CN1644208A

CN1644208A - 石杉碱甲、乙复合成分的蛇足石杉提取物及其制备方法

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Publication number: CN1644208A
Application number: CNA2004100846331A
Authority: CN
Inventors: 谢德隆; 谢家骏; 王军
Original assignee: Xie Jiajun
Current assignee: Shanghai Tianci Life Science Development Co ltd
Priority date: 2004-11-26
Filing date: 2004-11-26
Publication date: 2005-07-27
Anticipated expiration: 2024-11-26
Also published as: CN100566714C; WO2006056129A1; CN100441200C; US20070286911A1; CN101102772A; US8574633B2

Abstract

本发明涉及天然药物技术领域。本发明公开了一种含有石杉碱甲和石杉碱乙组合成分的蛇足杉提取物及制备方法。本发明方法制得的提取物含总生物碱以重量％表示为30％～99％，其中包括石杉碱甲和石杉碱乙总量以重量％表示达75％～99％。药效和毒理试验表明本发明的提取物具有明显的抑制胆碱酯酶活力的作用，其安全性和经济性明显优于石杉碱甲。本发明的提取物可用于制备能够改善和增强记忆及认知功能、防治阿尔茨海默病的药物制剂。

Description

石杉碱甲、乙复合成分的蛇足石杉提取物及其制备方法

技术领域：

本发明属于天然药物技术领域。具体涉及一种含有石杉碱甲、乙复合成分、能够改善和增强记忆及认知功能、防治阿尔茨海默病的蛇足石杉提取物及制备方法。

背景技术：

随着人类平均寿命的延长，学习记忆及认知功能障碍型中枢精神性疾病包括幼儿智力发育迟缓、成人记忆障碍、阿尔茨海默病等的发病率日见增加，尤其后者现已逐渐成为社会性问题而引起人们的高度关注。

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，也叫老年性痴呆或早老性痴呆，是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的致死性中枢神经系统退行性疾病。据WHO(世界卫生组织)最新估计，目前全世界阿尔茨海默病发病人数高达2000多万。其中，患有AD的人数在65岁以上的人群中占10％，而在85岁以上的人群中占有50％。在美国，现有400万人患有和缓性认知损伤疾病，还有另外400万人患有AD，且患病人数正呈急剧增加态势。在中国，随着社会快速迈入老龄化，AD患者亦呈现出增长的趋势。据北京协和医院对中国部分地区进行的阿尔茨海默病流行病学初步调查结果显示，我国北方地区65岁及以上居民阿尔茨海默病发病率为4.2％。以此推测，中国目前60岁以上老年人约占总人口的10％，为1.3亿，患有阿尔茨海默病人数约500万人之多。

AD确切病因至今不明，但大量的基础和临床实验证明，AD的记忆力损害及进行性认知障碍与其中枢神经递质乙酰胆碱量的持续相对不足有着密切的关系。病理生理学研究显示，AD患者大脑的新皮质、海马区、基底核和蓝斑核等部位的神经元大量丢失，同时伴有多种神经递质在脑内浓度的减少，尤其是乙酰胆碱的减少。中枢乙酰胆碱能系统功能的显著减退是AD早期出现的主要病理变化，并持续整个病程。而应用拟胆碱药物，包括胆碱前体药物，胆碱酯酶抑制剂(AchEI)，选择性M、N胆碱受体激动药等对延缓AD的发生与发展、减轻记忆及认知功能障碍具有明显的疗效。

他克林(tacrine)是美国FDA批准的第一个治疗AD的AchEI，虽然临床有效，但对肝脏的高毒性而使其在临床上的应用受到严格限制。他克林与1996年被美国FDA批准上市的E2020同誉为第一代AchEI。

蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.)Trev.)又名千层塔、蛇足草，作为药用植物，我国唐代陈藏器著的《本草拾遗》、清代吴其浚著的《植物名实图考》中就有记载，中国民间将其用于治疗跌打损伤、毒蛇咬伤和烧烫伤。1972年，中国医药研究人员首次发现该植物的生物碱类对动物横纹肌有松弛活性，1980年后，进一步从中分离出具有强生物活性的生物碱石杉碱甲(Huperzine A)。石杉碱甲属可逆性的胆碱酯酶抑制剂，易通过血脑屏障，具有促进记忆再现和增强记忆保护的作用，对提高正常人的记忆和认知功能、改善成年人记忆障碍、减轻AD患者进行性认知障碍和记忆力损害具有明显的效果。用石杉碱甲单一成分开发出的制剂(商品名哈伯因、双益平)，相对第一代AchEI，由于对脑内AchE具有高度的选择性，从而使其安全性得以显著提高，被誉为第二代AchEI。

临床试验显示，防治记忆及认知障碍疾患的用药周期相对较长，对AD患者也许是终生的，因此，药物的安全使用至关重要。为此，在确保疗效的基础上，有必要着眼于安全性更高的药物制剂的研制与开发。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于研究蛇足石杉总生物碱的抗胆碱酯酶活性、总生物碱主要成分石杉碱甲与石杉碱乙的比例与药效与毒性的关系，从而设计疗效更明显、时效更长、安全性更高、药用植物资源能被更充分地利用，可用于制备能够改善和增强学习记忆及认知功能、防治阿尔茨海默病的蛇足石杉提取物。

本发明提供了一种含有石杉碱甲和石杉碱乙复合成分的蛇足石杉提取物，该提取物含总生物碱以重量％表示为30％～99％(w/w)。

在该总生物碱中，包括石杉碱甲(Huperzine A)和石杉碱乙(Huperzine B)，还包括石杉碱丙(Huperzine C)，石杉碱丁(HuperzineD)，石杉碱戊(Huperzine E)，石杉碱己(Huperzine F)，石杉碱庚(Huperzine G)、6-β-羟基石杉碱甲(6-β-hydroxyhuperzine A)，蛇足石衫碱(Huperzinine)，石松灵碱(Lcyodoline)，石松宁碱(Lycodavine)，山芝宁碱(Serratinine)，山芝亭碱(Serratine)，8-去氧山芝宁碱(8-Deoxyserratinine)，马尾杉碱N(Phlegmariurine N)成分中的一种或多种，其中石杉碱甲和石杉碱乙的总含量以重量％表示为75％～99％。

该提取物中除含总生物碱之外，还含有高良姜素(Galangin)、山柰酚(Kaempferol)、槲皮素(Quercetin)、芹草素(Apigenin)、芫花素(Genkwanin)、木犀草素(Luteolin)和牡荆素(Vitexin)、山芝稀二醇(Serratenediol)、山芝稀三醇(Serratriol)、山芝三醇(Tohogenol)、21-表山芝稀二醇(21-epi-Serratenediol)成份中的一种或多种。

本发明是基于蛇足石杉内总生物碱各成分生物利用度、半衰期不同、各成分间可能存在的相互协同作用以及药物资源学的理论，采用独特的工艺技术，提取、富集蛇足石杉中总生物碱有效成分，调控其中主要成分石杉碱甲与石杉碱乙的比例，采用现代科学手段和实验方法，了解并掌握了其有效组分比例与药效毒性的关系，制订了可使疗效更明显、时效更长、用药更安全的提取物制备方法，同时亦使药用植物资源得到充分利用。

本发明提供了含有石杉碱甲和石杉碱乙复合成分的蛇足石杉提取物的制备方法，该方法包括下列步骤：

(1)提取：将生药蛇足石杉粉碎后置于提取罐中，用10～20倍量含0.5～1.5％盐酸或酒石酸水溶液，20～50℃条件下，动态搅拌提取24～48小时，得生药提取液；残渣用20～95％乙醇或水，80～100℃条件下，回流提取1～3小时，得残渣提取液；；

(2)浓缩：将步骤(1)生药提取液和残渣提取液分别浓缩至不超过原体积重量10～15％；

(3)萃取：将步骤(2)生药提取浓缩液用稀碱氨水调节PH值至8～10，用氯仿反复萃取3～6次，合并氯仿萃取液，浓缩回收氯仿，浓缩至不超过原体积重量10％；

(4)酸萃取：用1％～4％的柠檬酸或盐酸水溶液反复萃取上述步骤(3)溶液1～3次；

(5)活性炭脱色：取步骤(4)酸水萃取液，用水稀释10倍，活性炭用量为稀释后体积的1％～2％，搅拌10～30分钟，过滤得到透明液体；

(6)浓缩：将上步骤(5)溶液浓缩至不超过原体积的10％；

(7)柱层析：将步骤(6)浓缩物上硅胶柱或大孔树脂或阳离子交换树脂或聚酰胺树脂，采用洗脱用水或C₁～C₃的烷醇或丙酮或氯仿或甲基或乙基酯或它们任意比例的混合溶液洗脱液进行梯度洗脱，搜集高含量流份；

(8)将步骤(2)残渣提取浓缩液加2～4倍量去离子水稀释，搅拌均匀，沉降6小时，上清液16000r/min高速离心，离心液上大孔树脂或阳离子交换树脂或聚酰胺树脂，采用洗脱用水或C₁～C₃的烷醇或它们任意比例的混合溶液进行梯度洗脱，搜集高含量流份；

(9)将上述(7)(8)溜份合并浓缩至原体积的10～20％，将浓缩液送至真空冷冻机中冷冻干燥或喷雾干燥或真空干燥，得蛇足石杉提取物。

本发明生药提取所用的酸为无机酸如盐酸或有机酸如酒石酸。

本发明生药提取所用的方法为动态搅拌提取。

本发明动态搅拌提取后残渣的回流提取所用的溶剂为20～95％乙醇或水。

本发明所述用树脂柱的层析方法，并不限于多孔的聚合物硅胶柱或大孔树脂或阳离子交换树脂或聚酰胺树脂吸附技术。

本发明所述用树脂柱的层析方法，洗脱用水或C₁～C₃的烷醇或丙酮或氯仿或甲基或乙基酯或它们任意比例的混合溶液，例如甲醇～氯仿洗脱液的比例为甲醇∶氯仿＝99～1∶1～99。

本发明采用将浓缩液送至真空冷冻机中冷冻干燥或喷雾干燥或真空干燥，得蛇足石杉提取物。

本发明采用HPLC检测蛇足石杉提取物中石杉碱甲、石杉碱乙的含量，采用UV检测蛇足石杉提取物中石松碱的含量。

本发明提供的上述蛇足石杉提取物适用于制备能够提高少儿记忆功能、改善成年人良性记忆障碍、治疗阿尔茨海默病的药物制剂。

本发明公开的蛇足石杉提取物可用于制备口服制剂如片剂、胶囊、软胶囊、颗粒、滴丸，粘膜吸收剂如滴鼻剂、喷雾剂、栓剂，经皮给药剂如巴布剂，注射剂如肌肉注射、皮下注射、静脉注射等各种制剂。

上述制剂由本发明方法制备的蛇足石杉提取物与药用载体相配制而成。药用载体包括淀粉、糊精、明胶、糖类、糖醇、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、聚乙烯醇、聚丙烯酸或其衍生物、硬脂酸或镁盐或钙盐或其他已知赋形剂中的一种或多种。

具体实施方式

本发明通过以下的实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

实施例1：

制备工艺一：

(1)提取：将蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.)Trev.)100Kg粉碎后在提取罐中，用20倍量含1.5％酒石酸水溶液，30℃条件下，动态搅拌提取36小时；(2)浓缩：将渗滤液浓缩至100L；(3)萃取：将浓缩液用稀碱氨水调节PH值至8.5，用氯仿反复萃取4次，合并氯仿萃取液，浓缩回收氯仿，浓缩至100L；(4)酸反萃取：用2％的柠檬酸水溶液反复萃取上述溶液3次；(5)活性炭脱色：取酸水萃取液，用水稀释10倍，活性炭用量为稀释后体积的1％，搅拌30分钟，过滤得到透明液体；(6)浓缩：将上述溶液浓缩至200L；(7)柱层析：将上述浸膏上硅胶柱，采用甲醇-氯仿洗脱液进行梯度洗脱，搜集甲醇-氯仿(85∶15)洗脱液流份；(8)将上述流份合并浓缩至200ml送至真空冷冻机中冷冻干燥，得蛇足石杉提取物12g，由药材计算收率可达到万分之一点二，含石杉碱甲66％，石杉碱乙33％。

实施例2：

制备工艺二：

(1)提取：将蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.)Trev.)100Kg粉碎后在提取罐中，用20倍量含1.5％酒石酸水溶液，45℃条件下，动态搅拌提取36小时；(2)浓缩：将渗滤液浓缩至100L；(3)萃取：将浓缩液用稀碱氨水调节PH值至9，用氯仿反复萃取4次，合并氯仿萃取液，浓缩回收氯仿，浓缩至100L；(4)酸反萃取：用2％的柠檬酸水溶液反复萃取上述溶液3次；(5)活性炭脱色：取酸水萃取液，用水稀释10倍，活性炭用量为稀释后体积的1％，搅拌30分钟，过滤得到透明液体；(6)浓缩：将上述溶液浓缩至200L；(7)柱层析：将上述浸膏上硅胶柱，采用甲醇-氯仿洗脱液进行梯度洗脱，搜集甲醇-氯仿(50∶50)洗脱液流份；(8)将上述流份合并浓缩至500ml送至真空冷冻机中冷冻干燥，得蛇足石杉提取物30g，由药材计算收率可达到万分之三，含石杉碱甲52％，石杉碱乙39％。

实施例3：

制备工艺三：

(1)提取：将蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.)Trev.)100Kg粉碎后在提取罐中，用20倍量含1.5％酒石酸水溶液，45℃条件下，动态搅拌提取36小时；(2)浓缩：将渗滤液浓缩至100L；(3)萃取：将浓缩液用稀碱氨水调节PH值至9，用氯仿反复萃取4次，合并氯仿萃取液，浓缩回收氯仿，浓缩至100L；(4)酸反萃取：用2％的柠檬酸水溶液反复萃取上述溶液3次；(5)活性炭脱色：取酸水萃取液，用水稀释10倍，活性炭用量为稀释后体积的1％，搅拌30分钟，过滤得到透明液体；(6)浓缩：将上述溶液浓缩至200L；(7)柱层析：将上述浸膏上硅胶柱，采用甲醇-氯仿洗脱液进行梯度洗脱，搜集甲醇-氯仿(25∶75)洗脱液流份；(8)将上述流份合并浓缩至500ml送至真空冷冻机中冷冻干燥，得蛇足石杉提取物50g，由药材计算收率可达到万分之五，含石杉碱甲32％，石杉碱乙65％。

实施例4：

制备工艺四：

(1)提取：将蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.)Trev.)100Kg粉碎后在提取罐中，用20倍量含1.5％酒石酸水溶液，45℃条件下，动态搅拌提取24小时；残渣中加入10倍量65％乙醇85℃条件下回流提取2小时；(2)浓缩：将生药提取液和残渣提取液分别浓缩至100L；(3)萃取：将生药提取浓缩液用稀碱氨水调节PH值至9，用氯仿反复萃取4次，合并氯仿萃取液，浓缩回收氯仿，浓缩至100L；(4)酸反萃取：用2％的柠檬酸水溶液反复萃取上述溶液3次；(5)活性炭脱色：取酸水萃取液，用水稀释10倍，活性炭用量为稀释后体积的1％，搅拌30分钟，过滤得到透明液体；(6)浓缩：将上述溶液浓缩至200L；(7)柱层析：将上述浸膏上硅胶柱，采用甲醇-氯仿洗脱液进行梯度洗脱，搜集甲醇-氯仿(90∶10)洗脱液A溜份，备用；另搜集甲醇-氯仿(50∶50)B溜份；(8)将步骤(2)残渣提取浓缩液加2倍量去离子水，搅拌均匀，沉降6小时，上清液经16000r/min高速离心，取离心液上大孔树脂，依次采用水、20％乙醇、65％乙醇进行梯度洗脱，搜集65％乙醇溜份；(9)将上述(7)B流份与(8)流份合并浓缩至500ml送至真空冷冻机中冷冻干燥，得蛇足石杉提取物150g，由药材计算收率可达到千分之1.5，含石杉碱甲10％，石杉碱乙25％，总黄酮25％。

实施例5：

片剂制备：

处方(1000片量)

成分重量(g)

蛇足石杉提取物 0.1

乳糖 9.7

玉米淀粉 20

微晶纤维素 5

硫酸钙 10

交联羧甲基纤维素 5

硬脂酸镁 0.2

总计 50

按照通常片剂的操作，蛇足石杉提取物与其他辅料采用等量递加混合法混合均匀，采用湿法制粒，烘干后整粒，加入硬脂酸镁混合均匀后，压制成50mg/片。

实施例6：

胶囊制备

处方(1000粒量)

成分重量(g)

蛇足石杉提取物 0.1

玉米淀粉 30

糊精 29.3

硬脂酸镁 0.6

总计 60

按照通常胶囊的操作，以等量递加混合法将蛇足石杉提取物与玉米淀粉和糊精等辅料混合均匀，制粒，以硬脂酸镁作为润滑剂，选用5号胶囊，将药物填充、封口即得。

实施例7：

颗粒制备

处方(1000袋量)

成分重量(g)

蛇足石杉提取物 0.1

糊精 199.9

总计 200

按照通常颗粒的操作进行。将蛇足石杉提取物、糊精分别过筛，混匀，用乙醇-水制成软材，然后筛网制粒，干燥，过筛整粒即得。

实施例8：

滴鼻液体制剂制备

处方(1000瓶量)

成分重量(g)

蛇足石杉提取物 5

2，4-二甲基-β-环糊精 244

山犁糖醇 50

EDTA钠盐 0.5

苯扎氯胺 0.5

总计 250

上述剂量配置的药粉，待使用时加蒸馏水5000ml混匀即得。

实施例9：

气雾剂制备

处方(1000瓶量)

成分重量(g)

蛇足石杉提取物 10

乙醇 540

维生素C 1

F12 适量

按照通常气雾剂的操作进行。首先用乙醇和蒸馏水将蛇足石杉提取物制成溶液，然后与抛射剂混溶成均相溶液即得。

实施例10：

巴布剂制备

处方(1000片量)

成分重量(g)

蛇足石杉提取物 0.5

聚丙烯酸酯 18

月桂氮卓酮 0.6

月桂酸 1.8

丙二醇 5.4

乙酸乙酯 13.7

总计 40

按照通常巴布剂的操作进行。将上述蛇足石杉提取物、皮肤促透剂和粘性聚合物震荡搅匀，涂布于聚酯防粘层上，60℃干燥2分钟后，覆盖聚氨基甲酯膜背衬层，切片即得。

实施例11：

粉针剂制备

处方(1000瓶量)

成分用量

蛇足石杉提取物 0.05g

盐酸适量

注射用水 1000ml

按照通常粉针剂的操作进行。在规定的无菌等级条件下，将注射用水配制的10％盐酸溶液溶解蛇足石杉提取物，调节pH至4.0-5.5之间，用微孔滤膜两次超滤除菌，按剂量灌装，然后置冻干机中冷冻干燥，加塞、压盖即得。

实施例12

石杉碱甲和石杉碱乙含量测定

按照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定。

色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.02mol/L磷酸二氢钾(PH4.5)-乙睛(88∶12)为流动相；检测波长为308nm。理论塔板数按石杉碱甲峰计算，应不低于2000；石杉碱甲和石杉碱乙的分离度应不低于1.5。

对照品溶液的制备：取石杉碱甲和石杉碱乙对照品(市售或自制)，精密称定，用0.01mol/L盐酸使溶解，制成每1ml中各含有0.01mg，即得。

供试品溶液的制备：取蛇足石杉提取物适量，精密称定，用0.01mol/L盐酸溶解，制成每ml含有100ug的溶液，摇匀，滤过，弃去初滤液，取滤液作为供试品溶液。

测定方法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，用外标法计算出供试品中石杉碱甲、石杉碱乙即得。

实施例13

总黄酮含量测定

按照分光光度法(中国药典1995年版一部附录VB)测定。

对照品溶液的制备：精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品(市售或自制)20mg，置100ml容量瓶中，加70％乙醇70ml，于水浴上微热使溶解，放冷，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含无水芦丁0.2mg)。

标准曲线的制备：精密吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml分别置于10ml量瓶中，各加水至3ml，加pH4.5的醋酸—醋酸钠缓冲溶液2ml，0.1mol/L三氯化铝溶液2ml，摇匀，加70％乙醇至刻度，摇匀，以相应的试剂为空白，在270nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

测定方法：取蛇足石杉提取物25mg，于50℃减压干燥2小时，精密称定，置50ml容量瓶中，加70％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取0.5ml，置10ml容量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至3ml”起依法测定吸收度。从标准曲线上读出供试品溶液中相当于芦丁的总黄酮重量(mg)，计算，即得。

本发明蛇足石杉提取物的主要药效学和毒理学实验结果如下：

实验例1

主要药效学试验

1、受试样品：

组合物1：实施例1的蛇足石杉提取物，白色，其中，石杉碱甲66％，石杉碱乙33％，两者的重量比为2∶1；

组合物2：蛇足石杉提取物，白色，其中，石杉碱甲49％，石杉碱乙49％，两者的重量比为1∶1；

组合物3：实施例3的蛇足石杉提取物，白色，其中，石杉碱甲32％，石杉碱乙65％，两者的重量比为1∶2；

对照药：石杉碱甲(市售或自制)，白色粉状结晶，分子式C₁₅H₁₈N₂O，分子量242.32，mp229～230℃；

2、实验动物：

SD大鼠，雄性，体重250～300g，均购自中英合资上海西普尔-必凯实验动物有限公司。实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2003-0002。

3、实验方法：

取磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)和大鼠肝素抗凝全血1ml于试管内，置37℃水浴中预热5min，按样品编号次序迅速正确地加入0.007mol/L 乙酰胆碱溶液1.0ml，置于37℃水浴中，反应30min后即按同样次序迅速加入碱性羟胺溶液4.0ml，并充分振荡2min，继续加入1∶2盐酸溶液2.0ml，充分振荡约2min后，再加10％三氯化铁溶液2.0ml，充分振荡。用普通滤纸将上述溶液共10ml过滤，滤去蛋白的滤液盛入比色杯中以530nm波长进行比色。其中，抑制ChE活力的强度，以不加抑制剂为酶活力100％对照，以剩余酶活力的％对受试品g/l浓度的负对数(pI)作图，求得抑制酶活力50％时的药物剂量即pI50值。

4、实验结果：

以大鼠全血ChE活性的％对受试品g/l浓度的负对数(pI)作图，得到以石杉碱甲与石杉碱乙2∶1、1∶1、1∶2比例组合的蛇足石杉提取物对ChE活性的表观抑制强度图以及对ChE活力50％抑制的IC₅₀(g/l)值，见图1、表1。

表1 以石杉碱甲和石杉碱乙不同比例组合的蛇足石杉提取物

对全血ChE活力的影响

成分比例 IC₅₀

受试样品

HupA∶HupB g/l

组合物1 2∶1 8.04×10^-6

组合物2 1∶1 8.40×10^-6

组合物3 1∶2 9.74×10^-6

对照药 1∶0 4.82×10^-6

5、实验结论

以石杉碱甲和石杉碱乙不同比例组合的蛇足石杉提取物对胆碱酯酶活性均有明显的抑制作用。

实验例2

急性毒性试验：

1、受试样品：

同实验例1的受试样品。

2、实验动物：

ICR小鼠，SPF级，雌雄兼用，体重18～20g，均购自中英合资上海西普尔-必凯实验动物有限公司。实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2003-0002。

3、实验条件：

SPF实验环境。实验用小鼠分每笼5只饲养。饲养温度为22±2℃，湿度为60～70％，实验动物使用许可证号：SYXK(沪)2002-0035。饲以鼠用固体高压料。试验前禁食12小时，不禁水。

4、试验方法：

取小鼠280只，SPF级，雄性，禁食12小时后分别灌胃给以石杉碱甲与石杉碱乙2∶1、1∶1、1∶2比例组合的蛇足石杉提取物，另以石杉碱甲为对照，给药后自由饮食，即时及以后每天上、下午各观察1次，连续7天，第8天后，每天观察1次，记录14天内动物的死亡状况及毒性反应。

5、实验结果：

以简化几率单位法计算，以石杉碱甲和石杉碱乙2∶1、1∶1、1∶2比例组合的蛇足石杉提取物的LD₅₀(可信限95％)分别为9.23±1.9、13.76±3.0、20.33±4.29mg/kg，中毒动物死亡时间在9min～12hr之间，中毒症状主要表现为流涎、流泪、颤抖、抽搐、大汗淋漓、窒息、死亡。见表2。

表2 以石杉碱甲和石杉碱乙不同比例组合的蛇足石杉提取物

急性毒性试验(X±SD)

成分比例 LD₅₀

受试样品

HupA∶HupB mg/kg

组合物1 2∶1 9.23±1.9

组合物2 1∶1 13.76±3.0

组合物3 1∶2 20.33±4.29

对照药 1∶0 9.03±2.27

6、实验结论

石杉碱甲和石杉碱乙2∶1、1∶1、1∶2比例组合的蛇足石杉提取物、石杉碱甲的LD₅₀(可信限95％)分别为9.23±1.9、13.76±3.0、20.33±4.29、9.03±2.27mg/kg。其中，以石杉碱甲与石杉碱乙组合比例为1∶1或1∶2的蛇足石杉提取物的毒性强度比石杉碱甲明显下降，其减小的幅度分别达52.4％和125.1％。

7、实验结论：

石杉碱甲和石杉碱乙不同比例组合的蛇足石杉提取物具有一定的毒性，但其毒性强度相对石杉碱甲明显减小。

实验例1和实验例2结果显示，本发明蛇足石杉提取物(以石杉碱甲和石杉碱乙两成分组合比例明确为其特征)，具有明显的抑制胆碱酯酶活力的作用，且其安全性相对石杉碱甲明显提高。上述主要药效学和毒理学实验结果为其应用于临床治疗和改善中老年记忆减退和早老性痴呆症的记忆和认知障碍提供了坚实的生物学基础。

Claims

1、一种蛇足石杉提取物，其特征在于该提取物中总生物碱的含量以重量％表示为30％～99％，在该总生物碱中，包括石杉碱甲和石杉碱乙，还包括石杉碱丙、石杉碱丁、石杉碱戊、石杉碱己、石杉碱庚、6-β-羟基石杉碱甲、蛇足石衫碱、石松灵碱、石松宁碱、山芝宁碱、山芝亭碱、8-去氧山芝宁碱、马尾杉碱N成份中的一种或多种，其中石杉碱甲和石杉碱乙的总含量以重量％表示为75％～99％。

2、根据权利要求1所述的一种蛇足石杉提取物，其特征在于该提取物中除含总生物碱之外，还含有高良姜素、山柰酚、槲皮素、芹草素、芫花素、木犀草素、牡荆素、山芝烯二醇、山芝稀三醇、山芝三醇、21-表山芝烯二醇成份中的一种或多种。

3、一种蛇足石杉提取物的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)提取：将生药蛇足石杉粉碎后置于提取罐中，用10～20倍量含无机酸或有机酸的水溶液，动态搅拌得生药提取液；残渣用水或乙醇水溶液，回流提取得残渣提取液；

(6)浓缩：将上步骤(5)溶液浓缩至不超过原体积的10％；

(7)柱层析：将步骤(6)浓缩物上硅胶柱或大孔树脂或阳离子交换树脂或聚酰胺树脂，采用洗脱用水或C₁-C₃的烷醇或丙酮或氯仿或甲基或乙基酯或它们任意比例的混合溶液洗脱液进行梯度洗脱，搜集高含量流份；

(8)将步骤(2)残渣提取浓缩液加2～4倍量去离子水稀释，搅拌均匀沉降6小时，上清液16000r/min高速离心，离心液上大孔树脂或阳离子交换树脂或聚酰胺树脂，用水或C₁～C₃的烷醇或它们任意比例的混合溶液进行梯度洗脱，搜集高含量流份；

(9)将上述(7)(8)流份合并浓缩至原体积的10～20％，通过机械干燥得蛇足石杉提取物。

4、根据权利要求3所述的一种蛇足石杉提取物的制备方法，其特征在于其中所述生药提取所用的无机酸或有机酸为盐酸或酒石酸，浓度为0.5～1.5％，提取所用的方法为动态搅拌，提取的温度为20～50℃，时间为6～48小时；残渣提取所用的乙醇水溶液的乙醇浓度为20～95％，回流提取的温度为80～100℃，时间为1～3小时。

5、根据权利要求3所述的一种蛇足石杉提取物的制备方法，其特征在于其中所述洗脱时用C₁～C₃的烷醇指C₁～C₃的烷醇或丙酮或氯仿或甲基或乙基酯。

6、根据权利要求3所述的一种蛇足石杉提取物的制备方法，其特征在于其中所述通过机械干燥指将高含量流份浓缩液送至真空冷冻机中冷冻干燥或喷雾干燥或真空干燥。

7、根据权利要求1所述的一种蛇足石杉提取物，其特征在于该提取物可以用于制备提高少儿记忆功能、改善成年人良性记忆障碍、防止和治疗阿尔茨海默病的药物制剂。

8、根据权利要求1所述的一种蛇足石杉提取物，其特征在于该提取物可作为活性成分与药用载体相配制而成药物制剂。

9、根据权利要求7所述的药物制剂，其药用载体可以包括淀粉、糊精、明胶、糖类、糖醇、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、聚乙烯醇、聚丙烯酸或其衍生物、硬脂酸或镁盐或钙盐中的一种或多种。

10、根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于该制剂包括口服、注射、透皮、粘膜给药制剂。