CN104797563B - 合成富马酸乙酯的方法及其作为中间体的用途 - Google Patents

合成富马酸乙酯的方法及其作为中间体的用途 Download PDF

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Abstract

公开的实施方案涉及合成活化富马酸酯中间体的改进方法及其在化学合成中的用途。公开的实施方案描述合成活化富马酸酯，包括从活化基团衍生的那些酯，活化基团包括：4‑硝基苯基、二苯基磷酰基叠氮、新戊酰氯、氯磺酰异氰酸酯、对硝基苯酚、MEF、三氟乙酰基和氯，活化富马酸酯如富马酸单乙酯酰氯，随后原位使用活化酯。其它实施方案描述从未分离和未纯化中间体改进合成经取代的氨基烷基‑二酮基哌嗪，允许提高收率和反应器产量。

Description

合成富马酸乙酯的方法及其作为中间体的用途
相关申请交叉引用
本临时专利申请不对任何先前提交要求优先权。
技术领域
本发明涉及用于递送活性剂的组合物，特别是生物活性剂。公开的实施方案属于化学合成领域，更具体地讲，涉及制备富马酸4-硝基苯酯乙酯的改进合成方法及其作为化学中间体的用途。
背景
在对患者的活性剂给药中，药物递送是个持续存在的问题。递送活性剂的常规方法通常严重受生物、化学和物理屏障限制。一般这些屏障由通过其发生递送的环境、递送的靶环境或靶本身所形成。
生物活性剂特别易受这些屏障影响。例如，在药理剂和治疗剂递送到人时，身体形成屏障。物理屏障的实例是在达到靶前必须穿过的皮肤和各种器官膜。化学屏障包括但不限于pH变化、脂双层和降解酶。
在口腔递送系统的设计中，这些屏障特别重要。很多生物活性剂的口腔递送是对于动物给药选择的途径，如果不是对于生物、化学和物理屏障，例如在胃肠(GI)道中不同的pH、强效消化酶和活性剂不可渗透的胃肠膜。在一般不适用于口服的很多剂中有生物活性肽，例如降钙素和胰岛素；多糖，特别是粘多糖，包括但不限于肝素；类肝素；抗生素；和其它有机物质。在胃肠道中通过酸水解、酶等使这些剂快速无效或被破坏。
口服易受影响的药理剂的早前方法依赖辅助剂辅助给药(例如，间苯二酚和非离子表面活性剂，例如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚)以人工增加肠壁的穿透性；和酶抑制剂辅助给药(例如，胰蛋白酶抑制剂、氟磷酸二异丙酯(DFF)和特斯乐)以抑制酶降解。
脂质体已被描述为用于胰岛素和肝素的药物递送系统。参见例如美国专利4,239,754；Patel等(1976), FEBS Letters, 62卷, 60页；和Hashimoto等(1979),Endocrinology Japan, 26卷, 337页。
然而，药物递送系统的宽范围使用被排除，因为：(1)系统需要毒性量辅助剂或抑制剂；(2)适合的低分子量载运物(cargos) (即，活性剂)不可得到；(3)系统显示不良的稳定性和不足的保存期限；(4)系统难以制备；(5)系统不能保护活性剂(载运物)；(6)系统不利地改变活性剂；或(7)系统不能允许或促进活性剂吸收。
更近来，已用混合氨基酸的人工聚合物(类蛋白质)微球递送药物。例如，美国专利4,925,673描述包含类蛋白质微球载体的药物及其制备方法和用途。这些类蛋白质微球可用于递送多种活性剂。
在本领域仍需要容易制备且可递送宽范围活性剂的简单、廉价的递送系统。已显示有希望的一类递送系统为二酮基哌嗪(DKP)。具体地讲，3,6-双取代-2,5-二酮基哌嗪已显示有效将生物活性剂递送到肺的全身循环
根据DKP和给药途径，DKP分子可能需要取代和/或修饰结合到二酮基哌嗪环的侧链，以优化现有用于递送途径的赋形剂的分布。这样的一种基团包括具有经取代的氨基烷基的二酮基哌嗪，或者称为3,6-氨基烷基-2,5-二酮基哌嗪。取代侧链氨基通常包括与亲电子试剂反应。选择适合的亲电子试剂涉及很多因素，例如商业可得性，是否适合大规模生产，或是否难以分离用于随后与氨基烷基-二酮基哌嗪反应。
富马酰侧链引入到例如3,6-氨基烷基-2,5-二酮基哌嗪上作为赋形剂已证明特别有利。然而，引入这种富马酰部分需要相当多的合成工作。用于DKP官能化的一种选项利用以下事实：氨基烷基可用作亲核试剂进一步修饰二酮基哌嗪赋形剂。富马酸单乙酯酰氯(EFC)是已知并且可以购得的，然而，缺点是制药规模地使用酰氯。一些缺点包括有限的反应性、纯度、可能在商业可得性方面积压等。因此，增加亲电子位点的反应性可能有利。实现这一点的方式是通过富马酸乙酯的对硝基苯酚酯、富马酸4-硝基苯酯乙酯或其它活化富马酸乙酯。
另外，任何生产规模的化学品制造工作涉及相当大的成本和时间压力，包括赋形剂，例如前述二酮基哌嗪。因此，不仅需要具有最佳物理化学性质的赋形剂，而且需要那些化学物质的优化生产规模制造。这不仅应考虑原料和反应成本，而且应考虑反应器产量和合成目标分子花费的时间。使化学过程总收率达到最大的总体方法包括使沿化学途径的各中间体的收率和纯度达到最大。这经常要求在随后反应之前分离和纯化各中间体。通过采用这种方法，希望：a)防止来自各步骤的副产物和未反应原料与以后引入的中间体或原料相互作用；并且b)通过预先去除先前副产物、原料等，简化最终目标的纯化，从而通过减少由于可能进行的纯化损失的量而使最终目标收率达到最大。
概述
通过以下更详细描述的化合物和方法，满足现有技术的这些和其它未满足的需求。用经取代的3,6-氨基烷基-2,5-二酮基哌嗪作为药物赋形剂已显示大有希望。特别关注的是羧基取代的氨基烷基-二酮基哌嗪，例如由式I(R1=R2=COOR3)描述的那些化合物。
合成羧基取代的氨基烷基-二酮基哌嗪(R1=R2=RCOOH)可通过分离的氨基烷基-二酮基哌嗪(例如式2的化合物)或其盐(例如式2)进行。然后使胺与适合的亲电子试剂(例如，富马酸4-硝基苯酯乙酯3)反应，以得到经取代的氨基烷基-二酮基哌嗪(例如化合物4 R=Et)，取决于目标分子，然后可经过进一步官能化或去保护基，以得到经取代的氨基烷基-二酮基哌嗪(例如化合物4 R=H)。
通常，在多步化学合成中优化总收率的目标通过在随后反应之前分离和纯化各中间体分子达到。这种方法希望避免由以下导致的最终目标的损失：a)先前步骤的副产物与中间体或原料反应；和b)由于目标分子更复杂的分离和纯化的损失。
公开的实施方案提供通过使用原位产生的中间体合成经取代的二酮基哌嗪药物赋形剂的方法。实施方案提供与一般想法相反、比传统分离和纯化类型方法得到更高收率和反应器产量的结果。更具体地讲，实施方案显示原位且无需纯化地产生和使用富马酰中间体的方法，以及原位且无需分离或纯化地产生和使用氨基烷基-二酮基哌嗪的方法。
在一个实施方案中公开制备富马酸单乙酯(MEF)的活化酯的方法。其它实施方案涉及产生MEF的酐及其作为中间体的用途。其它实施方案涉及制备和原位使用MEF的活化酯。其它实施方案涉及通过产生4-硝基苯酚的反应性盐产生富马酸4-硝基苯酯乙酯。其它实施方案涉及从活化4-硝基苯基酯产生MEF的活化酯。在一个实施方案中，活化基团、剂或反应剂可选自多种反应剂，包括但不限于二苯基磷酰基叠氮、新戊酰氯、氯磺酰异氰酸酯、对硝基苯酚、MEF、三氟乙酰基和氯，例如富马酸单乙酯酰氯。
公开的实施方案包括合成MEF的活化酯的方法，所述方法包括：提供MEF的反应性亲电子衍生物；使醇与适合的碱反应，并产生醇盐，所述碱选自有机碱和无机金属碱；并使富马酸衍生物与钠盐在适合溶剂中反应。其它实施方案包括以下方法，其中：醇为4-硝基苯酚；碱为无机金属碱；碱为氢氧化钠；和其中盐为钠盐。
公开的实施方案包括合成MEF的活化酯的方法，所述方法包括：在第一反应混合物中，在适合溶剂中混合亲核醇和酸酐；加入质子清除剂；在第二反应混合物中，在适合溶剂中混合MEF和质子清除剂；并将第一混合物加到第二混合物。其它实施方案包括以下方法，其中：醇为在芳基环上具有吸电子取代基的苯酚；醇为4-硝基苯酚；质子清除剂为有机胺；和其中溶剂为极性有机溶剂。
公开的实施方案包括制备经取代氨基烷基-二酮基哌嗪的方法，所述方法包括：产生氨基烷基-二酮基哌嗪中间体；产生MEF的活化酯；使氨基烷基-二酮基哌嗪与活化酯反应；其中使富马酸乙酯的活化酯在不分离或纯化下原位反应。其它实施方案包括以下方法：其进一步在与活化酯反应之前使氨基烷基-二酮基哌嗪去保护的步骤；其中活化酯为4-硝基苯基酯；其中产生活化酯的步骤包括，产生MEF和另一种酸的混合酐，并使混合酐与醇反应，以产生MEF的活化酯；其中混合酐为三氟乙酰基-乙基-富马酸酯。
附图简述
当参考附图，将更好地理解本发明的示例性实施方案，其中相同的部分用相同的附图标记来标识，其中：
图1为显示用本文所述实施方案合成经取代的3,6-氨基烷基-2,5-二酮基哌嗪的方案。
图2显示一系列丙酮/水混合物的试验结果，探测所述混合物以确定部分A中体现的反应的最佳比。
图3为显示对硝基苯酚(p-NP)反应剂浓度对所得式4化合物品质的影响的图。
图4为显示在反应期间，部分A[与上相同]反应的pH控制的效果相对于无pH控制的图。
图5显示比较在环境温度相对于升温至50℃的反应温度从部分B产生的产物的品质的试验结果。
图6为显示对于二酮基哌嗪中间体的TFA去保护在改变丙酮/水比时得到的结果的图。
图7为描绘在TFA去保护步骤期间改变反应浓度时关于式4化合物特征的数据的图。
图8为描绘比较加入富马酸4-硝基苯酯乙酯对本文公开的反应实施方案得到的式4化合物品质的结果的图。
图9为描绘在生成式4化合物时用粗品或重结晶TFA-DKP得到的结果的图。
图10为比较用常规方法相对于用本文所述原位方法得到的式4化合物的总体品质的图。
图11为显示经取代的氨基烷基-二酮基哌嗪的合成实施方案的化学方案。
图12为显示制备活化MEF混合酐随后加到氨基烷基-二酮基哌嗪的化学方案。
图13a-f显示关于在不同条件下生成酐的数据的图表：(a)溶剂；(b)浓度；(c)TEA当量；(d)CSI当量；(e)CSI加入经历的时间；和(f)反应温度。
图14a-e显示关于在不同条件下生成经取代的氨基烷基-二酮基哌嗪的数据的图表：(a)碱；(b)溶剂；(c)THF/水比率；(d)反应时间/温度；(e)加入次序的影响。
图15显示通过MEF的活化磷酸酐产生4 (R=Et)的化学方案。
图16a-e显示在可变条件下图15中所示方案的数据的图表。
图17为显示产生MEF酐随后反应得到经取代的二酮基哌嗪的化学方案。
图18显示对用于产生MEF酐的可变条件的结果。
图19a-f显示对用于使MEF酐反应得到经取代的二酮基哌嗪的可变条件的结果。
图20为显示产生MEF酐随后反应得到经取代的二酮基哌嗪的化学方案。
图21a-d显示对用于产生MEF混合酐的可变条件的结果。
图22a-f显示对用于使MEF混合酐反应得到经取代的二酮基哌嗪的可变条件的结果。
图23显示用MEF混合酐产生经取代的二酮基哌嗪随后使MEF-部分酯皂化的化学方案。
图24a-g显示对用于合成皂化的经取代二酮基哌嗪的可变条件的结果。
图25显示在二酮基哌嗪原位去保护后用MEF混合酐产生经取代的二酮基哌嗪的化学方案。
图26显示在二酮基哌嗪原位去保护后用MEF混合酐产生经取代的二酮基哌嗪随后使酯部分皂化的化学方案。
图27为显示氨基烷基-二酮基哌嗪和EFC之间的反应，随后使乙基部分皂化的化学方案。
图28显示对用于沉淀图27中所示产物的4种酸的结果。
图29a-b显示对用于使EFC与氨基烷基-二酮基哌嗪偶联的可变条件的结果。
图30显示氨基烷基-二酮基哌嗪原位去保护随后与EFC偶联的化学方案。
详述
通常，在多步化学合成中优化总收率的目标通过在随后反应之前分离和纯化各中间体分子来实现。这种方法希望避免由以下导致的最终目标损失：a)先前步骤的副产物与中间体或原料反应；和b)由于目标分子更复杂的分离和纯化的损失。
公开的实施方案提供通过使用原位产生的中间体合成经取代的二酮基哌嗪药物赋形剂的方法。实施方案提供与一般想法相反、比传统分离和纯化类型方法得到更高收率和反应器产量的结果。更具体地讲，实施方案显示原位且无纯化地产生和使用富马酰中间体的方法，以及原位且无分离或纯化地产生和使用氨基烷基-二酮基哌嗪的方法。在本文公开的实施方案中，提供在简化的一步过程中合成活化MEF的方法。在一个实施方案中，活化基团、剂或反应剂可选自多种反应剂，包括但不限于二苯基磷酰基叠氮、新戊酰氯、氯磺酰异氰酸酯、对硝基苯酚、MEF、三氟乙酰基和氯，例如富马酸乙酯酰氯。在一个示例性实施方案中，使富马酸乙酯酰氯与包含吸电子部分的苯酚(例如，对硝基苯酚)反应，以生成MEF的活化酯，然后使酯原位用作亲电子试剂，以引入富马酰部分。在另一个方面，用反应性醇(例如4-硝基苯酚)的钠盐产生活化富马酸酯。这种酯也可原位用于偶联反应。
为了更好地理解，转向附图，图1显示产生酯取代的氨基烷基-二酮基哌嗪的方案。像这样的二酮基哌嗪的合成通常包括氨基烷基-二酮基哌嗪与活化酯偶联，带有两种倒数第二的中间体的后分离。公开的实施方案说明合成这种和类似的二酮基哌嗪得到提高的收率和反应器产量的改进方法。
实施例
富马酸乙酯酰氯和4-硝基苯酚偶联：向1L 4-颈圆底烧瓶加入11.20g(80.51mmol)4-硝基苯酚、90mL水和69mL丙酮。在氮下搅拌时，向反应加入90mL去离子水中12.80g(120.8mmol)碳酸钠的溶液。用加料漏斗将21mL丙酮中的富马酸乙酯酰氯(EFC)(17.0mL, d=1.16g/mL, 121mmol)加入到混合物。在EFC加入期间观察到25-33℃放热。在EFC加入进行时，反应混合物从黄色褪到无色。在EFC加入结束时，反应pH为7-7.5。在EFC加入完成后约15分钟，用450mL去离子水稀释反应。在27℃生成沉淀物。将混合物保持15分钟，然后分离固体，用去离子水(3x220mL)洗涤，并在50℃真空烘箱中干燥1小时。分析产物的重量百分数纯度。
在总共8个试验中评估EFC和4-硝基苯酚偶联产生富马酸4-硝基苯酯乙酯。在整个试验中保持碱和溶剂系统恒定，并改变反应和猝灭时间。在不提供时间用于EFC和4-硝基苯酚之间的反应时，产物收率似乎增加。然而，这可能是由于过量碳酸钠随产物分离，这些物质的低%重量纯度支持这种假说。15-60分钟反应时间得到良好的富马酸4-硝基苯酯乙酯收率和纯度(分别>96%重量和>94%重量)。类似地，15-45分钟猝灭时间得到良好的产物品质。
规模(mmol) 时间 猝灭时间 收率 %重量
14 45 30 97 96.22
14 60 45 96 96.28
36 15 15 99 98.55
36 15 15 97 90.08
36 0 15 101 87.5
36 30 15 122 87.94
36 0 30 112 82.85
81 15 15 96 94.94
富马酸乙酯酰氯和4-硝基苯酚偶联，随后连同去保护的DKP原位使用
部分A(原位生成富马酸4-硝基苯酯乙酯)：用磁力搅拌器、温度读出器/控制器和具有氮入口的加料漏斗装配1L 3-颈圆底烧瓶。使排出气体排到碱洗涤器，向烧瓶加入对硝基苯酚(9.18g, 0.066mol)和丙酮(10mL)。然后向反应混合物加入溶于水(25mL)的氢氧化钠(2.90g，0.073mol)。在氢氧化钠加入期间，观察到~15℃放热，反应混合物从澄清黄色溶液变成黄橙色悬浮体/浆料。加入完成后，使反应混合物冷却到20℃，通过加料漏斗经5-10分钟加入丙酮(10mL)中的EFC(8.78g, 0.054mol)。在EFC加入期间，观察到~15℃放热，反应混合物从橙色变成黄色，在加入后约20分钟观察到固体。在EFC加入结束时反应混合物的pH为7-8。在室温搅拌反应混合物1小时，随后加入另外的丙酮(30mL)，以溶解沉淀的022。
部分B(生成粗品4)：在250mL锥形瓶中，用丙酮(10mL)稀释水(25mL)中氢氧化钠(8.82g, 0.44mol)的溶液。向锥形瓶加入氨基烷基二酮基哌嗪(式1: R1=R2=H; n=3)。将中和的二酮基哌嗪溶液加到包含原位富马酸4-硝基苯酯乙酯的圆底烧瓶，将二酮基哌嗪烧瓶用水(5mL)洗入反应器。将反应混合物加热到50℃，保持温度1小时，冷却到~30℃，然后用水(50mL)猝灭。通过过滤收集所得固体，用水(2x100mL)和丙酮(2x100mL)洗涤，在50℃真空烘箱中干燥过夜。用HPLC TM5466分析固体。监测反应收率、%重量纯度和%面积纯度。
图2显示探测一系列丙酮/水混合物的结果，以确定部分A中所述反应(富马酸乙酯酰氯和对硝基苯酚之间的反应)的最佳比率。在水不存在下反应不良好进行。结果表明，1:1.25的丙酮/水比提供高收率和纯度平衡。这令人惊讶，因为水中的氢氧化钠是酯皂化的一般方法，但酯生成并保留用于以后的反应。
图3显示反应浓度对所得4的品质的结果的图。试验的中间条件(2.8mL溶剂/mmolp-NP)得到经取代的氨基烷基-二酮基哌嗪收率、纯度和反应器产量的良好平衡。在高浓度，反应器产量增加，但经取代的氨基烷基-二酮基哌嗪收率和纯度受损，在低浓度，%重量纯度略降低。试验的中间浓度得到每1L反应器空间约36g 4 (R=Et)，比常规反应产量好约30%。
图4显示在反应期间部分A反应的pH控制对比无pH控制的结果的图。在EFC加入期间反应pH控制在7.5时与不控制pH的试验相比，为得到4的收率或纯度的显著差异。
图5显示在环境温度对比升温至50℃的反应温度，从部分B制备的产物的品质的结果。结果表明，升高温度提供较佳品质。
这些研究表明，EFC和p-NP可组合成活化酯，然后用氢氧化钠作为碱用氨基烷基-二酮基哌嗪处理，以与已知方法(分离倒数第二中间体并且Na2CO3用于最终偶联)相当的收率和纯度并以较佳反应器产量生成粗品经取代氨基烷基-二酮基哌嗪。利用氢氧化钠的结果与用碳酸钠得到的那些结果相当。
原位TFA-DKP去保护，随后原位使用富马酸4-硝基苯酯乙酯：部分A(原位生成富马酸4-硝基苯酯乙酯)：用磁力搅拌器、温度读出器/控制器和具有氮入口的加料漏斗装配1L3-颈圆底烧瓶。使排出气体排到碱洗涤器，向烧瓶加入对硝基苯酚(9.18g, 0.066mol)和丙酮(10mL)。然后向反应混合物加入溶于水(25mL)的氢氧化钠(2.90g，0.073mol)。在氢氧化钠加入期间，观察到~15℃放热，反应混合物从澄清黄色溶液变成黄橙色悬浮体/浆料。加入完成后，使反应混合物冷却到20℃，通过加料漏斗经5-10分钟加入丙酮(10mL)中的EFC(8.78g, 0.054mol)。在EFC加入期间，观察到~15℃放热，反应混合物从黄橙色变成黄色悬浮体/浆料。在EFC加入结束时反应混合物的pH为7-8。在室温搅拌反应混合物1小时，随后加入另外的丙酮(15mL)，以溶解沉淀的富马酸4-硝基苯酯乙酯。
部分B(生成粗品4)：向250mL圆底烧瓶中加入受保护的二酮基哌嗪(式1, R1=R2=TFA; n=3, TFA-DKP)(9.68g, 0.022mol)和丙酮(25mL)。向TFA-DKP浆料/悬浮体加入溶于水(30mL)的氢氧化钠(2.16g, 0.054mol)。在室温搅拌混合物30分钟。将所得澄清黄色溶液加到包含原位富马酸4-硝基苯酯乙酯的烧瓶。将TFA-DKP烧瓶用水(10mL)洗入反应器。将反应混合物加热到45℃，保持温度1小时，冷却到~30℃，并用水(50mL)猝灭。通过过滤收集所得固体，用水(2x100mL)和丙酮(2x100mL)洗涤，在50℃真空烘箱中干燥过夜。用HPLCTM5466分析固体。监测反应收率、%重量纯度和%面积纯度。
图6显示呈现在对于酮基哌嗪中间体的TFA去保护改变丙酮/水比率时得到的结果的图。结果表明，TFA-DKP的1:1.12丙酮/水比率得到最高4(R=Et)的收率和纯度。
图7显示描绘在TFA去保护步骤期间改变反应浓度时4的品质的结果的图。试验的中间条件之一(7.95mL溶剂/mmol TFA-DKP)得到4(R=Et)的收率、纯度和反应器产量的最佳平衡。在较高浓度，反应器产量增加，但4(R=Et)%重量纯度受损，较低浓度得到相当的收率和纯度但较差的反应器产量。7.95mL溶剂/mol TFA-DKP的反应浓度得到~40g 4/1L反应器空间，比现有4(R=Et)的反应好约40%。
图8为比较加入富马酸4-硝基苯酯乙酯对所得4的品质的结果的图。结果表明，在增加加入量至高于2.5摩尔当量时，总品质没有显著提高。
图9为在生成4时用粗品或重结晶TFA-DKP得到的结果的图。结果表明，中间体TFA-DKP纯度对4品质具有可忽略的影响。
这些研究证明可用氢氧化钠作为碱使原位富马酸4-硝基苯酯乙酯与去保护的TFA-DKP偶联。与现有方法比较，在此研究中确定的最佳条件以相当的纯度但有较佳收率和反应器产量(40%或更高)得到4。
图10为比较用常规方法相对于用原位方法得到的4的总品质的图。从此图清楚地看到，原位方案产生较高品质的产物，并显著增加反应器产量。
下表显示来自富马酸4-硝基苯酯乙酯与氨基烷基-二酮基哌嗪偶联的结果。使用原位富马酸4-硝基苯酯乙酯，用EFC p-NP和TFA-DKP进行底部6个反应。
二酮基哌嗪摩尔数 碱 %收率(经校正) 来自1L烧瓶的质量
.053 Na2CO3 88.9 28
.085 Na2CO3 84 36.37
.022 NaOH 90 35.6
.022 NaOH 93 37
.028 NaOH 91 47
.022 NaOH 83 35.8
.028 NaOH 82 46
.028 NaOH 90 47
.028 NaOH 73 42
.028 NaOH 90 47
.028 NaOH 94 53.84
.028 NaOH 99 56.68
.022 NaOH 100 44
.022 NaOH 94 41.52
.022 NaOH 92 40.32
.028 NaOH 113 64.67
实施例4：对于偶联图11由MEF、TFAA和p-NP、NaOH实验制备4：部分A：用磁力搅拌器、温度读出器/控制器和具有氮接头的加料漏斗装配250mL 3-颈圆底烧瓶。使排出气体排到碱洗涤器。向烧瓶加入对硝基苯酚(p-NP, 10g)和三氟乙酸酐(TFAA, 16.61g, 11mL)，并启动搅拌。用三乙胺(TEA, 600µL)处理所得黄色浆料。在TEA加入后观察到~12℃放热。将溶液搅拌约30分钟(直至澄清，表明生成过程完成)。
部分B(原位生成富马酸4-硝基苯酯乙酯)：用磁力搅拌器、温度读出器/控制器、具氮接头的加料漏斗和回流冷凝器装配250mL 4-颈圆底烧瓶。向烧瓶加入富马酸单乙酯(MEF, 10.36g)和丙酮(9mL)。向烧瓶加入TEA(16.33mL)，在TEA加入后观察到~15℃放热。使所得澄清溶液冷却到20℃，并通过加料漏斗缓慢加入部分A溶液。使反应温度在加入时间内保持低于30℃。用丙酮(3mL)清洗部分A烧瓶，并将清洗液加到反应烧瓶。将反应混合物搅拌30分钟，同时保持温度在20-30℃之间。
部分C(生成粗品4(R=Et))：向250mL圆底烧瓶加入TFA-DKP(12.66g)和丙酮(25mL)。向TFA-DKP浆料加入溶于水(30mL)的氢氧化钠(2.83g)。在室温搅拌混合物约30分钟。将所得澄清黄色溶液加到包含原位富马酸4-硝基苯酯乙酯的烧瓶。将TFA-DKP烧瓶用水(10mL)洗入反应器，并向反应混合物加入另外的丙酮(23mL)和水(35mL)。将反应混合物加热到45℃，保持温度1小时，冷却到~30℃，用水(50mL)猝灭，并搅拌另外30分钟。通过过滤收集所得固体，用水(2x100mL)和丙酮(2x100mL)洗涤，在50℃真空烘箱中干燥过夜。用HPLCTM5466分析固体。监测反应收率、%重量纯度和%面积纯度。
首先从MEF和三氟乙酸对硝基苯酯产生原位富马酸4-硝基苯酯乙酯，然后与去保护的TFA-DKP (2)偶联。以63%收率和85%重量纯度得到所得的粗品4(R=Et)。试验的初始条件得到每1L反应器空间约~36g的4，比现有方法产量好约35%。
用THF代替丙酮得到较低产物收率，但纯度相当，在此样品中反式异构体含量增高。在原位富马酸4-硝基苯酯乙酯生成步骤中使用另外的TFAA不能提高4(R=Et)的收率或纯度。
样品ID TFAA当量 溶剂 %收率 g/1L烧瓶 %反式 %重量 %面积
D733-47A 1.1 丙酮 63 36.4 52.97 84.73 91.79
D733-47T 1.1 THF 38 21.56 71.45 84.62 88.15
D733-67 1.25 丙酮 23 13.22 59.31 56.17 51.25
从此表清楚地看到，原位产生和使用活化MEF得到优良的收率，更重要的是得到提高的产量。
实施例5：
用磁力搅拌器、温度读出器/控制器和具有氮入口的加料漏斗装配500mL 3-颈圆底烧瓶。使排出气体排到碱洗涤器。向烧瓶加入富马酸单乙酯(MEF, 5g)、无水二氯甲烷或THF(10mL)和三乙胺(TEA, 12mL)。在TEA加入期间观察到放热。使澄清反应混合物在冰浴中冷却到5℃。经20-30分钟加入10mL无水二氯甲烷中氯磺酰异氰酸酯(CSI, 4.96g)的溶液。加入完成后，使反应混合物保持低于10℃经3小时。对于使用DCM的反应，通过在真空中去除溶剂分离粗品MEF酐。对于用THF作为溶剂的反应，无进一步操作地使用MEF酐。
用磁力搅拌器、温度读出器/控制器和具有氮接头的加料漏斗装配500mL 3-颈圆底烧瓶。使排出气体排到碱洗涤器。向烧瓶加入2(5.47g)和水(80mL)中碳酸钠(8.90g)的溶液。使步骤1中得到的活化酐溶于THF(80mL)，并加入到烧瓶。在室温搅拌反应混合物过夜。通过过滤收集所得固体，用水(50mL)和丙酮(20mL)洗涤，并在50℃真空烘箱中干燥过夜。用HPLC TM5466分析固体。监测反应收率、%重量纯度和%面积纯度。通过用收率乘以%重量纯度计算分析校正的收率。
图12显示产生活化MEF酐随后与二酮基哌嗪反应的化学方案。
图13a-f显示在不同条件下生成MEF酐的结果。探测溶剂、反应浓度、TEA和CSI的量、加入时间和加入温度。图13a表明THF以比DCM更高的%重量纯度和相当的分析校正收率得到MEF活化酐。其它试验参数(图13b-f)不影响分析校正收率或%面积纯度。
图14a-e显示使用CSI-MEF酐和氨基烷基-二酮基哌嗪的结果。用THF作为溶剂原位生成MEF活化酐，然后加入到2的碱性溶液，以产生4(R=Et)。
评价三种碱：三乙胺、碳酸钠和氢氧化钠，结果显示于图14a中。氢氧化钠以比碳酸钠更高的分析校正收率产生4(R=Et)，三乙胺不适用于此反应，因为在72小时反应时间后得不到物质。
评价三种溶剂：THF、DCM和丙酮，结果显示于图14b中。THF以比其它试验溶剂更高的分析校正收率和纯度得到4(R=Et)。另外探测数种不同的水/THF混合物，因为在水不存在下反应不良好进行。然而，加水似乎不提高收率或产物品质(图14c)。
也探测不同的反应时间和温度组合。高反应温度得到很少4，在室温，随着时间增加到18小时，分析校正收率增加(图14d)。
图15显示产生活化MEF酐随后与二酮基哌嗪反应的化学方案。
实施例：用活化MEF磷酸酐制备4(R=Et)
用磁力搅拌器、温度读出器/控制器和具有氮接头的加料漏斗装配500mL 3-颈圆底烧瓶。使排出气体排到碱洗涤器。向烧瓶加入富马酸单乙酯(MEF, 5g)、THF(15mL)和三乙胺(TEA, 10mL)。在TEA加入期间观察到放热。向反应混合物加入二苯基磷酰基叠氮(DPPA,9mL)，然后随即加入碳酸钠(18.23g)和水(60mL)的溶液中溶解的2溶液(28.21g)。将包含016的烧瓶用水(10mL)洗入反应混合物。在室温搅拌反应混合物过夜。通过过滤收集所得固体，用水(2x100mL)和丙酮(2x50mL)洗涤，在50℃真空烘箱中干燥过夜。用HPLC TM5466分析固体。
通过活化MEF磷酸酐合成4(R=Et)的参数筛选
图16a显示THF以比其它试验溶剂更高的%重量纯度和分析校正收率得到4(R=Et)。用THF作为溶剂用于其它研究。也评价碱(碳酸钠相对于氢氧化钠)的作用。图16b显示氢氧化钠以更高的%重量纯度(80%)得到4(R=Et)，然而，碳酸钠得到更高的分析校正收率。不考虑图16c和d中使用的碱，%重量纯度和分析校正收率二者均随增加时间而提高。图16e显示，与由2的乙酸溶液制备的4(R=Et)比较，使用固体形式的2显著提高4(R=Et)的%重量纯度。
图17显示产生二聚MEF酐随后与氨基烷基-二酮基哌嗪反应的化学方案。
实施例：制备二聚MEF酐
用磁力搅拌器、温度读出器/控制器和具有氮入口的加料漏斗装配500mL 3-颈圆底烧瓶。使排出气体排到碱洗涤器。向烧瓶加入富马酸单乙酯(MEF, 20g)、无水二氯甲烷(DCM, 25mL)和无水三乙胺(TEA, 20mL)。在TEA加入期间观察到放热。使澄清反应混合物在干冰/丙酮浴中冷却到-25℃。经15-20分钟加入10mL无水二氯甲烷中氯磺酰异氰酸酯(CSI,9.8g, 6.1mL)的溶液。使反应混合物温度在加入期间保持低于0℃。加入完成后，使反应混合物保持低于10℃经6小时。向反应烧瓶加水(200mL)。使层分离，水相用二氯甲烷(2x200mL)萃取。将有机相合并，经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。以94%收率得到所得二聚MEF酐，无进一步纯化地使用。
用力磁搅拌器、温度读出器/控制器和具有氮接头的加料漏斗装配500mL 3-颈圆底烧瓶。使排出气体排到碱洗涤器。向烧瓶加入固体2(5.47g)和碳酸钠(8.80g)在水(60mL)中的溶液。也加入THF(20mL)，并搅拌混合物，直至得到澄清溶液。使二聚MEF酐(8.97g)溶于THF(32mL)，并通过加料漏斗经10-15分钟加入到反应烧瓶。在室温搅拌反应混合物6小时。
用水(50mL)猝灭反应混合物，并继续搅拌另外45分钟。通过过滤收集所得固体，用水(2x50mL)和丙酮(50mL)洗涤，并在50℃真空烘箱中干燥过夜。用HPLC TM5466分析固体。
图18a-d显示在改变数种条件时合成二聚MEF酐的结果。探测溶剂(a)、CSI加入温度(b)、CSI加入后保持温度(c)和反应时间(d)。DCM似乎与THF相比提供极佳的结果。
图18b显示CSI加入温度的影响。CSI加入在5℃开始，在整个加入期间反应温度保持低于20℃，且CSI加入在-25℃开始，在整个加入期间反应温度保持低于0℃。用于二聚MEF酐制备的温度条件不影响4的收率和纯度。
也探测CSI加入后的反应保持温度(图18c)。结果表明，较低保持温度以较佳收率与相当的纯度得到4。在图18d中探测不同的反应时间。试验的中间条件(6小时搅拌)得到4的收率和纯度的良好平衡。短反应时间(即，3小时)不足以使反应完成，但延长时间(即，17小时)使产物降解。
总而言之，结果表明，二聚MEF酐制备所用的最佳条件包括用DCM作为溶剂，在CSI加入期间保持低温，和在CSI加入后保持6小时。因此，这些条件用于进一步评价。
对于4的生成筛选的参数
用以上条件生成二聚MEF酐，然后转化成4。评价不同偶联条件的影响，结果显示于图19a-f中。条件变量包括碱选择，(a)溶剂；(b)溶剂-水比率；反应温度和反应时间(c)和(d)；Na2CO3加入量(e)；胺的固体或液体形式的使用(f)。
图19a显示评价五种溶剂的结果：THF、丙酮、DCM、乙酸乙酯(EtOAc)和乙腈(ACN)。THF以比其它试验溶剂更高的收率和纯度得到4。另外探测数种不同的水/THF混合物(图19b)，因为在水不存在下反应不良好进行。结果表明，使用1:1的THF/水比率时，4(R=Et)的纯度达到最大限度。也用两种碱(碳酸钠和氢氧化钠)探测不同的反应时间和温度组合。使用Na2CO3在室温3-6小时的反应时间以90%收率与88%重量纯度得到4(R=Et)(图19c)。在用NaOH作为碱时，反应时间或温度均不影响4(R=Et)的收率和纯度，但与Na2CO3相比收率较低(图19d)。总而言之，使用固体2，在此研究期间得到的最高4(R=Et)收率为~91%，并具有90%重量纯度。用2作为乙酸水溶液以良好的收率(90%)得到2，但具有低纯度(51%)。
实施例：制备MEF混合酐
用磁力搅拌器、温度读出器/控制器和具有氮入口的加料漏斗装配1L 4-颈圆底烧瓶。使排出气体排到碱洗涤器。向烧瓶加入富马酸单乙酯(MEF, 30g)、二氯甲烷(DCM)或四氢呋喃(THF)(200mL)和三乙胺(TEA, 45mL)。在TEA加入期间观察到放热。使澄清反应混合物在干冰/丙酮浴中冷却到-25℃。经15-20分钟加入在20mL DCM或THF中的新戊酰氯(39.2g, 40mL)溶液。使反应温度在加入期间保持低于-10℃。加入完成后，使反应混合物缓慢达到室温，并搅拌2小时。所得固体通过硅藻土过滤去除。滤饼用DCM或THF(2x100mL)和丙酮(50mL)洗涤。将滤液在真空中浓缩，以96%收率得到MEF混合酐。不经进一步纯化使用此物质。
用力磁搅拌器、温度读出器/控制器和具有氮接头的加料漏斗装配500mL 3-颈圆底烧瓶。使排出气体排到碱洗涤器。向烧瓶加入固体2(5g)和碳酸钠(8.72g)在水(60mL)中的溶液。也加入THF(20mL)，并搅拌溶液，直至澄清。使MEF混合酐(8g)溶于THF(25mL)，并通过加料漏斗经5-10分钟加入到反应烧瓶。将反应混合物在室温搅拌3小时，然后用水(100mL)猝灭，并搅拌另外30分钟。通过过滤收集所得固体，用水(2x80mL)和丙酮(2x80mL)洗涤，并在50℃真空烘箱中干燥过夜。用HPLC TM5466分析固体。监测反应收率、%重量纯度和%面积纯度。
图20显示产生MEF混合酐随后反应得到经取代的二酮基哌嗪的化学方案。
图21a-d显示用于总体上根据图20产生的MEF混合酐的可变条件和对4(R=Et)的影响的结果。探测(a)溶剂、(b)新戊酰氯加入温度、(c)新戊酰氯加入后保持温度和(d)反应时间。探测新戊酰氯加入温度、保持温度和时间的不同组合。结果表明，试验的所有条件以相当的收率和纯度得到4(R=Et)。
对于生成4(R=Et)筛选的参数
用上述条件生成MEF混合酐，然后转化成4(R=Et)。图22a-f 显示评价不同偶联条件的结果，包括碱选择、溶剂、反应温度和反应时间。评价三种溶剂：THF、丙酮和乙腈(ACN)。THF以比其它试验溶剂更佳的纯度得到4(R=Et)(图22a)。也用两种碱(碳酸钠和氢氧化钠)探测不同的反应时间和温度组合。使用Na2CO3在室温3小时反应时间以93%收率与89%重量纯度得到4(R=Et)(图22b)。在用NaOH作为碱时得到较低收率和纯度(图22c和d)。与使用作为固体的2比较，使用乙酸水溶液(2L)显著降低4(R=Et)收率和纯度(图22e)。用NaOH代替Na2CO3作为2L碱得到甚至更低的4(R=Et)收率，然而，与对2S观察到的结果不同，增加2L氢氧化钠加入量提高4(R=Et)收率和纯度(图22f对比22d)。
图23显示用MEF混合酐产生经取代的二酮基哌嗪随后使MEF部分酯皂化的化学方案。
用Na2CO3作为碱制备4(R=Et)
用磁力搅拌器、温度读出器/控制器和具有氮接头的加料漏斗装配500mL 3-颈圆底烧瓶。使排出气体排到碱洗涤器。向烧瓶加入固体2(5g)和碳酸钠(8.99g)在水(60mL)中的溶液。也加入THF(20mL)，并搅拌溶液，直至澄清。使MEF混合酐(8g)溶于THF(25mL)，并通过加料漏斗经5-10分钟加入到反应烧瓶。将反应混合物在室温搅拌3小时，以促进原位生成4(R=Et)。反应混合物用水(100mL)猝灭，并继续搅拌另外30分钟。向反应混合物加入甲醇(50mL)，并将反应混合物加热至回流。通过加料漏斗经5分钟向反应混合物加入水(50mL)中的氢氧化钠(5.45g)溶液。将混合物加热约10分钟(直至澄清，表明4(R=Et)皂化完成，得到4(R=H))，然后冷却到25℃。加入浓HCl(35mL)，并在室温搅拌反应混合物2小时。通过过滤收集所得固体，用水(2x80mL)和丙酮(2x80mL)洗涤，并在50℃真空烘箱中干燥过夜。用HPLCTM5478分析固体。监测反应收率、%重量纯度和%面积纯度。
用NaOH作为碱制备4
用磁力搅拌器、温度读出器/控制器和具有氮接头的加料漏斗装配500mL 3-颈圆底烧瓶。使排出气体排到碱洗涤器。向烧瓶加入固体2(5g)和氢氧化钠(0.65g)在水(60mL)中的溶液。也加入THF(20mL)，并搅拌混合物，直至澄清。使MEF混合酐1(8g)溶于THF(25mL)，并通过加料漏斗经5-10分钟加入到反应烧瓶。将反应混合物在室温搅拌30分钟，以促进原位生成4，然后用水(100mL)猝灭反应，并搅拌另外30分钟。
向反应混合物加入甲醇(50mL)，并将反应混合物加热至回流。通过加料漏斗经5分钟向反应混合物加入氢氧化钠(4.75g)在水(50mL)中的溶液。将混合物加热约10分钟(直至澄清，表明皂化完成，得到4(R=H))，然后冷却到25℃。加入浓HCl(20mL)，并在室温搅拌反应混合物2小时。通过过滤收集所得固体，用水(2x80mL)和丙酮(2x80mL)洗涤，并在50℃真空烘箱中干燥过夜。用HPLC TM5478分析固体。监测反应收率、%重量纯度和%面积纯度。
对于生成4(R=H)筛选的参数
在单一反应容器中，制备MEF混合酐1，原位转化成4(R=Et)，然后转化成4(R=H)。图24a-g显示不同的4(R=Et)偶联条件影响的结果，包括碱选择、反应温度和反应时间。用两种碱(碳酸钠和氢氧化钠)探测不同的反应时间和温度组合。使用Na2CO3在室温3小时的偶联反应时间随后用氢氧化钠皂化以89%收率和78%重量纯度得到4(R=H)，提高温度和减少时间降低4(R=H)的收率和纯度(图24a)。在用NaOH作为偶联碱时，利用在固定反应温度增加反应时间得到较低的4(R=H)收率和纯度，且利用在固定反应时间提高反应温度得到较低收率和纯度(图24b)。收率和纯度不受NaOH加入量影响(图24c)。在不用水猝灭反应时观察到收率略微降低(图24d)。从皂化反应去除甲醇不影响4(R=H)的收率或纯度(图24e)，然而，反应过滤在甲醇不存在下受损。与使用2固体比较，使用016乙酸水溶液(2L)降低4(R=H)收率和纯度(图24f)。用NaOH代替Na2CO3作为016L碱得到甚至更低的4(R=H)收率，然而，与对2S观察到的结果不同，增加2L氢氧化钠加入量提高4(R=H)收率和纯度(图24g对比图24c)。
图25显示在二酮基哌嗪原位去保护后用MEF混合酐产生经取代的二酮基哌嗪的化学方案。
用磁力搅拌器、温度读出器/控制器和具有氮接头的加料漏斗装配500mL 3-颈圆底烧瓶。使排出气体排到碱洗涤器。向烧瓶加入TFA-DKP(5g)、THF(30mL)和水(30mL)，并启动搅拌。加入氢氧化钠(1.20g)在水(30mL)中的溶液，并搅拌溶液约15分钟(直至澄清，表明TFA-DKP去保护完成)。使MEF混合酐1 (7.53g)溶于THF(30mL)，并通过加料漏斗经5-10分钟加入到反应烧瓶。将反应混合物在室温搅拌30分钟，然后用水(50mL)猝灭，并搅拌另外15分钟。加入丙酮(15mL)，并搅拌反应混合物另外15分钟。通过过滤收集所得固体，用水(2x70mL)和丙酮(3x70mL)洗涤，并在50℃真空烘箱中干燥过夜。用HPLC TM5466分析固体。监测反应收率、%重量纯度和%面积纯度。通过用收率乘以%重量纯度计算分析校正的收率。
样品ID %收率 %反式 %面积 %重量
D698-45 84 18.81 95.57 86.28
D698-47 86 27.74 95.28 85.15
表2. 从TFA-DKP/混合酐偶联得到的004的分析结果。
制备MEF混合酐，然后与经去保护的TFA-DKP偶联。以85%收率和86%重量纯度得到所得粗品4(R=Et)。反式异构体含量低，这是因为TFA-DKP原料只包含顺式异构体。溶剂筛选研究表明，THF和丙酮得到相当的分析校正收率。反式异构体含量随增加的反应浓度而增加，并且在用THF作为溶剂时最高。
图26显示在二酮基哌嗪原位去保护后用MEF混合酐产生经取代的二酮基哌嗪随后皂化酯部分的化学方案。
用磁力搅拌器、温度读出器/控制器和具有氮接头的加料漏斗装配500mL 3-颈圆底烧瓶。使排出气体排到碱洗涤器。向烧瓶加入TFA-DKP(5g)、THF(30mL)和水(30mL)，并启动搅拌。加入水(30mL)中氢氧化钠(1.20g)的溶液，并搅拌溶液约15分钟(直至澄清，表明TFA-DKP去保护完成)。使MEF混合酐1 (7.53g)溶于THF(30mL)，并通过加料漏斗经5-10分钟加入到反应烧瓶。将反应混合物在室温搅拌30分钟，以促进生成富马酰胺键，然后用水(50mL)猝灭，并搅拌另外15分钟。加入甲醇(50mL)，并搅拌反应混合物另外15分钟。将反应混合物加热到回流(~69℃)。通过加料漏斗经5分钟向反应混合物加入水(50mL)中的氢氧化钠(4.00g)。将混合物加热约10分钟(直至澄清，表明皂化完成)，冷却到25℃。
加入浓HCl (30mL)，并在室温搅拌反应混合物2小时。通过过滤收集所得固体，用水(2x80mL)和丙酮(2x80mL)洗涤，并在50℃真空烘箱中干燥过夜。用HPLC TM5478分析固体。监测反应收率、%重量纯度和%面积纯度。
在单一反应容器中合成MEF混合酐1，然后与去保护的TFA-DKP偶联，皂化，并沉淀。以~85%收率和~75%重量纯度得到所得粗品4(R=H)。用于制备混合酐的溶剂对粗品4(R=H)品质没有影响。
下表显示从TFA-DKP与MEF混合酐偶联得到的重结晶4(R=H)的数据。规范以蓝色显示。规范结果以外以红色显示。
评价在单一容器中MEF混合酐和TFA-DKP偶联，随后皂化并沉淀成粗品4(R=H)。以良好收率和纯度得到所得粗品4(R=H)。粗品4(R=H)重结晶以良好纯度(NLT 92%重量)得到物质。
下表显示在不同条件下富马酸乙酯酰氯和氨基烷基-二酮基哌嗪偶联的结果。
下表显示对于不同酰氯浓度、保持时间和洗涤的结果。
下表显示在不同条件下用氢氧化钠偶联的结果。
下表显示在偶联反应期间使用氢氧化钠的其它结果。
图27为显示氨基烷基-二酮基哌嗪和EFC之间反应随后皂化乙基部分的化学方案。
皂化程序：固定pH。向500mL 4-颈圆底烧瓶加入26.75g 18.68%的016溶液(5.00g016实际, 13.3mmol)和108mL水。然后向反应加入15mL 9.5M氢氧化钠。通过加料漏斗滴加125mL THF中4.6mL(33mmol, d=1.17) EFC的溶液，并保持所得混合物30分钟，以促进偶联反应。然后用10mL 9.5M氢氧化钠处理反应混合物，并加热到回流(67℃)皂化。在回流15小时后，使反应冷却到30℃，并加入15mL(~150mmol) ~10M HCl。将反应搅拌30分钟。通过过滤收集所得固体，用水(3x50mL)、甲醇(3x50mL)和丙酮(3x50mL)洗涤，并在50℃真空烘箱中干燥最少15小时。通过TM54782测定百分数纯度。
或者，试剂比与上述相同，但有以下例外。对于2/EFC 偶联，用9.5M氢氧化钠将反应调节到pH 11。对于皂化，加入另外的9.5M NaOH，以将溶液调节到预定的可变pH。产物沉淀如上所述进行。
评价4种酸(盐酸、硫酸、磷酸和乙酸)的4(R=H)沉淀。盐酸得到最佳产物收率和品质(图28)。返滴定用HCl沉淀的4(R=H)证明完全转化成二酸。图29显示对于图27的偶联反应的可变条件的结果。
图30显示氨基烷基-二酮基哌嗪原位去保护随后与EFC偶联的化学方案。
在无pH控制下制备4(R=Et)：
用磁力搅拌器、温度读出器/控制器和具有氮接头的加料漏斗装配500mL 3-颈圆底烧瓶。使排出气体排到碱洗涤器。向烧瓶加入TFA-DKP(9.68g, 0.022mol)和丙酮(10mL)，并启动搅拌。向TFA-DKP浆料加入溶于水(25mL)的氢氧化钠(5.18g, 0.13mol)。在氢氧化钠加入后观察到~13℃放热。在室温搅拌混合物约10分钟。所得澄清黄色溶液为pH 13。通过加料漏斗经5-10分钟向反应混合物加入溶于丙酮(10mL)的EFC(8.94g, 0.055mol)。在EFC加入期间，混合物pH降至约4，因此加入溶于水(10mL)的另外的氢氧化钠(1.1g, 0.028mol)，以使pH提高到约9。将混合物在室温搅拌约1小时，用水(50mL)猝灭，然后搅拌另外30分钟。通过过滤收集所得固体，用水(2x100mL)和丙酮(2x100mL)洗涤，在50℃真空烘箱中干燥过夜。用HPLC TM5466分析固体。监测反应收率和4(R=Et)的%面积和%重量纯度。
用pH控制制备4(R=Et)：
用磁力搅拌器、温度读出器/控制器、用于EFC加料的注射泵、pH探头和连接到加料的具有用于25% NaOH的转接器的虹吸管，装配500mL 4-颈圆底烧瓶，并启动搅拌。向TFA-DKP浆料加入溶于水(60mL)的氢氧化钠(4.32g, 0.11mol)。在氢氧化钠加入后观察到~14℃放热。在室温搅拌混合物约40分钟。所得澄清黄色溶液为pH 11.9。通过注射泵经20分钟向反应混合物加入丙酮中的EFC(18.38g, 0.11mol, 如上制备)。通过用加料泵加入25%NaOH，使溶液pH保持在8.5。在EFC加入结束时，反应pH为9.7，反应温度为50℃。将混合物在室温搅拌约30分钟，用水(100mL)猝灭，然后搅拌另外30分钟。通过过滤收集所得固体，用水(2x100mL)和丙酮(2x100mL)洗涤，在50℃真空烘箱中干燥过夜。用HPLC TM5466分析固体。监测反应收率、消耗的碱体积和4(R=Et)的%面积和%重量纯度。
进行去保护的TFA-DKP和EFC的偶联。在无pH控制下进行反应时，在EFC加入期间反应混合物变成酸性。需要另外的NaOH使pH提高到7-8，并驱使反应完成。在pH控制下进行偶联反应时，以80%收率和79.9%重量纯度得到粗品4(R=Et)。进行第二pH控制反应，并评价用纯EFC代替EFC/丙酮溶液。在此，在EFC加入结束时反应pH为4.4，尽管加入2.32摩尔当量NaOH(相对于EFC)。这些研究表明，pH控制的直接偶联去保护的TFA-DKP和EFC以比不使用pH控制条件更佳的收率和纯度得到粗品4(R=Et)。
在描述本发明的上下文中(尤其在以下权利要求的上下文中)使用的术语“一个”和“该”及类似提述，旨在解释为包括单数和复数二者，除非本文另外指明或与上下文明显抵触。
本文中数值范围的叙述只是旨在作为分别提及此范围内各单独值的简写方法。除非本文另外指明，各单独值如同单独在本文中叙述那样结合到本说明书中。本文所述的所有方法可以任何适合次序进行，除非本文另外指明或与上下文明显抵触。在本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“诸如”)的使用只是旨在更好地说明本发明，不构成对另外要求保护的本发明范围的限制。在本说明书中的语言不应解释为表示本发明实践必不可少的任何非要求保护的要素。
对本文公开的本发明的供选要素或实施方案分组不应解释为限制。各组成员可单独或与该组其它成员或本文中存在的其它要素组合来提述和要求保护。出于方便和/或可专利性的原因，预期可在一个组中包括或从一个组删除组内的一个或多个成员。在任何这样的包括或删除出现时，在本文中应认为说明书包含如此修改的组，从而满足在所附权利要求中使用的任何和所有马库什组的书面描述。
在本文中描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知实施本发明的最佳方式。当然，在阅读前述说明时，那些优选实施方案的变化对本领域的普通技术人员将变得显而易见。发明人预期技术人员适当利用这些变化，并且发明人预期本发明以其它方式实践，而不是本文具体描述的那样。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求中叙述主题的所有修改和等价物。另外，本发明包括上述要素的所有可能变化的任何组合，除非本文另外指明或与上下文明显抵触。另外，在整个本说明书中已引用多个专利和印刷出版物。每个以上引用的参考文献和印刷出版物均通过引用各自以全文结合到本文中。
最后，应了解，本文公开的本发明实施方案为本发明原理的说明。可利用的其它修改属于本发明的范围内。因此，作为举例而非限制，可根据本文教授利用本发明的供选结构。因此，本发明不限于明确显示和描述的。
已显示和描述本发明的实施方案，本领域的技术人员应了解，可进行很多变化和改进，以实现所述发明且仍在要求保护的本发明的范围内。另外，以上指示的很多要素可由提供相同结果且落在要求保护的本发明精神内的不同要素改变或代替。因此，预期仅如权利要求范围所说明来限制本发明。

Claims (8)

1.一种制备式I，R=H或乙基，n=3，的二酮基哌嗪的方法，所述方法包括：
产生氨基烷基二酮基哌嗪；
提供富马酸单乙酯的活化衍生物；
使所述氨基烷基-二酮基哌嗪与所述活化富马酸单乙酯衍生物反应；其中所述活化衍生物为混合酐，所述混合酐来自富马酸单乙酯和一种试剂的反应，所述试剂选自二苯基磷酰基叠氮、新戊酰氯、氯磺酰异氰酸酯和三氟乙酸酐；
且其中使所述富马酸单乙酯的活化衍生物与所述氨基烷基二酮基哌嗪在不纯化下原位反应。
2.权利要求1的方法，所述方法进一步包括在与所述活化富马酸单乙酯反应之前从所述氨基烷基-二酮基哌嗪去除保护基的步骤。
3.权利要求1的方法，其中所述活化衍生物为通过富马酸单乙酯酰氯与新戊酸反应产生的混合酐。
4.权利要求1的方法，所述方法进一步包括式I的二酮基哌嗪的乙基酯的皂化。
5.权利要求1的方法，所述方法进一步包括在与氨基烷基二酮基哌嗪反应之前分离富马酸单乙酯的活化衍生物。
6.权利要求1的方法，其中提供富马酸单乙酯的活化衍生物的步骤包括：
在第一反应混合物中，在适合溶剂中混合富马酸单乙酯和质子清除剂；
加入所述试剂之一；和
在不纯化下，在式I的二酮基哌嗪合成中使用这种混合物。
7.权利要求6的方法，其中所述质子清除剂为有机胺。
8.权利要求6的方法，其中所述溶剂为极性有机溶剂。
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