7)洗脱。洗脱后的IgG用1M Tris-HCl(pH 8.0)中和，然后浓缩并用PBS使用Amicon Ultra-0.5Ultracel-10膜(Millipore)清洗至浓度为15-20mg/mL。
实施例13.曲妥珠单抗(GalNAz)2(图15c)
用UDP-N-叠氮基乙酰基半乳糖胺52(UDP-GalNAz)对曲妥珠单抗施行糖基转移方案。进行蛋白质A亲和纯化之后，质谱分析表明形成了：一个主产物(49713Da，总重链的90％)，因GalNAz转移至核心GlcNAc(Fuc)取代的曲妥珠单抗而得到；和一个次产物(49566Da，总重链的±10％)，因GalNAz转移至核心GlcNAc取代的曲妥珠单抗而得到。
实施例14.贝伐单抗(GalNAz)2
根据一般方案用Endo S修剪贝伐单抗(7.5mg，10mg/mL)。将修剪后的贝伐单抗(10mg/mL)与UDP-GalNAz 52(65μL，10mM)和β(1,4)-GalT1(Y289L)(75μL，2mg/mL)在10mMMnCl2和25mM Tris-HCl(pH 8.0)中在30℃下孵育16小时。用ProtA纯化得到了修饰的贝伐单抗(3.2mg)。AccuTOF分析显示形成了一个主要的重链产物(50282Da，±95％)。
实施例15.西妥昔单抗(GalNAz)2
根据一般方案用endo S修剪西妥昔单抗(7.5mg，10mg/mL)。将修剪过的西妥昔单抗(10mg/mL)与UDP-GalNAz 52(65μL，10mM)和β(1,4)-GalT1(Y289L)(75μL，2mg/mL)在10mMMnCl2和25mM Tris-HCl(pH 8.0)中在30℃下孵育16小时。用ProtA纯化得到了经修饰的西妥昔单抗(3.2mg)。AccuTOF分析显示形成了两个主要重链产物(51884Da和52029Da)，根据N297聚糖的修剪，但非Fab聚糖的修剪。
实施例15-1.利妥昔单抗(GalNAz)2
根据一般方案用endo S修剪利妥昔单抗(7.5mg，10mg/mL)。将修剪过的利妥昔单抗(10mg/mL)与UDP-GalNAz 52(65μL，10mM)和β(1,4)-GalT1(Y289L)(75μL，2mg/mL)在10mMMnCl2和25mM Tris-HCl(pH 8.0)中在30℃下孵育16小时。用ProtA纯化得到了经修饰的利妥昔单抗(3.2mg)。AccuTOF分析显示完全转化为目标产物(质量49625，预期质量49627)。
实施例15-2.吉瑞昔单抗(GalNAz)2
根据上面描述的一般方案用endo S修剪吉瑞昔单抗，导致形成一个主要的重链产物(49427Da)。随后如上所述将修剪过的吉瑞昔单抗与UDP-GalNAz和β(1,4)-Gal-T1(Y289L)孵育，导致形成了一个主要的重链产物(49643Da)。
实施例15-3.曲妥珠单抗(GalNAc-yne)2
将根据一般方案通过endo S处理曲妥珠单抗而得到的修剪的曲妥珠单抗(100μL，10mg/mL，6.6nmol)与UDP-GalNAc-yne(53)(5μL，10mM)和β(1,4)-Gal-T1(Y289L)(5μL，2mg/mL)在10mM MnCl2和25mM Tris-HCl(pH 8.0)中在30℃下孵育16小时。用ProtA纯化粗的混合物以提供trast-(GalNAc-yne)2(0.43mg)。AccuTOF分析显示90％转化为目标产物(质量49735，预期质量49736)，观察到10％的副产物(质量50379)。
实施例15-4.曲妥珠单抗(GalNLev)2
将根据一般方案通过endo S处理曲妥珠单抗而得到的修剪的曲妥珠单抗(100μL，10mg/mL，6.6nmol)与UDP-GalNLev(54)(10μL，10mM)和β(1,4)-Gal-T1(Y289L)(5μL，2mg/mL)在10mM MnCl2和25mM Tris-HCl(pH 8.0)中在30℃下孵育16小时。用ProtA纯化粗的混合物以得到trast-(GalNLev)2(0.53mg)。AccuTOF分析显示95％转化为目标产物(质量49753，预期质量49754)，观察到5％的副产物(质量50417)。
混合血浆IgG的修剪和向混合血浆IgG的GalNAz-转移
实施例15-5.血浆IgG的质谱分析
向包含0.5mg混合血浆IgG(LeeBiosolutions，Inc)的反应混合物中加入PBS(220μL)和消化缓冲液(250μL，0.1mg/mL木瓜蛋白酶，0.02M半胱氨酸，0.02M EDTA，在PBS中)，随后在37℃下孵育1小时。随后加入蛋白质A浆体(100μL)并将混合物颠倒(end-over-end)旋转混合1小时。蛋白质A用PBS(3×1mL)清洗，随后用甘氨酸.HCl缓冲液(pH 2.7，0.1M，300μL)洗脱。将所述洗脱的缓冲液用Tris-HCl(pH 8.0，1M，80μL)中和，随后取出样品根据标准方法进行质谱分析(图14a)。
实施例15-6.混合血浆IgG的修剪
将混合血浆IgG(170μL，14mg/mL)用endo S(16μL，20U/μL)在98μL Tris-HCl(25mM，pH 8.0)中在37℃下修剪16小时。根据分析方案进行分析。AccuTOF检测显示了完全的转化。
上述实施例15-5和15-6在方案16中图解描述。
实施例15-7.至血浆IgG的GalNAz-转移
将修剪后的血浆IgG(46μL，10.8mg/mL，3.3nmol)与UDP-GalNAz52(3.3μL，10mM)和β1,4-Gal-T1(Y289L)(2.5μL，2mg/mL)在10mM MnCl2和25mM Tris-HCl(pH 8.0)中在30℃下孵育16小时。根据分析方案对血浆IgG进行分析，AccuTOF测量显示出完全的转化。
通过环加成反应使叠氮基-修饰的IgG与环辛炔探针的缀合
共价连接的BCN-或DIBAC-官能化的分子(在DMSO中)用PBS稀释。加入纯化的包含叠氮基的IgG(100μL，10mg/mL)，然后将反应混合物在4℃下颠倒旋转12至72小时。将得到的IgG缀合物浓缩并用PBS使用Amicon Ultra-0.5Ultracel-10Membrane(Millipore)清洗至终浓度为10mg/mL。
通过张力引发的环加成反应使叠氮基-修饰的IgG与环辛炔探针的缀合反应
进行蛋白质A纯化之后，将包含叠氮基的IgG(100μM或15mg/mL)加入至0.01体积的40mM的共价连接的环辛炔官能化的分子(4当量)在DMSO或DMF中的储备液中，立即混合然后在室温下颠倒旋转12至24小时。如果需要的话，重复此方法以得到完全的转化。
将得到的IgG缀合物浓缩并用PBS使用Amicon Ultra-0.5Ultracel-10Membrane(Millipore)清洗，至终浓度为10mg/mL。
在ADC的情况下，此步骤是由通过在Superdex200柱上的尺寸排阻色谱法进行的纯化来代替。
实施例16.BCN-生物素与曲妥珠单抗(GalNAz)2的缀合
将BCN-生物素缀合物25(2μL 100mM在DMSO中)用PBS(98μL)稀释，然后将5μL此溶液与曲妥珠单抗(GalNAz)2(5μL 10mg/ml在PBS中)混合。清洗并浓缩，随后的质谱分析表明存在一个主产物(50294Da,总重链的90％)和次产物(50148Da，总重链的±10％)。
实施例17.DIBAC-生物素对曲妥珠单抗(GalNAz)2的偶联
DIBAC-生物素缀合物30(2μL 100mM在DMSO中)用PBS(98μL)稀释，然后对5μL此溶液进行曲妥珠单抗(GalNAz)2(5μL 10mg/ml在PBS中)处理。清洗并浓缩，随后质谱分析表明存在一个主产物(50247Da,总重链的90％)和次产物(50101Da，总重链的±10％)。
实施例17-1.DIBAC-vc-PABA-MMAF 41与曲妥珠单抗(GalNAz)2的缀合
1天后根据AccuTOF分析表明实现全部的转化。观察质量为51248，预期质量为51248。
实施例18.BCN-多柔比星28a与曲妥珠单抗(GalNAz)2的缀合
将BCN-多柔比星28a(4μL，50mM在DMSO中的溶液)用PBS(896μL)稀释，然后如一般方案所述对其进行曲妥珠单抗(GalNAz)2处理。清洗并浓缩，随后的质谱分析表明存在一个主产物(50708Da，总重链的90％)和次产物(50294Da,总重链的±10％)。
实施例19.BCN-多柔比星35与曲妥珠单抗(GalNAz)2的缀合
将BCN-多柔比星35(4μL，50mM在DMSO中)用PBS(896μL)稀释，然后如一般方案所述对其进行曲妥珠单抗(GalNAz)2处理。清洗并浓缩，随后的质谱分析表明存在曲妥珠单抗(GalNAz)2和BCN-多柔比星35的缀合物(51114Da)。
实施例20.BCN-PEG8-多柔比星28b与曲妥珠单抗(GalNAz)2的缀合
将BCN-PEG8-多柔比星(400μM，4当量)与曲妥珠单抗(GalNAz)2(100μM)在PBS中孵育16小时，导致完全转化为曲妥珠单抗(PEG8-多柔比星)2(50467和51134Da之间的重链产物，具有50881Da的主峰，该主峰对应于具有缀合至BCN-PEG8-多柔比星的核心GalNAzGlcNAc(Fuc)的重链)。
实施例21.BCN-vc-PABA-多柔比星33与曲妥珠单抗(GalNAz)2的缀合
将BCN-多柔比星33(4μL，50mM在DMSO中的溶液)用PBS(896μL)稀释，如一般方案所述对其进行曲妥珠单抗(GalNAz)2处理。清洗并浓缩，随后的质谱分析表明存在曲妥珠单抗(GalNAz)2和BCN-vc-PABA-多柔比星33的缀合物(51114Da)。
实施例22.BCN-vc-PABA-MMAE 37a与曲妥珠单抗(GalNAz)2的缀合
将BCN-vc-PABA-MMAE 37a(125μM，5当量)与曲妥珠单抗(GalNAz)2(25μM)在PBS中孵育16小时，导致完全转化为曲妥珠单抗(vc-PABA-MMAE)2(51137和51600Da之间的重链产物，具有51283Da的主峰(major peak)，所述主峰对应于具有缀合至BCN-vc-PABA-MMAF的核心GalNAzGlcNAc(Fuc)的重链，总重链的±95％；以及由于在质谱过程中PABA接头的片段化而导致的50520Da处的次峰(minor peak)，总重链的±5％重链)。
实施例23.BCN-vc-PABA-MMAF 37b与曲妥珠单抗(GalNAz)2的缀合
将BCN-vc-PABA-MMAF 37b(600μM，4+2当量)与曲妥珠单抗(GalNAz)2(100μM)在PBS中孵育约16小时，导致完全转化为曲妥珠单抗(vc-PABA-MMAF)2(51032与51500Da之间的重链产物，具有：51181Da的主峰,其对应于具有缀合至BCN-vc-PABA-MMAF的核心GalNAzGlcNAc(Fuc)的重链，总重链的±95％；以及由于在质谱过程中PABA接头的片段化导致的50407Da处的次峰，总重链的±5％)。
实施例24.BCN-MMAF 38与曲妥珠单抗(GalNAz)2的缀合
曲妥珠单抗(MMAF)2：BCN-MMAF 38与曲妥珠单抗(GalNAz)2(100μM)在PBS中孵育约16小时，导致完全转化为曲妥珠单抗(MMAF)2(50636与51100Da之间的重链产物，具有50783Da的主峰,其对应于具有缀合至BCN-MMAF的核心GalNazGlcNAc(Fuc)的重链)。
实施例24-2.BCN-MMAF 57与曲妥珠单抗(GalNAz)2的缀合
曲妥珠单抗(MMAF)2 :将BCN-MMAF(57，图10b)与曲妥珠单抗(GalNAz)2(100μM)在PBS中孵育约16小时，导致完全转化为曲妥珠单抗(MMAF)2(50636与51100Da之间的重链产物，具有50783Da的主峰,其对应于具有缀合至BCN-MMAF 57的核心GalNAzGlcNAc(Fuc)的重链)。
实施例25.BCN-vc-PABA-美登木素生物碱39与曲妥珠单抗(GalNAz)2的缀合
将BCN-vc-PABA-美登木素生物碱39(800μM，2x 4当量)与曲妥珠单抗(GalNAz)2(100μM)在PBS中孵育约40小时，导致完全转化为曲妥珠单抗(vc-PABA-美登木素生物碱)2(50781与51600Da之间的重链产物，具有51172Da的主峰,其对应于具有缀合至BCN-vc-PABA-美登木素生物碱的核心GalNAzGlcNAc(Fuc)的重链，总重链的±95％)。
通过张力引发的环加成反应使环辛炔-多柔比星缀合物42-44与曲妥珠单抗(GalNAz)2缀合
向曲妥珠单抗-(GalNAz)2(7.5μL，20mg/ml，1nmol)的PBS溶液中加入环辛炔溶液(2.5μL，2.4mM 5％DMF在MiliQ中，6nmol)。反应物经颠倒旋转，随后进行AccuTOF分析。
实施例26:MCFO-多柔比星42与trast(GalNAz)2的缀合
5天后根据AccuTOF分析得到80％的转化。观察质量为50548，预期质量为50550。
实施例27:DIBO-多柔比星43与trast(GalNAz)2的缀合
5天后根据AccuTOF分析得到30％的转化。观察质量为50530，预期质量为50544。
实施例28:环辛炔-多柔比星44与trast(GalNAz)2的缀合
5天后根据AccuTOF分析得到50％的转化。观察质量为50434，预期质量为50449。
实施例29:曲妥珠单抗-(N3)2与炔烃-生物素45的CuAAC
向trast-(GalNAz)2(10μL，9.6mg/ml，0.64nmol)(衍生自52)的PBS溶液中加入生物素-炔烃的溶液(45，1μL，10mM，10nmol)和储备预混合液(1μL，10mM CuSO4，10mM抗坏血酸钠，10mM tris((1-((O-乙基)羧甲基)-(1,2,3-三唑-4-基))甲胺,在含有20％MeCN的miliQ中)。反应物经颠倒旋转过夜，之后AccuTOF分析显示完全形成了目标产物(观察质量为50195)，如图17所示。
实施例30:曲妥珠单抗-yne2与叠氮基-生物素46的CuAAC
向衍生自53的trast-(GalNAc-yne)2(10μL，9.6mg/ml，0.64nmol)的PBS溶液中加入生物素-N346的溶液(1μL，10mM，10nmol)和储备预混合液(1μL，10mM CuSO4，10mM抗坏血酸钠，10mM tris((1-((O-乙基)羧甲基)-(1,2,3-三唑-4-基))甲胺在含有20％MeCN的miliQ中)。反应物经颠倒旋转过夜，之后AccuTOF分析显示了50％的转化(质量50353，预期质量50351)，如图18所示。
实施例31:马来酰亚胺-vc-PABA-美登木素生物碱40与曲妥珠单抗(N297C)的缀合
将曲妥珠单抗(N297C)(4mg，10mg/mL)与DTT(10当量)在22℃下在PBS(pH 7.4)中孵育2小时。通过旋转过滤纯化来去除过量的DTT，然后将还原的IgG(10mg/mL)与去氢抗坏血酸(20当量)在22℃下孵育3小时。加入马来酰亚胺-vc-PABA-美登木素生物碱40(3当量)并将反应混合物在室温下孵育1小时，之后通过旋转过滤纯化来去除过量的马来酰亚胺-vc-PABA-美登木素生物碱40。AccuTOF分析显示形成了三种重链产物，其对应于未修饰的重链(49133Da，总重链的±10％)、缀合至1个美登木素生物碱的重链(50454Da,总重链的±85％)和缀合至2个美登木素生物碱的重链(50774Da，总重链的±5％)。未检测到与轻链的缀合。
实施例32:体外血浆稳定性测定
人血浆(使用肝素制备)在4℃下以200g离心10分钟并将上清液与蛋白质A琼脂糖(Kem-En-Tec)在4℃下孵育1小时以耗尽IgG。使用0.22μm滤纸(Whatman)对经耗尽的血浆进行过滤除菌。将衍生自28a的曲妥珠单抗-多柔比星缀合物加入至无菌人血浆中，至终浓度为100μg/ml，并在CO2培养箱中在37℃下孵育以保持血浆pH水平接近生理pH7.2。在0、24、48和144小时取样，并在-80℃下储存。用蛋白质A琼脂糖纯化曲妥珠单抗缀合物，随后进行MS分析。将人血浆样品与蛋白质A琼脂糖在4℃下孵育1小时，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗三次以及用100mM甘氨酸-HCl(pH 2.7)洗脱曲妥珠单抗缀合物，随后用1M Tris-HCl(pH 8.0)中和。MS分析显示对应于曲妥珠单抗-多柔比星缀合物的峰(50708Da)没有随时间降低。此外，没有检测到对应于降解产物的峰，证明缀合物在人血浆中稳定至少144小时。
实施例33:体外功效
将SK-Br-3(Her2+)、SK-OV-3(Her2+)和MDA-MB-231(Her2-)细胞置于96-孔板(5000个细胞/孔)中的补充有10％胎牛血清(FCS)(Invitrogen)的RPMI 1640GlutaMAX(Invitrogen)(200μL/孔)中，并在37℃下，5％CO2中孵育过夜。在补充有10％FCS的RPMI1640GlutaMAX中制备无菌过滤的化合物的三倍稀释系列(范围为±0.002至100nM)。在去除培养基后，四倍添加所述浓度系列并在37℃下，5％CO2中孵育三天。培养基用0.01mg/mL的在补充有10％FCS的RPMI 1640GlutaMAX中的刃天青(Sigma Aldrich)代替。在37℃下，5％CO2中4至6小时后，用荧光成像读板仪(flurescence plate reader，Tecan Infinite 200)在540nm激发光和590nm发射光下检测荧光。通过设定无细胞的孔为0％的存活率以及具有最低剂量的化合物的孔为100％存活率而将相对荧光单元(RFU)标准化为细胞存活百分数。对于每种条件，示出了平均细胞存活百分数±sem。
将曲妥珠单抗-(vc-PABA-MMAE)2(源自37a)、曲妥珠单抗-(vc-PABA-MMAF)2(源自37b)、曲妥珠单抗-(vc-PABA-美登木素生物碱)2(源自39)、曲妥珠单抗-(美登木素生物碱)2和曲妥珠单抗(N297C)-(vc-PABA-美登木素生物碱)2(源自40)的体外细胞毒性与作为阳性对照的T-DM1和作为阴性对照的曲妥珠单抗和利妥昔单抗-(vc-PABA-美登木素生物碱)2做对比。所有的基于曲妥珠单抗的ADC都影响Her2-阳性细胞系SK-Br-3和SK-OV-3的存活率，但是不影响Her2-阴性细胞系MDA-MB-231，其显示了这些ADC特异性靶向Her2阳性细胞。在Her2阴性细胞系MDA-MB-231中，只有T-DM1在最高浓度(100nM)下显示出微弱的细胞存活率的降低。
实施例34:DTPA缀合、放射性标记和IRF的测定
将曲妥珠单抗(MMAF)2(源自trast(GalNAz)2和37b的缀合)和曲妥珠单抗(美登木素生物碱)2(源自trast(GalNAz)2和39的缀合)、去糖基化的曲妥珠单抗(由曲妥珠单抗和endo S的处理得到)和天然曲妥珠单抗与异硫氰酸酯-DTPA(Macrocyclics，Houston，TX)缀合并用111In(Covidien，Petten)标记。对于动物实验，以介于2.7-3.4MBq/μg之间的比活来标记所有构建体。
实施例35：PK/生物分布研究
用5x 106个SK-OV-3细胞(注射体积：200μl)对BALB/c裸鼠(n＝15)进行右侧腹皮下接种。在肿瘤诱导14天后，具有五只小鼠的组用15-20MBq的111In-标记的抗体(以25μg的蛋白质剂量标记)静脉注射。为评估缀合物的体内稳定性和药代动力学，通过在注射放射标记的抗体制剂之后的0.5、1、30min、1、2和4小时以及1、2、5、7、9、13、16和21天时进行下颌下出血以获取50μl的血液样品。
实施例36：生物分布
注射(3d p.i.)一周后小鼠被施安乐死并解剖以确定放射标记在相关组织中的生物分布。曲妥珠单抗(MMAF)2(源自37b)、曲妥珠单抗(美登木素生物碱)2(源自39)和去糖基化的曲妥珠单抗的组织分布与天然曲妥珠单抗的组织分布相当。
实施例37：体内功效
雌性SHO小鼠(Crl:SHO-Prkdcscid Hrhr，实验阶段的开始时为6至9周龄，从法国的Charles River Laboratories，L'Arbresles得到)用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉，皮肤用氯己定溶液杀菌，在肩胛间区的平坦处(the level of the interscepular region)切开，将20mm3肿瘤块(HBCx-13B乳腺癌患者来源的异种移植物模型)置于皮下组织中并用夹子闭合皮肤。当肿瘤体积在60至200mm3的范围内时，用载体、曲妥珠单抗-(vc-PABA-美登木素生物碱)2(源自39，以3mg/kg和9mg/kg)、曲妥珠单抗-(vc-PABA-MMAF)2(源自37b，以3mg/kg和9mg/kg)和T-DM1(9mg/kg)静脉注射具有四只小鼠的组。
曲妥珠单抗和衍生物的详细质谱分析
对天然曲妥珠单抗、曲妥珠单抗(GalNAz)2和从曲妥珠单抗(GalNAz)-2通过铜催化的点击化学(与46缀合，根据实施例29中描述的方案)或通过张力引发的点击化学(与25缀合，如实施例16中的描述)制备的生物素缀合物进行详细的质谱分析，使用nanoLC联合超高分辨率的QTOF MS(maXis 4G)进行完整的蛋白质种类的分析(nanoLC-MS)。
实施例38：完整蛋白质的分析
样品制备
蛋白质还原是在10mM DTT中在56℃下进行30分钟。在分析之前将样品用2％的甲酸进行1：1稀释。
液相色谱-质谱
使用UHPLC nanoflow液相色谱法(Bruker Daltonics nano advance)在线联合超高分辨率四极杆飞行时间质谱仪(Bruker Daltonics maXis 4G ETD)通过轴向去溶剂化真空辅助电喷雾源(axial desolvation vacuum assisted electrospray source)(BrukerDaltonics captive sprayer)进行蛋白质分离。3分钟内在5000nL/min的流速下使用0.1％甲酸将蛋白质上样于捕捉柱(trap column)(Dionex PepSwift，0.2x 5mm)上。蛋白质在0.2x 150mm monolitihic颗粒柱(Michrom 8μmPLRP-S)上分离，在50℃下以1000nl/min的流速使用20至50％乙腈和0.1％甲酸的线性梯度。使用6L/min氮气在180℃下和1600V的毛细管电压下对从色谱柱中洗脱的肽进行去溶剂化和离子化。质谱仪是使用安捷伦(Agilent)调谐混合液(G1969-85000)外部校正，并使用锁定质量模式(lockmass)在1221.9906m/z做校正(Agilent G1982-85001)。质谱仪被编程在500-4200m/z的范围内以1Hz获取图谱，设置如下：400Vpp Funnel RF，10eV isCID，400Vpp多极RF，8eV四极杆离子能，510m/z低质量，10eV碰撞池能，3500Vpp碰撞RF，110μs转运时间，450Vpp离子冷却RF和18μs预脉冲存储。
数据处理
所有的数据在数据分析软件上处理。锁定质量校正后，将轻链和重链MS谱分别都对每个色谱峰平均。平均的图谱使用最大熵算法结合轻链图谱的SNAP峰拾取算法或重链图谱的相加峰拾取算法解卷积。
实施例39蛋白水解的肽分析
样品制备
对于每个样品，对5微克的蛋白质进行溶液内胰蛋白酶消化。简而言之，在56℃下在10mM DTT中进行还原30分钟。使用50mM氯乙酰胺对还原的半胱氨酸进行烷基化作用(脲基甲基化(carbamidomethylation))。首先通过加入0.5μg的LysC肽酶并在37℃下孵育3小时来进行蛋白质消化。随后将800ng的胰蛋白酶加入至样品中并在37℃下孵育过夜(O/N)。将得到的蛋白水解的肽浓缩，并使用时行时止的洗脱技巧(stop-and-on elution tip)进行脱盐。
液相色谱-串联质谱
使用UHPLC nanoflow液相色谱(Bruker Daltonics nano advance)在线联合超高容量离子阱(Bruker Daltonics amaZon speed ETD)通过轴向去溶剂化真空辅助电喷雾源(Bruker Daltonics captive sprayer)进行肽分离。3分钟内在5000nL/min的流速下使用0.1％甲酸将肽上样于捕捉柱(Dionex PepSwift，0.2x 5mm)上。在0.1x 250mmmonolitihic柱(Dionex PepSwift)上在60℃下使用5至25％乙腈和0.1％甲酸的线性梯度以800nl/min的流速分离肽。使用3L/min氮气在150℃下和1300V的毛细管电压下对从色谱柱中洗脱的肽进行去溶剂化和离子化。质谱仪被编程以采集单独的测量谱图(MS)并随后进行对最丰富的6种离子的数据依赖的碎片分析(MS/MS)。测量谱图是在增强分辨率模式(enhanced resolution mode)下采集并使用下面的仪器设置：50ms最大累积时间，500.000ICC目标，1000m/z处调谐，5谱图平均。碎片谱图是在极端扫描模式(extreme scanmode)下采集并启用自动选择碎裂模式，所述自动选择碎裂模式根据质荷比和母离子的荷电态(chargestate)在碰撞诱导解离(CID)和电子转运解离(ETD)碎裂方法之间转换。下面的仪器设置被用于碎片扫描：500.000ICC目标，200ms最大累积时间，SPS启用，70％CID能和0.2min动态排除。
数据库检索
通过数据分析软件(Bruker Daltonics，v4.1)处理采集的原始质谱数据，产生Mascot相容性输入文件(compatible input files)(GMF格式)。将GMF文件加载于ProteinScape软件(Bruker Daltonics，V3.1)中并使用Mascot数据库检索软件搜索序列数据库。Fasta序列数据库包含曲妥珠单抗轻链和重链蛋白质序列和添加的污染的蛋白质序列(例如LysC、胰蛋白酶和角蛋白)。使用下述设置进行检索：0.35Da母离子质量容忍度(precursor mass tolerance)，0.35Da碎片离子质量容忍度，胰蛋白酶特异性为最多2处遗漏切割，脲基甲基化(carbamidomethylation)(C)作为固定的修饰作用。下面规定了可变的修饰作用：氧化作用(MHW)、脱酰胺作用(NQ)、氨甲酰化作用(K+N-末端)和乙酰化作用(蛋白质N-末端)。Mascot离子分值在识别分值阈值之上的肽被接受作为有效识别(肽错误发现率<1％)。
相对定量
对于曲妥珠单抗重链蛋白质，在通过铜催化的46的缀合而得到的曲妥珠单抗-缀合物中唯一鉴定了带有组氨酸氧化的单独的肽(序列K.FNWYVDGVEVH*NAK.T，具有氧化的H11)，但是在其他样品中全部没有检测到。在数据分析软件中产生带有和未带有氧化的组氨酸的肽的提取离子流(EIC)色谱图(分别为EIC：847.46±0.5m/z和EIC：839.97±0.5m/z)。此外下面两个肽的EIC色谱图被用于标准化目的：-.EVQLVESGGGLVQPGGSLR.L(EIC:941.6±0.5m/z)和K.GPSVFPLAPSSK.S(EIC:593.95±0.5m/z)。来自三个重复测量的积分后的峰面积被平均并表示为相对于天然曲妥珠单抗的值，表明带有氧化的组氨酸的上述片段的量达到该特定片段的总量的69％(31％未修饰的片段)。
对于曲妥珠单抗轻链蛋白质，在通过铜催化的46的缀合得到的曲妥珠单抗-缀合物中唯一鉴定了带有甲硫氨酸氧化的单独的肽(序列-.DIQM*TQSPSSLSASVGDR.V，带有氧化的M4)，但是在其他样品中全部没有检测到。
实施例40：GalT突变体Y289N、Y289F、Y289M、Y289V、Y289A和Y289G和Y289I的克隆和表达
通过重叠延伸PCR方法从包含编码由130-402位氨基酸残基构成的GalT的催化结构域的序列的构建体来扩增GalT突变体基因。野生型酶是由SEQ ID NO:17代表。对于Y289N突变体(由SEQ ID NO:18代表)，第一DNA片段用一对引物扩增：Oligo38_GalT_External_Fw(CAG CGA CAT ATG TCG CTG ACC GCA TGC CCT GAG GAG TCC，由SEQ ID NO:1代表)和Oligo19_GalT_Y289N_Rw(GAC ACC TCC AAACTG CAC GTA AGG TAG GCT AAA，由SEQID NO:2代表)。NdeI限制性位点加了下划线，同时突变位点用粗体突出显示。第二片段用一对引物扩增：Oligo29_GalT_External_Rw(CTG ATG GAT GGA TCC CTA GCT CGG CGT CCCGAT GTC CAC，由SEQ ID NO:3代表)和oligo18_GalT_Y289N_Fw(CCT TAC GTG CAGTTTGGA GGT GTC TCT GCT CTA，由SEQ ID NO:4代表)。BamHI限制性位点加了下划线，同时突变位点用粗体突出显示。在第二轮PCR中使用Oligo38_GalT_External_Fw和Oligo29_GalT_External_Rw引物将第一轮PCR产生的两个片段融合。在用NdeI和BamHI消化后，此片段被连接至用相同的限制性酶切割的pET16b载体上。新构建的表达载体包含编码Y289N突变体的基因和编码来自pET16b载体的His-tag的序列，其通过DNA测序结果确认。对于Y289F(由SEQID NO:19代表)、Y289M(由SEQ ID NO:20代表)、Y289I(由SEQ ID NO:21代表)、Y289V(由SEQID NO:22代表)、Y289A(由SEQ ID NO:23代表)和Y289G(由SEQ ID NO:24代表)突变体的构建，使用同样的方法，其中突变位点分别变为编码苯丙氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸的、、、、或三联体。更具体而言，对于Y289F的构建，使用在本文中定义为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5的一对引物来扩增第一片段，用在本文中定义为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6(指的是表1的相关序列)一对引物来扩增第二片段。此外，对于Y289M的构建，使用在本文中定义为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:7的一对引物来扩增第一片段，用在本文中定义为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:8(指的是表1的相关序列)一对引物来扩增第二片段。
表达并分离GalT突变体，根据Qasba等人报道的方法(Prot.Expr.Pur.2003，30，219-229)从包涵体重折叠。重折叠之后，去除沉淀并使用Ni-NTA柱(HisTrap excel 1mL柱，GE Healthcare)分离可溶且折叠的蛋白质。在用25mM Tris-HCl(pH 8.0)、300mM NaCl和200mM咪唑洗脱后，在25mM Tris-HCl(pH 8.0)中透析所述蛋白质并使用旋转过滤器(带有Ultracel-10膜(Merck Millipore)的Amicon Ultra-15离心过滤单元)浓缩至2mg/mL。
表1 所用引物的序列识别
实施例41：用GalT突变体Y289N、Y289F和Y289M转移UDP-GalNAz
使用β(1,4)-Gal-T1突变体Y289N、Y289F或Y289M中的一个实现通过酶学方法将半乳糖衍生物转移到曲妥珠单抗上。因而，将去糖基化的曲妥珠单抗(按上面的描述制备，10mg/mL)与UDP-N-叠氮基乙酰基半乳糖胺52(UDP-GalNAz)(1mM)和各个β(1,4)-Gal-T1突变体的(0.1mg/mL)在10mM MnCl2和25mM Tris-HCl(pH 8.0)中在30℃下孵育16小时。
对于所有的三种突变体Y289N、Y289F或Y289M，粗混合物的质谱分析表明，核心GlcNAc(Fuc)-取代的曲妥珠单抗完全转化为曲妥珠单抗(GalNAz)2(49713Da，总重链的90％)。

Claims (65)

1.抗体-缀合物，其是通过一种包括下述步骤的方法获得：
(i)使包含核心N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)取代基的抗体与式S(A)x-P的化合物在合适的催化剂的存在下接触以得到经修饰的抗体，其中所述核心N-乙酰葡糖胺取代基任选地被岩藻糖基化；其中所述催化剂包含突变的来自半乳糖基转移酶的催化结构域；其中S(A)x是包含x个官能团A的糖衍生物，其中A独立地选自叠氮基和炔基基团且x为1、2、3或4；其中P选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)和胞苷二磷酸(CDP)；
其中经修饰的抗体被定义为包含GlcNAc-S(A)x取代基的抗体，所述GlcNAc-S(A)x取代基是通过所述GlcNAc-S(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1键合至所述抗体，并且其中所述经修饰的抗体具有式(4)：
其中：
S(A)x和x为如上定义的；AB代表抗体；GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；Fuc为岩藻糖；b为0或1；并且y为1至20；和
(ii)通过环加成使所述经修饰的抗体与接头-缀合物反应，其中：
(a)当所述经修饰的抗体为叠氮化物-修饰的抗体时，所述接头-缀合物包含炔基基团以及一个或多个目的分子；或
(b)当所述经修饰的抗体为炔-修饰的抗体时，所述接头-缀合物包含叠氮基基团以及一个或多个目的分子；
其中目的分子(D)通过接头(L)与所述抗体缀合；其中所述目的分子(D)为活性物质，且其中活性物质被定义为具有生物学活性和/或药学活性的物质。
2.根据权利要求1所述的抗体-缀合物，其中x为1或2。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体-缀合物，其中y为1、2、3或4。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体-缀合物，其中所述抗体为完全抗体，且其中y为2。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体-缀合物，其中所述抗体选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体。
6.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体-缀合物，其中所述接头-缀合物中包括的所述炔基基团为环炔基基团、杂环炔基基团或末端炔基基团。
7.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体-缀合物，其中所述经修饰的抗体为叠氮化物-修饰的抗体，且其中所述接头-缀合物具有式(11)或(11b)：
其中：
D和L如权利要求1中所定义；
r为1-20；
R1独立地选自氢、卤素、-OR5、-NO2、-CN、-S(O)2R5、C1-C24烷基、C6-C24芳基、C6-C24杂芳基、C7-C24烷基芳基、C7-C24烷基杂芳基、C7-C24芳基烷基和C7-C24杂芳基烷基，且其中所述烷基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、芳基烷基和杂芳基烷基为任选地取代的，其中两个取代基R1可连接在一起形成增环的环烷基或增环的芳烃或杂芳烃取代基，且其中R5独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24芳基、C6-C24杂芳基、C7-C24烷基芳基、C7-C24烷基杂芳基、C7-C24芳基烷基和C7-C24杂芳基烷基；
X为C(R1)2、O、S或NR2，其中R2为R1或L(D)r，其中L、D和r为如上定义的；
q为0或1，条件是如果q为0那么X为N-L(D)r；
a为0、1、2、3、4、5、6、7或8；
a'为0、1、2、3、4、5、6、7或8；以及
a+a'<10。
8.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体-缀合物，其中所述经修饰的抗体为叠氮化物-修饰的抗体以及其中所述接头-缀合物具有下式(17)：
其中：
R1、L、D和r为如权利要求7中定义的；
Y为O、S或NR2，其中R2为如权利要求7中定义的；
R3独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24芳基、C6-C24杂芳基、C7-C24烷基芳基、C7-C24烷基杂芳基、C7-C24芳基烷基和C7-C24杂芳基烷基；
R4选自氢、Y-L(D)r、-(CH2)n-Y-L(D)r、卤素、C1-C24烷基、C6-C24芳基、C6-C24杂芳基、C7-C24烷基芳基、C7-C24烷基杂芳基、C7-C24芳基烷基和C7-C24杂芳基烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子间断，其中所述烷基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、芳基烷基和杂芳基烷基独立地为任选地取代的；以及
n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
9.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体-缀合物，其中所述经修饰的抗体为叠氮化物-修饰的抗体和其中所述接头-缀合物具有式(19)：
其中L、D和r为如权利要求7中定义的。
10.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体-缀合物，其中所述经修饰的抗体为叠氮化物-修饰的抗体和其中所述接头-缀合物具有式(15)：
其中L、D和r为如权利要求7中定义的。
11.用于制备抗体-缀合物的方法，其包括下述步骤：
(i)使包含核心N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)取代基的抗体与式S(A)x-P的化合物在合适的催化剂的存在下接触以得到经修饰的抗体，其中所述的核心N-乙酰葡糖胺取代基任选地被岩藻糖基化；其中所述催化剂包含突变的来自半乳糖基转移酶的催化结构域；其中S(A)x是包含x个官能团A的糖衍生物，其中A独立地选自叠氮基和炔基基团且x为1、2、3或4；其中P选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)和胞苷二磷酸(CDP)；
其中经修饰的抗体被定义为包含GlcNAc-S(A)x取代基的抗体，所述GlcNAc-S(A)x取代基是通过所述GlcNAc-S(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1键合至所述抗体，以及其中所述经修饰的抗体具有式(4)：
其中：
S(A)x和x为如上定义的；AB代表抗体；GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；Fuc为岩藻糖；b为0或1；和y为1至20；以及
(ii)通过环加成使所述经修饰的抗体与接头-缀合物反应，其中：
(a)当所述经修饰的抗体为叠氮化物-修饰的抗体时，所述接头-缀合物包含炔基基团以及一个或多个目的分子；或
(b)当所述经修饰的抗体为炔-修饰的抗体时，所述接头-缀合物包含叠氮基基团以及一个或多个目的分子；
其中目的分子(D)是通过接头(L)与抗体缀合；其中所述目的分子为活性物质，且其中活性物质被定义为具有生物学活性和/或药学活性的物质。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述催化剂为包含突变的来自β(1,4)-半乳糖基转移酶的催化结构域的催化剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述催化剂选自GalT Y289L、GalT Y289N和GalTY289I。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述催化剂为包含突变的来自β(1,4)-半乳糖基转移酶的催化结构域的催化剂，选自GalT Y289F、GalT Y289M、GalT Y289V、GalT Y289G、GalT Y289I和GalT Y289A。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中x为1或2。
16.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中y为1、2、3或4。
17.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述抗体为完全抗体，且其中y为2。
18.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述接头-缀合物中包括的所述炔基基团为环炔基基团、杂环炔基基团或末端炔基基团。
19.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述经修饰的抗体为叠氮化物-修饰的抗体，且其中所述接头-缀合物具有式(11)或(11b)：
其中：
D和L为如权利要求11中定义的；
r为1-20；
R1独立地选自氢、卤素、-OR5、-NO2、-CN、-S(O)2R5、C1-C24烷基、C6-C24芳基、C6-C24杂芳基、C7-C24烷基芳基、C7-C24烷基杂芳基、C7-C24芳基烷基和C7-C24杂芳基烷基，并且其中所述烷基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、芳基烷基和杂芳基烷基为任选地取代的，其中两个取代基R1可连接在一起以形成增环的环烷基或增环的芳烃或杂芳烃取代基，且其中R5独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24芳基、C6-C24杂芳基、C7-C24烷基芳基、C7-C24烷基杂芳基、C7-C24芳基烷基和C7-C24杂芳基烷基；
X为C(R1)2、O、S或NR2，其中R2为R1或L(D)r，其中L、D和r为如上定义的；
q为0或1，条件是如果q为0那么X为N-L(D)r；
a为0、1、2、3、4、5、6、7或8；
a'为0、1、2、3、4、5、6、7或8；以及
a+a'<10。
20.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述经修饰的抗体为叠氮化物-修饰的抗体，且其中所述接头-缀合物具有式(17)：
其中：
R1、L、D和r为如权利要求19中定义的；
Y为O、S或NR2，其中R2为如权利要求19中定义的；
R3独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24芳基、C6-C24杂芳基、C7-C24烷基芳基、C7-C24烷基杂芳基、C7-C24芳基烷基和C7-C24杂芳基烷基；
R4选自氢、Y-L(D)r、-(CH2)n-Y-L(D)r、卤素、C1-C24烷基、C6-C24芳基、C6-C24杂芳基、C7-C24烷基芳基、C7-C24烷基杂芳基、C7-C24芳基烷基和C7-C24杂芳基烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子间断，其中所述烷基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、芳基烷基和杂芳基烷基独立地为任选地取代的；以及
n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
21.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述经修饰的抗体为叠氮化物-修饰的抗体，且其中所述接头-缀合物具有式(15)或式(19)：
其中L、D和r为如权利要求19中定义的。
22.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体-缀合物用于制备药剂的用途。
23.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体-缀合物用于制备用于治疗癌症的药剂的用途。
24.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体-缀合物用于制备用于治疗乳腺癌的药剂的用途。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述乳腺癌为HER2阳性乳腺癌。
26.一种制备经修饰的抗体的方法，所述方法包括：
(a)在内切糖苷酶的存在下使具有核心N-乙酰葡糖胺的抗体聚糖去糖基化，以得到包含核心N-乙酰葡糖胺取代基的抗体，其中所述核心N-乙酰葡糖胺取代基任选地被岩藻糖基化，其中所述核心N-乙酰葡糖胺取代基是通过N-糖苷键键合至所述抗体的天冬酰胺氨基酸的侧链中的酰胺氮原子，并且其中所述内切糖苷酶为Endo S、Endo S49、Endo F或其组合；随后
(b)使所述抗体与式S(A)x-P的化合物在合适的催化剂的存在下接触，其中所述催化剂包含突变的来自半乳糖基转移酶的催化结构域；其中S(A)x是包含x个官能团A的糖衍生物，其中A独立地选自叠氮基和炔基基团且x为1、2、3或4；其中P选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)和胞苷二磷酸(CDP)；
其中经修饰的抗体被定义为包括GlcNAc-S(A)x取代基的抗体，所述GlcNAc-S(A)x取代基是通过所述GlcNAc-S(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1键合至所述抗体。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述内切糖苷酶为Endo S、Endo F或其组合。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述内切糖苷酶为Endo S49。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述催化剂为包含突变的来自β(1,4)-半乳糖基转移酶的催化结构域的催化剂。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述催化剂选自GalT Y289L、GalT Y289N和GalTY289I。
31.根据权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述催化剂为包含突变的来自β(1,4)-半乳糖基转移酶的催化结构域的催化剂，其选自GalT Y289F、GalT Y289M、GalT Y289V、GalT Y289G、GalT Y289I和GalT Y289A。
32.根据权利要求26-28中任一项所述的方法，其中A为叠氮基。
33.包括GlcNAc-S(A)x取代基的抗体，其中GlcNAc为N-乙酰葡糖胺，其中S(A)x为包括x个官能团A的糖衍生物，其中A独立地选自叠氮基和炔基基团以及x为1、2、3或4，其中所述GlcNAc-S(A)x取代基是通过所述GlcNAc-S(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1键合至所述抗体上，通过N-糖苷键键合至所述抗体的天冬酰胺氨基酸的侧链中的酰胺氮原子，并且其中所述GlcNAc任选地被岩藻糖基化。
34.根据权利要求33所述的抗体，其中A为叠氮基。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的抗体在制备抗体-缀合物(AC)中的用途，其中抗体-缀合物被定义为通过接头(L)与目的分子(D)缀合的抗体。
36.制备抗体-缀合物的方法，其包括使根据权利要求33或权利要求34所述的经修饰的抗体与接头-缀合物反应，其中：
(a)当所述经修饰的抗体为叠氮化物-修饰的抗体时，所述接头-缀合物包含炔基基团以及一个或多个目的分子；或
(b)当所述经修饰的抗体为炔-修饰的抗体时，所述接头-缀合物包括叠氮基基团和一个或多个目的分子。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述接头-缀合物中包括的所述炔基基团为环炔基基团、杂环炔基基团或末端炔基基团。
38.根据权利要求37所述的方法，包括使根据权利要求34的经修饰的抗体与接头-缀合物反应，其中所述接头-缀合物包含末端炔基基团和一个或多个目的分子。
39.根据权利要求37所述的方法，包括使根据权利要求34的经修饰的抗体与接头-缀合物反应，其中所述接头-缀合物包含环炔基或杂环炔基基团和一个或多个目的分子。
40.根据权利要求37所述的方法，其中所述接头-缀合物具有式(11)或(11b)：
其中：
L为接头；
D为目的分子；
r为1-20；
R1独立地选自氢、卤素、-OR5、-NO2、-CN、-S(O)2R5、C1-C24烷基、C6-C24芳基、C6-C24杂芳基、C7-C24烷基芳基、C7-C24烷基杂芳基、C7-C24芳基烷基和C7-C24杂芳基烷基，且其中所述烷基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、芳基烷基和杂芳基烷基为任选地取代的，其中两个取代基R1可连接在一起形成增环的环烷基或增环的芳烃或杂芳烃取代基，且其中R5独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24芳基、C6-C24杂芳基、C7-C24烷基芳基、C7-C24烷基杂芳基、C7-C24芳基烷基和C7-C24杂芳基烷基；
X为C(R1)2、O、S或NR2，其中R2为R1或L(D)r，其中L、D和r为如上定义的；
q为0或1，条件是如果q为0那么X为N-L(D)r；
a为0、1、2、3、4、5、6、7或8；
a'为0、1、2、3、4、5、6、7或8；以及
a+a'<10。
41.根据权利要求39或权利要求40所述的方法，其中所述接头-缀合物具有式(17)：
其中：
R1、L、D和r为如权利要求40中定义的；
Y为O、S或NR2，其中R2为如权利要求40中定义的；
R3独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24芳基、C6-C24杂芳基、C7-C24烷基芳基、C7-C24烷基杂芳基、C7-C24芳基烷基和C7-C24杂芳基烷基；
R4选自氢、Y-L(D)r、-(CH2)n-Y-L(D)r、卤素、C1-C24烷基、C6-C24芳基、C6-C24杂芳基、C7-C24烷基芳基、C7-C24烷基杂芳基、C7-C24芳基烷基和C7-C24杂芳基烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子间断，其中所述烷基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、芳基烷基和杂芳基烷基独立地为任选地取代的；以及
n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
42.根据权利要求39或权利要求40所述的方法，其中所述接头-缀合物具有式(15)或式(19)：
其中L、D和r为如权利要求40中定义的。
43.根据式(20)或(20b)的抗体-缀合物：
其中：
L、D、X、R1、a、a’、r和q为如权利要求40中定义的；
b为0或1；
p为0或1；
Q为-N(H)C(O)CH2-或-CH2-；
x为1、2、3或4；
y为1-20；
并且其中AB为一种抗体，S为糖或糖衍生物，GlcNAc为N-乙酰葡糖胺和Fuc为岩藻糖。
44.根据权利要求43所述的抗体-缀合物，其中所述抗体缀合物具有式(21)：
其中AB、L、D、S、Q、x、y、b、p、r、R1和GlcNAc为如权利要求43中定义的，并且其中R3、R4、Y和n为如权利要求41中定义的。
45.根据权利要求43所述的抗体-缀合物，其中所述抗体缀合物具有式(15b)或具有式(22)：
其中AB、L、D、S、x、y、b、p、r、Q和GlcNAc为如权利要求43中定义的。
46.根据权利要求43-45中任一项所述的抗体-缀合物，其中所述目的分子(D)选自活性物质、报告分子、叠氮化物、环炔基基团和杂环炔基基团，其中所述报告分子选自诊断剂、染料、荧光团、放射性同位素标记、造影剂、磁共振成像剂或质量标记。
47.通过根据权利要求37-42中任一项所述的方法得到的抗体-缀合物。
48.根据权利要求43-45中任一项所述的抗体-缀合物用于制备药剂的用途。
49.根据权利要求43-45中任一项所述的抗体-缀合物用于制备用于治疗癌症的药剂的用途。
50.根据权利要求43-45中任一项所述的抗体-缀合物用于制备用于治疗乳腺癌的药剂的用途。
51.根据权利要求50所述的用途，其中所述乳腺癌为HER2阳性乳腺癌。
52.组件试剂盒，其包括根据权利要求34所述的抗体和根据式11的接头-缀合物：
其中R1、X、L、D、a、r和q为如权利要求40中定义的。
53.用于制备抗体-缀合物的方法，包括使经修饰的抗体与接头-缀合物反应，其中所述接头-缀合物包含环炔基基团或杂环炔基基团和一个或多个目的分子，其中所述经修饰的抗体为包含GlcNAc-S(A)x取代基的抗体，其中GlcNAc为N-乙酰葡糖胺，其中S(A)x为包含x个官能团A的糖衍生物，其中A为叠氮基且x为1、2、3或4，其中所述GlcNAc-S(A)x取代基是通过所述GlcNAc-S(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1键合至所述抗体，并且其中所述GlcNAc任选地被岩藻糖基化。
54.根据权利要求53所述的方法，包括下述步骤：
(i)使包含核心N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)取代基的抗体与式S(A)x-P的化合物在合适的催化剂的存在下接触以得到经修饰的抗体，其中所述核心N-乙酰葡糖胺取代基任选地被岩藻糖基化；其中所述催化剂包含突变的来自半乳糖基转移酶的催化结构域；其中S(A)x是包含x个官能团A的糖衍生物，其中A为叠氮基基团且x为1、2、3或4；其中P选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)和胞苷二磷酸(CDP)；
其中经修饰的抗体被定义为包括GlcNAc-S(A)x取代基的抗体，所述GlcNAc-S(A)x取代基是通过所述GlcNAc-S(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1键合至所述抗体，以及其中所述经修饰的抗体具有式(4)：
其中：
S(A)x和x为如上定义的；AB代表抗体；GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；Fuc为岩藻糖；b为0或1；和y为1至20；以及
(ii)使所述经修饰的抗体与接头-缀合物反应，其中所述接头-缀合物包含环炔基或杂环炔基基团以及一个或多个目的分子。
55.根据权利要求53或54所述的方法，其中所述催化剂为包含突变的来自β(1,4)-半乳糖基转移酶的催化结构域的催化剂。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述催化剂选自GalT Y289L、GalT Y289N和GalTY289I。
57.根据权利要求53或权利要求54所述的方法，其中所述催化剂为包含突变的来自β(1,4)-半乳糖基转移酶的催化结构域的催化剂，其选自GalT Y289F、GalT Y289M、GalTY289V、GalT Y289G、GalT Y289I和GalT Y289A。
58.根据权利要求53或权利要求54所述的方法，其中所述接头-缀合物具有式(11)或(11b)：
其中：
L为接头；
D为目的分子；
r为1-20；
R1独立地选自氢、卤素、-OR5、-NO2、-CN、-S(O)2R5、C1-C24烷基、C6-C24芳基、C6-C24杂芳基、C7-C24烷基芳基、C7-C24烷基杂芳基、C7-C24芳基烷基和C7-C24杂芳基烷基，并且其中所述烷基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、芳基烷基和杂芳基烷基为任选地取代的，其中两个取代基R1可连接在一起形成增环的环烷基或增环的芳烃或杂芳烃取代基，且其中R5独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24芳基、C6-C24杂芳基、C7-C24烷基芳基、C7-C24烷基杂芳基、C7-C24芳基烷基和C7-C24杂芳基烷基；
X为C(R1)2、O、S或NR2，其中R2为R1或L(D)r，其中L、D和r为如上定义的；
q为0或1，条件是如果q为0那么X为N-L(D)r；
a为0、1、2、3、4、5、6、7或8；
a'为0、1、2、3、4、5、6、7或8；以及
a+a'<10。
59.根据权利要求53或权利要求54所述的方法，其中所述接头-缀合物具有式(17)：
其中：
R1、L、D和r为如权利要求58中定义的；
Y为O、S或NR2，其中R2为如权利要求58中定义的；
R3独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24芳基、C6-C24杂芳基、C7-C24烷基芳基、C7-C24烷基杂芳基、C7-C24芳基烷基和C7-C24杂芳基烷基；
R4选自氢、Y-L(D)r、-(CH2)n-Y-L(D)r、卤素、C1-C24烷基、C6-C24芳基、C6-C24杂芳基、C7-C24烷基芳基、C7-C24烷基杂芳基、C7-C24芳基烷基和C7-C24杂芳基烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子间断，其中所述烷基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、芳基烷基和杂芳基烷基独立地为任选地取代的；以及
n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
60.根据权利要求53或权利要求54所述的方法，其中所述接头-缀合物具有式(15)或式(19)：
其中L、D和r为如权利要求58中定义的。
61.通过根据权利要求53-60中任一项所述的方法得到的抗体-缀合物。
62.根据权利要求61所述的抗体-缀合物用于制备药剂的用途。
63.根据权利要求61所述的抗体-缀合物用于制备用于治疗癌症的药剂的用途。
64.根据权利要求61所述的抗体-缀合物用于制备用于治疗乳腺癌的药剂的用途。
65.根据权利要求64所述的用途，其中所述乳腺癌为HER2阳性乳腺癌。
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