CN104804077B - 胸腺肽的制备提取方法及其用药安全的产物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了制备胸腺肽的方法，其包括加入缓冲溶液、破碎细胞、加热处理、离心后超滤，纳滤，以及检测并保留不含峰2所对应的成份的产物。该方法制备的胸腺肽的用药安全性进一步提高。另外，本发明还提供了通过该方法制备的胸腺肽及其制剂和应用等。
Description
技术领域
本发明属于多肽/蛋白质技术领域，具体而言，本发明涉及胸腺肽的提取方法，其改进了现有的提取方法，所获得的胸腺肽产物更加安全，减少了用药的不良反应的发生。
背景技术
胸腺是人体的重要免疫器官，其能分泌多种重要的激素，如促胸腺生成素、胸腺肽等。其中，胸腺肽(又名胸腺素，thymosin)是胸腺组织分泌的具有生理活性的一组多肽(组合物)，可以从牛、猪的胸腺里面提取得到，例如，可通过本发明人早期发明的提取方法来提取(参见中国专利第02117757号)。然而，提取的胸腺肽成份复杂，尽管各种肽成份可以起到协同作用或补偿作用，功效更能得到保证，但是发生不良反应的潜在可能性也更大。
为此，近10年来，人们主要通过基因工程手段来获得成份单一的胸腺肽(化合物)，例如α-胸腺肽、胸腺五肽或它们的衍生物等。通过提取方法获得胸腺肽(组合物)的思路已经逐渐边缘化了，连进行相应研究的兴趣也基本没有了。
甚至实际上本发明人也没有免俗，中国专利第02117757号后再开发的技术也基本涉及通过基因工程手段来获得成份单一的胸腺肽(化合物)。然而，本发明人并没有完全受现有技术发展趋势的左右，在长期严谨的实践所不懈积累的数据中偶然发现了一些与提取的胸腺肽的不良反应发生有关联的端倪，经过艰苦的研究，在提取的胸腺肽的众多成份中发现了一种会增加不良反应发生率的成份，因而摸索出了新的胸腺肽的提取方法，使通过其提取的胸腺肽能大幅降低不良反应发生率，在当前公众和药监部门日益重视药品安全性的情况下，是十分有益的。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的胸腺肽的提取方法。另外，本发明还提供了通过该方法提取的胸腺肽及其应用等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了制备胸腺肽的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)对新鲜的胸腺加入pH2.0-4.0的缓冲溶液，以抑制酶活性；
(2)对胸腺组织缓冲溶液进行处理以破碎细胞(优选在10℃以下用超声波、匀质机或超细技术进行处理)；
(3)任选在5-15分钟内将破碎细胞提取的产物用微波加热至70-85℃(优选80℃)并然后迅速冷却(优选冷却至10℃以下)；
(4)冷冻离心得离心液，经截留分子量为6000-10000的超滤柱进行超滤；
(5)应用纳滤技术，将超滤液浓缩(优选浓缩5-15倍)，得浓缩产物；和，
(6)检测并保留不含峰2所对应的成份的浓缩产物，其中，峰2是HPLC图谱上47-49min处(优选约47.8min处，如47.8min处)的峰。
在本文中，胸腺肽也称提取的胸腺肽，指的是从动物中提取的天然胸腺肽，其通常是从动物(如猪、牛、羊等哺乳动物)的胸腺提取的。优选在本发明第一方面的方法中，胸腺是牛胸腺(如，小牛胸腺、胎牛胸腺)、羊胸腺和/或猪胸腺。
通过精细的纯化过程，可以直接去除浓缩产物中的峰2所对应的成份，然而优选在本发明第一方面的方法中，检测是取样并进行HPLC检测，然后再保留不含峰2所对应的成份的浓缩产物的批次。
在本发明的具体实施方式中，HPLC检测的条件是以磷酸盐溶液为流动相，以每分钟0.6ml的流速，以色氨酸为内标，并且以260nm波长为检测波长。
另外，本发明第一方面的方法可以包括弃去含峰2所对应的成份的浓缩产物的步骤。
在第二方面，本发明提供了提取的胸腺肽，其不含峰2所对应的成份的浓缩产物，其中，峰2是HPLC图谱上47-49min处(优选约47.8min处)的峰。经本发明人研究发现，峰2所对应的成份会带来潜在的注射用药安全性隐患，尽管仍旧达到目前的用药标准，但是如果去掉，将有益于公众的用药安全，减少医疗纠纷，是值得推广的。
优选本发明第二方面的胸腺肽是通过本发明第一方面的方法制备的。
在第三方面，本发明提供了一种药物制剂，其包括本发明第二方面的胸腺肽和药学上可接受的辅剂。药学上可接受的辅剂包括药学上可接受的各种辅料、载体，有赋形剂、稀释剂、填充剂、吸收促进剂、酶抑制剂、崩解剂、润滑剂、润湿剂和/或粘合剂等，它们与活性成分相容。通过药学教科书或试验手册，运用药学上可接受的辅剂制备常规的药物制剂对本领域普通技术人员来说是熟知的。本发明的药物制剂包含本发明第二方面的胸腺肽作为活性成分，将该胸腺肽和药学上可接受的辅剂组合在一起，配制成各种制剂，优选为固体制剂和液体制剂。本发明的制剂可以为单位剂量形式，如片剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释释放形式)、粉剂、混悬剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂、乳液剂、悬浮液、针剂、粉针剂(包括冻干粉针剂)、等剂型以及各种缓释剂型，从而适合各种给药形式，例如口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等的给药形式。本发明优选的是注射剂，包括注射液或注射用冻干粉。例如，可以选用生理盐水与第二方面的胸腺肽配制成注射液。
在第四方面，本发明提供了本发明第二方面所述的胸腺肽在制备用于慢性肝炎、病毒性肝炎、肝硬化、原发性或继发性T淋巴细胞缺陷病、自身免疫性疾病、细胞免疫功能低下相关的疾病或肿瘤性疾病辅助性治疗的药物中的应用。给药的剂量和形式一般由医师根据患者的具体情况(如年龄、体重、性别、患病时间、身体状况等)确定。如以注射剂形式给药，以药物中的胸腺肽计，给药的剂量为1-50mg胸腺肽/每名成人患者。给药形式根据各种药物制剂的剂型来确定，适合的给药形式有口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等给药形式，本发明优选注射的给药形式。
在第五方面，本发明提供了检测本发明第二方面所述的胸腺肽的方法，其包括将待测的胸腺肽进行HPLC检测并判断HPLC图谱上是否存在47-49min处(优选约47.8min处)的峰，其中HPLC检测的条件是以磷酸盐溶液为流动相，以每分钟0.6ml的流速，以色氨酸为内标，并且以260nm波长为检测波长。该方法能够在取样量很少的情况下，快速检测出待测的胸腺肽是否是本发明第二方面所述的胸腺肽，从而可以判断待测的胸腺肽所属批次的胸腺肽是否是本发明第二方面所述的胸腺肽。
本发明取得的有益效果在于：进一步提高了胸腺肽用药的安全性，在当前公众和药监部门日益重视药品安全性的情况下，是特别值得推广的；对原有的(提取)制备方法的改动小，增加的制备时间和设备少，还可以沿用原有生产设备。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多修改对所属领域技术人员来说都是显而易见了。
另外，本发明引用了现有公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文之中，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
附图说明
图1显示了本发明提取的合格胸腺肽的示例性的HPLC图谱，其是由多批次合格的胸腺肽的HPLC图谱重叠而成的。为了保持可见性，叠加在后的曲线做了一定的坐标偏移，但是在各自的峰2位置上没有可检测的峰。其中，从图上左侧开始由下至上依次为批次1至批次9。
图2显示了不合格胸腺肽的示例性的HPLC图谱，其是由多批次不合格的胸腺肽的HPLC图谱重叠而成的。为了保持可见性，叠加在后的曲线做了一定的坐标偏移，在各自的峰2位置上均检测到了明显的峰。其中，从图上左侧开始由下至上依次为批次1至批次9。
具体实施方式
本发明以下将提供具体的实施例，其中有未详尽之处可以参考多肽/蛋白质领域的教科书、试验手册等的内容，尤其是中国专利第02117757号。
实施例一、本发明的胸腺肽的制备
最初步骤参照中国专利第02117757号所述的方法进行制备。示例性的制备方法为：取1kg新鲜胸腺，加pH3.2的0.05M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液2000ml，在4℃以下用超声破碎3分钟×3次检查无完整细胞，提取胸腺肽并搅拌15分钟，用微波加热至80℃(5分钟)，迅速用冰盐水冷却至10℃以下，冷冻离心，得离心液2500ml，用截留分子量为10000的超滤柱进行超滤，滤液再经纳滤浓缩至300ml，即为胸腺肽粗产物。以上各批次新鲜胸腺分别为不同来源的胸腺，包括不同时间来自于东北、山东、内蒙的小牛胸腺、猪胸腺。
然后对胸腺肽粗产物分别取样，上样于Waters1525-2487型高效液相色谱仪(可购自Waters公司，其中凝胶色谱柱为WatersUltrahydrogelTM250，7.8×300mm，5μm)，以磷酸盐溶液(配方为：3.6g/L十二水合磷酸氢二钠，1.5g/L磷酸二氢钠，23.4g/L氯化钠)为流动相，以每分钟0.6ml的流速，以色氨酸为内标，以260nm波长为检测波长，进行检测，得HPLC图谱，将不同批次获得的图谱归类重叠后分别参见图1和图2，其中，图1所对应的批次在色氨酸相对保留时间的1.49倍处(即约47.8min处)均没有特异峰(峰2)出现；图2所对应的批次在色氨酸相对保留时间的1.49倍处(即约47.8min处)均有一个特异峰(峰2)出现。峰2是否出现，与胸腺的来源没有可归纳的关联性，带有一定的随机性，因此可能与胸腺的储存和/或运输情况有关，而并不直接关联于其来源，其中峰2出现的批次占2003年～2011年总批次的17.4％。
根据下文的结果，保留HPLC检测中没有峰2的相应批次的胸腺肽粗产物，即为本发明的胸腺肽；弃去HPLC检测中存在峰2的相应批次的胸腺肽粗产物。
实施例二、不同产物的药效学试验
按照常规的氢化可的松造模的方法，检测不同批次胸腺肽对小鼠E花环形成率的影响，在不考虑HPLC检测中是否有峰2的情况下，按照实施例一制备出的HPLC检测中没有峰2的相应批次的胸腺肽粗产物的E花环形成率为12.18±0.31％，而按照实施例一制备出的HPLC检测中存在峰2的相应批次的胸腺肽粗产物的E花环形成率为12.05±0.37％，两者效果基本一致，没有显著的区别。这表明，在胸腺肽中是否存在峰2所对应的成份，对胸腺肽发挥药效没有影响。
实施例三、不同产物的安全性结果
按照实施例一制备出的胸腺肽，无论是否存在峰2所对应的成份，其注射剂均能通过目前CFDA的安全性测试。
然而，根据我公司销售人员对使用单位(医院)的长期反馈统计，在2003年～2011年期间，在使用按照实施例一制备出的胸腺肽的注射剂后发生的不良反应(包括恶心、呕吐、腹泻、口唇和/或皮肤紫绀、面色苍白、呼吸急促、骨和/或肌肉疼痛、疱疹和/或皮疹、发热头痛等症状)的情况，有39.2％是使用经HPLC检测没有峰2的相应批次的，有60.8％是使用经HPLC检测存在峰2的相应批次的。考虑到峰2出现的批次仅仅占总批次的17.4％，HPLC检测中存在峰2的相应批次的胸腺肽粗产物导致不良反应的可能性是HPLC检测中没有峰2的相应批次的胸腺肽粗产物的7倍以上，因此，完整采取诸如实施例一的提取方法，实施检测并仅仅保留本发明的胸腺肽，可以大幅降低不良反应的发生率。
在2012年～2014年期间，完整采取诸如实施例一的提取方法，实施检测并仅仅保留本发明的胸腺肽，使用单位(医院)对不良反应的反馈率下降了78％，表明HPLC检测的峰2所对应的成份可能会为胸腺肽注射剂的用药安全性带来一定隐患，尽管能通过目前CFDA的安全性测试，但是在制备胸腺肽的过程中仍旧应当通过适当的过程予以去除。
Claims (18)
1.制备胸腺肽的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)对新鲜的胸腺加入pH2.0-4.0的缓冲溶液，以抑制酶活性；
(2)对胸腺组织缓冲溶液进行处理以破碎细胞；
(3)任选在5-15分钟内将破碎细胞提取的产物用微波加热至70-85℃并然后迅速冷却；
(4)冷冻离心得离心液，经截留分子量为6000-10000的超滤柱进行超滤；
(5)应用纳滤技术，将超滤液浓缩，得浓缩产物；和，
(6)检测并保留不含峰2所对应的成份的浓缩产物，其中，峰2是HPLC图谱上47-49min处的峰。
2.权利要求1所述的方法，其中破碎细胞在10℃以下用超声波、匀质机或超细技术进行。
3.权利要求1所述的方法，其中用微波加热至80℃。
4.权利要求1所述的方法，其中迅速冷却至10℃以下。
5.权利要求1所述的方法，其中将超滤液浓缩5-15倍。
6.权利要求1所述的方法，其中峰2是HPLC图谱上47.8min处的峰。
7.权利要求1所述的方法，其中胸腺是牛胸腺、羊胸腺和/或猪胸腺。
8.权利要求7所述的方法，其中牛胸腺是小牛胸腺或胎牛胸腺。
9.权利要求1所述的方法，其中检测是取样并进行HPLC检测。
10.权利要求9所述的方法，其中HPLC检测的条件是以磷酸盐溶液为流动相，以每分钟0.6ml的流速，以色氨酸为内标，并且以260nm波长为检测波长。
11.权利要求1所述的方法，其包括弃去含峰2所对应的成份的浓缩产物的步骤。
12.提取的胸腺肽，其通过权利要求1-11之一所述的方法制备，其不含峰2所对应的成份的浓缩产物，其中，峰2是HPLC图谱上47-49min处的峰。
13.权利要求12所述的胸腺肽，其中峰2是HPLC图谱上47.8min处的峰。
14.药物制剂，其包括权利要求12或13所述的胸腺肽和药学上可接受的辅剂。
15.权利要求14所述的药物制剂，其是注射剂。
16.权利要求12或13所述的胸腺肽在制备用于预防和/或治疗慢性肝炎、病毒性肝炎、肝硬化、原发性或继发性T淋巴细胞缺陷病、自身免疫性疾病、细胞免疫功能低下相关的疾病或肿瘤性疾病辅助性治疗的药物中的应用。
17.检测权利要求12或13所述的胸腺肽的方法，其包括将待测的胸腺肽进行HPLC检测并判断HPLC图谱上是否存在47-49min处的峰，其中HPLC检测的条件是以磷酸盐溶液为流动相，以每分钟0.6ml的流速，以色氨酸为内标，并且以260nm波长为检测波长。
18.权利要求17所述的方法，其中判断HPLC图谱上是否存在47.8min处的峰。
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