CN1101468C - 聚合凝胶生物相容性载体制品的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种聚合凝胶生物相容性载体制品的制备方法，属微生物技术领域。将斜面菌种经20%(g/ml)豆汁放大成液体一级菌，用同样成份固体培养收集菌体，在100ml20%(g/ml)土豆汁内加海藻酸盐、聚合凝胶粉末载体各2克混匀，灭菌冷却后加入上述菌体，再于凝固剂中固化后为成品。该方法适用于各种活性微生物菌和酶制剂，制品具有凝胶吸水、保水和失水、着水的可重复性，并对人畜无害，无环境污染。

Description

聚合凝胶生物相容性载体制品的制备方法

一种聚合凝胶生物相容性载体制品的制备方法，本项发明属于微生物技术应用领域。

自70年代末固定化技术开始得到了广泛应用，首先在发酵行业带来了工业革命的技术进步。良好的固定化生物制品如固定化菌或固定化酶，能有效地回避液态工作条件下自身代谢产物或反应物造成的负反馈，使生物制品工作效率得到极大提高。如固定化酵母转化同样产物，转化时间由常规36个小时缩短为现在的3.1-3.5个小时，现已有产品投入使用，效果极为显著，诸如此类的固定化生物制品在工业液体环境下应用的实例还有许多。在固相环境中或干燥条件下需要保持活性生物制品，如活菌：有浸染活性的杀虫菌、除草真菌，对蚜虫有浸染性虫霉、食用菌的菌种等，生物制剂如酶、抗生素、病毒等，这些制品像在液相环境中工作的菌体那样，同样需要固定化相容性载体帮助来提高使用效果。专利号92103777采用淀粉相容性载体制备生物杀虫剂，但这一载体遇水易分解，不具有可重复性。采用聚合凝胶能够克服这一技术上的难题。本人曾在丙烯酰胺聚合凝胶载体上使用(专利申请号为94103705)得到成功尝试，但这一方法制备工艺较为严谨，载体与生物活性物质(活性菌或活性生物大分子)相包容时条件不易控制，操作困难。

本发明的目的在于解决上述已有技术存在的不足，提供一种在温和条件下与活性生物菌或生物大分子相容合的制备方法，包容后的生物制品具有凝胶吸水性、保水性或粘着性和失水着水的可重复性，并克服干燥条件下生物制品易失活的应用技术难题，可适用于食品、医药、化工、农药、化肥等领域的聚合凝胶生物相容性载体制品的制备。

本发明以如下技术方案实现：用定型结合材料和凝固剂，以交联丙烯酰胶凝胶、淀粉和丙烯腈共聚后的交联物或聚乙烯醇交联物的聚合凝胶为载体在无菌条件下将斜面菌种制成聚合凝胶生物相容性载体制品的制备方法，其特征在于：由100ml含海藻酸钠、聚合凝胶粉末载体各2克混均匀成定型结合材料和含CaCl₂ 2％(g/ml)的凝固剂，以交联丙烯酰胺凝胶、淀粉和丙烯腈共聚后的交联物或聚乙烯醇交联物的聚合凝胶等其中一种为聚合凝胶粉末载体，在无菌条件下将斜面菌种制成聚合凝胶生物相容性载体制品，包括以下次序的方法步骤：将斜面菌种经20％(g/ml)土豆汁放大成液体一级菌，再用同样成份固体培养基或萨氏合成培养基培养收集菌体备用；在100ml 20％(g/ml)  土豆汁内或萨氏合成培养基中加入海藻酸盐、聚合凝胶粉末各2克混均匀成定型混合液，热溶、灭菌、冷却，加入上述制备的菌体20-30克混合均匀，将此混合物逐滴加入灭菌冷却的2％-4％凝固剂中，固化后制成成品。

本发明所具有的有益效果：多年来食用菌菌种工作设想之一是希望得到活性强、耐贮存、易运输、使用方便的干燥食用菌生产种，本方法制备的生产种终于填补了这一空白。乞今为止，白僵菌工业化生产从斜面菌种至生产要经多次的扩繁，由于不可少的繁殖代数频增，使产品质量与原菌质量相差许多，大量贮存扩繁次数少的纯菌直接用于生产，能进一步保证产品质量。用凝胶制备技术制成的生物相容性载体，使大量保存优质纯菌成为可能。这种聚合凝胶生物相容性载体制品的制备方法简单，本项方法选用聚合丙烯酰胺、淀粉与丙烯腈共聚物、聚乙烯醇和粘多糖等大分子有机物形成的聚合凝胶为生物相容性载体，在温和条件下与生物菌或生物大分子(如酶、抗菌素等)相容合，包容后的生物制品具有凝胶吸水、保水、粘着和失水着水的可重复性，较好地克服了在干燥条件下生物制品易失活的技术难题，是食品、医药、化工、农药、化肥等诸多领域生物技术应用的工艺改进，方法简便，产品无“三废”，对人畜无害，对环境无污染。

附图说明：

附图为聚合凝胶生物相容性载体制品的制备方法流程图。

下面结合实施例和附图详细说明本发明。本发明的二个关键步骤是：1、根据需要选取适当的吸水、保水性载体材料，也可自加工或有售。这些载体材料大都是不溶于水的聚合凝胶，如交联丙烯酰胺凝胶、淀粉和丙烯腈共聚后的交联物、聚乙烯醇交联物等，载体材料多为干燥粉末，筛目根据需要确定。2、选择定型材料，如土豆汁——海藻酸盐定形材料，即将2克海藻酸钠热溶于20％(g/ml)土豆汁中灭菌冷却后备用。类似的定型材料还有叉角菜、卡拉胶、骨胶元蛋白等。定型剂与凝固剂接触短时间便可以固化，海藻酸盐固剂为2％的氯化钙。

实施例一：颗粒状食用菌种的制备。菌种选用5.39平茹种，该菌种由黑龙江省微生物所出售，聚合凝胶材料选用交联型丙烯酰胺干燥粉末，粉末过80筛目，该材料由黑龙江省科学院技术物理研究所提供。20％(g/ml)土豆汁是将土豆去皮，取20克切成小块，加水定溶100ml加蔗糖2克，煮沸5-10分钟后过滤定容100ml，此实施例煮沸时间为10分钟，将5.39斜面菌种先经20％(g/ml)土豆汁液体一级放大，磁力搅拌，在24℃培养＞48小时，按玉米粉∶麸皮＝3∶1份混合后再以该混合物∶土豆汁＝1∶1.2比例相混合，经混合后高压灭菌，冷却后接入一级培养结束后的5.39平菇菌种，接种前先将这种混合物培养基平摊在9厘米直径的平皿内，接种时用玻璃棒平涂三至四次5.39一级种液，盖好平皿置于24℃恒温箱中培养，3天后平皿表面长满菌丝，10天后已浸透并穿过平皿培养基，同时产生一种强烈的诱人香味。定型液制备：定型液取海藻酸钠及过80目筛的丙烯酰胺交联粉末各2克混于100ml 20％(g/ml)土豆汁营养液中，热溶灭菌冷却后加入5.39平皿固体培养制备物20克-30克混均使其充分分散后将此混合物逐滴加入灭菌冷却后的2％CaCl₂凝固剂中，滴入时所用的器械因管径不同，在凝固剂中形成的粒度大小不相同。也可将定型液全部投入凝固剂中，成形后可用挤出机挤成条状或片状，也可干燥后粉碎成粉末状。以上过程均在无菌条件下完成，包容时工作温度由CaCl₂凝固剂的温度确定，  但凝固剂液体体积必须是定型液体积的5倍以上。用本方法制得的5.39平茹凝胶颗粒菌种干燥后含水＜15％，平均在5-7粒/克。用试管棉塞在室温下存放124天后取出投入用常规方法配制并灭菌后的棉籽壳料袋中，平均袋重750克，共做41袋，每袋加凝胶颗粒菌种2-3克，26℃培养，3天后已有半数以上见有菌丝萌发，14天后菌丝量已占满料袋的80％以上，21天已全部出现菇蕾原基，26天已有部分长出第一茬子实体。除一袋有污染和三袋因破损污染外，其它均与常规种植一样出菇，生长良好。用干燥颗粒菌种种植出菇，在国内尚未属首次，这对菌种扩繁和食用菌生产工艺技术革新将具有重要意义。

实施例二：凝胶丝孢类真菌杀虫剂的制备，属于生物农药类。菌种选用白僵菌9^#，简称B9^#，吉林省农科院提供，扩大B9^#的斜面菌种用20％(g/ml)土豆汁液体一级种，见实施例1。培养成熟后用玻璃棒沾菌液反复涂于土豆汁玉米粉混合固体培养基上(即先制得20％g/ml土豆汁再与玉米粉1∶1相混合后平摊于9cm直径的平皿中并灭菌)，接种后三天即可见平皿固体培养基上长满白色菌丝，随温度逐渐升至27-29℃将皿盖半开，5-7天培养基上长满黄白色菌粉可供收集，将收集的纯菌粉投入20％(g/ml)土豆汁混合定型液中(即先制成20％g/ml土豆汁，见实施例1，再加入海藻酸钠粉末和交联型丙烯酰胺粉末各2克，混合后灭菌并冷却)，以上制得菌悬液含孢量达2.0×10⁹孢子/ml，逐滴加入到2％CaCl₂固定液中或同实施例1那样加工成条状、片状或干燥后的粉状，用试管棉塞存放，用不加凝胶粉末作为对照。本方法制备的颗粒菌含水量＜15％，平均12-15粒/克。存放6个月后取出在土豆汁斜面固体培养基中复活，每管一粒，共做了14支，5天后全都萌发出菌丝，10天后斜面都长满黄白色菌粉，干燥颗粒凝胶菌发菌率达100％，对照共做6支，至10天后仅在海藻酸钠干燥颗粒表面长出少许白色菌斑，菌丝没有在斜面固体培养基上漫延。这表明凝胶的保水性对保持菌粉活性起到了很重要的作用。

Claims (1)

1、一种聚合凝胶生物相容性载体制品的制备方法，其特征在于：由100ml含海藻酸钠、聚合凝胶粉末载体各2克混均匀成定型结合材料和含CaCl₂ 2％(g/ml)的凝固剂，以交联丙烯酰胺凝胶、淀粉和丙烯腈共聚后的交联物或聚乙烯醇交联物的聚合凝胶，其中一种为聚合凝胶粉末载体，在无菌条件下将斜面菌种制成聚合凝胶生物相容性载体制品，包括以下次序的方法步骤：将斜面菌种经20％(g/ml)土豆汁放大成液体一级菌，再用同样成份固体培养基或萨氏合成培养基培养收集菌体备用；在100ml 20％(g/ml)土豆汁内或萨氏合成培养基中加入海藻酸盐、聚合凝胶粉末各2克混均匀成定型混合液，热溶、灭菌、冷却，加入上述制备的菌体20-30克混合均匀，将此混合物逐滴加入灭菌冷却的2％-4％凝固剂中，固化后制成成品。