CN105130931A - 一种麻风树烷型二萜类化合物的制备方法 - Google Patents

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杨珊珊
陆洪
庞莉
王欢欢
韩朝
李上文
杜思邈
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Abstract

本发明涉及一种麻风树烷型二萜类化合物的制备方法，该方法采用三维液相色谱技术，首先以正己烷－乙醇为流动相，以正相硅胶色谱柱为一维制备色谱柱，对甘遂提取物进行组分切割，收集目标组分为一维分离组分；再以水-乙腈为流动相，以C18(250mm×20mm)色谱柱为二维制备色谱柱，对一维分离组分进行组分切割，收集，旋转蒸发浓缩，得到二维分离组分；最后以C18(250mm×10mm)色谱柱为三维制备色谱柱，得到高纯度的kansuininA，纯度可以达到98％以上；本发明制备过程重复性高，可操作性好，同时甘遂资源丰富，容易获取，适合大规模生产的要求。

Description

一种麻风树烷型二萜类化合物的制备方法
技术领域
本发明涉及化合物生产领域，尤其是一种麻风树烷型二萜类化合物的制备方法。
背景技术
萜类化合物(TerpenoiAs)是一类骨架多样、数量庞大、生物活性广泛的一类重要的天然药物化学成分。中药甘遂的主要成分就是此类化合物，包括三萜类和二萜类化合物，而麻风树烷型二萜类化合物是甘遂二萜类成分之一，多为一个5元环与一个12元环骈合在一起而形成,同时某些位置的羟基形成醚或酯桥。麻风树烷型二萜类化合物kansuininA就是其中一种，具有广泛的生物活性，其结构如下：
目前发现，kansuininA对流感病毒FM1感染的小鼠病毒性肺炎有一定的治疗作用，但是随剂量的增加，反而加剧了染毒小鼠肺的肝样性病变，表现出弱的抗病毒活性。
研究表明，kansuininA存在于甘遂中。现行《中国药典》收录的甘遂为大戟科大戟属植物甘遂的干燥块根。性寒,味苦；有毒。现代研究表明,甘遂化学成分具有抗氧化、抗肿瘤、抗生育、抗病毒、泻下和免疫抑制等作用。
但是关于甘遂的化学成分，传统提取方法都是通过液液萃取的方式进行，该种方法存在许多缺陷，如批次之间不具有重复性，整个提取过程的时间周期长，试剂耗费量大等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种麻风树烷型二萜类化合物的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种麻风树烷型二萜类化合物(kansuininA)的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备甘遂粗提物：以甘遂为原料，磨成粉末状得到干燥的甘遂粗粉，甘遂粗粉与乙酸乙酯的料液比按kg/L计1:(8-10)将甘遂粗粉用乙酸乙酯常温下浸泡5h，间歇搅拌，提取1-3次，静置过夜，取上清，过滤，所得滤液进行减压浓缩至干，溶于正己烷-乙醇溶液中，进行减压抽滤，得到甘遂浓度为50-500mg/mL的提取液；
(2)对所得到的提取液进行一维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇；进样量为50-300mL/针；流动相流速为600mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；梯度洗脱；根据紫外吸收光谱收集目的组分，减压浓缩至干，得到一维液相组分；
(3)用甲醇溶解一维液相组分，溶解至浓度为80-130mg/mL；
(4)进行二维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是水，B相是乙腈；进样量为1.0-4.0mL/针；流动相流速为10-18mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；梯度洗脱；根据紫外吸收光谱收集目的组分(GS-5-4峰(22.9-25.9min)作为目的组分)，减压浓缩至干，得到二维液相组分；
(5)用甲醇溶解二维液相组分，溶解至浓度为50-200μg/mL；
(6)进行三维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是水，B相是乙腈；进样量为10-100μL/针；流动相流速为3-5mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；等度洗脱；根据紫外吸收光谱收集目的组分，减压浓缩至干，得到目的产物。
优选的，上述麻风树烷型二萜类化合物的制备方法，所述步骤(2)中一维液相色谱分离采用的色谱柱为正相硅胶轴向加压色谱柱，填料为AgelaInnovalsilica(250mm×150mm；10μm,使用时柱温为室温或25-40℃。
优选的，上述麻风树烷型二萜类化合物的制备方法，所述步骤(4)中二维液相色谱采用的色谱柱为：HanbonC18色谱柱(250mm×20mm；8μm,使用时柱温为室温或25-40℃。
优选的，上述麻风树烷型二萜类化合物的制备方法，所述步骤(6)中三维液相色谱采用的色谱柱为：HanbonC18色谱柱(250mm×10mm；8μm，使用时柱温为室温或25-40℃。
优选的，上述麻风树烷型二萜类化合物的制备方法，所述步骤(1)(2)中减压浓缩采用旋转蒸发仪进行，工艺条件为真空度0.05-0.08Mpa、温度50-60℃。
优选的，上述麻风树烷型二萜类化合物的制备方法，所述步骤(4)(6)中减压浓缩采用旋转蒸发仪进行，工艺条件为真空度0.05-0.08Mpa、温度60-80℃。
优选的，上述麻风树烷型二萜类化合物的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备甘遂粗提物：以甘遂为原料，磨成粉末状得到干燥的甘遂粗粉，甘遂粗粉与乙酸乙酯的料液比按kg/L计1:9将甘遂粗粉用乙酸乙酯常温下浸泡5h，间歇搅拌，提取3次，静置过夜，取上清，过滤，所得滤液进行旋转蒸发至干，溶于正己烷-乙醇溶液中，进行减压抽滤，得到甘遂浓度为94mg/mL的提取液；
(2)对所得到的提取液进行一维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇；进样量为200mL/针；流动相流速为600mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长210nm；梯度洗脱——0-20％B洗脱25min，100％B洗脱8min；根据紫外吸收光谱收集目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到一维液相组分；
(3)用甲醇溶解一维液相组分，溶解至浓度为124mg/mL；
(4)进行二维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是水，B相是乙腈；进样量为1.0-4.0mL/针；流动相流速为10-18mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长210nm；梯度洗脱——30-95％B洗脱40min,95％B洗脱10min；根据紫外吸收光谱收集目的组分(GS-5-4峰(22.9-25.9min)作为目的组分)，旋转蒸发浓缩至干，得到二维液相组分；
(5)用甲醇溶解二维液相组分，溶解至浓度为87μg/mL；
(6)进行三维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是水，B相是乙腈；进样量为50μL/针；流动相流速为3mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长210nm；60％B等度洗脱；根据紫外吸收光谱收集目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到目的产物。
本发明的有益效果是：
上述麻风树烷型二萜类化合物，采用三维液相色谱技术提取kansuininA，将提取物直接溶解，通过制备型高效液相色谱技术进行分离，大大减少了提取分离的工作量，具有分离效率高，产品纯度高达98％以上，重复性好，仪器自动化程度高，得到的物质组分批次之间一致性高，可操作性好，经工艺放大后可以运用于工业生产等优点，所得单体化合物容易积累到一定量，为进一步探索单体化合物的药效学奠定基础，适合大规模生产的要求。
附图说明
图1是从甘遂中分离纯化kansuininA的一维高效制备液相色谱图；
图2是从甘遂中分离纯化kansuininA的二维高效制备液相色谱图；
图3是从甘遂中分离纯化kansuininA的三维高效制备液相色谱图；
图4是本发明所得到的目的组分kansuininA的分析型高效液相色谱图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
实施例1
以甘遂为原料，磨成粉末状后用乙酸乙酯在室温下浸泡5h,甘遂粗粉与乙酸乙酯的料液比按kg/L计为1:8，间歇搅拌，连续提取3次，取上清减压蒸馏的方式进行浓缩，采用真空度0.06Mpa、温度50℃，得到乙酸乙酯粗提物，呈浸膏状，称取350g粗提物，溶于3800mL乙醇体积分数为30％的乙醇-正己烷溶液，制得甘遂提取物溶液，浓度为92mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备，色谱柱为Innovalsilica(250mm×150mm；10μm,流动相采用二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇，梯度洗脱方式：0-20％B洗脱25min，100％B洗脱8min。采用紫外检测器，检测波长210nm，制备温度为室温，进样量为200mL/针，流动相流速为600mL/min，收集16.6-19.7分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，采用真空度0.06Mpa、温度60℃得到一维液相组分。用甲醇溶解一维组分，浓度为124mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行二维液相色谱制备，色谱柱为HanbonC18色谱柱(250mm×20mm；8μm，流动相采用二元混合有机相，其中A相是水，B相是乙腈，采用30-95％B洗脱40min,95％B洗脱10min。采用紫外检测器，检测波长210nm，制备温度为室温，进样量为3mL/针，流动相流速为15mL/min，收集23-25.9分钟的馏分，旋转蒸发至干，采用真空度0.06Mpa、温度70℃得到二维液相组分。用甲醇溶解二维组分，浓度为87μg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行三维液相色谱制备，色谱柱为HanbonC18色谱柱(250mm×10mm；8μm，流动相采用二元混合有机相，其中A相是水，B相是乙腈，采用60％B等度洗脱20min。采用紫外检测器，检测波长210nm，制备温度为室温，进样量为45μL/针，流动相流速为3mL/min，收集18-19.8分钟的馏分，旋转蒸发至干，采用真空度0.06Mpa、温度70℃得到kansuininA化合物。经液相色谱分析，纯度为97.5％，一维制备kansuininA粗品中kansuininA的含量为17％。
实施例2
以甘遂为原料，磨成粉末状后用乙酸乙酯在室温下浸泡5h,甘遂粗粉与乙酸乙酯的料液比按kg/L计为1:10，间歇搅拌，连续提取3次，取上清减压蒸馏的方式进行浓缩，采用真空度0.06Mpa、温度50℃，得到乙酸乙酯粗提物，呈浸膏状，称取380g，溶于4000mL乙醇体积分数为30％的乙醇-正己烷溶液，制得甘遂提取物溶液，浓度为95mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备，色谱柱为Innovalsilica(250mm×150mm；10μm,流动相采用二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇，梯度洗脱方式：0-20％B洗脱25min，100％B洗脱8min。采用紫外检测器，检测波长210nm，制备温度为室温，进样量为200mL/针，流动相流速为600mL/min，收集16.6-19.7分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，采用真空度0.06Mpa、温度60℃，得到一维液相组分。用甲醇溶解一维组分，浓度为124mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行二维液相色谱制备，色谱柱为HanbonC18色谱柱(250mm×20mm；8μm，流动相采用二元混合有机相，其中A相是水，B相是乙腈，采用30-95％B洗脱40min,95％B洗脱10min。采用紫外检测器，检测波长210nm，制备温度为室温，进样量为2.5mL/针，流动相流速为16mL/min，收集22.5-25.8分钟的馏分，旋转蒸发至干，采用真空度0.06Mpa、温度70℃，得到二维液相组分。用甲醇溶解二维组分，浓度为87μg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行三维液相色谱制备，色谱柱为HanbonC18色谱柱(250mm×10mm；8μm，流动相采用二元混合有机相，其中A相是水，B相是乙腈，采用60％B等度洗脱20min。采用紫外检测器，检测波长210nm，制备温度为室温，进样量为40μL/针，流动相流速为4mL/min，收集17.5-18.8分钟的馏分，旋转蒸发至干，采用真空度0.06Mpa、温度70℃，得到kansuininA化合物。经液相色谱分析，纯度为98.5％，一维制备kansuininA粗品中kansuininA的含量为18％。
实施例3
以甘遂为原料，磨成粉末状后用乙酸乙酯在室温下浸泡5h,甘遂粗粉与乙酸乙酯的料液比按kg/L计为1:10间歇搅拌，连续提取3次，取上清减压蒸馏的方式进行浓缩，采用真空度0.06Mpa、温度50℃，得到乙酸乙酯粗提物，呈浸膏状，称取400g，溶于4500mL乙醇体积分数为30％的乙醇-正己烷溶液，制得甘遂提取物溶液，浓度为89mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备，色谱柱为Innovalsilica(250mm×150mm；10μm,流动相采用二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇，梯度洗脱方式：0-20％B洗脱25min，100％B洗脱8min。采用紫外检测器，检测波长210nm，制备温度为室温，进样量为200mL/针，流动相流速为600mL/min，收集16.6-19.7分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，采用真空度0.06Mpa、温度60℃，得到一维液相组分。用甲醇溶解一维组分，浓度为124mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行二维液相色谱制备，色谱柱为HanbonC18色谱柱(250mm×20mm；8μm，流动相采用二元混合有机相，其中A相是水，B相是乙腈，采用30-95％B洗脱40min,95％B洗脱10min。采用紫外检测器，检测波长210nm，制备温度为室温，进样量为2mL/针，流动相流速为14mL/min，收集23-26分钟的馏分，旋转蒸发至干，采用真空度0.06Mpa、温度70℃，得到二维液相组分。用甲醇溶解二维组分，浓度为87μg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行三维液相色谱制备，色谱柱为HanbonC18色谱柱(250mm×10mm；8μm，流动相采用二元混合有机相，其中A相是水，B相是乙腈，采用60％B等度洗脱20min。采用紫外检测器，检测波长210nm，制备温度为室温，进样量为60μL/针，流动相流速为3mL/min，收集17.9-19.3分钟的馏分，旋转蒸发至干，采用真空度0.06Mpa、温度70℃，得到kansuininA化合物。经液相色谱分析，纯度为98.9％，一维制备kansuininA粗品中kansuininA的含量为23％。
实施例4
如图1-4所示，以甘遂为原料，磨成粉末状后用乙酸乙酯在室温下浸泡5h,甘遂粗粉与乙酸乙酯的料液比按kg/L计为1:9，间歇搅拌，连续提取3次，取上清减压蒸馏的方式进行浓缩，采用真空度0.06Mpa、温度50℃，得到乙酸乙酯粗提物，呈浸膏状，称取470g，溶于5000mL乙醇体积分数为30％的乙醇-正己烷溶液，制得甘遂提取物溶液，浓度为94mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备，色谱柱为Innovalsilica(250mm×150mm；10μm,流动相采用二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇，梯度洗脱方式：0-20％B洗脱25min，100％B洗脱8min。采用紫外检测器，检测波长210nm，制备温度为室温，进样量为200mL/针，流动相流速为600mL/min，收集16.6-19.7分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，采用真空度0.06Mpa、温度60℃，得到一维液相组分。用甲醇溶解一维组分，浓度为124mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行二维液相色谱制备，色谱柱为HanbonC18色谱柱(250mm×20mm；8μm，流动相采用二元混合有机相，其中A相是水，B相是乙腈，采用30-95％B洗脱40min,95％B洗脱10min。采用紫外检测器，检测波长210nm，制备温度为室温，进样量为3mL/针，流动相流速为15mL/min，收集22.9-25.9分钟的馏分，旋转蒸发至干，采用真空度0.06Mpa、温度70℃，得到二维液相组分。用甲醇溶解二维组分，浓度为87μg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行三维液相色谱制备，色谱柱为HanbonC18色谱柱(250mm×10mm；8μm，流动相采用二元混合有机相，其中A相是水，B相是乙腈，采用60％B等度洗脱20min。采用紫外检测器，检测波长210nm，制备温度为室温，进样量为50μL/针，流动相流速为3mL/min，收集18.1-19.5分钟的馏分，旋转蒸发至干，采用真空度0.06Mpa、温度70℃，得到目标化合物(kansuininA)。经液相色谱分析，为背景技术中所述kansuininA化合物，纯度为99.5％，一维制备kansuininA粗品中kansuininA的含量为24％。
本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合医药制备领域的普通市售产品。
上述参照具体实施方式对该一种麻风树烷型二萜类化合物的制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种麻风树烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)制备甘遂粗提物：以甘遂为原料，磨成粉末状得到干燥的甘遂粗粉，甘遂粗粉与乙酸乙酯的料液比按kg/L计1:(8-10)将甘遂粗粉用乙酸乙酯常温下浸泡5h，间歇搅拌，提取1-3次，静置过夜，取上清，过滤，所得滤液进行减压浓缩至干，溶于正己烷-乙醇溶液中，进行减压抽滤，得到甘遂浓度为50-500mg/mL的提取液；
(2)对所得到的提取液进行一维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇；进样量为50-300mL/针；流动相流速为600mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；梯度洗脱；根据紫外吸收光谱收集目的组分，减压浓缩至干，得到一维液相组分；
(3)用甲醇溶解一维液相组分，溶解至浓度为80-130mg/mL；
(4)进行二维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是水，B相是乙腈；进样量为1.0-4.0mL/针；流动相流速为10-18mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；梯度洗脱；根据紫外吸收光谱收集目的组分，减压浓缩至干，得到二维液相组分；
(5)用甲醇溶解二维液相组分，溶解至浓度为50-200μg/mL；
(6)进行三维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是水，B相是乙腈；进样量为10-100μL/针；流动相流速为3-5mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；等度洗脱；根据紫外吸收光谱收集目的组分，减压浓缩至干，得到目的产物。
2.根据权利要求1所述的麻风树烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中一维液相色谱分离采用的色谱柱为正相硅胶轴向加压色谱柱，填料为AgelaInnovalsilica——250mm×150mm；10μm,使用时柱温为室温或25-40℃。
3.根据权利要求1所述的麻风树烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中二维液相色谱采用的色谱柱为：HanbonC18色谱柱——250mm×20mm；8μm,使用时柱温为室温或25-40℃。
4.根据权利要求1所述的麻风树烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中三维液相色谱采用的色谱柱为：HanbonC18色谱柱——250mm×10mm；8μm，使用时柱温为室温或25-40℃。
5.根据权利要求1所述的麻风树烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)(2)中减压浓缩采用旋转蒸发仪进行，工艺条件为真空度0.05-0.08Mpa、温度50-60℃。
6.根据权利要求1所述的麻风树烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)(6)中减压浓缩采用旋转蒸发仪进行，工艺条件为真空度0.05-0.08Mpa、温度60-80℃。
7.根据权利要求1所述的麻风树烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)制备甘遂粗提物：以甘遂为原料，磨成粉末状得到干燥的甘遂粗粉，甘遂粗粉与乙酸乙酯的料液比按kg/L计1:9将甘遂粗粉用乙酸乙酯常温下浸泡5h，间歇搅拌，提取3次，静置过夜，取上清，过滤，所得滤液进行旋转蒸发至干，溶于正己烷-乙醇溶液中，进行减压抽滤，得到甘遂浓度为94mg/mL的提取液；
(2)对所得到的提取液进行一维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇；进样量为200mL/针；流动相流速为600mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长210nm；梯度洗脱——0-20％B洗脱25min，100％B洗脱8min；根据紫外吸收光谱收集目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到一维液相组分；
(3)用甲醇溶解一维液相组分，溶解至浓度为124mg/mL；
(4)进行二维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是水，B相是乙腈；进样量为1.0-4.0mL/针；流动相流速为10-18mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长210nm；梯度洗脱——30-95％B洗脱40min,95％B洗脱10min；根据紫外吸收光谱收集目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到二维液相组分；
(5)用甲醇溶解二维液相组分，溶解至浓度为87μg/mL；
(6)进行三维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是水，B相是乙腈；进样量为50μL/针；流动相流速为3mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长210nm；60％B等度洗脱；根据紫外吸收光谱收集目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到目的产物。
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