CN105061310A - 一种从千层塔中提取石杉碱甲的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从千层塔中提取石杉碱甲的方法，包括下述步骤:浸泡处理、原料处理、酶解、去油、酸解、柱层析、重结晶。本发明先采用酶提取植物油脂，利用非油成分对油和水的亲和力差异及油水比重不同而将油和非油成分分离，增加了产品收率和提高了提取率。

Description

一种从千层塔中提取石杉碱甲的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域的提取方法，具体说是一种从千层塔中提取石杉碱甲的方法。

背景技术

千层塔为石杉科石杉属蕨类植物，又名蛇足石杉、救命王。多年生草本，全株暗绿色，高15～40厘米。根须状。茎直立或下部平卧，顶端常具生殖芽，落地成新苗。叶纸质，椭圆状披针形。孢子囊肾形，横生叶腋，两端超出叶缘，淡黄色，全株上下均有。主布东北、长江流域和闽、粤、桂、滇、黔等省区。民间常将全草入药，有毒，用于退热、止血、消肿散毒、跌打损伤等。在中国南方，民间用石松类全草治疗风湿麻痹、跌打损伤、发热等症。1881年，Bodeker从L.complanatum分离得到了第一个石松生物碱；自1986年刘嘉森从石松类植物蛇足石杉〔Huperziaseratta(Thunb),Trev(Huperziaceae)〕中分离得到了石杉碱甲以来，石杉碱甲成为药学界持续研究的热点之一。

石杉碱甲(HuperzineA)为可逆的、高选择性的、低毒性的胆碱酷酶抑制剂，可以增加大脑中的乙酞胆碱含量，有恢复和增强记忆的疗效，为我国首创的治疗良性记忆障碍和阿尔茨海默氏痴呆的药物，疗效高于他克林，毒扁豆碱和加兰他敏。国内用于治疗老年痴呆的石杉碱甲新药“双益平”和“哈伯因”已经成功生产上市。石杉碱甲对有机磷中毒，以及重症肌无力症治疗也有显著疗效。石杉碱甲易透过血脑屏障，口服生物利用度高，作用时间长的特点，无严重不良反应，在国际上已被列为第二代胆碱酷酶的抑制剂，是目前国内外上述病症最有效的药物。

传统的石杉碱甲分离方法有酒石酸浸泡、盐酸渗流,Soxhlet抽提以及用乙醇回流提取、硅胶柱层析等，这些方法缺点是耗时、有机试剂用量多、得率低以及杂质较多。盐酸渗流法以生药粗粉用2％HCl渗流，继而以阳离子树脂交换，所得总碱用硅胶柱层析低压分离，再以乙醇-冰醋酸洗脱。按色带不同分成6部分，不同部分再进一步分离，利用制备性薄层层析分离得到石杉碱甲。此法步骤繁琐，使用的试剂较多，成本高，得率低，不适合工业化，只适用于实验室少量分离。乙醇提取法是以95％的乙醇浸泡提取石松生物碱，再以稀NaOH溶液萃取，所得的酚性生物碱再以碱性硅胶柱层析，接着用氯仿-甲醇洗脱，各流份以薄层层析检查，最后用丙酮进行重结晶得到石杉碱甲晶体。此法提取分离石杉碱甲相对来说工艺流程缩短了，但是提取不完全，得率低，费用高。沈生荣等用氯仿制成总碱浸膏再用盐酸进行萃取的方法分离得到石杉碱甲。查圣华，李秀男等利用微波协助提取及超声提取石杉碱甲等法，与传统提取方法相比有固液分离次数少，处理时间短，操作简便；溶剂耗量少，成本低；选择性好，杂质较少；能量传输效果好等优点，但是费用高，不便用于产业化。

发明内容

本发明的目的是提供一种从千层塔中提取石杉碱甲的方法，具有工艺简单，适合生产，生产成本低等优点。

本发明通过以下技术方案实现，具体包括如下步骤：

1)浸泡处理：将千层塔装入编织袋，扎好口，放在水池里，水池加满水，并在水池上面压上重物，浸泡；

2)原料处理：将步骤1)得到的千层塔粉碎至20-40目，加入相当于原料2-3倍重量的纯净水，加热至50-60℃维持5-10分钟，得到膏状浆液；

3)酶解：将步骤2)得到的膏状浆液，调pH为4-5，加入膏状浆液0.05-0.1％重量份的果胶-纤维素复合酶和0.001重量份的甘露醇进行酶解40-60分钟，得到酶解液；

4)去油：将步骤3)得到的酶解液，加入2-3倍重量的纯净水，加热至60-70℃浸提60-120分钟，得上层浮油液与下层液、渣混合物，分离；

5)酸解：将步骤4)得到的下层液、渣混合物，用硫酸调pH为2-3，加热至50-60℃维持6-8小时；

6)萃取：向步骤5)得到的酸解液中加入氨水，调pH为8-9，加入氯仿进行萃取，然后将氯仿萃取液浓缩得浸膏；

7)柱层析：将步骤6)得到的浸膏，用20-30％乙醇(v/v)溶解，用腈基键合硅胶树脂反相层析，用40％乙醇(v/v)进行洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至无醇味；

8)重结晶：向步骤7)得到的洗脱液中加入丙酮进行重结晶，洗涤，干燥得石杉碱甲。

本发明步骤1)所述的浸泡，时间优选15-24小时。

步骤3)所述的果胶-纤维素复合酶，优选活性是1-3万活性单位/克(毫升)的固态或液态果胶-纤维复合酶。

与现有技术相比，本发明的优点：

1、千层塔的植物细胞内含有大量的油脂，主要由成分为甘油三酯的化合物组成的混合物，这些油脂以油粒和油体原生质体形式、呈不连续颗粒状、与颗粒蛋白体一起无规则地分散在细胞内等存在形式存在。现有的提取方法，都是直接对千层塔等原料打碎或粉碎后通过水提/醇提、酶解、或者微波提取等方式直接提取，在提取的时候，细胞中的油脂会同时分离出，含有油脂的基团和石杉碱甲等生物碱混在一起，从而影响后续有效成分的分离，增加了工序的处理难度。本发明先采用酶提取植物油脂，利用非油成分对油和水的亲和力差异及油水比重不同而将油和非油成分分离，增加了产品收率和提高了提取率。

2、本发明采用千层塔水池浸泡，千层塔浸泡在水里，千层塔逐渐软化，水分自然进入到内部，利于植物油脂的分离，利于后续酶解、去油；同时，千层塔浸泡在水里，厌氧细菌大量繁殖，特别是夏天的时候，会变酸，pH值会下降，方便后面工序的调整pH。

3、本发明先采用果胶-纤维素复合酶去除细胞壁，释放植物细胞中的油脂，加入甘露醇，可以保持渗透压，利于油脂的释放。

4、本发明得到的石杉碱甲，经HPLC检测，含量在99％以上，收率90％以上。

具体实施方式

下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1：

一种从千层塔中提取石杉碱甲的方法，具体包括如下步骤：

1)浸泡处理：将千层塔装入编织袋，扎好口，放在水池里，水池加满水，并在水池上面压上重物，浸泡15小时；

2)原料处理：将步骤1)得到的千层塔粉碎，加入相当于原料2-3倍重量的纯净水，加热至50℃维持5分钟，得到膏状浆液；

3)酶解：将步骤2)得到的膏状浆液，调pH为4，加入膏状浆液0.05％重量份活性是1万活性单位/克的果胶-纤维素复合酶和0.001重量份的甘露醇进行酶解40分钟，得到酶解液；

4)去油：将步骤3)得到的酶解液，加入2倍重量的纯净水，加热至60℃浸提120分钟，得上层浮油液与下层液、渣混合物，分离；

5)酸解：将步骤4)得到的下层液、渣混合物，用硫酸调pH为2，加热至60℃维持6小时；

6)萃取：向步骤5)得到的酸解液中加入氨水，调pH为8，加入氯仿进行萃取，然后将氯仿萃取液浓缩得浸膏；

7)柱层析：将步骤6)得到的浸膏，用20％乙醇(v/v)溶解，用腈基键合硅胶树脂反相层析，用40％乙醇(v/v)进行洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至无醇味；

8)重结晶：向步骤7)得到的洗脱液中加入丙酮进行重结晶，洗涤，干燥得石杉碱甲，经HPLC检测，含量99.1％。

实施例2：

一种从千层塔中提取石杉碱甲的方法，具体包括如下步骤：

1)浸泡处理：将千层塔装入编织袋，扎好口，放在水池里，水池加满水，并在水池上面压上重物，浸泡24小时；

2)原料处理：将步骤1)得到的千层塔破碎，加入相当于原料2-3倍重量的纯净水，加热至60℃维持8分钟，得到膏状浆液；

3)酶解：将步骤2)得到的膏状浆液，调pH为4.5，加入膏状浆液0.1％重量份活性是2万活性单位/毫升的果胶-纤维素复合酶和0.001重量份的甘露醇进行酶解50分钟，得到酶解液；

4)去油：将步骤3)得到的酶解液，加入3倍重量的纯净水，加热至70℃浸提60分钟，得上层浮油液与下层液、渣混合物，分离；

5)酸解：将步骤4)得到的下层液、渣混合物，用硫酸调pH为3，加热至50℃维持8小时；

6)萃取：向步骤5)得到的酸解液中加入氨水，调pH为9，加入氯仿进行萃取，然后将氯仿萃取液浓缩得浸膏；

7)柱层析：将步骤6)得到的浸膏，用30％乙醇(v/v)溶解，用腈基键合硅胶树脂反相层析，用40％乙醇(v/v)进行洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至无醇味；

8)重结晶：向步骤7)得到的洗脱液中加入丙酮进行重结晶，洗涤，干燥得石杉碱甲，经HPLC检测，含量99.2％。

实施例3：

1)浸泡处理：将千层塔装入编织袋，扎好口，放在水池里，水池加满水，并在水池上面压上重物，浸泡18小时；

2)原料处理：将步骤1)得到的千层塔粉碎，加入相当于原料2-3倍重量的纯净水，加热至55℃维持10分钟，得到膏状浆液；

3)酶解：将步骤2)得到的膏状浆液，调pH为5，加入膏状浆液0.08％重量份活性是3万活性单位/克的果胶-纤维素复合酶和0.001重量份的甘露醇进行酶解60分钟，得到酶解液；

4)去油：将步骤3)得到的酶解液，加入2倍重量的纯净水，加热至65℃浸提100分钟，得上层浮油液与下层液、渣混合物，分离；

5)酸解：将步骤4)得到的下层液、渣混合物，用硫酸调pH为3，加热至60℃维持7小时；

6)萃取：向步骤5)得到的酸解液中加入氨水，调pH为8，加入氯仿进行萃取，然后将氯仿萃取液浓缩得浸膏；

7)柱层析：将步骤6)得到的浸膏，用20％乙醇(v/v)溶解，用腈基键合硅胶树脂反相层析，用40％乙醇(v/v)进行洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至无醇味；

8)重结晶：向步骤7)得到的洗脱液中加入丙酮进行重结晶，洗涤，干燥得石杉碱甲，经HPLC检测，含量99.1％。

Claims (3)

1.一种从千层塔中提取石杉碱甲的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)浸泡处理：将千层塔装入编织袋，扎好口，放在水池里，水池加满水，并在水池上面压上重物，浸泡；

2)原料处理：将步骤1)得到的千层塔粉碎或破碎，加入相当于原料2-3倍重量的纯净水，加热至50-60℃维持5-10分钟，得到膏状浆液；

3)酶解：将步骤2)得到的膏状浆液，调pH为4-5，加入膏状浆液0.05-0.1％重量份的果胶-纤维素复合酶和0.001重量份的甘露醇进行酶解40-60分钟，得到酶解液；

4)去油：将步骤3)得到的酶解液，加入2-3倍重量的纯净水，加热至60-70℃浸提60-120分钟，得上层浮油液与下层液、渣混合物，分离；

5)酸解：将步骤4)得到的下层液、渣混合物，用硫酸调pH为2-3，加热至50-60℃维持6-8小时；

6)萃取：向步骤5)得到的酸解液中加入氨水，调pH为8-9，加入氯仿进行萃取，然后将氯仿萃取液浓缩得浸膏；

7)柱层析：将步骤6)得到的浸膏，用20-30％乙醇溶解，用腈基键合硅胶树脂反相层析，用40％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至无醇味；

8)重结晶：向步骤7)得到的洗脱液中加入丙酮进行重结晶，洗涤，干燥得石杉碱甲。

2.根据权利要求1所述的一种从千层塔中提取石杉碱甲的方法，其特征在于：步骤1)所述的浸泡，时间为15-24小时。

3.根据权利要求1所述的一种从千层塔中提取石杉碱甲的方法，其特征在于：步骤3)所述的果胶-纤维素复合酶，为活性是1-3万活性单位/克的固态或1-3万活性单位/毫升的液态果胶-纤维复合酶。