CN104940767B - 抗病原微生物的中药组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗病原微生物的中药组合物及其制备方法和应用,属于中医药技术领域。所述中药组合物的活性成分由以下重量份的原料制备而成:黄连20‑40份、龙胆2‑4份、百部3‑6份、苦参3‑6份、丁香1‑3份、香薷3‑6份、三白草10‑20份、大青叶5‑10份、鸡冠花4‑8份、冰片1‑3份。所述中药组合物重用黄连,对多种病原微生物具有抑制作用,对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和脚气致病菌的抗菌效果显著。将其制备成触变凝胶剂,制法新颖简单,制剂载药量大,疗效好。
Description
技术领域
本发明属于中医药技术领域,具体涉及一种抗病原微生物的中药组合物及其制备方法和应用。
背景技术
外阴阴道念珠菌病(Vulvovaginal Candidiasis,简称VVC),又名霉菌性阴道炎,是由白色念珠菌(CanidiaAlbicans,缩写为CA)所引起的生殖道感染性疾病,仅次于细菌性阴道炎,主要发生在育龄妇女,是妇科常见病和多发病,影响大多数妇女的健康和正常生活。约75%的妇女一生中至少发作过一次念珠菌性阴道炎,其中有40%~50%会多次反复发作。
西医临床对该病的治疗常采用不同的抗真菌药物和治疗方案,包括唑类药物以及多烯类药物,其中唑类药物的主要品种又包括伊曲康唑、氟康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑和咪康唑,制霉菌素是多烯类药物中临床应用最多的品种,但抗真菌药物的耐受性和毒副作用等问题日益突兀,临床应用具有很大局限性。
中医认为该病主要与湿、热、虫三邪有关,主要病机是湿邪,病因又有内外之分。内因主要是肝、肾、脾功能障碍而导致:肝脉绕阴器,又主藏血,为风木之脏;肾藏精主生殖,开窍于二阴;脾主运化水湿。肝经湿热或肝郁脾虛化火生湿,湿热之邪,阴经下注,蕴结阴器,或感染虫蜇,虫绕阴部,发为阴痒。外因则为摄生不慎,洗浴用具不洁,感染湿毒,直犯阴器,阴中作痒,甚至奇痒难忍。传统治疗大多采用清热解毒、利湿收敛、杀虫止痒的方法。近代医学家在研究和学习前人经验的基础上,结合临床经验对此病进行辨证论治,并取得较佳的治疗效果。
中医外治法治疗妇科炎症至今已有数千年的历史,历代的中医文献中均有大量记载,包括《金匮要略》、《备急千金要方》、《医宗金鉴》、《景岳全书·妇人归·前阴类》等古籍。外治法即在人体外在、外向或浅表部位用药,通过敷、熏或洗,使药物透过皮肤、粘膜吸收以及穴位刺激、经络的传导作用,直接作用于患处或治疗部位从而达到治疗目的。中医药外用治疗皮肤粘膜真菌病具有来源广、副作用小、价格低廉、诱导耐药性小,能充分体现中医的特色和优势。
目前市售外用制剂以液体洗剂为主,其发挥作用直接迅速。但本发明在前期研究发现,上市洗剂存在指标成分含量低、制剂载药量低,因而抑菌效果差,这或许由于该类制剂中黄连生物碱类成分在水中溶解度差、制剂工艺过程保留率低所致;液体洗剂还存在与肌肤接触时间短,易挥发、流散等缺陷,因此上市中药洗剂未能发挥中医药处方应有的抑菌效果。
触变凝胶是指含有少量胶体的溶液,在一定温度下静置时,逐渐变为半固体状凝胶,振摇时,又可以变成可流动的胶体溶液,具有良好的分散及助悬作用。
本发明借鉴古代验方和现代临床治疗白色念珠菌感染的中医外用处方及治则,开展了清热药、芳香化湿药、温里药、杀虫药等(包括黄连、黄芩、黄藤、三白草、香薷、丁香等54味常用中药及不同提取方式的提取物)对白色念珠菌的抑菌效果研究,筛选出抗CA效果好的以黄连为主药的中药组合物。同时发现在一定范围内,制剂中黄连生药浓度的增大,可显著提高对白色念珠菌的抑制效果。但如前所述,黄连生药浓度的提高受到常规剂型限制。本发明进一步优化辅料、剂型及其工艺,制备触变凝胶剂,使制剂中黄连等生药浓度达到其最佳作用范围,从而从制剂组方和剂型创新两方面结合完成本发明,所得制剂对白色念珠菌等病原微生物的抑制效果显著优于同类上市制剂。
发明内容
基于此,本发明的目的之一在于提供一种疗效显著,安全稳定可靠的抗病原微生物的中药组合物。
为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
一种抗病原微生物的中药组合物,所述中药组合物的活性成分由以下重量份的原料制备而成:黄连20-40份、龙胆2-4份、百部3-6份、苦参3-6份、丁香1-3份、香薷3-6份、三白草10-20份、大青叶5-10份、鸡冠花4-8份、冰片1-3份。
在其中一些实施例中,所述中药组合物的活性成分由以下重量份的原料制备而成:黄连20-30份、龙胆2-4份、百部3-5份、苦参3-5份、丁香1-2份、香薷4-5份、三白草12-15份、大青叶6-8份、鸡冠花5-6份、冰片1-2份。
在其中一些实施例中,所述中药组合物的活性成分由以下重量份的原料制备而成:黄连25份、龙胆3份、百部4份、苦参4份、丁香1.5份、香薷4.5份、三白草13.5份、大青叶7份、鸡冠花5.5份、冰片1.5份。
中医认为外阴阴道念珠菌病主要是由湿、热、虫三邪所致,上述中药组合物的组方符合中医药理论,以黄连、龙胆、百部、苦参、丁香、香薷、三白草、大青叶、鸡冠花、冰片配伍运用,方中黄连长于清热燥湿,本方重用其为君药;三百草清热解毒,丁香、香薷气味芳香、避秽化浊、杀虫止痒,龙胆清肝胆下焦湿热,共为臣药;百部、苦参杀虫燥湿止痒,大青叶清热解毒,鸡冠花收敛止带,冰片外用清凉杀虫止痒且皮肤透过性好,共为佐药。诸药合而外用,共奏清热燥湿,解毒除癣,杀虫止痒之功效。
本发明的另一目的在于提供上述抗病原微生物的中药组合物的制备方法,所述方法包括以下步骤:
(1)按处方配比称取黄连、龙胆、百部、苦参、三白草、大青叶、鸡冠花药材,粉碎成粉末,用体积为药材质量6-10倍(ml/g)的乙醇溶液进行渗漉提取,收集渗漉液,作为A组药液;
(2)按处方配比称取丁香、香薷药材,粉碎成粉末,用体积为药材质量6-10倍(ml/g)的乙醇溶液进行渗漉提取,收集初漉液至其中生药浓度为0.32-0.35g/ml,并按处方配比取冰片溶于初漉液中,作为B组药液;继续收集续漉液,作为C组药液;
(3)将A组药液与C组药液合并,减压浓缩得D组药液,与B组药液分别储存,即得所述中药组合物。
在其中一些实施例中,步骤(1)和(2)所述粉末为中粉,所述粉末进行渗漉提取前经过如下处理:以60%-80%(ml/ml)的乙醇溶液润湿,密闭25-35分钟,装入渗漉装置,用60%-80%(ml/ml)的乙醇溶液浸泡20-28小时。
在其中一些实施例中,步骤(1)和(2)所述乙醇溶液的浓度为60%-80%(ml/ml),所述渗漉的渗漉速度为4-9ml/(min·kg)。
在其中一些实施例中,步骤(3)所述减压浓缩的压力为-0.06--0.09MPa,温度为75-80℃,浓缩至50℃时的相对密度为1.01~1.03。
本发明的目的之三在于提供上述中药组合物的应用。具体技术方案如下:
上述中药组合物在制备抗病原微生物的外用药物中的应用。
在其中一些实施例中,所述病原微生物为白色念珠菌。
在其中一个实施例中,所述病原微生物为金黄色葡萄球菌。
在其中一个实施例中,所述病原微生物为脚气致病菌。
本发明的第四个目的在于提供一种抗病原微生物的外用药物,具体技术方案如下:
一种抗病原微生物的外用药物,所述外用药物由上述抗病原微生物的中药组合物和医药辅料制备而成。
在其中一些实施例中,所述外用药物主要由上述抗病原微生物的中药组合物、艾维素、和水制备而成,所述外用药物的剂型为触变凝胶剂。
在其中一些实施例中,所述外用药物中中药组合物的生药浓度为0.12-0.42g/ml,艾维素的浓度为2.4-4g/100ml。
在其中一些实施例中,所外用药物中中药组合物的生药浓度为0.417g/ml;所述艾维素为艾维素CL-611,在外用药物中的浓度为4g/100ml。
本发明的第五个目的在于提供上述外用药物的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
(1)量取蒸馏水于烧杯中,搅拌下加入艾维素,加毕搅拌,即得触变凝胶空白基质;
(2)分别取权利要求4或5所述的D组药液和蒸馏水于烧杯中,加热,搅拌溶解均匀,降温后加入权利要求4或5所述的B组药液,即得混合药液;
(3)将步骤(2)所得混合药液搅拌下缓缓加入步骤(1)所得空白基质中,加毕搅拌,即得所述外用药物。
在其中一些实施例中,步骤(1)的搅拌速度为11000-13000r/min,加毕搅拌8-12分钟;步骤(2)的加热温度为70-80℃,降温后的温度为40-45℃;步骤(3)的搅拌速度为11000-13000r/min,加毕搅拌8-12分钟。
本发明具有以下有益效果:
(1)目前,对于黄连、龙胆、百部、苦参、丁香、香薷、三白草、大青叶、鸡冠花组方的抗白色念珠菌的中药外用制剂尚无文献及专利报道,本发明在中医药理论和临床实践支持下,经过反复实验所得到的上述组方的中药组合物抗CA的效果优于现有上市的纯中药复方制剂,适合于长期及预防性应用等特点,具有良好的临床应用前景。
(2)本发明通过使用艾维素触变凝胶作为载体,将上述中药组合物制备成触变凝胶剂,该触变凝胶剂载药量大,增加了生药浓度和制剂稳定性,既克服了制剂中药物浓度过大析出、沉淀的缺陷,又保持了洗剂具有流动性的特点,在剂型上优于现有制剂。
(3)本发明所述中药组合物及其制剂还具有抗金黄色葡萄球菌和脚气致病菌的效果,疗效显著。
(4)本发明所述中药组合物及其制剂,组方中药源广,副作用少,耐药性小,成本低廉,抑菌效果显著。
附图说明
图1为白色念珠菌的TEM照片(×9700)。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明做进一步的阐述,这将有助于对本发明及其效果的进一步了解,但不限定本发明的保护范围。
以下实施例如无特别说明乙醇浓度均指体积浓度,乙醇溶液或水相对于药材质量的倍数均为体积(ml)相对于质量(g)的倍数。
实施例1抗病原微生物的中药组合物
一种抗病原微生物的中药组合物,所述中药组合物的活性成分由以下重量份的原料制备而成:黄连25份、龙胆3份、百部4份、苦参4份、丁香1.5份、香薷4.5份、三白草13.5份、大青叶7份、鸡冠花5.5份、冰片1.5份。
该中药组合物的制备方法如下:
(1)按处方配比称取黄连、龙胆、百部、苦参、三白草、大青叶、鸡冠花药材,粉碎成中粉,以少量80%乙醇溶液润湿,密闭30分钟,装入渗漉装置,用少量80%乙醇溶液浸泡24小时,用药材质量8倍量的80%乙醇溶液进行渗漉提取,渗漉速度为6ml/(min·kg)。收集全部渗漉液,即得A组药液;
(2)按处方配比称取丁香、香薷药材,粉碎成中粉,以少量80%乙醇溶液润湿,密闭30分钟,装入渗漉装置,用少量80%乙醇溶液浸泡24小时,用药材质量8倍量的80%乙醇溶液进行渗漉提取,渗漉速度为6ml/(min·kg)。收集初漉液至其中生药浓度为0.33g/ml,并按处方配比取冰片溶于初漉液中,作为B组药液;继续收集续漉液,作为C组药液;
(3)将A组药液与C组药液合并,减压(-0.06MPa,80℃)浓缩至相对密度为1.01~1.03(50℃),即得D组药液,与B组药液分别储存备用,即得所述中药组合物。
实施例2抗病原微生物的中药组合物的抗CA药敏试验
1试验材料(仪器、试剂、药材与试验用菌)
旋转蒸发仪(ELELA SB-1000);
套式恒温器(TC-15,海宁市新华医疗器械厂);
数控超声波清洗器(KQ5200DA,昆山市超声设备有限公司);
单人双面净化工作台(苏州净化设备有限公司);
高压蒸汽灭菌锅(上海三申医疗器械有限公司);
恒温培养箱(池本理化业株式会社);
空气浴振荡器(哈尔滨市东联电子科技开发有限公司);
沙氏液体培养基(青岛高科园海博生物技术,批号:20120822);
沙氏琼脂培养基(青岛高科园海博生物技术,批号:20120924);
黄苦洗液(四川向阳药业有限公司,批号:121112);
复方苦参洗剂(浙江中法制药有限公司,20121014);
香莲外洗液(广东省中医院,批号:20121030);
香荷洗剂(广东省中医院,批号:120907);
洁尔阴洗液(四川恩威制药有限公司,批号:1108042);
黄蒲洁肤洗剂(五0五药业有限公司,批号:1109502);
消炎止痒洗剂(中山市第二人民医院,批号:20120501);
苦柏洗液(广州市黄埔区中医院,批号:20121030);
其他试剂均为分析纯;
黄连药材,购于湖北省恩施州利川县黄连种植基地;
三白草药材,产地为广西;
大青叶,购于广州致信药业;
其它药材均购于和翔制药有限公司。
白色念珠菌(Candida albicans),由武汉同济医科大学微生物实验室提供,编码为19号。
2试验方法
2.1供试液的制备
将实施例1制备的中药组合物调节其总生药浓度分别为:0.695g/ml、0.556g/ml、0.417g/ml、0.278g/ml、0.139g/ml,即得实验组供试液,以部分上市中药妇科洗液作为对照组供试液。
2.2纸片扩散法
2.2.1菌液的制备
用无菌接种环,刮取单菌落接种于液体沙氏培养基中,置恒温摇床中(37℃,200r/min)培养4~6h,作为原菌液。使用时,经麦氏比浊法调整菌液浓度为0.5单位麦氏标准,即可。
2.2.2平板接种
用无菌医用棉签蘸取200μl菌液于固体培养基上,均匀涂抹。
2.2.3贴药敏纸
无菌操作法,分别将10μl药液滴加到纸片(直径为6.0mm)上,略干后用无菌镊子将纸片放于固体培养基表面并轻压,使纸片与培养基表面完全接触。本试验每块平板贴药敏纸片3~5个,不挪动位置,15min后反转过来,放入培养箱内于37℃、5%CO2条件下培养14~16h,观察并记录结果。
2.2.4判定标准
根据药敏纸片周围抑菌圈的大小判定其抗菌程度,判定标准:不敏感(小于或等于6mm,-),低度敏感(小于等于7mm,+),中度敏感(大于7mm,++),高敏感(大于等于15mm,+++)。
3实验结果
实施例1制备的中药组合物调节黄连的生药浓度,其体外抗CA药效如表1所示;部分上市中药妇科洗液体外抗CA药效实验结果如表2所示。
表1抗病原微生物的中药组合物各浓度的体外抗CA药效
表2部分上市中药妇科洗液体外抗CA药效
结果显示,上述部分上市中药妇科洗液对CA多具有中、低程度抑制作用。香莲外洗液、香荷洗剂,对CA抑制作用较佳,抑菌圈为8mm;洁尔阴洗液、黄蒲洁肤洗剂、消炎止痒洗剂、苦柏洗液对CA抑制作用较弱;本发明的抗病原微生物的中药组合物对CA的抑制效果较好,将其稀释至生药浓度只有0.139g·ml-1(相当于黄连生药浓度0.05g/ml)时都具有较好的抑CA效果,依次增大总生药浓度(0.139g/ml、0.278g/ml、0.417g/ml、0.556g/ml、0.695g/ml),对CA表现出逐步增强的抑制效果(抑菌圈为8.0、9.0、10.8、12.3、12.3mm),且优于上述上市中药妇科洗液的抗CA效果。
实施例3不同提取方式所得到的抗病原微生物中药组合物的抗CA药敏试验
3.1处方组成
本实施例所述抗病原微生物中药组合物的处方原料组成及配比同实施例1。
3.2试验材料
本实施例所用到的试验材料的说明同实施例2。
3.3供试液的制备
3.3.1全方水提供试液的制备
按处方配比称取全方药材,用水煎煮2次,加水量分别为药材重量的10倍、8倍,煎煮时间分别为1.5小时和1小时,合并两次煎液,减压(-0.06~-0.08Mpa,75℃)浓缩至生药浓度为1g/ml,即得全方水提浓缩液,并按处方配比取冰片溶于少量乙醇中,继续添加乙醇至冰片在乙醇中的浓度为0.15g/ml,即得冰片乙醇液,分别取浓缩液6.8ml和冰片乙醇液1ml于10ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀,即得全方水提供试液。
3.3.2全方60%乙醇溶液回流提取供试液制备
按处方配比称取全方药材,用60%乙醇溶液提取两次,乙醇溶液用量分别为药材质量的10倍、8倍,提取时间分别为1.5小时、1小时,合并两次提取液,减压(-0.06~-0.08Mpa,75℃)浓缩至生药浓度为1g/ml,即得全方60%乙醇溶液回流提取浓缩液,并按处方配比取冰片溶于少量乙醇中,继续添加乙醇至冰片在乙醇中的浓度为0.15g/ml,即得冰片乙醇液,分别取浓缩液6.8ml和冰片乙醇液1ml于10ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀,即得全方60%乙醇溶液回流提取供试液。
3.3.3全方60%乙醇溶液渗漉提取供试液制备
按处方配比称取全方药材,粉碎成粗粉,以少量60%乙醇溶液润湿,密闭30分钟,装入渗漉装置,用少量60%乙醇浸泡24小时,用药材重量的10倍量的60%乙醇溶液进行渗漉提取,渗漉速度为9ml/(min·kg)。收集药材重量的85%的初漉液,另器保存;继续收集续漉液,续漉液减压(-0.06~-0.08Mpa,75℃)浓缩至生药浓度约0.5g/ml时,加入初漉液,减压(-0.06~-0.08Mpa,75℃)浓缩至生药浓度为1g/ml,即得全方60%乙醇溶液渗漉提取浓缩液,并按处方配比取冰片溶于少量乙醇中,继续添加乙醇至冰片在乙醇中的浓度为0.15g/ml,即得冰片乙醇液,分别取浓缩液6.8ml和冰片乙醇液1ml于10ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀,即得全方60%乙醇溶液渗漉提取供试液。
3.3.4部分水提+部分60%乙醇溶液回流提取供试液制备
按处方配比称取三白草、大青叶、鸡冠花,加水煎煮两次,加水量分别为药材重量的10倍、8倍,煎煮时间分别为1.5小时、1小时,合并两次煎液,减压(-0.06~-0.08Mpa,75℃)浓缩至1g/ml,即得部分水提浓缩液。
按处方配比称取黄连、龙胆、百部、苦参、丁香、香薷药材,加60%乙醇溶液回流提取两次,乙醇溶液用量分别为药材质质量的10倍、8倍,提取时间分别为1.5小时、1小时,合并两次提取液,减压(-0.06~-0.08Mpa,75℃)浓缩至生药浓度为1g/ml,即得部分60%乙醇溶液回流提取浓缩液。
按处方配比取冰片溶于适量乙醇中,继续添加乙醇至冰片在乙醇中的浓度为0.15g/ml,即得冰片乙醇液。
分别取部分水提浓缩液2.6ml、部分60%乙醇溶液回流提取浓缩液4.2ml和冰片乙醇液1ml于10ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀,即得部分水提+部分60%乙醇溶液回流提取供试液。
3.3.5部分水提+部分60%乙醇溶液渗漉提取供试液制备
部分水提浓缩液的制备同3.3.4所述。
按处方配比称取黄连、龙胆、百部、苦参、丁香、香薷药材,粉碎成粗粉,以少量60%乙醇溶液润湿,密闭30分钟,装入渗漉装置,用少量60%乙醇溶液浸泡24小时,用药材质量的10倍量的60%乙醇溶液进行渗漉提取,渗漉速度为9ml/(min·kg)。收集药材质量的85%的初漉液,另器保存;继续收集续漉液,续漉液减压(-0.06~-0.08Mpa,75℃)浓缩至生药浓度约0.5g/ml时,加入初漉液,减压(-0.06~-0.08Mpa,75℃)浓缩至生药浓度为1g/ml,即得部分60%乙醇溶液渗漉提取浓缩液。
按处方配比取冰片溶于适量乙醇中,继续添加乙醇至冰片在乙醇中的浓度为0.15g/ml,即得冰片乙醇液。
分别取上述部分水提浓缩液2.6ml、部分60%乙醇溶液渗漉提取浓缩液4.2ml和冰片乙醇液1ml于10ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀,即得部分水提+部分60%乙醇溶液渗漉提取供试液。
3.4试验方法
本实施例试验方法与判定标准同实施例2。
3.5试验结果
本发明的抗病原微生物的中药组合物用不同提取方式所得到的提取液体外抗CA的效果如表3所示。
表3不同提取方式得到的抗病原微生物的中药组合物的抗CA效果
*注:1、香莲外洗液的生药浓度为1g/ml;2、不同提取工艺路线制备的本发明所述中药组合物的供试品中每毫升含生药量为0.695g,每毫升含黄连生药量为0.25g;3、以上抑菌圈为两次平行试验的平均值。
从表3可知:本发明所述的中药组合物,其原材料全方采用“60%乙醇溶液渗漉提取方式”及“部分水提+部分60%乙醇溶液渗漉提取方式”,抗CA效果最优,抑菌圈分别为13.0mm、12.5mm;“部分水提+部分60%乙醇溶液回流提取”的方式抑菌效果次之,抑菌圈为11.5mm;全方采取60%乙醇溶液回流提取的方式抑菌效果不及渗漉提取的效果,抑菌圈为10.0mm;全方采取水提方式,抑菌效果最差,抑菌圈低于8.0mm。除全方水提外,其余提取方式的抗CA效果均好于对照组香莲外洗液的抗CA效果。
采用渗漉提取方式时,本发明所述中药组合物的抗CA效果最佳,可能原因是渗漉提取未经过长时间剧烈受热过程,有利于抗CA的有效成分的保留。
实施例4不同渗漉提取工艺参数所得到的抗病原微生物中药组合物的抗CA药敏试验
4.1处方组成
本实施例所述抗病原微生物中药组合物的处方原料组成及配比同实施例1。
4.2试验材料
本实施例所用到的实验材料的说明同实施例2。
4.3试验方法
4.3.1正交试验方法
考察渗漉提取工艺中乙醇浓度和用量、药材粉碎粒度及渗漉速度对所提取得到的抗病原微生物中药组合物的抗CA药效的影响。采用四因素三水平正交实验设计,正交实验设计如表4:
表4正交试验设计表
*注:1、最粗粉:指能全部通过一号筛,但混有能通过三号筛不超过20%的粉末;2、粗粉:指能全部通过二号筛,但混有能通过四号筛不超过40%的粉末;3、中粉:指能全部通过四号筛,但混有能通过五号筛不超过60%的粉末。
按处方配比,称取黄连、龙胆、百部、苦参、丁香、香薷、三白草、大青叶、鸡冠花药材,按实施例3中全方乙醇溶液渗漉提取的方法和上述提取试验计划表进行提取实验。
4.3.2抗CA药敏试验方法
本实施例抗CA药敏试验的方法和判定标准同实施例2。
4.4试验结果
本发明的抗病原微生物中药组合物进行渗漉提取时,采用不同工艺参数所得到的提取液的抗CA药敏试验结果如表5所示:
表5不同提取工艺参数所得到抗病原微生物中药组合物的抗CA药敏试验结果
*注:以上抑菌圈为两次平行试验的平均值。
由上述结果得知,影响本发明抗病原微生物的中药组合物的体外抗CA的因素顺序为:乙醇浓度(A)>粉碎粒度(C)>渗漉速度(D)>乙醇用量(B)。乙醇浓度(A)对提取液的抑菌效果影响最大,其影响具有显著性,方差分析显示其水平三效果最佳;次之为粉碎粒度(C),方差分析显示水平三效果最佳;渗漉速度(D)对抑菌效果也有影响,方差分析显示水平二效果最佳;乙醇用量(B)对提取液的抑菌效果影响不大。因此,本发明的中药组合物其最佳渗漉提取工艺参数为:A3B1C3D2,即处方药材粉碎成中粉,乙醇的浓度为80%,乙醇用量为药材质量的8倍,渗漉速度为6ml/(min·kg)。
实施例5全方和分组渗漉提取方式得到的抗病原微生物中药组合物的抗CA药敏试验
5.1处方组成
本实施例所述抗病原微生物中药组合物的处方原料组成及配比同实施例1。
5.2试验材料
本实施例所用到的实验材料的说明同实施例2。
5.3供试液的制备
5.3.1全方渗漉提取的供试液的制备
按处方配比称取除冰片以外的处方药材,粉碎成中粉,以少量80%乙醇溶液润湿,密闭30分钟,装入渗漉装置,用少量80%乙醇溶液浸泡24小时,加药材质量8倍量的80%乙醇溶液进行渗漉提取,渗漉速度为6ml/(min·kg),收集以上渗漉液,量其体积,取适量,减压(-0.06~-0.08Mpa,75℃)浓缩至无醇味,并按处方配比取冰片溶于适量乙醇中,继续添加乙醇至冰片在乙醇中的浓度为0.15g/ml,即得冰片乙醇液,再将冰片乙醇液加入到渗漉浓缩液中,加水调节生药量为0.695g/ml,即得全方渗漉提取的供试液。平行制备3份。
5.3.2分组渗漉提取的供试液的制备
渗漉组①药液的制备按处方配比称取黄连、龙胆、百部、苦参、三白草、大青叶、鸡冠花药材,粉碎成中粉,以少量80%乙醇溶液润湿,密闭30分钟,装入渗漉装置,用少量80%乙醇溶液浸泡24小时,用药材质量8倍量的80%乙醇溶液进行渗漉提取,渗漉速度为6ml/(min·kg)。收集渗漉液,即得渗漉组①药液。平行制备2份。
渗漉组②药液的制备按处方配比称取丁香、香薷药材,粉碎成中粉,以少量80%乙醇溶液润湿,密闭30分钟,装入渗漉装置,用少量80%乙醇溶液浸泡24小时,用药材质量8倍量的80%乙醇溶液进行渗漉提取,渗漉速度为6ml/(min·kg)。分别收集初漉液至其中生药浓度为0.33g/ml和续漉液。平行制备2份。
渗漉组①药液与渗漉组②续漉液合并,减压(-0.06MPa,80℃)浓缩至无醇味,即得渗漉浓缩液。取渗漉组②的初滤液适量,按处方配比取冰片溶于初漉液中,再加入渗漉浓缩液,最后加水调整生药量为0.695g/ml,即得分组渗漉提取的供试液。
5.4试验方法
本实施例试验方法与判定标准同实施例2。
5.5试验结果
本发明的抗病原微生物中药组合物采用全方渗漉提取和分组渗漉提取方式得到的提取液抗CA的试验结果如表6和表7所示。
表6抗病原微生物中药组合物的全方渗漉提取液抗CA药敏试验结果
表7抗病原微生物中药组合物的分组渗漉提取液的抗CA药敏试验结果
由表6和表7的结果得知,本发明的中药组合物采用分组渗漉提取的方式得到的提取液平均抑菌圈为12.3mm,与全方渗漉提取方式得到的提取液的平均抑菌圈11.9mm接近。发明人在前期大量的实验过程中发现丁香药材中的丁香酚具挥发性,在减压浓缩过程中随溶剂被回收,损失较大。考虑到全方渗漉提取液在浓缩时丁香酚由于受热易挥发而损失严重,而分组渗漉提取液由于保留了前3倍含丁香酚的渗漉提取液(不浓缩)而大大提升了丁香酚的保留率。因此分组渗漉提取工艺更合理、稳定、可靠。
实施例6抗病原微生物的触变凝胶剂及其载药量考察
本实施例所述抗病原微生物的触变凝胶剂由本发明所述抗病原微生物的中药组合物、艾维素、苯甲酸钠和水组成,其中抗病原微生物的中药组合物的原料组成及配比同实施例1。
6.1实验材料(仪器与试剂)
数显型高速分散机(T25,德国IKA,);
数字式黏度计(NDJ-8S,上海精天电子仪器有限公司);
烧杯、玻璃棒、胶头吸管;
艾维素RC-591(批号:DN12823890;厂家:美国FMC公司);
艾维素CL-611(批号:EN12824561;厂家:美国FMC公司);
苯甲酸钠(天津大茂化学试剂厂);
其它实验材料的说明同实施例2。
6.2制备方法
6.2.1中药组合物的制备
(1)按处方配比称取黄连、龙胆、百部、苦参、三白草、大青叶、鸡冠花药材,粉碎成中粉,以少量80%乙醇溶液润湿,密闭30分钟,装入渗漉装置,用少量80%乙醇溶液浸泡24小时,用药材质量8倍量的80%乙醇溶液进行渗漉提取,渗漉速度为6ml/(min·kg)。收集全部渗漉液,即得A组药液;
(2)按处方配比称取丁香、香薷药材,粉碎成中粉,以少量80%乙醇溶液润湿,密闭30分钟,装入渗漉装置,用少量80%乙醇溶液浸泡24小时,用药材质量8倍量的80%乙醇溶液进行渗漉提取,渗漉速度为6ml/(min·kg)。收集初漉液至其中生药浓度为0.33g/ml,并按处方配比取冰片溶于初漉液中,作为B组药液;继续收集续漉液,作为C组药液;
(3)将A组药液与C组药液合并,减压(-0.06MPa,80℃)浓缩至相对密度为1.01~1.03(50℃),滤过(过200目筛)即得D组药液,与B组药液分别储存备用,即得所述中药组合物。
6.2.2艾维素空白基质的制备
分别量取蒸馏水25ml于烧杯中,再分别称取艾维素粉末适量,边加边搅拌(12000r/min),待艾维素在水中分散均匀(艾维素凝胶由稠变稀)后,继续搅拌(12000r/min)15分钟,即得艾维素空白基质。
6.2.3含中药组合物的触变凝胶剂的制备
取6.2.1所制备的D组药液适量、苯甲酸钠0.125g于烧杯中,加水至25ml,水浴(75℃)加热搅拌使溶解均匀,待药液温度降至约45℃,加入6.2.1制备的B组药液适量,即得混合药液,然后边搅拌(12000r/min)边将混合药液缓缓加入6.2.2制备的艾维素空白基质中,加完后,继续搅拌(12000r/min)10分钟,即得含中药组合物的触变凝胶剂。
6.3艾维素RC-591和CL-611的载药量考察
根据艾维素使用说明及预实验,空白艾维素RC-591在1.8%时即具有良好的触变性,当浓度大于3.0%时凝胶过稠失去触变性,故本实验考察1.8、2.4、3.0%的艾维素RC-591的载药量;空白艾维素CL-611在2.4%时即具有较佳的触变性,当浓度大于4.0%时凝胶过稠失去触变性,故本实验考察2.4、3.0、4.0%的CL-611载药量。结果如表8和表9所示。
表8艾维素RC-591的载药量考察
表9艾维素CL-611的载药量考察
结果:(1)由表8可知,含1.8%、2.4%的RC-591触变凝胶剂加入中药组合物提取液成型后均出现分层、絮凝,含3.0%的艾维素RC-591的凝胶加入的生药量为0.139g/ml时触变凝胶光滑细腻,具有良好触变性,增大生药浓度,均出现分层、絮凝,说明艾维素RC-591对本发明的中药组合物的载药量为0.139g/ml。
(2)由表9可知,含2.4%的艾维素CL-611触变凝胶剂依次加入不同浓度的中药组合物提取液后均出现分层、絮凝,增大艾维素CL-611的浓度为3.0%时,触变凝胶可以承载生药浓度为0.139g/ml,增大艾维素CL-611的浓度为4.0%时,触变凝胶可承载生药浓度为0.417g/ml。
(3)由表8和表9可知:生药浓度显著影响凝胶剂的成型稳定性,生药浓度越大越不利于触变凝胶剂的成型;增大处方中艾维素的浓度有利于凝胶剂的成型稳定性。
(4)艾维素CL-611的载药量大于RC-591,成型稳定性较佳,其最佳浓度为4%(4g/100ml)。
实施例7抗病原微生物的触变凝胶剂的分散速度及分散时间的考察
本实施例所述抗病原微生物的触变凝胶剂由本发明所述抗病原微生物的中药组合物(黄连生药浓度为0.15g/ml,总生药浓度为0.417g/ml)、艾维素CL-611(4g/100ml)、苯甲酸钠(0.25g/100ml)和水组成,其中抗病原微生物的中药组合物的原料组成及配比同实施例1。
试验材料的说明同实施例6,触变凝胶剂的制备方法除搅拌速度和搅拌时间外,均同实施例6。
分别考察艾维素CL-611以6000r/min、9000r/min、12000r/min的搅拌速度在水中分散均匀后,继续搅拌5分钟、10分钟、15分钟形成空白基质,加中药组合物提取液(黄连生药浓度为0.15g/ml,总生药浓度为0.417g/ml)后的成型稳定性。结果如表10-12所示。
表10艾维素CL-611分散速度为6000r/min时的触变凝胶剂的成型稳定性
表11艾维素CL-611分散速度为9000r/min时的触变凝胶剂的成型稳定性
表12艾维素CL-611分散速度为12000r/min时的触变凝胶剂的成型稳定性
结果:(1)由表10、表11可知,分散速度为6000r/min、9000r/min不利于4.0%的CL-611成型,凝胶均出现分层或者絮凝。(2)表12中,分散速度为12000r/min分散时间为5min,凝胶出现分层、絮凝,分散时间为10min、15min时凝胶光滑细腻、具有良好的触变性,说明分散速度为12000r/min、搅拌时间为10、15min均可使凝胶剂成型,从节省生产时间角度考虑,分散时间选择10min即可。
实施例8抗病原微生物触变凝胶剂对CA的抗菌敏感性及作用机理电镜研究
8.1试验材料
8.1.1主要仪器与试剂
透射电镜(型号:TECNAI G2SPIRIT TWIN,公司:美国FEI,产地:捷克);
单人双面净化工作台(苏州净化设备有限公司);
高压蒸汽灭菌锅(上海三申医疗器械有限公司);
恒温培养箱(池本理化业株式会社);
空气浴振荡器(哈尔滨市东联电子科技开发有限公司)。
念珠菌显色培养基(青岛高科园海博生物技术,批号:20130218)
沙氏液体培养基(青岛高科园海博生物技术,批号:20120822)
沙氏琼脂培养基(青岛高科园海博生物技术,批号:20120924)
8.1.2受试药液
抗病原微生物触变凝胶剂(组成同实施例7,制备方法同实施例6,批号:20140211);
香莲外洗液(广东省中医院医疗机构制剂,批号:20131010)
8.1.3试验用菌
白色念珠菌①:武汉同济医科大学微生物实验室提供的白色念珠菌19号。
白色念珠菌②、③:广州华侨医院皮肤性病科提供的临床分离菌株1014、1017号。
8.2试验方法
8.2.1临床分离菌株的培养和鉴别
无菌棉拭子采集临床上诊断为白色念珠菌阴道炎的患者阴道壁分泌物,将标本放入装有少量生理盐水的无菌试管中,用接种环醮取标本生理盐水液,在念珠菌显色培养基上划线后,于28℃培养箱中,培养48小时。挑选出绿色或蓝绿色显色明显的菌落,经YBC酵母菌鉴定卡,鉴定该菌株为CA。取CA菌株于液体沙氏培养基中培养24h后,再次转种在斜面沙氏固体培养基上,培养24~48小时后,放置10℃冰箱保存备用。
8.2.2抗菌敏感性
8.2.2.1菌液的制备
用消毒接种环刮取2~3个CA单菌落接种于液体沙氏培养基中,置恒温摇床中(37℃,200r/min)培养4~6h,作为原菌液。使用时,经麦氏比浊法调整菌液浓度为0.5单位麦氏标准(含菌约为1.5×108cfu/ml),即得供试菌悬液。
8.2.2.2最低抑菌浓度(MIC)及(最低杀菌浓度)MBC的测定
试管倍比稀释法:①取9支试管(编号1-9),第1~9根试管分别加入沙氏液体培养基2ml;②于第1根试管中加入受试药液2ml,混合均匀;③从第1根试管吸取混合液2ml至第2根试管中,混合均匀;再从第2根试管中移取混合液2ml至下一支试管,依此倍比稀释抗菌药物,至第9管时弃去2ml,此时各试管药物浓度依次为原药液的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512倍;④再往9支试管中分别加入100μl供试菌悬液;⑤另取9支试管(编号1-9),同法制备,至“第9管时弃去2ml”,不加菌悬液,作阴性对照;⑥将18支试管于37℃、5%CO2条件下的恒温培养箱中培养24h。
通过肉眼比浊观察对应的阴性对照管,无菌生长者为供试品对该受试菌的MIC。将MIC测定中各管中的菌药混合物,接种于沙氏琼脂平板上,置于37℃、5%CO2条件下的恒温培养箱中培养24h,仍无菌落生长的管内药物浓度为该药对该受试菌的MBC。
8.3抗菌敏感性试验结果
抗病原微生物触变凝胶剂以及香莲外洗液对CA的抗菌敏感性测定结果如表14和表15所示。
表13试管二倍稀释法各试管中生药含量
*注:“-”表示该试管溶液颜色与对应阴性对照比较,澄清度无变化;“+”表示该试管溶液颜色与阴性对照比较,变浑浊。
表15琼脂平板法测定CA菌株的MBC的结果
*注:“-”表示平板无菌落生长;“+”表示平板有菌落生长。
由表14、表15结果可知,香莲外洗液对三株临床分离的CA菌株的MIC均为31.25mg/ml,对不同临床分离菌株的抑制作用无差异;MBC均为62.50mg/ml,对不同临床分离菌株的杀菌作用亦无差异,MBC结果与文献报道一致。本发明的抗病原微生物触变凝胶剂对不同临床分离菌株的MIC均为13.03mg/ml,对不同临床分离菌株的抑制作用无差异;MBC均为26.06mg/ml,对不同临床分离菌株的杀菌作用亦无差异。本发明的抗病原微生物触变凝胶剂对不同临床分离的CA菌株的MIC和MBC均低于香莲外洗液,因此本发明的抗病原微生物触变凝胶剂的抗菌效力更强。
8.4透射电镜(TEM)标本制备及观察
取用2倍MBC浓度的本实施例上述抗病原微生物触变凝胶剂和香莲外洗液作用24小时的及未经药物作用的白色念珠菌①的菌悬液,离心,取沉淀,沉淀用2.5%的戊二醛固定过夜,经脱水,切片,染色,置透射电镜下观察。
结果显示,正常的CA菌体近似圆形,细胞壁及细胞膜结构完整,细胞壁结构明显(图1-A);经香莲外洗液作用后CA呈“空壳”状,细胞壁结构疏松,有裂口,细胞膜缺失严重(图1-B);经本发明的抗病原微生物触变凝胶剂处理后CA细胞壁结构疏松,有裂口,细胞膜连续性破坏,细胞膜缺失严重,胞浆内容物漏出(图1-C、图1-D)。本发明的抗病原微生物触变凝胶剂抗CA的作用,可能通过破坏CA的细胞壁、细胞膜、细胞核的结构而达到抗真菌作用,且其抗菌效力更强。
实施例9抗病原微生物的触变凝胶剂对金黄色葡萄球菌的抗菌敏感性试验
9.1试验材料和方法
金黄色葡萄球菌①、②、③:广州华侨医院皮肤性病科提供的临床分离菌株。
其它实验材料和受试药液同实施例8,试验方法同实施例8。
9.2MIC及MBC的测定结果
抗病原微生物触变凝胶剂对金黄色葡萄球菌的抗菌敏感性测定结果如表17和表18所示。
表16试管二倍稀释法各试管中生药含量
表17试管二倍稀释法测定对金黄色葡萄球菌的MIC结果
*注:“-”表示该试管溶液颜色与对应阴性对照比较,澄清度无变化;“+”表示该试管溶液颜色与阴性对照比较,变浑浊。
表18琼脂平板法测定对金黄色葡萄球菌的MBC结果
*注:“-”表示平板无菌落生长;“+”表示平板有菌落生长。
由表17和表18的结果可知:本发明的抗病原微生物的触变凝胶剂对不同临床分离菌株金黄色葡萄球菌的MIC均为3.26mg/ml,对不同临床分离菌株的抑制作用无差异;MBC分均为6.52mg/ml,对不同临床分离菌株的杀菌作用也无差异。结果表明,本发明抗病原微生物的触变凝胶剂对金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌效果。
实施例10抗病原微生物的触变凝胶剂治疗脚气的临床疗效
10.1一般资料
本组100例门诊患者中,年龄最小者12岁,最大者67岁;男72例,女28例;病程最长者1年,最短者15天;初发者65例,复发者35例;并发红丝疔者1例,并发足丫感染者9例。临床表现为趾间、足缘、足底出现水疱或糜烂、瘙痒、疼痛等。全部患者均使用本发明所述的抗病原微生物的触变凝胶剂(配方组成及制备方法同实施例8)进行涂布治疗。
10.2治疗方法
使用前洗净双足,触变凝胶剂在用前振摇使成流动的液体状,用棉签将药液均匀涂抹于患处,每日3次,7天为1个疗程。用药期间,患者所用脚盆、脚布、鞋袜需消毒且分开,注意手足卫生防止感染;若出现脚部皮肤已糜烂者慎用,除脚气外其他部位真菌感染禁用。
10.3疗效评价
本实验采用以下标准,痊愈:症状完全消失,且随访1月内无复发;有效:局部症状明显减轻;无效:用药3个月后症状无缓解。
10.4治疗结果
结果见表19,使用本发明的抗病原微生物的触变凝胶剂对脚气进行治疗,总有效率达到95%(95/100),一般连续用药3天,脚气症状大多有缓解。结果表明,本发明的抗病原微生物的触变凝胶剂对治疗脚气具有显著的的临床疗效。
表19抗病原微生物的触变凝胶剂对治疗脚气的效果
*注:总有效率=(显效例数+有效例数)/总例数×l00%。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种抗病原微生物的中药组合物,其特征在于,所述中药组合物的活性成分由以下重量份的原料制备而成:黄连20-40份、龙胆2-4份、百部3-6份、苦参3-6份、丁香1-3份、香薷3-6份、三白草10-20份、大青叶5-10份、鸡冠花4-8份、冰片1-3份。
2.根据权利要求1所述的抗病原微生物的中药组合物,其特征在于,所述中药组合物的活性成分由以下重量份的原料制备而成:黄连20-30份、龙胆2-4份、百部3-5份、苦参3-5份、丁香1-2份、香薷4-5份、三白草12-15份、大青叶6-8份、鸡冠花5-6份、冰片1-2份。
3.根据权利要求1所述的抗病原微生物的中药组合物,其特征在于,所述中药组合物的活性成分由以下重量份的原料制备而成:黄连25份、龙胆3份、百部4份、苦参4份、丁香1.5份、香薷4.5份、三白草13.5份、大青叶7份、鸡冠花5.5份、冰片1.5份。
4.一种权利要求1-3任一项所述的抗病原微生物的中药组合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)按配比称取黄连、龙胆、百部、苦参、三白草、大青叶、鸡冠花药材,粉碎成粉末,用体积为药材质量6-10倍的乙醇溶液进行渗漉提取,单位以ml/g计,收集全部渗漉液,作为A组药液;
(2)按配比称取丁香、香薷药材,粉碎成粉末,用体积为药材质量6-10倍的乙醇溶液进行渗漉提取,单位以ml/g计,收集初漉液至其中生药浓度为0.32-0.35g/ml,并按配比取冰片溶于初漉液中,作为B组药液;继续收集续漉液,作为C组药液;
(3)将A组药液与C组药液合并,减压浓缩得D组药液,与B组药液分别储存备用,即得所述中药组合物。
5.根据权利要求4所述的抗病原微生物的中药组合物的制备方法,其特征在于,步骤(1)和(2)所述粉末为中粉,所述粉末进行渗漉提取前经过如下处理:以体积浓度为60%-80%的乙醇溶液润湿,密闭25-35分钟,装入渗漉装置,用体积浓度为60%-80%的乙醇溶液浸泡20-28小时;步骤(1)和(2)所述乙醇溶液的体积浓度为60%-80%,所述渗漉的渗漉速度为4-9ml/min·kg;步骤(3)所述减压浓缩的压力为-0.06--0.09MPa,温度为75-80℃,浓缩至50℃时的相对密度为1.01-1.03。
6.权利要求1-3任一项所述的中药组合物在制备抗病原微生物的外用药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的中药组合物的应用,其特征在于,所述病原微生物为白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、脚气致病菌。
8.一种抗病原微生物的外用药物,其特征在于,所述外用药物由权利要求1-3任一项所述的中药组合物和辅料制备而成。
9.根据权利要求8所述的抗病原微生物的外用药物,其特征在于,所述外用药物主要由权利要求1-3任一项所述的中药组合物、艾维素和水制备而成,所述外用药物的剂型为触变凝胶剂,所述外用药物中中药组合物的生药浓度为0.12-0.42g/ml,艾维素的浓度为2.4-4g/100ml。
10.一种权利要求8-9任一项所述的抗病原微生物的外用药物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)量取蒸馏水于烧杯中,搅拌下加入艾维素,加毕搅拌,即得触变凝胶空白基质;
(2)分别取权利要求4或5中所述的D组药液和蒸馏水于烧杯中,加热,搅拌溶解均匀,降温后加入权利要求4或5中所述的B组药液,即得混合药液;
(3)将步骤(2)所得混合药液搅拌下缓缓加入步骤(1)所得空白基质中,加毕搅拌,即得所述外用药物。
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CN102178862A (zh) * | 2011-04-27 | 2011-09-14 | 北京生泰尔生物科技有限公司 | 香连消毒液的制备及质量检测方法 |
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Title |
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香莲复方制剂治疗体股癣、花斑癣疗效观察;范瑞强 等;《中国中西医结合杂志》;19941020;第14卷(第10期);614-615 * |
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Publication number | Publication date |
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CN104940767A (zh) | 2015-09-30 |
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