CN112457251A

CN112457251A - 从千层塔提取物中分离多种高含量生物碱单体的方法

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Publication number: CN112457251A
Application number: CN202011368732.8A
Authority: CN
Inventors: 李伟; 黄华学
Original assignee: Hunan Huacheng Biotech Inc
Current assignee: Hunan Huacheng Biotech Inc
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2040-11-30
Also published as: CN112457251B

Abstract

本发明涉及一种从千层塔总生物碱中分离多种高含量生物碱单体的方法，包括以下步骤：先将千层塔总生物碱用流动相溶解、稀释，再注入高压制备液相色谱柱，最后用流动相洗脱，流动相为乙腈‑水混合溶剂；收集不同时间段的洗脱液馏分，分别浓缩、干燥，得高纯度6β‑羟基石杉碱甲、石杉碱甲和石杉碱乙产品。本发明通过筛选出合适的洗脱剂和洗脱条件，特别是采用了梯度洗脱的方式，以及在洗脱机II中加入少量醋酸，最终以高收率和高纯度得到了三种生物碱单体：6β‑羟基石杉碱甲、石杉碱甲和石杉碱乙产品。

Description

从千层塔提取物中分离多种高含量生物碱单体的方法

技术领域

本发明涉及一种从千层塔提取物中分离天然活性成分的方法，具体涉及一种从千层塔提取物中分离多种高含量生物碱单体的方法。

背景技术

千层塔，为石松科石杉属植物蛇足石杉Lycopodium Serratum Thunb.，以全草入药，是一种名贵珍稀野生药用植物。民间用全草治疗跌打损伤、毒蛇咬伤、淤血肿痛和精神分裂等疾病。

千层塔中富含大量生物碱：石杉碱甲，石杉碱乙，6β-羟基石杉碱甲，石松碱，石松定碱，蛇足石松碱，石松灵碱，棒石松宁碱，千层塔碱，千层塔宁碱，千层塔尼定碱，千层塔它宁碱，千层塔它尼定碱，石松文碱，光泽石松灵碱，N-甲基石杉碱乙，蛇足石杉碱等等。

石杉碱甲是千层塔中一种非常重要的天然植物碱，是一种强效、可逆和高选择性第二代乙酰胆碱酯酶抑制剂。其具有较高的脂溶性，分子小，能很好地透入血脑屏障，进入中枢后较多地分布于大脑的额叶、颞叶、海马等与学习和记忆有密切联系的脑区，在低剂量下对乙酰胆碱酯酶(AchE)有强大的抑制作用，使分布区内神经突触间隙Chemicalbook的乙酰胆碱(Ach)含量明显升高，从而增强神经元兴奋传导，强化学习与记忆脑区的兴奋作用，起到提高认知功能、增强记忆保持和促进记忆再现的作用。是目前国内开发最为成功的治疗阿尔茨海默病(老年性痴呆症)的药物。石杉碱甲还可以用于重症肌无力、老年性记忆衰退和早老性痴呆症、青少年学习障碍和记忆增强，同时具有抗癌、消炎、抑制艾滋病毒等作用。

石杉碱乙同样是一种来源于千层塔的胆碱酯酶抑制剂，其作用特点与石杉碱甲相似，但生物活性为后者的四分之一。

研究发现，6β-羟基石杉碱甲也是一种强效胆碱酯酶抑制剂。动物实验表明，6β-羟基石杉碱甲对乙酰胆碱酯酶的抑制作用比石杉碱甲强约4倍，而毒性远远低于石杉碱甲，具有重要的药用价值。

然而千层塔植株矮小，生长缓慢，散生于山林阴湿处，野生资源十分有限，并且植株中石杉碱甲、石杉碱乙等生物碱的含量极低，限制了它的开发利用。此外，国内对千层塔资源的开发和千层塔提取物的研究往往只局限在石杉碱甲一种成分，通常忽略了其余同样具有药理活性的千层塔生物碱。

CN 00101469.2公开了一种乙酰胆碱酯梅抑制剂石杉碱甲的提取新方法，是以千层塔为原料，经稀酸加热浸泡、调碱氯仿萃取、浓缩、稀碱萃取除杂、稀酸反萃取、活性炭脱色、再调碱氯仿萃取、浓缩、丙酮反复重结晶等步骤，得到石杉碱甲产品。该方法生产周期长达3～4天，原料处理量大、溶剂使用量和消耗量大，反复使用萃取操作易发生乳化，且多次重结晶，导致石杉碱甲损耗大，得率仅十万分之五。

CN 02115669.7公开了从中草药千层塔中提取石杉碱甲的方法，是以千层塔为原料，经粉碎、有机酸浸泡、浓缩、调碱、氯仿萃取、碱液萃取、氯仿再次萃取、浓缩、硅胶拌样、柱层析、梯度洗脱、冷冻结晶、制备型高效液相色谱仪分离提纯、冷冻干燥等步骤，得到石杉碱甲产品。该方法同样原料处理量大、溶剂使用量和消耗量大，反复使用萃取操作易发生乳化，且结晶时间长达10～20天，产品收率仅十万分之七至九，不适宜工业化生产。

CN 101747275 A公开了一种泡沫分离法分离千层塔中石杉碱甲的方法，是以千层塔浸膏为原料，经乙醇溶解、阴离子表面活性剂结合、泡沫分离塔鼓气、收集泡沫、离心、沉淀物碱溶、搅拌反应、过滤、重结晶等步骤，得到纯度为40％～60％的石杉碱甲产品。该方法是利用某些阴离子表面活性剂中的-SO₃ ^-基团与石杉碱甲中的-NH₃ ⁺基团结合，通过收集泡沫、并分离泡沫中的石杉碱甲，达到纯化的目的。但是，千层塔浸膏中能够与阴离子表面活性剂中的-SO₃ ^-基团结合的化合物除石杉碱甲以外，还有很多其他物质，因此该方法获得的石杉碱甲产品纯度不高，仅40％～60％；该方法需要使用大量的表面活性剂、需要特制的泡沫分离设备、往乙醇溶液中长时间通入空气鼓泡将消耗大量的乙醇，因此该方法的生产成本偏高；该方法在长时间通入空气鼓泡的过程中，石杉碱甲分子有被氧化破坏的分险，因此，该方法获得石杉碱甲的收率偏低。

此外，上述几种方法只分离纯化了千层塔生物碱中的一种——石杉碱甲，并未对千层塔中的其它生物碱加以利用、甚至把它们当成废弃物除去，无形中造成了极大的浪费。

CN200410042760.5公开了一种分析与分离制备石杉碱甲和石杉碱乙的方法，是以千层塔为原料，经酸水浸泡提取、大孔吸附树脂富集浓缩、反向柱层析、非烷基键合相硅胶介质中低压反向层析、浓缩结晶等步骤，得到高纯度的石杉碱甲和石杉碱乙。该方法步骤繁琐，生产周期长，先后共使用了三次层析或吸附过程，且最后的中低压反向层析过程样品处理量极小(仅毫克级别)，加上起始原料千层塔本身的目标成分(石杉碱甲和石杉碱乙)含量很低，所以该方法不具备产业化前景。

CN201110449262.2公开了从千层塔中提取分离石杉碱甲和石杉碱乙的方法，是以千层塔为原料，经粉碎、酸水超声提取、活性炭脱色、阳离子交换树脂吸附洗脱、反向色谱分离、浓缩结晶、重结晶等步骤，得到石杉碱甲和石杉碱乙产品。该方法获得的产品收率偏低，此外，同样是起始原料千层塔本身的目标成分(石杉碱甲和石杉碱乙)含量很低，原料处理量大、生产周期长但是获得的产品很少，不适宜工业化生产。

CN201110026481.X公开了一种从植物药材柳杉叶马尾杉中提取高纯度石杉碱甲和石杉碱乙的方法，是以干燥的柳杉叶马尾杉为原料，经粉碎、酸水提取、离子交换树脂吸附洗脱、反向色谱柱分离、混合溶剂萃取、活性炭脱色、结晶等步骤，得到石杉碱甲和石杉碱乙产品。该方法获得的产品收率偏低，均不超过60％，不适宜工业化生产。

老年痴呆症在我国的患病率为2％～5％，患病率随年龄的增长逐渐上升。目前，老年痴呆症每年的新发病率约1％，高龄老人可达10％～20％。老年痴呆症死亡率位居常见病死亡率第4位，仅次于心脑血管疾病、肿瘤和脑卒中。随着社会人口老龄化的加剧，老年性痴呆必将成为一个不可忽略的卫生和社会问题。

由于千层塔提取物中的各种生物碱，对老年性痴呆有独特的疗效，因此利用好有限的千层塔资源，对千层塔提取物进行深度开发、研究，具有重大的现实意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种将千层塔提取物进行深度开发，工艺连贯、简单，可操作性强，生产成本低，安全环保，且各种活性成分的含量高、收率高，适合工业化生产的从千层塔提取物中分离多种高含量生物碱单体的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种从千层塔总生物碱中分离多种高含量生物碱单体的方法，包括以下步骤：先将千层塔总生物碱用流动相溶解、稀释，再注入高压制备液相色谱柱，最后用流动相洗脱，流动相为乙腈-水混合溶剂；收集不同时间段的洗脱液馏分，分别浓缩、干燥，得高纯度6β-羟基石杉碱甲、石杉碱甲和石杉碱乙产品。

优选地，色谱柱中的填料为硅胶(C4、C6、C8、C12、C18)或聚合物(聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚羟基甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇)，优选为聚羟基甲基丙烯酸酯。

优选地，采用梯度洗脱的方式，所述洗脱采用梯度洗脱的方式，流动相I为乙腈/甲醇/乙醇-水混合溶剂，其中乙腈/甲醇/乙醇体积分数为10-15％，流动相II为乙腈/甲醇/乙醇-水-醋酸混合溶剂，其中乙腈/甲醇/乙醇体积占比为15-25％，醋酸体积占比1-3％。乙腈/甲醇/乙醇表示乙腈，甲醇，乙醇中的至少一种。在流动相加入少量的醋酸的目的是防止洗脱过程中目标成分拖尾和交叉，也即防止石杉碱甲没有完全洗脱之前，部分石杉碱乙的泄露，有利于两种目标成分的充分、快速分离。由于石杉碱甲和石杉碱乙的极性相差很小，采用常规洗脱无法有效将两者分离。

优选地，所述高压制备液相色谱柱的柱压为3～10Mpa；色谱填料的粒径为5～20μm；所述色谱填料的用量为千层塔总生物碱重量的30～50倍(L/kg)；所述色谱填料装柱的高径比为2～3：1；所述流动相洗脱的流速为20-40BV/小时。

优选地，在采用梯度洗脱的方式条件下，从洗脱开始计时，第10～13min为洗脱液馏分A，馏分A收集结束后，换用流动相II，在相同流速下，收集第15～20min为洗脱液馏分B，第22～30min为洗脱液馏分C。

洗脱液馏分A、B、C分别浓缩、干燥后，分别得到的高含量千层塔生物碱单体，分别为6β-羟基石杉碱甲，石杉碱甲，石杉碱乙。

本发明中，1BV＝1个层析硅胶装柱体积或1个色谱填料装柱体积。

在本发明的一个优选技术方案中，所用到的千层塔总生物碱是通过以下步骤的制备方法得到的：

(1)溶解：将千层塔提取物用有机溶剂1溶解，过滤，得提取液；

(2)反萃取：用含有表面活性剂的酸水反萃取提取液，合并酸水层；

(3)脱色、过滤、浓缩：往酸水层加入吸附脱色剂，搅拌脱色，粗过滤，再用纳滤膜过滤，滤液减压浓缩后用碱液调节pH值至碱性；

(4)萃取：用有机溶剂2萃取步骤(3)中的碱性浓缩液，合并有机层，水洗至中性待用；

(5)硅胶层析：将步骤(4)中的有机层通过硅胶层析柱，收集硅胶层析柱流出液，浓缩，干燥，得千层塔总生物碱。

采用上述方法从千层塔提取中制备总生物碱，特别是在步骤(2)的反萃取中，通过酸液的浓度和用量，以及加入便面活性剂，能够高收率，高纯度地获得总生物碱，为进一步分离提纯石杉碱甲，石杉碱乙，6β-羟基石杉碱甲提供了便利。以高收率和高纯度获得生物碱的单品。

优选地，步骤(1)中，所述有机溶剂1为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯中的至少一种，有机溶剂的用量为千层塔提取物重量的10～30倍(L/kg)。

优选地，步骤(2)中，所述的酸为无机酸，具体包括盐酸、硫酸和磷酸，所述酸水的质量百分比浓度为1-3％。反萃取优选为两次以上，每次反萃取使用的酸水用量为千层塔提取物重量的30～60倍(L/kg)。使用酸水对千层塔提取物有机溶剂溶液进行反萃取的目的，是利用无机酸可与生物碱反应生成相应的盐(成盐后易溶于酸水，呈离子状态)，从而将有机溶剂溶液中的生物碱(包括6β-羟基石杉碱甲、石杉碱甲和石杉碱乙)全部转移至酸水相中；非生物碱等脂溶性成分则大量保留在反萃取后的有机相中，实现初步分离生物碱和非生物碱的目的。若酸水的质量百分比浓度过低、酸水的用量过少或反萃取的次数过少，都将无法充分的达到上述目的；若酸水的质量百分比浓度过高、酸水的用量过多或反萃取的次数过多，都将造成能源和物料的浪费。

优选地，步骤(2)中，所述的表面活性剂为阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂按照质量比1～2：1～2的复配，所述阳离子表面活性剂为长链烷基季铵盐型表面活性剂，比如十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十八烷基三甲基氯化铵；所述非离子表面活性剂为聚氧乙烯型表面活性剂，比如脂肪醇聚氧乙烯，烷基酚聚氧乙烯醚，脂肪酸聚氧乙烯酯，聚氧乙烯烷基胺，聚氧乙烯烷基酰胺。

进一步优选地，所述表面活性剂在酸水中的重量百分比为0.01％～0.1％，优选0.02～0.05％。往酸水中加入表面活性剂的目的，第一是提高反萃取的效率，使千层塔生物碱完全转相至酸水层；第二是防止乳化，起到一定的破乳作用。若表面活性剂的用量过少，将无法达到上述目的；若表面活性剂的用量过多，结果将适得其反，过量的表面活性剂将加剧酸水层和有机层的乳化，导致千层塔生物碱的收率严重偏低。

优选地，步骤(3)中，所述的吸附脱色剂为硅藻土、活性白土或活性炭，吸附脱色剂的用量为千层塔提取物重量的5％～10％。使用吸附脱色剂的目的是除去酸水层中的水溶性色素。

优选地，步骤(3)中，所述搅拌脱色的时间为1～3小时。

优选地，步骤(3)中，所述纳滤膜的截留分子量为300～500Da，所述纳滤的压力为0.3～0.5Mpa。使用纳滤膜过滤的目的是除去酸水层中大分子量的水溶性杂质(包括表面活性剂)。若纳滤膜的截留分子量过小或纳滤的压力过低，生物碱盐将无法透过纳滤膜，将同大分子水溶性杂质一起存在于纳滤膜截留液中，无法达到分离的目的；若纳滤膜的截留分子量过大或纳滤的压力过大，生物碱盐和大分子水溶性杂质都将透过纳滤膜，一起存在于纳滤膜透过液中，同样无法达到分离的目的。

优选地，步骤(3)中，所述减压浓缩的温度为60～70℃，真空度为-0.08～-0.09Mpa，所述浓缩液的体积为千层塔提取物重量的10～20倍(L/kg)。减压浓缩的目的，是减少水相的体积、提高生物碱盐的浓度，从而减少后续萃取步骤有机溶剂的用量，并提高萃取步骤的收率。

优选地，步骤(3)中，所述的碱液为氢氧化钠或氢氧化钾水溶液，所述调碱后的pH值为9～12。用碱液调节浓缩液的pH值至碱性的目的，是将浓缩液中生物碱盐与碱反应，生成游离的生物碱(分子状态)，从而减小生物碱在水中的溶解度，有利于后续萃取步骤生物碱的转相。

优选地，步骤(4)中，所述有机溶剂2为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯中的至少一种。优选萃取是进行了两次以上，每次萃取使用的有机溶剂用量依次为千层塔提取物重量的20～30倍(L/kg)。使用有机溶剂对碱性浓缩液进行萃取的目的，是利用浓缩液中的生物碱盐(离子状态)与碱反应生成游离态的生物碱(分子状态)，水溶性减小、脂溶性增大的原理，将生物碱全部转相至有机溶剂相中，大量小分子水溶性杂质则保留在萃取后的碱性水层中，从而对生物碱和非生物碱再次进行分离。若有机溶剂的用量过少或萃取的次数过少，都将无法充分的达到上述目的；若有机溶剂的用量过多或萃取的次数过多，都将造成能源和物料的浪费。

优选地，步骤(5)中，所述的硅胶为柱层析硅胶，硅胶的用量为千层塔提取物重量的5～10倍(L/kg)，所述硅胶层析柱的高径比为2～8：1，所述有机层通过硅胶层析柱的流速为0.2～1BV/小时。将有机层通过硅胶层析柱的目的有两个：第一是利用柱层析硅胶在中等极性有机溶剂环境中，只吸附脂溶性色素、不吸附生物碱的原理，除去脂溶性色素，达到纯化千层塔总生物碱的目的(不需要任何洗脱剂洗脱)；第二是除去有机层中少量的水，防止后续浓缩过程由于水的存在导致后期浓缩温度过高、造成生物碱降解而收率偏低。若柱层析硅胶的用量过少、硅胶层析柱的高径比过小或上柱的流速过快，都将无法充分的达到上述目的；若柱层析硅胶的用量过多、硅胶层析柱的高径比过大或上柱的流速过慢，都将造成能源和物料的浪费。

优选地，本发明所述从千层塔提取物中分离多种高含量生物碱单体的方法中，在步骤(5)硅胶层析得到千层塔总生物碱之后，还可以进行步骤(6)：高压制备液相色谱分离6β-羟基石杉碱甲、石杉碱甲和石杉碱乙：

本发明方法的原理是：

千层塔提取物中的生物碱呈游离分子状态时，易溶于有机溶剂、难溶于水；与酸反应成盐后，生物碱呈离子状态，难溶于有机溶剂、易溶于水。利用上述差异，通过反萃取和萃取，使生物碱反复转相，达到去除大量不同类型杂质的目的，反萃取和萃取之间辅以吸附脱色剂脱色、纳滤，萃取之后再采用硅胶柱层析，最终得到高含量的千层塔总生物碱。本发明还利用高压制备液相色谱对千层塔总生物碱进一步分离，由于6β-羟基石杉碱甲、石杉碱甲和石杉碱乙三者的极性有差异，选择适当的流动相，采用梯度洗脱发，最终分离得到了高纯度的生物碱单品，实现了高含量6β-羟基石杉碱甲、高含量石杉碱甲和高含量石杉碱乙的分离。

本发明方法的有益效果如下：

(1)本发明方法提供了一种同时分离三种千层塔生物碱单体的生产方法，做到了对千层塔提取物资源的科学化、合理化、最大化利用。

(2)本发明方法所得的千层塔总生物碱产品及三种生物碱单体产品的含量高，收率高。

(3)本发明方法原料处理量大，溶剂用量少，萃取过程不易发生乳化，生产周期短，工艺连贯、简单，可操作性强，生产成本低，安全环保，适合工业化生产。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例所使用的千层塔提取物购于湖南华诚生物资源股份有限公司，其中6β-羟基石杉碱甲的含量为0.36％，石杉碱甲的含量为3.05％，石杉碱乙的含量为1.12％，总生物碱的含量为4.90％；本发明实施例所使用的柱层析硅胶购于青岛海洋化工有限公司；本发明实施例所使用的纳滤膜购于南京福林德环保科技有限公司；本发明实施例所使用的高压制备液相色谱购于江苏汉邦科技有限公司；本发明实施例所使用的辅料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

所用柱层析填料聚羟基甲基丙烯酸酯为RSpak DM-614，C18反相硅胶采购自青岛邦凯，粒径10μm，色谱纯。

本发明实施例中，采用高效液相色谱(HPLC)外标法测定6β-羟基石杉碱甲、石杉碱甲和石杉碱乙的含量，采用酸碱滴定法测定总生物碱的含量。

制备例1

(1)溶解：取千层塔提取物3kg，用90L乙酸乙酯溶解，过滤除去不溶物，得千层塔提取物乙酸乙酯溶液；

(2)反萃取：用2wt％的盐酸水溶液，其中含0.01wt％十四烷基三甲基氯化铵，0.03wt％烷基酚聚氧乙烯醚OP-30，反萃取千层塔提取物乙酸乙酯溶液，反萃取两次(第一次反萃取的酸水用量为150L，第二次反萃取的酸水用量为120L)，合并酸水层；

(3)脱色、过滤、浓缩：往酸水层加入0.2kg活性炭，搅拌脱色2小时，粗过滤，再用截留分子量为500Da的纳滤膜过滤(过滤压力0.3Mpa)，纳滤膜滤液在温度为65℃、真空度为-0.08Mpa条件下减压浓缩，浓缩至体积为60L，浓缩液用氢氧化钠水溶液调节pH值为10；

(4)萃取：用二氯甲烷萃取步骤(3)中的碱性浓缩液，萃取两次(第一次萃取的有机溶剂用量为90L，第二次萃取的有机溶剂用量为60L)，合并有机层，将有机层水洗至中性待用；

(5)硅胶层析：将步骤(4)中的有机层以0.5BV/小时的流速通过硅胶层析柱(柱层析硅胶的用量25L，硅胶层析柱的高径比为8：1)，收集硅胶层析柱流出液，浓缩，干燥，得千层塔总生物碱0.148kg，所得千层塔总生物碱的含量为95.09％，千层塔总生物碱的收率为95.73％。

制备例2

(1)溶解：取千层塔提取物3kg，用75L二氯甲烷溶解，过滤除去不溶物，得千层塔提取物二氯甲烷溶液；

(2)反萃取：用1.5wt％的硫酸水溶液，其中含0.02wt％十六烷基三甲基氯化铵，0.02wt％烷基酚聚氧乙烯醚OP-30，反萃取千层塔提取物二氯甲烷溶液，反萃取两次(第一次反萃取的酸水用量为150L，第二次反萃取的酸水用量为150L)，合并酸水层；

(3)脱色、过滤、浓缩：往酸水层加入0.3kg硅藻土，搅拌脱色3小时，粗过滤，再用截留分子量为300Da的纳滤膜过滤(过滤压力0.5Mpa)，纳滤膜滤液在温度为60℃、真空度为-0.09Mpa条件下减压浓缩，浓缩至体积为50L，浓缩液用氢氧化钾水溶液调节pH值为11；

(4)萃取：用氯仿萃取步骤(3)中的碱性浓缩液，萃取两次(第一次萃取的有机溶剂用量为90L，第二次萃取的有机溶剂用量为60L)，合并有机层，将有机层水洗至中性待用；

(5)硅胶层析：将步骤(4)中的有机层以0.5BV/小时的流速通过硅胶层析柱(柱层析硅胶的用量25L，硅胶层析柱的高径比为8：1)，收集硅胶层析柱流出液，浓缩，干燥，得千层塔总生物碱0.149kg；所得千层塔总生物碱的含量为93.71％，千层塔总生物碱的收率为94.98％。

制备例3

(1)溶解：取千层塔提取物3kg，用60L氯仿溶解，过滤除去不溶物，得千层塔提取物氯仿溶液；

(2)反萃取：用2.5wt％的磷酸水溶液，其中含0.015wt％十四烷基三甲基氯化铵，0.03wt％脂肪酸聚氧乙烯酯A105，反萃取千层塔提取物氯仿溶液，反萃取两次(第一次反萃取的酸水用量为180L，第二次反萃取的酸水用量为150L)，合并酸水层；

(3)脱色、过滤、浓缩：往酸水层加入0.3kg活性白土，搅拌脱色3小时，粗过滤，再用截留分子量为300Da的纳滤膜过滤(过滤压力0.4Mpa)，纳滤膜滤液在温度为70℃、真空度为-0.08Mpa条件下减压浓缩，浓缩至体积为50L，浓缩液用氢氧化钠水溶液调节pH值为10；

(4)萃取：用乙酸乙酯萃取步骤(3)中的碱性浓缩液，萃取两次(第一次萃取的有机溶剂用量为90L，第二次萃取的有机溶剂用量为90L)，合并有机层，将有机层水洗至中性待用；

(5)硅胶层析：将步骤(4)中的有机层以0.8BV/小时的流速通过硅胶层析柱(柱层析硅胶的用量30L，硅胶层析柱的高径比为6：1)，收集硅胶层析柱流出液，浓缩，干燥，得千层塔总生物碱0.146kg；所得千层塔总生物碱的含量为94.37％，千层塔总生物碱的收率为93.73％

制备例4

其他步骤和条件和制备例1相同，区别在于步骤(2)中，盐酸水溶液中，含0.04wt％十四烷基三甲基氯化铵，不含烷基酚聚氧乙烯醚OP-30。

经酸碱滴定法测定，本实施例所得千层塔总生物碱的含量为94.82％，千层塔总生物碱的收率为93.83％。

制备例5

其他步骤和条件和制备例1相同，区别在于步骤(2)中，盐酸水溶液中，含0.04wt％烷基酚聚氧乙烯醚OP-30，不含十四烷基三甲基氯化铵。

经酸碱滴定法测定，本实施例所得千层塔总生物碱的含量为93.57％，千层塔总生物碱的收率为94.14％。

制备例6

其他步骤和条件和制备例1相同，区别在于步骤(2)中，盐酸水溶液中，含0.03wt％十四烷基三甲基氯化铵和0.03wt％烷基酚聚氧乙烯醚OP-30。

经酸碱滴定法测定，本实施例所得千层塔总生物碱的含量为95.12％，千层塔总生物碱的收率为92.38％。

制备例7

其他步骤和条件和制备例1相同，区别在于步骤(2)中，盐酸水溶液中，十四烷基三甲基氯化铵替换为相同质量分数的十二烷基磺酸钠。

经酸碱滴定法测定，本实施例所得千层塔总生物碱的含量为95.09％，千层塔总生物碱的收率为93.26％。

制备例8

其他步骤和条件和制备例1相同，区别在于步骤(3)中，纳滤膜的截留分子量为700Da。经酸碱滴定法测定，本实施例所得千层塔总生物碱的含量为86.74％，千层塔总生物碱的收率为93.52％。

以上制备例表明，采用特定步骤的提取方法，特别是采用了含有复配的阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂的酸液进行反萃取，能够高收率地得到高质量的总生物碱，更便于进行后续的分离提纯得到生物碱单品。

实施例1

将制备例1所得的千层塔总生物碱用流动相I(乙腈-水混合溶剂，其中乙腈的体积占比为13％)溶解、稀释固形物浓度为12％的溶液，再注入高压制备液相色谱柱(柱压为15Mpa，色谱柱的填料类型为聚羟基甲基丙烯酸酯，色谱填料的粒径为10μm，色谱填料的用量为6L，色谱填料装柱的高径比为2.3：1)，用流动相以30BV/小时的流速洗脱。从洗脱开始计时，收集第11～12min为洗脱液馏分A，馏分A收集结束后，换用流动相II(乙腈-水-醋酸混合溶剂，乙腈-体积占比为20％，醋酸体积占比1.3％)，收集第16～18min为洗脱液馏分B，收集第24～28min为洗脱液馏分C。将洗脱液馏分A浓缩、干燥后，得到的高含量6β-羟基石杉碱甲产品；将洗脱液馏分B浓缩、干燥后，得到的高含量石杉碱甲产品；将洗脱液馏分C浓缩、干燥后，得到的高含量石杉碱乙产品。

经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得6β-羟基石杉碱甲产品的含量为98.72％，6β-羟基石杉碱甲产品的收率为93.45％；经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得石杉碱甲产品的含量为99.52％，石杉碱甲产品的收率为95.01％；经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得石杉碱乙产品的含量为99.89％，石杉碱乙产品的收率为94.47％。

实施例2

将制备例2得到的千层塔总生物碱用流动相I(乙腈-水混合溶剂，其中乙腈的体积占比为12％)溶解、稀释固形物浓度为12％的溶液，再注入高压制备液相色谱柱(柱压为15Mpa，色谱柱的填料类型为聚甲基丙烯酸酯，色谱填料的粒径为15μm，色谱填料的用量为6L，色谱填料装柱的高径比为2.0：1)，用流动相以30BV/小时的流速洗脱。从洗脱开始计时，收集第11～12min为洗脱液馏分A，馏分A收集结束后，换用流动相II(乙腈-水-醋酸混合溶剂，乙腈-体积占比为17％，醋酸体积占比1％)，收集第17～20min为洗脱液馏分B，收集第26～30min为洗脱液馏分C。将洗脱液馏分A浓缩、干燥后，得到的高含量6β-羟基石杉碱甲产品；将洗脱液馏分B浓缩、干燥后，得到的高含量石杉碱甲产品；将洗脱液馏分C浓缩、干燥后，得到的高含量石杉碱乙产品。

经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得6β-羟基石杉碱甲产品的含量为97.59％，6β-羟基石杉碱甲产品的收率为90.36％；经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得石杉碱甲产品的含量为99.52％，石杉碱甲产品的收率为94.81％；经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得石杉碱乙产品的含量为98.85％，石杉碱乙产品的收率为93.77％。

实施例3

将制备例3得到的千层塔总生物碱用流动相I(乙腈-水混合溶剂，其中乙腈的体积占比为15％)溶解、稀释固形物浓度为12％的溶液，再注入高压制备液相色谱柱(柱压为15Mpa，色谱柱的填料类型为聚甲基丙烯酸酯，色谱填料的粒径为15μm，色谱填料的用量为6L，色谱填料装柱的高径比为2.0：1)，用流动相以30BV/小时的流速洗脱。从洗脱开始计时，收集第11～12min为洗脱液馏分A，馏分A收集结束后，换用流动相II(乙腈-水-醋酸混合溶剂，乙腈-体积占比为25％，醋酸体积占比3％)，收集第15～17min为洗脱液馏分B，收集第22～26min为洗脱液馏分C。将洗脱液馏分A浓缩、干燥后，得到的高含量6β-羟基石杉碱甲产品；将洗脱液馏分B浓缩、干燥后，得到的高含量石杉碱甲产品；将洗脱液馏分C浓缩、干燥后，得到的高含量石杉碱乙产品。

经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得6β-羟基石杉碱甲产品的含量为97.51％，6β-羟基石杉碱甲产品的收率为92.16％；经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得石杉碱甲产品的含量为99.62％，石杉碱甲产品的收率为94.86％；经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得石杉碱乙产品的含量为97.58％，石杉碱乙产品的收率为93.95％。

实施例4

其他步骤和条件和实施例1相同，区别在于流动相II为乙腈-水混合溶剂，乙腈-体积占比为20％，即不加入醋酸。

经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得石杉碱甲产品的含量为96.61％，石杉碱甲产品的收率为92.26％；石杉碱乙产品的含量为97.42％，石杉碱乙产品的收率为91.40％。

实施例5

其他步骤和条件和实施例1相同，区别在于流动相II中醋酸的浓度为0.5％。

经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得石杉碱甲产品的含量为98.52％，石杉碱甲产品的收率为94.36％；石杉碱乙产品的含量为99.65％，石杉碱乙产品的收率为93.16％。

实施例6

其他步骤和条件和实施例1相同，区别在于流动相II中醋酸的浓度为5％。

经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得石杉碱甲产品的含量为98.78％，石杉碱甲产品的收率为93.74％；石杉碱乙产品的含量为99.83％，石杉碱乙产品的收率为92.95％。

实施例7

其他步骤和条件和实施例1相同，区别在于色谱柱的填料类型为C18硅胶，规格为10μm。

经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得6β-羟基石杉碱甲产品的含量为97.36％，6β-羟基石杉碱甲产品的收率为92.71％；经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得石杉碱甲产品的含量为99.37％，石杉碱甲产品的收率为94.26％；经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得石杉碱乙产品的含量为99.17％，石杉碱乙产品的收率为93.66％。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种从千层塔总生物碱中分离多种高含量生物碱单体的方法，包括以下步骤：先将千层塔总生物碱用流动相溶解、稀释，再注入高压制备液相色谱柱，最后用流动相洗脱，流动相为乙腈-水混合溶剂；收集不同时间段的洗脱液馏分，分别浓缩、干燥，得高纯度6β-羟基石杉碱甲、石杉碱甲和石杉碱乙产品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱柱中的填料为硅胶(C4、C6、C8、C12、C18)或聚合物(聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚羟基甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇)。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，色谱柱中的填料为聚羟基甲基丙烯酸酯。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱采用梯度洗脱的方式，流动相I为乙腈/甲醇/乙醇-水混合溶剂，其中乙腈/甲醇/乙醇体积分数为10-15％，流动相II为乙腈/甲醇/乙醇-水-醋酸混合溶剂，其中乙腈/甲醇/乙醇体积占比为15-25％，醋酸体积占比1-3％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高压制备液相色谱柱的柱压为3～10Mpa；色谱填料的粒径为5～20μm；所述色谱填料的用量为千层塔总生物碱重量的30～50倍(L/kg)；所述色谱填料装柱的高径比为2～3：1；所述流动相洗脱的流速为20-40BV/小时。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在采用梯度洗脱的方式条件下，从洗脱开始计时，第10～13min为洗脱液馏分A，馏分A收集结束后，换用流动相II，在相同流速下，收集第15～20min为洗脱液馏分B，第22～30min为洗脱液馏分C。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所用到的千层塔总生物碱是通过以下步骤的制备方法得到的：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的酸为无机酸，具体包括盐酸、硫酸和磷酸，所述酸水的质量百分比浓度为1-3％。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的表面活性剂为阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂按照质量比1～2：1～2的复配，所述阳离子表面活性剂为长链烷基季铵盐型表面活性剂，所述非离子表面活性剂为聚氧乙烯型表面活性剂；优选地，所述长链烷基季铵盐型表面活性剂选自十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十八烷基三甲基氯化铵中的至少一种，所述聚氧乙烯型表面活性剂选自脂肪醇聚氧乙烯，烷基酚聚氧乙烯醚，脂肪酸聚氧乙烯酯，聚氧乙烯烷基胺，聚氧乙烯烷基酰胺中的至少一种。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述表面活性剂在酸水中的重量百分比为0.01％～0.1％，优选0.02～0.05％。