CN1049685C - 一种固定化活细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种固定化活细胞的制备方法，它以聚乙烯醇为载体，首先将聚乙烯醇溶液与活细胞悬浮液混合，以无菌淀粉为隔离成形剂成型，再经低温冷冻定型、解冻、漂洗后加工成颗粒状产物。本发明提供的方法简便、可大批量生产。适用于所有微生物的固定化、造价低，产物无论在中性介质酸性介质或高浓度无机盐介质中，强度都很高，使用寿命4800小时以上，实际上可使用1至数年，可广泛应用于食品发酵工业和医药工业，改进传统发酵工艺。

Description

一种固定化活细胞的制备方法

本发明涉及一种固定化活细胞的制备方法，特别是采用聚乙烯醇作载体的固定化方法。

固定化活细胞技术是近几年来继固相酶技术后迅速发展起来的生物工程新技术，该技术采用包埋法将肉眼看不清的微生物活细胞固定在载体上，形成直观的固定化活细胞实体，活细胞仍能增殖，新陈代谢，其酶系完整，可迅速完成一系列复杂的生化反应，得到有用产物。

在固定化方法中，载体可以是天然或合成高分子材料，例如，褐藻胶，K-卡拉胶，聚丙烯酰胺等，其中，褐藻胶，K-卡拉胶存在强度差、使用寿命短等缺点(只有1000多个小时)，而聚丙烯酰胺由于其单体分子及聚合促进剂等皆具毒性，不利于微生物活细胞的生长，在高分子材料中，采用聚乙烯醇(PVA)材料，不具毒性甚至对人体亦公认无害，价格低，较适合于包埋微生物活细胞，已有以PVA为载体的固定化方法，尚存在一些缺点，例如：将微生物或酶与PVA溶液混合后，置于饱和硼酸溶液中短时间内使其形成球体，随之将球体与磷酸盐溶液接触，使其完全硬化，制成微生物或酶固定化产物，这种方法存在步骤多，无机盐浓度高，对微生物生长不利等缺点；有些采用PVA载体的固定化方法中，需要有具空干燥脱水步骤，工艺复杂，费时；有的需用模具成形，或加油类作为成形剂，其效果均不太理想。

本发明的目的是提供一种固定化活细胞的制备方法，该方法简便，不需在模具中成形，机械强度高，适合于工业化生产，并能长期反复使用。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：制备方法中采用PVA为载体，首先将聚乙烯醇溶液与活细胞悬浮液混合，以无菌淀粉为隔离成形剂成型，再经低温冷冻定型，室温自然解冻、漂洗后用铰碎机铰碎成颗粒状产物。

在固定化活细胞混合液中，聚乙烯醇浓度控制在10-20％(W/W)，活细胞悬浮液浓度在2-20％(W/W)，其余为水；无菌淀粉与混合液的重量比为0.5-2∶1；冷冻温度在-10-30℃，时间48小时-12小时，解冻温度一般控制在5-40℃，最好是10-25℃的室内，自然空气中解冻5-48小时。聚乙烯醇的聚合度在400-1900之间，最好控制在1750±75，聚乙烯醇浓度最好为15±0.5％(W/W)，PVA聚合度过高，流动性差，操作不便，过低不易成型。

无菌淀粉制备：普通淀粉100℃，干热灭菌1小时，或常压干蒸15分钟(上汽计时)，务使其中心温度达100℃，然后冷却至20-30℃，即为无菌淀粉。

制得固定化微生物活细胞可直接用于生产，边增殖边发酵，也可先在适宜的培养基中培养增殖一段时间后再用于生产。

以下结合实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：

制备固定化啤酒酵母活细胞6Kg，各组分配比：啤酒酵母悬浮液(活细胞数10⁶-10⁹个/ml)0.6Kg，聚乙烯醇0.9kg，水4.5kg，淀粉5kg，其操作步骤是：将PVA放入水中，搅匀，用沸水浴或蒸汽浴加热溶解，温度在80-120℃，溶解后冷却至室温，加无菌水补足溶解时损失的水量，随后加入啤酒酵母悬浮液，混合均匀，将上述粘液进行成形处理，即以一直径为5-25mm的喷嘴，以均匀速度注入予置灭菌淀粉的容器中，形成线条层状，条间、层间以无菌淀粉隔离成型，再经冷冻处理定型，温度为-30℃，时间12小时，将冷冻产物进行自然解冻，温度为20℃，时间36小时，(全部软化为止)，除去大部分淀粉后，漂洗2-5次，至水清亮为止。产物以Φ8mm的无菌绞肉机绞碎处理，得到直径为2-5mm的颗粒状产物。

上述所使用的淀粉可回收重复使用。将制得的固定化酵母活细胞取出4.3kg，放入容积12.5升的酒化生物反应器中，从下部泵入16％(折光计)糖化液，上部流出8％(折光计)的酒化液，流速0.1L/h，温度10-30℃，

酒化液：乙醇7.3％(V/V)，总酸0.15％(W/V，以HAC计)还原糖1.1％(W/V，以葡萄糖计)。

连续发酵4800小时，载体强度无任何降低。可使用1年甚至数年。

实施例2：

制备固定化醋酸菌活细胞6kg，其各组分的配比，聚乙烯醇0.9kg、水4.5kg、淀粉5kg、醋酸菌体悬浮液(活细胞数10⁸个/ml)0.6kg，其操作步骤同实施例1。

将制得的固定化醋酸菌活细胞载体取出，4.8kg，放入容积为12.5升的醋化生物反应器中，下部通入无菌空气，上部流入酒化液，温度30℃转化率80-100％，日产0.8升食醋，总酸4.0-4.4％(W/V以HAC计)，进行半连续发酵4800小时，载体除有小于1/4的磨损外，强度没有降纸，将可继续使用1年-数年。所生产的食醋达到ZB×66004-86，GB2719-81标准要求。

实施例3：

固定化鲁氏酵母、球拟酵母、乳链球菌活细胞各5kg的制备。

各组分配比：同实施例1、2。

其操作步骤同实施例1

将分别制得的固定化鲁氏酵母菌、球拟酵母菌，乳链球菌活细胞各5kg，对以低盐固态发酵工艺(前酵)生产的酱油浸淋液为底液，于20℃温度下，进行半连续或者批次后酵增香，多次反复使用4800小时，载体完好如初，可使用1-数年，所生产的酱油符合国家标准ZB×66013-87，GB2717-81，质量风味明显提高，总酯及乙醇含量提高1.5-9倍，批次后酵周期3-15天。

本发明优点：制作简单，造价低，强度高，使用寿命长，适于工业化生产，应用范围广泛，例如：可用于制酒工业，以固定化酵母菌活细胞发酵制酒精；食用酒精、啤酒、白酒、低度白酒、黄酒、葡萄酒、汽酒等，利用固定化酵母，可使发酵速度大大加快，前发酵由传统发酵法7天缩短至2天，后酵时间由20-60天缩短至10天左右，另外，可采用分别包埋不同菌株，混和发酵，避免菌种间相互拮抗；调味品工业：在食醋酱油的生产方面，采用本发明的固定化酵母菌、醋酸菌活细胞于食醋生产的两个重要生化阶段——酒精发酵阶段和醋酸发酵阶段，可克服上述传统工艺的诸多缺点，不需辅料和翻坯，不仅改善和减轻劳动条件和强度，解决醋渣成灾的问题。而且生产周期缩短1/2，转换率达80-100％，出品率相应提高，实现食醋生产机械化、半连续化、管道化、安全卫生；医药方面，利用固定化微生物活细胞生产或转化出昂贵的抗生素、干扰素等；微生物学领域：可在短期内制取大量微生物，可将用基因工程获得新种微生物：进行快速培养，并应用到实际生产，造福于人类社会；食品工业；用于氨基酸、维生素的生产，还可用于废水处理等等。

Claims (5)

1、一种固定化活细胞的制备方法，它利用聚乙烯醇为载体，并先将聚乙烯醇溶液与活细胞悬浮液混合，其特征在于以无菌淀粉为隔离成形剂成型，再经低温冷冻定型，室温自然解冻、漂洗后加工成颗粒状产物。

2、按权利要求1所述的固定化活细胞的制备方法，其特征在于：在固定化活细胞混合液中聚乙烯醇含量为10-20％(W/W)，活细胞悬浮液含量为2-20％(W/W)，其余为水；无菌淀粉与上述混合液的重量比为0.5-2∶1；所述冷冻温度为-10～-30℃，其对应冷冻时间为48小时-12小时。

3、按权利要求2所述的固定化活细胞的制备方法，其特征在于：聚乙烯醇聚合度为1750±75；聚乙烯醇的浓度15±0.5％。

4、按权利要求1或2或3所述的固定化活细胞的制备方法，其特征在于：所述加工成颗粒状产物是采用铰碎机铰碎。

5、按权利要求1或2或3所述的固定化活细胞的制备方法，其特征在于所述的固定化活细胞混合液通过直径5～25mm的喷嘴注入装有无菌淀粉的容器中隔离成型。