CN102133302B - 一种马鞭草中提取的治疗前列腺炎的马鞭草提取物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及马鞭草中提取的治疗前列腺炎的马鞭草提取物，可有效解决制备治疗前列腺炎的药物问题，本发明解决的技术方案是，取马鞭草药材，粉碎，用乙醇加热回流提取2次，合并提取液，过滤，减压浓缩，用蒸馏水分散均匀，冷藏静置后过滤，取上清液通过大孔吸附树脂柱，先用蒸馏水洗脱，再用乙醇洗脱，弃去洗脱液，继用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩干燥，粉碎成细粉得含马鞭草苷50％以上的马鞭草提取物，本发明方法简单，原材料丰富，易生产，提取物马鞭草苷含量高，可有效实现在制备治疗前列腺炎药物中的应用，是中药上的创新。

Description

一种马鞭草中提取的治疗前列腺炎的马鞭草提取物

一、技术领域

本发明涉及医药，特别是一种马鞭草中提取的治疗前列腺炎的马鞭草提取物。

二、背景技术

慢性前列腺炎(Chronic Prostatis CP)是成年男性生殖系统一种常见病、多发病，约占泌尿科门诊病人的40％左右。据统计，35岁以上男性，30％-40％患者有不同程度的慢性前列腺炎。前列腺增生患者，多伴有慢性前列腺炎，为50岁后男性最常见的慢性生殖道感染。表现为尿频、尿急、尿痛、排尿不尽、排尿困难等排尿异常症状，会阴部、下腹部、阴茎阴囊、腰骶部等部位不适或疼痛等症状，持续时间超过3个月，可伴有不同程度的排尿症状和性功能障碍，并伴精神差、记忆功能减退等神经衰弱症状，严重影响患者健康状况和生活质量。

在CP中慢性非细菌性前列腺炎(CNP)的发病是慢性细菌性前列腺炎(CBP)的8倍，好发于中青年男性人群，而前列腺液(EPS)、精液及第三份膀胱中段尿标本(VB3)细菌培养结果阴性，提示可能与其它致病微生物的感染有关。近些年来，关于慢性非细菌性前列腺炎病因的研究很多，提出了很多假说，如微生物因素、免疫反应、尿液返流、心理因素等，但都未取得里程碑式的突破。由于病因和发病机制尚未明确，多以对症治疗为主，亦有针对可能发病机制的治疗，如α-受体阻滞剂、花粉制剂、非甾体抗炎药、皮质类固醇以及物理疗法，抗菌治疗，精神疗法等，方法虽多，但实际的临床效果却令人失望。

现代医学认为，本病缠绵难愈是由于前列腺囊包膜周围纤维组织以及血-前列腺膜屏障作用，药物很难到达病所而发挥效用所致。前列腺组织解剖结构特殊，前列腺腺管狭长，尿道病原菌进入后，不易随分泌物排出和清除，前列腺一血液之间的屏障作用，药物不易渗透前列腺上皮脂膜进入腺体内，在前列腺中难以达到有效浓度。延误治疗和对抗菌素的耐药，导致慢性炎症，而慢性炎性病变又使管腔狭窄，纤维组织增生，细菌长期滞留在前列腺组织内，形成慢性病灶，使其治疗难度增大，以致治愈率极低，复发率极高。慢性前列腺炎的发病率在近年来显上升趋势，现有的西药虽有一定的效果，但疗效远远达不到人们的要求，而且副作用也较多。慢性非细菌性前列腺炎已成为近年来国内外医学界研究的难点之一。

马鞭草(Herba Verbenae)为马鞭草属植物马鞭草(Verbena officinalis L.)的地上部分。植物资源丰富，分布于全国各地。味苦性凉，入肝、脾、肾经，具有清热解毒、凉血散瘀、利水消肿的功效，用于疟疾、湿热痢疾泄泻，痈疮肿毒，牙龈肿痛，喉痹肿痛，血滞经闭腹痛、症瘕积聚，水肿腹胀等症，但至今未见有马鞭草提取物用于治疗前列腺炎的报道。

三、发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种马鞭草中提取的治疗前列腺炎的马鞭草提取物，可有效解决制备治疗前列腺炎的药物问题。

本发明解决的技术方案是，取马鞭草药材，粉碎，用乙醇加热回流提取2次，合并提取液，过滤，减压浓缩，用蒸馏水分散均匀，冷藏静置后过滤，取上清液通过大孔吸附树脂柱，先用蒸馏水洗脱，再用乙醇洗脱，弃去洗脱液，继用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩干燥，粉碎成细粉得含马鞭草苷(又称马鞭草甙)50％以上的马鞭草提取物。

本发明方法简单，原材料丰富，易生产，提取物马鞭草苷含量高，可有效实现在制备治疗前列腺炎药物中的应用，是中药上的创新。

四、具体实施方法

以下结合实际和实验资料，对本发明的具体实施方式做详细说明。

本发明在具体实施中是，取马鞭草药材，粉碎为粗粉，每次加粗粉8倍重量的质量浓度为80％的乙醇加热回流提取2次，每次2小时，合并提取液，滤过，减压浓缩至在50℃相对密度为1.12-1.15的浓缩液，加入4倍量浓缩液体积的蒸馏水分散均匀，冷藏静置后滤过，取上清液通过HP-20型大孔吸附树脂柱，先用4倍柱体积的蒸馏水洗脱，再用4倍柱体积的质量浓度为20％的乙醇洗脱，弃去洗脱液，继用8倍柱体积的质量浓度为80％的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩干燥，粉碎成细粉得含马鞭草苷50％以上的马鞭草提取物。

该马鞭草提取物可有效用于制备治疗前列腺炎的药物，以满足对前列腺炎治疗的需要，并经动物实验，充分证明了马鞭草提取物(主要是含马鞭草苷)，具有很好的治疗前列腺炎之功效，有关实验资料如下：

实验1马鞭草苷对小鼠前列腺炎模型的影响

1.1实验动物

小鼠，昆明种，雄性，24～26g，动物合格证编号904013，购于河北省医学实验动物中心，饲养在河南中医学院实验动物中心，饲料为消毒饲料，垫料为消毒垫料，均由河南省实验动物中心提供。饮水为消毒蒸馏水。饲养条件：温度20～25℃，相对湿度40％～60％，自然光照，每笼10只，常规饲养，隔天更换垫料。

1.2实验药物和试剂

实验药物为本发明马鞭草提取物。

由江苏南京青泽医药科技有限公司提供，经HPLC检测，马鞭草苷含量为50.13％；

试剂为：前列康片，规格：每片含油菜花花粉0.5g，浙江康恩贝制药股份有限公司，批号20090122；消痔灵注射液，规格：每支10ml，北京双鹤药业股份有限公司，批号20070405；戊巴比妥钠，中国医药集团上海化学试剂公司，批号F20060715；注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司，批号X0901038；医用酒精，洛阳市洁康消毒剂厂，批号20080003；生理盐水，郑州永和制药有限公司，批号090217221；冰醋酸，开封化学试剂总厂，批号061208；甲醛，中国莱阳市双双化工有限公司，批号20070512。

1.3实验仪器

JY601电子秤，上海民桥医疗器械有限公司；FA(N)/JA(N)系列电子天平，上海民桥精密仪器有限公司；可调式移液器，上海雷勃分析仪器有限公司；OLYMPUS光学显微镜；BL-2000医用图像分析系统，成都泰盟科技有限公司。

2实验方法

2.1造模与分组

实验室常规饲养1周后，挑选体重在24～26g的雄性小鼠用于实验。随机选取10只作为空白对照组，其余用于造模。造模小鼠分别称重，按35mg/kg剂量，腹腔注射戊巴比妥钠，麻醉成功后，用酒精消毒皮肤，进行手术。于下腹正中切口达腹腔，提出膀胱及两侧精囊，暴露膀胱背侧前列腺(背侧叶)，用微量注射器准确注入25％消痔灵注射液0.02ml，送复脏器，分层缝合肌肉、皮肤，用酒精消毒手术伤口，待小鼠清醒后放回鼠笼常规饲养。术后肌内注射青霉素20万u/kg，连用3天，以预防感染。术后第8天，挑选恢复情况较好的造模小鼠50只按体重随机分为5组，每组10只，即模型组，前列康组，马鞭草苷高、中、低剂量组。

2.2给药方法

2.2.1实验用药的配制

根据预试验的情况，马鞭草苷高、中、低剂量组小鼠每日给药剂量分别为：200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，用生理盐水分别配制成浓度为10、5、2.5mg/ml的溶液；

前列康片：前列康按成人临床用量的15倍给药。小鼠每日剂量为1.5g/kg，临用前用生理盐水配成浓度为0.075g/ml的混悬液；

消痔灵注射液：临用前用灭菌注射用水配制成25％的浓度。

2.2.2给药剂量和方法

空白对照组：灌胃给予生理盐水0.2ml/10g，1日1次，连续21天；模型组：灌胃给予生理盐水0.2ml/10g，1日1次，连续21天；前列康组：灌胃给予前列康混悬液0.2ml/10g，浓度为0.075g/ml，1日1次，连续21天；马鞭草苷高剂量组：灌胃给予马鞭草苷溶液0.2ml/10g，浓度为10mg/ml，1日1次，连续21天；马鞭草苷中剂量组：灌胃给予马鞭草苷溶液0.2ml/10g，浓度为5mg/ml，1日1次，连续21天；马鞭草苷低剂量组：灌胃给予马鞭草苷溶液0.2ml/10g，浓度为2.5mg/ml，1日1次，连续21天。

2.3指标测定

小鼠24h内饮水量：于造模后的第14天和第28天分别测定每组小鼠24h内的饮水量。

白细胞计数以及卵磷脂小体密度评分：于末次给药24h后，称小鼠体重，然后以颈椎脱臼法处死，迅速取出部分前列腺组织，精密称重，剪碎，按每1mg前列腺组织加生理盐水4μl，充分混匀。取试管1支，加白细胞稀释液(1％冰醋酸水溶液)380μl，用微量加样器准确吸取上述制备好的标本20μl，于试管稀释液底部轻轻放出，吹打3次混匀，充池，用低倍镜计数四角4个大方格内的白细胞总数及卵磷脂小体密度。白细胞计数采用显微镜直接观察计算：白细胞数/L＝4个大方格内的白细胞总数×50×10⁶；卵磷脂小体密度按临床检验标准进行评分：满视野为4分，3/4视野为3分，1/2视野为2分，1/4视野为1分。

前列腺及相关组织的形态学检查：取一部分前列腺组织以及睾丸、附睾、肾脏、胸腺用生理盐水漂洗干净，固定于10％福尔马林溶液中，石蜡包埋，常规脱水，切片，HE染色。用显微镜结合计算机图形图像分析系统，在×400倍镜下观察前列腺及相关组织的形态学变化。

2.4统计学处理方法

数据分析用SPSS 13.0 for windows统计软件包进行数据资料的统计学处理，计量资料用平均数±标准差(

)表示，组间比较用单因素方差分析，计数资料采用Ridit分析。

3实验结果

3.1对前列腺炎模型小鼠饮水量的影响

分别在造模后的第14天和第28天，分别测定每组小鼠在24h内的饮水量，结果见表1。

表1马鞭草苷对前列腺炎模型小鼠饮水量的影响(m1)

从上表可看出，模型组小鼠在造模后第14天和第28天饮水量均比空白对照组少，分别减少5.0％和19.8％，说明随着造模时间的延长，模型小鼠前列腺炎症状加重。与模理组比，马鞭草苷高、中、低剂量组在第14天和第28天饮水量分别增加2.8％、19.1％，2.4％、14.8％，0.4％、7.7％，说明随着给药时间延长，对前列腺炎症状减轻越明显。

3.2对前列腺炎模型小鼠前列腺组织中白细胞数及卵磷脂小体密度的影响

按相应实验方法及标准，观察并记录前列腺组织中白细胞总数及卵磷脂小体密度积分，结果见表2。

表2马鞭草苷对前列腺炎模型小鼠前列腺组织中白细胞数及卵磷脂小体密度的影响(

n＝10)

★★表示与模型组相比，P＜0.01

从上表可看出，与空白对照组相比，模型组前列腺组织中白细胞数显著增加(P＜0.01)、卵磷脂小体密度积分显著减少(P＜0.01)，说明前列腺炎模型复制成功。与模型组相比，马鞭草苷高、中、低剂量组和前列康组前列腺中白细胞数均显著减少(P＜0.01)，前列腺卵磷脂小体密度积分均显著增加(P＜0.01)，且以马鞭草苷高、中剂量效果明显。

3.3对前列腺炎模型小鼠器官组织形态的影响

3.3.1对前列腺组织的影响

光镜下对小鼠前列腺组织观察可见：空白对照组前列腺腺体正常，腺上皮均呈皱褶状排列，间质未见炎细胞浸润和纤维的增生；模型组前列腺出现明显增生，腺腔扩张，腺上皮变平，间质组织增宽，间质有明显的炎细胞(中性粒细胞)浸润和纤维的增生；前列康组前列腺腺体扩大，腺上皮细胞呈皱褶状排列，而腺体周围出现少量纤维增生和少量的炎症细胞；马鞭草苷高剂量组前列腺腺体正常，腺上皮细胞呈皱褶状排列，间质未见炎细胞浸润和纤维的增生；马鞭草苷中剂量组前列腺腺腔基本恢复正常，腺体上皮细胞大部分呈皱褶状排列，间质中有少量的纤维增生和炎细胞；马鞭草苷低剂量组前列腺出现明显的增生，腺腔明显扩张，上皮变平呈扁平状，间质中有少量的纤维增生和炎症细胞浸润。

表3马鞭草苷对前列腺炎模型小鼠前列腺组织的影响

“-”前列腺腺体、腺上皮和间质均正常；“+”前列腺腺体少有扩张，腺上皮呈现扁平状，腺体周围少有纤维增生和少量的炎细胞浸润；“++”前列腺腺体明显增生、腺腔扩张，腺上皮扁平状，间质有少量纤维增生和炎细胞浸润；“+++”前列腺腺体明显增生、腺腔扩张，腺上皮扁平状，间质有明显的纤维增生和炎细胞浸润。

从表3可看出，经Ridit检验，与空白对照组比，模型组出现显著的前列腺炎症的病理变化(P＜0.01)，说明造模型成功。与模型组比，大、中剂量马鞭草苷组的前列腺炎症病理变化显著减轻(P＜0.01)，小剂量组病理变化仅有减轻趋势。

根据实验各组前列腺的不同的病理改变采用细胞立体计量学方法，用测试格点记数法进行测定，计算炎症区的炎细胞的体密度(Vv)。实验各组前列腺的不同的病理改变测得结果见表4。

公式：Vv＝P∑n/参照系∑n×100％

表4马鞭草苷对前列腺炎模型小鼠前列腺体体密度(Vv)的影响(

n＝10)

★★表示与模型组相比，P＜0.01

从上表可看出，与空白对照组比，模型组前列腺体密度(Vv)显著增加(P＜0.01)。与模型组相比，前列康组及马鞭草苷高、中、低剂量组小鼠的前列腺体密度(Vv)均显著减小(P＜0.01)。

通过对实验各组小鼠前列腺体的立体计量学测定结果分析，可以看出，小鼠前列腺炎动物模型的主要立体计量学改变为前列腺腺体的体密度(Vv)增加。前列康及马鞭草苷均具有减小体密度，抑制小鼠前列腺炎的作用，其中以马鞭草苷高、中剂量作用最好，主要在病理组织学表现为腺体不扩张，间质中炎症细胞减少，腺体体密度下降。

3.3.2对肾脏组织的影响

光镜下对小鼠肾脏组织观察可见：空白对照组肾小球、肾小囊、肾小管及上皮细胞均正常；模型组肾小球、肾小囊、肾小管未见明显的病理改变；前列康组肾小球基本正常，肾小囊未见异常，肾小管上皮细胞出现空泡变性；马鞭草苷高剂量组肾小球、肾小囊及肾小管上皮细胞均正常；马鞭草苷中剂量组肾小球、肾小囊及肾小管未见有明显病理改变；马鞭草苷低剂量组肾小球、肾小囊及肾小管及上皮细胞均基本正常。

表5马鞭草苷对前列腺炎模型小鼠肾脏组织的影响

“-”肾小球、肾小囊、肾小管及上皮细胞均正常；“+”肾小球、肾小囊、肾小管及上皮细胞约有25％细胞出现泡变；“++”肾小球、肾小囊、肾小管及上皮细胞约有50％细胞出现泡变；“+++”肾小球、肾小囊、肾小管及上皮细胞约有75％细胞出现泡变。

从表5可看出，经Ridit检验，各组之间无明显差异，但可看出，马鞭草苷高、中剂量对肾脏有一定的益处，可减轻潜在的病理变化；前列康反使肾脏的病理变化加重。

3.3.3对睾丸组织的影响

光镜下对小鼠睾丸组织观察可见：空白对照组睾丸曲细精管各级精原细胞、支持细胞及间质均正常；病理模型组睾丸曲细精管中各级精原细胞基本正常，而在精子之后出显许多嗜酸性的精原细胞；前列康组睾丸曲细精管中的精原细胞中有嗜酸性变的精原细胞；马鞭草苷高剂量组睾丸曲细精管中各级精原细胞均正常；马鞭草苷中剂量组睾丸曲细精管中有1/3的精原细胞呈现嗜酸性改变；马鞭草苷低剂量组睾丸曲细精管中的精原细胞大部分呈现嗜酸性改变。

表6马鞭草苷对前列腺炎模型小鼠曲细精管中精原细胞的影响

“-”睾丸曲细精管精原细胞无嗜酸性改变；“+”睾丸曲细精管精原细胞约有25％出现嗜酸性改变；“++”睾丸曲细精管精原细胞约有50％出现嗜酸性改变；“+++”睾丸曲细精管精原细胞约有75％出现嗜酸性改变。

从表6可看出，经Ridit检验，与空白对照组比，病理模型组出现明显的睾丸病理变化(P＜0.05)，与模型组比，马鞭草苷高、中、低剂量组均可显著减轻睾丸的病理变化(P＜0.01)。

3.3.4对附睾组织的影响

光镜下对小鼠附睾组织观察可见：空白对照组附睾的附睾管和间质均正常；模型组附睾中附睾管内含有丰富的精子，管腔周围出现明显纤维增生和炎细胞浸润；前列康组附睾管内含有丰富的精子，管腔周围有大量纤维增生和炎细胞浸润；马鞭草苷高剂量组附睾管和间质细胞均正常；马鞭草苷中剂量组附睾周围纤维增生明显变薄减少，炎细胞明显减少；马鞭草苷小剂量组附睾周围可见明显纤维增生和少数炎细胞。

表7马鞭草苷对前列腺炎模型小鼠附睾组织的影响

“-”附睾腺体周围无纤维增生和炎细胞浸润，均正常；“+”附睾腺体周围有少数纤维增生和炎细胞浸润；“++”附睾腺体周围有明显纤维增生和炎细胞浸润；“+++”附睾腺体周围有大量纤维增生和炎细胞浸润。

从表7可看出，经Ridit检验，与空白对照组比，模型组出现显著的附睾病理变化(P＜0.01)。与模型组相比，马鞭草苷高剂量组附睾的病理变化显著减轻(P＜0.01)，马鞭草苷中剂量组附睾的病理变化明显减轻(P＜0.05)，而马鞭草苷低剂量和前列康减轻附睾病理变化的作用不明显。

3.3.5对胸腺组织的影响

光镜下对小鼠胸腺组织观察可见：空白对照组实验动物的胸腺小叶分界清楚，皮质髓质分界清楚，皮质的淋巴细胞较为密集；模型组实验动物的皮质变薄，淋巴细胞较为稀疏；前列康组动物胸腺皮质增厚，淋巴细胞较密集；马鞭草苷高、中剂量组动物的皮质明显增厚，淋巴细胞较为密集；马鞭草苷低剂量组动物的皮质增厚，淋巴细胞较密集。

采用测微尺测定胸腺皮质最宽处和最窄处求均数为皮质厚度，利用测微尺基线计算压在基线上的淋巴细胞数求均数为淋巴细胞数。实验各组测得结果见表8。

表8马鞭草苷对前列腺炎模型小鼠胸腺皮质厚度及淋巴细胞个数的影响

★★表示与模型组相比，P＜0.01

从上面表、图可看出，与空白组比较，模型组小鼠的胸腺皮质显著变薄，淋巴细胞个数显著减少(P＜0.01)，提示细胞免疫功能下降。前列康组和马鞭草高、中、低剂量组小鼠胸腺皮质显著增厚(P＜0.01)，淋巴细胞个数显著增加(P＜0.01)，提示马鞭草苷和前列康均能够显著增强前列腺炎模型小鼠的免疫功能。

4实验小结

本实验采用25％消痔灵注射液0.02ml/只注入小鼠前列腺(背侧叶)，建立小鼠前列腺炎模型。本实验从前列腺炎模型组小鼠的饮水量相对减少，前列腺组织中白细胞数显著增多、卵磷脂小体密度积分显著减少，前列腺Vv(体密度)显著性升高几方面阐述了消痔灵注射液对小鼠前列腺的影响，结合小鼠前列腺炎模型组小鼠前列腺组织形态学的病理改变，说明了本实验小鼠前列腺炎模型成功建立。

本实验通过马鞭草苷高、中、低剂量组小鼠饮水量相对增加、卵磷脂小体密度积分显著增加，前列腺组织中白细胞数显著减少，前列腺Vv显著降低，使前列腺炎症的病理变化显著减轻等方面验证了马鞭草苷对前列腺炎模型组小鼠的治疗作用，其中以马鞭草苷高、中剂量组对小鼠前列腺炎的抑制作用较好。马鞭草苷高、中、低剂量可减轻睾丸、附睾的病理变化，而且对肾脏可产生有益的影响，可以改善其潜在的病理变化。证明了马鞭草苷对小鼠前列腺炎模型炎性症状干预有效，可改善模型相关组织的病理变化及改善小鼠列腺炎模型引起的继发性机体病变。

本实验探索性的研究了马鞭草苷对小鼠免疫功能的影响，通过马鞭草苷高、中、低剂量可以显著增加模型小鼠胸腺厚度，增加淋巴细胞个数，证明马鞭草苷有增强前列腺炎动物模型免疫功能的作用。通过增强机体免疫功能来逆转其病理生理过程，从而对慢性前列腺炎起到治疗作用。

实验2马鞭草苷对大鼠前列腺炎模型的影响

1实验材料

1.1实验动物

大鼠，Wister，雄性，240～260g，动物合格证编号904012，购于河北省医学实验动物中心，饲养在河南中医学院实验动物中心，饲料为消毒饲料，垫料为消毒垫料，均由河南省实验动物中心提供。饮水为消毒蒸馏水。饲养条件：温度20～25℃，相对湿度40％～60％，自然光照，每笼10只，常规饲养，每天更换垫料。

1.2实验药物和试剂

马鞭草苷，由江苏南京青泽医药科技有限公司提供，经HPLC检测，含量为50.13％)；前列康片，规格：每片含油菜花花粉0.5g，浙江康恩贝制药股份有限公司，批号20090122；消痔灵注射液，规格：每支10ml，北京双鹤药业股份有限公司，批号20070405；戊巴比妥钠，中国医药集团上海化学试剂公司，批号F20060715；注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司，批号X0901038；医用酒精，洛阳市洁康消毒剂厂，批号20080003；生理盐水，郑州永和制药股份有限公司，批号20090302；冰醋酸，开封化学试剂总厂，批号061208；甲醛，中国莱阳市双双化工有限公司，批号20070512；IL-2放射免疫分析药盒，北京普尔伟业生物科技有限公司，批号20090424；IL-1β放射免疫分析药盒，北京普尔伟业生物科技有限公司，批号20090424；TNF-α放射免疫分析药盒，北京普尔伟业生物科技有限公司，批号20090424；

1.3实验仪器

JY601电子秤，上海民桥医疗器械有限公司；FA(N)/JA(N)系列电子天平，上海民桥精密仪器有限公司；可调式移液器，上海雷勃分析仪器有限公司；BCD-248T冰箱，新飞集团有限公司；OLYMPUS光学显微镜；BL-2000医用图像分析系统，成都泰盟科技有限公司；TGL-16G高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；DY89-1电动玻璃匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司；Sn-895B型智能放免γ测量仪，上海原子核研究所四环仪器一厂。

2实验方法

2.1造模与分组

实验室常规饲养1周后，挑选体重在240～260g的雄性大鼠用于实验。随机选取10只作为空白对照组，其余用于造模。每只大鼠分别称重，按30mg/kg的剂量，腹腔注射戊巴比妥钠，麻醉成功后，固定于手术台上，用酒精消毒腹部皮肤，于下腹正中切口达腹腔，提出膀胱及两侧精囊，暴露膀胱背侧前列腺(背侧叶)，准确注入25％消痔灵注射液0.2ml，送复脏器，分别缝合肌肉、皮肤，用酒精消毒手术伤口，待大鼠清醒后放回鼠笼常规饲养。术后肌内注射青霉素20万u/kg，连用3天，以预防感染。术后第8天，挑选恢复情况较好的造模大鼠50只按体重随机分为5组，每组10只，即模型组、前列康组、马鞭草苷高、中、低剂量组。

2.2给药方法

2.2.1实验用药的配制

根据预试验的情况，马鞭草苷高、中、低剂量组大鼠每日给药剂量分别为：120mg/kg、60mg/kg、30mg/kg，临用前用生理盐水分别配制成浓度为12、6、3mg/ml的溶液；

前列康片：前列康片按成人临床用量的10倍给药，每日剂量为1g/kg，临用前用蒸馏水配成浓度为0.1g/ml的混悬液；

消痔灵注射液：临用前用灭菌注射用水配制成25％的浓度。

2.2.2给药方法

空白对照组：灌胃给予生理盐水1ml/100g，1日1次，连续22天；病理模型组：灌胃给予生理盐水1ml/100g，1日1次，连续22天；前列康组(前列康片组)：灌胃给予前列康混悬液1ml/100g，浓度为0.1g/ml，1日1次，连续22天；马鞭草苷高剂量组：灌胃给予马鞭草苷溶液1ml/10g，浓度为12mg/ml，1日1次，连续22天；马鞭草苷中剂量组：灌胃给予马鞭草苷溶液0.2ml/10g，浓度为6mg/ml，1日1次，连续22天；马鞭草苷低剂量组：灌胃给予马鞭草苷溶液0.2ml/10g，浓度为3mg/ml，1日1次，连续22天。

2.3指标测定

前列腺组织外观形态：于末次给药24h后，称大鼠体重，断头处死，剖开大鼠下腹部，暴露前列腺组织，用肉眼观察每组大鼠的前列腺形态、大小、色泽及周围组织粘连情况等。

白细胞计数和卵磷脂小体密度评分：取前列腺液10μl放入1ml白细胞稀释液中，充分混匀后吸取1μl混合液镜检白细胞数，另取前列腺液10μl涂片，观察并记录卵磷脂小体密度，评分标准为：满视野4分，3/4视野3分，1/2视野2分，1/4视野1分。

前列腺指数测定：迅速取出前列腺，称其湿重，计算前列腺指数。前列腺指数＝前列腺湿重mg/体重g。

前列腺匀浆中细胞因子水平测定：精密称取200mg前列腺组织，用眼科剪剪碎，倒入匀浆器中，用移液管加入生理盐水1ml，进行匀浆(其中匀浆器下端浸入冰水中)。随后将组织匀浆在低温下以3000r/min离心15min。取上清液按试剂盒说明书方法测定前列腺组织中IL-2、IL-1β、TNF-α水平。

测定原理：利用液相竞争抑制原理，采用平衡阀对样品进行测定。待测样品或标准品与限量的抗血清及标记抗原加在一起进行竞争结合反应，反应完全后，加入免疫分离剂，分离出抗原-抗体复合物，测定复合物的放射性(B)，计算各标准管的结合率(B/B₀％)，作出标准曲线，查出样品浓度。

白细胞介素-2水平测定加样程序表：单位μl

测定范围：1～81ng/ml

结果计算：用自动r计数器预先编制好程序直接给出参数、标准曲线、样品浓度白细胞介素-1β水平测定加样程序表：单位μl

测定范围：0.03～8.1ng/ml

结果计算：用自动r计数器预先编制好程序直接给出参数、标准曲线、样品浓度肿瘤坏死因子-α水平测定加样程序表：单位μl

测定范围：0.3～24.3ng/ml

结果计算：用自动r计数器预先编制好程序直接给出参数、标准曲线、样品浓度。

前列腺及相关组织的形态学检查：取一部分前列腺组织和胸腺用生理盐水漂洗干净，固定于10％福尔马林溶液中，石蜡包埋，常规脱水，切片，HE染色。用显微镜结合计算机图形图像分析系统，在高倍镜下观察前列腺组织和胸腺的形态学变化。

2.4统计方法

数据分析用SPSS 13.0 for windows统计软件包进行数据资料的统计学处理，计量资料用平均数±标准差

表示，组间比较用单因素方差分析。

3实验结果

3.1前列腺组织外观形态

空白对照组大鼠前列腺表面红润有光泽，无结节、硬化，腺体组织柔软而有弹性，与周围组织无粘连，易于分离；模型组大鼠前列腺明显增大，有充血或瘀血状态，弹性较差，与周围组织有不同程度的粘连，部分可见有结节和硬化；前列康组大鼠前列腺与周围组织粘连较轻，有些腺体仅轻度水肿，硬结小；马鞭草苷各剂量组大鼠前列腺柔软有光泽，呈浅肉色，与周围组织无明显粘连，腺体大小无明显改变，未见结节。

3.2对大鼠前列腺炎模型大鼠前列腺指数的影响

称取前列腺湿重，计算前列腺指数，结果见表。

表9马鞭草苷对前列腺炎模型大鼠前列腺指数的影响(n＝10)

★★表示与模型组相比，P＜0.01

从上表可看出，与空白对照组比，模型组前列腺指数显著增高(P＜0.01)，说明大鼠前列腺炎建立成功。与模型组比，马鞭草苷高、中、低剂量组和前列康组大鼠前列腺指数显著降低(P＜0.01)，说明马鞭草苷可以显著改善前列腺炎症状。

3.3对前列腺炎模型大鼠前列腺液中白细胞数及卵磷脂小体密度积分的影响

按相应实验方法及标准，观察并记录前列腺液中白细胞总数及卵磷脂小体密度积分，结果见表10。

表10马鞭草苷对前列腺炎模型大鼠前列腺液中白细胞数及卵磷脂小体密度积分的影响(

n＝10)

★★表示与模型组相比，P＜0.01

由上表可以看出，与空白对照组相比，模型组大鼠前列腺液中白细胞数显著增加(P＜0.01)，卵磷脂小体密度积分显著减少(P＜0.01)，表明模型组大鼠前列腺炎症状明显，模型建立成功。与模型组相比，前列康组及马鞭草苷高、中、低剂量组大鼠前列腺液白细胞数显著减少(P＜0.01)，卵磷脂小体密度积分显著增加(P＜0.01)。实验结果表明，马鞭草苷具有改善前列腺炎模型大鼠前列腺炎症状的作用。

3.4马鞭草苷对大鼠前列腺炎模型大鼠前列腺匀浆中IL-2、IL-1β、TNF-α水平的影响

制备前列腺匀浆，按试剂盒说明书方法测定前列腺匀浆中的IL-2、IL-1β、TNF-α水平，结果见表11。

表11马鞭草苷对前列腺炎模型大鼠前列腺匀浆中IL-2、IL-1β、TNF-α水平的影响(

n＝10)

★★表示与模型组相比，P＜0.01；★表示与模型组相比，P＜0.05

从上面表、图可看出，与空白对照组比，模型组大鼠前列腺匀浆中IL-2、IL-1β、TNF-α水平均显著升高(P＜0.01)，说明大鼠前列腺炎模型建立成功。与模型组比，前列康组和马鞭草苷高、中、低剂量组大鼠前列腺匀浆中TNF-α水平显著降低(P＜0.01)，IL-2水平明显降低(P＜0.05)。前列康组和马鞭草苷高剂量组IL-1β水平显著降低(P＜0.01)，马鞭草苷中、低剂量组IL-1β水平明显降低(P＜0.05)。提示马鞭草苷抑制模型大鼠前列腺炎的作用可能与其降低炎症因子水平有关，从而改善前列腺炎症状。

3.5对大鼠前列腺炎模型大鼠前列腺组织形态的影响

光镜下对大鼠前列腺组织观察可见：空白对照组前列腺多数腺体处于静止状态，腺上皮皱褶排列，腺腔内无分泌物，腺腔明显缩小，间质炎症细胞少见；模型组前列腺腺腔明显扩张，腺上皮呈扁平状，腺腔内充满着大量红色分泌物，间质可见大量炎症细胞；前列康组少部分腺体显著缩小，大部分腺体处扩张状态，分泌物减少，周围可见少量炎症细胞；马鞭草苷高剂量组前列腺上皮呈皱褶状，腺腔明显缩小，间质基本恢复正常；马鞭草苷中剂量组前列腺大部分腺体缩小，腺腔内有分泌物，腺上皮呈皱褶状态，间质有少量的炎细胞浸润；马鞭草苷低剂量组前列腺腺体处于明显的扩张状态，腺上皮变薄呈扁平状，间质有大量炎细胞胞浸润。各用药组对前列腺炎模型均有不同程度的抑制作用，以马鞭草苷高、中剂量对模型大鼠前列腺炎抑制作用最好。

根据实验各组动物前列腺出现不同程度的腺体、大小差异和腺上皮皱褶的不同程度差异，采用立体计量学定量测定，可以客观地反映其病理变化的程度。按照每组动物10只，每只拍三张照片即30张，求X数。观测指标为腺体体密度(Vv)。测得结果见表12。

表12马鞭草苷对前列腺炎模型大鼠前列腺体的体密度(Vv)的影响(

n＝10)

★★表示与模型组相比，P＜0.01

从上表可看出，与空白对照组比，模型组前列腺Vv显著增加(P＜0.01)，说明大鼠前列腺炎模型建立成功。与模型组比，马鞭草苷高、中、低剂量组和前列康组大鼠前列腺体的Vv显著降低(P＜0.01)，以马鞭草苷高剂量的作用最强。

3.6对大鼠前列腺炎模型大鼠胸腺组织形态的影响

光镜下对大鼠胸腺组织观察可见：空白对照组大鼠的胸腺小叶分界清楚，皮质髓质分界清楚，皮质的淋巴细胞较为密集；模型组大鼠的皮质变薄，淋巴细胞较为稀疏；前列康组动物胸腺皮质变薄，淋巴细胞较密集；马鞭草苷高剂量组动物的皮质明显增厚，淋巴细胞密集，马鞭草苷中、低剂量组大鼠的皮质变薄，淋巴细胞较为密集。

采用测微尺测定胸腺皮质最宽处和最窄处求均数为皮质厚度，利用测微尺基线计算压在基线上的淋巴细胞数求均数为淋巴细胞数。实验各组测得结果见表13。

表13马鞭草苷对前列腺炎模型小鼠胸腺皮质厚度及淋巴细胞个数的影响

★★表示与模型组相比，P＜0.01

从上表可看出，与空白组比较，模型组大鼠的胸腺皮质显著变薄(P＜0.01)，淋巴细胞个数显著减少(P＜0.01)，提示细胞免疫功能下降。马鞭草高剂量组大鼠的胸腺皮质显著增厚(P＜0.01)，淋巴细胞个数显著增加(P＜0.01)，提示马鞭草苷能够显著增强前列腺炎模型大鼠的免疫功能。

4实验小结

本实验采用25％消痔灵注射液0.2ml/只注入大鼠前列腺(背侧叶)，复制大鼠前列腺炎模型。本实验从前列腺炎模型组大鼠前列腺指数显著增大，前列腺液中白细胞数显著增加、卵磷脂小体密度积分显著减少，前列腺Vv显著增加几方面阐述了消痔灵注射液对大鼠前列腺的影响，结合模型组大鼠前列腺组织形态学的病理改变，说明了本实验大鼠前列腺炎模型成功复制。

本实验通过马鞭草苷大、中、小剂量组大鼠的前列腺指数显著降低，列腺液中白细胞水平显著降低，卵磷脂小体密度评分显著增加，前列腺匀浆中IL-2、IL-1β、TNF-α水平显著或明显降低及前列腺Vv显著降低，显示马鞭草苷可较好地改善前列腺炎模型大鼠的前列腺炎症状。

按上述方法，经多次反复实验(12次)，均取得了相同或相近似的结果，这充分表明本发明的马鞭草提取物具有很好的治疗前列腺炎的功效，可有效用于制备治疗前列腺炎的药物，实现马鞭草提取物在制备治疗前列腺炎的药物中的应用，开拓了马鞭草的新用途，是治疗前列腺炎药物上的一大创造。

Claims (2)

1.一种马鞭草中提取的治疗前列腺炎的马鞭草提取物，其特征在于，该提取物是，取马鞭草药材，粉碎为粗粉，每次加粗粉8倍重量的质量浓度为80％的乙醇加热回流提取2次，每次2小时，合并提取液，过滤，减压浓缩至在50℃下相对密度为1.12-1.15的浓缩液，加入浓缩液4倍体积量的蒸馏水分散均匀，冷藏静置后过滤，取上清液通过HP-20型大孔吸附树脂柱，先用4倍柱体积的蒸馏水洗脱，再用4倍柱体积的质量浓度为20％的乙醇洗脱，弃去洗脱液，继用8倍柱体积的质量浓度为80％的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩干燥，粉碎成细粉得含马鞭草苷50％以上的马鞭草提取物。

2.如权利要求1所述的马鞭草提取物在制备治疗前列腺炎药物中的应用。