CN104788990B

CN104788990B - 一种从腊八蒜中提取和分离黄色素的方法

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Publication number: CN104788990B
Application number: CN201510205714.0A
Authority: CN
Inventors: 王丹; 刘盼盼; 赵晓燕; 马越; 张超
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2015-04-27
Filing date: 2015-04-27
Publication date: 2017-03-01
Anticipated expiration: 2035-04-27
Also published as: CN104788990A

Abstract

本发明提供一种从腊八蒜中提取和分离黄色素的方法，包括以下步骤：1)采用酸性乙醇溶液对腊八蒜进行提取，制得提取液；2)采用有机溶剂对提取液进行萃取，制得含有黄色素的第一粗提物；3)采用大孔树脂对第一粗提物中的黄色素进行吸附，并对吸附后的大孔树脂进行洗脱，制得第二粗提物；4)采用酸性溶液将第二粗提物制成第二粗提液后，用凝胶树脂柱进行凝胶层析，收集440nm处的洗脱液，制得黄色素初品；其中，采用的洗脱剂为酸性溶液和有机溶剂的混合液，酸性溶液与有机溶剂的体积比为(2：8)‑(5：5)，酸性溶液为pH值2‑4的水溶液，有机溶剂为乙醇、乙腈或正丁醇。该方法操作简单、可实施性高，能够从腊八蒜中分离出高纯度的天然黄色素。

Description

一种从腊八蒜中提取和分离黄色素的方法

技术领域

本发明涉及食品加工中天然色素的分离技术，具体是关于一种从腊八蒜中提取和分离黄色素的方法。

背景技术

中国传统蒜制品腊八蒜中的绿色素是天然的植物次生代谢产物。绿色素由紫外吸收波长分别为590、440nm的蓝色素和黄色素构成。含色素的腊八蒜提取物具有抗氧化、抑制HL-60人白血病细胞、BGC-823胃癌细胞、人乳腺癌细胞、人肝癌细胞Bel-7402和人前列腺癌细胞PC-3M-1E8增值等作用，研究表明蓝色素及黄色素粗提物都具有清除DPPH、超氧阴离子和羟自由基等作用。可见腊八蒜色素作为天然食用色素，除了具有安全、无毒等特性，还具有一定的功能性，因此从腊八蒜中分离出色素单体成分对食品、化妆品、医药领域都具有重大的意义。

对于腊八蒜色素的分离纯化，目前已有一些研究，赵晓丹等建立了初步提取分离大蒜绿变色素的方法：以柱层析为主要手段，选用CG-50树脂、SIPI-40树脂，硅胶等不同填料对色素进行了分离和纯化，等到了蓝色素和黄色素的粗提物，但未能得到色素的纯品；其他学者在此基础上，经高效液相进一步分离，得到最终产物为黄色素和与黄色素性质相似物质的混合物，仍然未能获得单体色素；近年来有学者通过体外合成的方式合成了一系列大蒜黄色素的类似物。然而直至目前为止，没有从腊八蒜中分离出天然的单一黄色素。

发明内容

本发明提供一种从腊八蒜中提取和分离黄色素的方法，用于解决现有技术中无法从腊八蒜中提取高纯度的单一黄色素成分的缺陷。

本发明提供一种从腊八蒜中提取和分离黄色素的方法，包括如下步骤：

1)采用pH值为2-4的酸性乙醇溶液对腊八蒜进行提取，制得提取液；

2)采用有机溶剂对所述提取液进行萃取，收取萃取液，制得含有黄色素的第一粗提物；

3)采用大孔树脂对所述第一粗提物中的黄色素进行吸附，并对吸附后的大孔树脂进行洗脱，收集洗脱液，制得第二粗提物；

4)采用酸性溶液将所述第二粗提物制成第二粗提液后，用凝胶树脂柱进行凝胶层析，收集440nm处的洗脱液，制得黄色素初品；其中，所述凝胶层析采用的洗脱液剂为酸性溶液和有机溶剂的混合液，所述混合液中酸性溶液与有机溶剂的体积比为(2：8)-(5：5)，所述酸性溶液为pH值2-4的水溶液，所述有机溶剂为乙醇、乙腈或正丁醇。

进一步地，在上述步骤4)结束后，还包括下述步骤5)：

5)采用高效液相色谱对所述黄色素初品进行纯化，所述高效液相色谱采用C₁₈色谱柱，流动相A为0.3-0.6％的甲酸水溶液，流动相B为0.3-0.6％乙腈溶液，洗脱梯度为0-3min15％B，3-10min 20％B，收集最大吸收峰值处的洗脱液，并去除洗脱液中的有机溶剂，制得黄色素终品。

在本发明的制备中涉及的分离手段包括步骤3)的普通柱层析方法、步骤4)的等度液相色谱分离方法以及步骤5)的梯度液相色谱分离方法，这三者的基本原理都是利用不同物质在各种溶剂的溶解度不同，当需要获取某一混合物中的某单一成分时，先将该混合物附着于某一具有吸附性的固定相(载体柱)上，通过选用合适的溶剂(称为淋洗剂或洗脱剂，该溶剂对该单一成分的溶解性极佳，对其他成分溶解性较差)对附着有混合物的固定相进行淋洗，混合物中在该洗脱剂中溶解性最好的物质会先通过载体柱流出，从而达到分离的目的。因此，在分离过程中，分离条件(洗脱剂的种类以及流速选择等)的确定对于分离效果有着至关重要的作用。其中，普通柱层析的载体柱是通过在玻璃柱内加填硅胶等物质完成固定相制备后在进行相应的上样、淋洗操作，其中玻璃柱的长短粗细以及硅胶量的选择根据待分离混合的量进行相应的选择，而等度以及梯度液相色谱采用色谱仪进行，适合少量物质的高精度分离，其中梯度液相色谱的分离效果由于在分离过程中在不同时间采用了不同比例的洗脱液，所以其分离效果优于等度液相色谱。

本发明的分离方法中，所有的用于提取、溶解、淋洗的pH值为2-4的溶液，都是采用甲酸、乙酸、三氟乙酸和磷酸中的一种或几种进行溶液pH值的调节。控制pH值在该范围内，既能够最大限度的对腊八蒜中的黄色素进行有效地提取与溶解，又不会使黄色素分解发生其他化学反应。

本发明所采用的腊八蒜是经过一段时间腌制，蒜体已经明显呈现绿色的腊八蒜，如果腌制时间过短蒜体还未呈现绿色，则蒜中的色素含量过低，还不适于黄色素的提取。为了能够实现腊八蒜中黄色素的完全提取，一般在对腊八蒜进行提取前，还会对腊八蒜进行破碎处理以增大提取溶剂的接触范围，一般破碎至40-80目即可。进一步地，在步骤1)中，采用所述酸性乙醇溶液提取腊八蒜一次以上，并且控制所述酸性乙醇溶液中乙醇的体积含量为50-90％，所述腊八蒜与所述酸性乙醇溶液的质量体积比为1:(1-8)，提取温度为-4-25℃，提取时间为12-24h。在提取过程中，为了提高提取率，可以采用转速为800-100r/min的搅拌装置进行搅拌提取，每1g腊八蒜采用1-8ml的酸性乙醇溶液进行提取，同时步骤1)可以进行一次以上，提取后，将每次的提取物合并过滤，收集滤液，制得提取液。

进一步地，在步骤2)中，采用所述有机溶剂萃取所述提取液一次以上，并且控制所述提取液与所述有机溶剂的体积比为1:(1-5)，萃取时间为2-6h；其中，所述有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿。提取液中含有大量的脂溶性杂质，这些杂质在酸水中的溶解性好，因此采用萃取的方法将脂溶性杂质从提取液中分离出去。为了得到提高萃取的效率，该操作可进行2-5次，将每次的萃取液，即有机相，进行合并，得到第一粗提物。

第一粗提物中除了腊八蒜色素物质还含有一些糖类、氨基酸、蛋白质等大分子组分，为了将这些大分子组分与腊八蒜色素物质分开，特此选择与大分子组分不亲和，却能吸附腊八蒜物质的大孔树脂作为分离载体，从而进一步的通过淋洗洗脱，实现大分子组分与腊八蒜色素物质的分离。进一步地，所述大孔树脂为XAD-7大孔树脂、AB-8大孔树脂或YWD-01大孔树脂。

进一步地，步骤3)包括对所述第一粗提物浓缩，并将浓缩物溶于双蒸水中，制得第一粗提液，其中控制所述浓缩物与双蒸水的质量体积比为1：(0.5-4)；将所述第一粗提液上装有所述大孔树脂的层析柱，采用pH值为2-4的水溶液以3-8mL/min的流速洗涤2-4个柱体积，随后采用pH值为2-4的酸性乙醇进行洗脱，收集洗脱液，制得第二粗提物。具体地，可以在35℃将第一粗提物进行浓缩直至有机溶剂全部去除得到浓缩物。为了提高产品的纯度，可以将第一粗提物的浓缩物溶解于双蒸水中得到第一粗提液，双蒸水即为蒸馏过两次水，水中的大部分盐类、氨类以及有机物已经被除去，因此有助于色素的提纯。

在本发明的具体方案中，将第一粗提液进行柱层析处理，所用的大孔树脂的质量以所需处理的样品质量决定，一般为30-40:1，即处理1g样品，需要大孔树脂30-40g。上样后，由于第一粗提液中的一些糖类、氨基酸、蛋白质等大分子组分与树脂不亲和不会被吸附在大孔树脂中，因此先选用pH为2-4的水溶液作为洗涤剂，以流速为3-8ml/min对大孔树脂柱洗涤，将这些大分子组分冲洗下来，当洗涤剂的体积为2-4倍的柱体积时，第一粗提物中的大分子组分就会被完全除去，而第一粗提物中的色素成分不易被洗涤剂冲刷仍然被吸附在大孔树脂中。此时，再采用pH值为2-4的酸性乙醇作为洗脱剂，以3-10ml/min的流速对大孔树脂柱进行洗脱，由于色素成分易溶于该洗脱剂中，因此能够将吸附在大孔树脂中的色素成分冲刷出来，对洗脱液进行收集，得到第二粗提物。同样的，洗脱剂的体积为2-4倍的柱体积时，大孔树脂中的色素成分会被全部冲刷洗脱出来。其中，柱体积通过式(1)进行计算，

V＝πr²h 式(1)

其中，r为载体柱的半径，h为载体柱内固定相(大孔树脂)的高度。

此时，第二粗提物中含有黄色素、蓝色素以及其他酚酸类物质，为了得到成分单一的黄色素，因此对第二粗提物进行步骤4)的等度色谱处理。具体的，等度色谱中的色谱柱可选取凝胶树脂柱，进一步地，凝胶树脂柱中填装的凝胶树脂为SephadexG-25凝胶树脂、Sephadex LH-20凝胶树脂、SephadexG-20凝胶树脂或SephadexG-15凝胶树脂。

进一步地，步骤4)中，在将所述第二粗提物制成第二粗提液之前，先对所述第二粗提物进行浓缩，并将浓缩物溶于所述酸性溶液中，制得第二粗提液，其中控制所述浓缩物与酸性溶液的质量体积比为1：(0.5-3)，并且控制第二粗提液的进样量为2-6mL，所述洗脱液的流速为1-4mL/min。具体的，在进行凝胶树脂分离前，将收集到的第二粗提物在35℃进行浓缩处理，制得第二粗提物的浓缩物。将该浓缩物溶解在pH值2-4的水溶液中得到第二粗提液，以2-6mL的进样量注入凝胶柱中，以洗脱剂进行洗脱，控制洗脱剂的流速为1-4ml/min。该步洗脱正是进行黄色素与其他色素，例如蓝色素和酚酸类物质的分离，因此，洗脱剂对于分离效果至关重要。该步骤的洗脱剂为酸性溶液和有机溶剂的混合液，所述混合液中酸性溶液与有机溶剂的体积比为(2：8)-(5：5)，所述酸性溶液为pH值2-4的水溶液，所述有机溶剂为乙醇、乙腈或正丁醇。同时，由于黄色素的吸收波长为440nm,因此选择在该波长处对洗脱液进行收集，可以将洗脱剂的体积控制为2-4个柱体积，进样量中的有效成分便能洗脱完毕，其中柱体积V根据式(1)进行计算。将该洗脱液在35℃进行浓缩处理，在压力为0.22MPa,温度为冷冻干燥，制得黄色素初品。

经过上述处理后得到的黄色素初品中，黄色素的纯度已高达70％以上，大部分的蓝色素以及酚酸类物质已经被去除，为了得到腊八蒜中单一的黄色素成分，对上述黄色素初品进行步骤5)中的高效液相色谱制备，所选用的色谱柱为常规C₁₈色谱柱。进一步地，步骤5)中，所述C₁₈色谱柱为XBridge C₁₈或ZORBAX SB-C₁₈。

进一步地，步骤5)中，将所述黄色素初品制成浓度为55-65mg/L的黄色素溶液后再进行所述纯化，并且控制所述液相色谱的进样量500-3000μL，柱温20-30℃，流速4-7mL/min，检测波长440nm。在本发明的具体实施方法中，将所述黄色素初品溶解于双蒸水中配制为浓度为55-65mg/L的水溶液后在进行高效液相色谱分离。为了得到纯度更高的黄色素，在具体分离过程中，可以采用梯度洗脱，具体梯度洗脱的条件为流动相A为0.3-0.6％的甲酸水溶液，流动相B为0.3-0.6％乙腈溶液，洗脱梯度为0-3min 15％B，3-10min 20％B，根据色谱图收集最大吸收峰值处的洗脱液，在35℃下浓缩去除有机溶剂，而后在压力0.22MPa，冷冻干燥得到黄色素终品。

本发明方案的实施，能够从腊八蒜中分离并纯化制得成分单一的天然黄色素，操作简单，可实施性高，最终产品经高效液相色谱检测纯度可达90％以上。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的黄色素终品的高效液相色谱图；

图2为本发明实施例2制备的黄色素终品的高效液相色谱图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例所采用的腊八蒜均为已经绿变完全的腊八蒜。

实施例1

将1kg腊八蒜破碎至50目后，浸泡于pH＝3(乙酸调pH)的2000mL80％乙醇溶液中，在-4℃提取3次，每次12h，将3次的提取液合并。

将提取液按体积比1:1的比例与乙酸乙酯混合，萃取3次，每次3h，取3次有机相合并，制得第一粗提物。

将上述第一粗提物在35℃旋转蒸发进行浓缩至干，按照重量体积比1:2的比例溶于双蒸水，以AB-8树脂作为固定相，固定相的质量与第一粗提物的质量比为35:1，进行柱层析处理。首先采用2倍柱体积的pH＝3(乙酸调pH值)的纯水进行洗涤，控制流速为5mL/min，而后用2倍柱体积的pH＝3(乙酸调pH值)的乙醇进行洗脱，控制流速为5mL/min，收集洗脱液，制得第二粗提物。

在35℃下将上述第二粗提物旋转蒸发进行浓缩，并将该浓缩物按重量体积比1:2的比例溶于pH＝3的酸水(乙酸调pH值)制成第二粗提液，用凝胶树脂柱进行凝胶层析，收集440nm处的洗脱液。具体的，控制第二粗提液的进样量为3mL，加载至Sephadex LH-20，用3倍柱体积的pH＝3(乙酸调pH值)的酸性溶液和有机溶剂的混合液作为洗脱剂(体积比，pH＝3的水溶液：乙醇＝1：1)进行洗脱，控制流速1.5mL/min，收集440nm下最大吸收峰处的洗脱液，35℃下旋转蒸发浓缩，冷冻干燥制得黄色素初品，该黄色素初品为黄色粉末。

将上述黄色素初品加入双蒸水中配置成浓度为60mg/mL的黄色素溶液，进行梯度液相色谱处理。采用ZORBAX SB-C18(250×9.4mm内径)的C18色谱柱，控制柱温30℃，流速4mL/min，进样量1000uL；其中，流动相A为0.5％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈溶液，控制梯度洗脱条件0-3min 15％B，3-10min 20％B，以440nm为检测波长，收集最大吸收峰处的洗脱液，在温度35℃下，旋转蒸发浓缩至干，冷冻干燥，得到1.1g黄色素终品。图1为本发明实施例1制备的黄色素终品的高效液相色谱图，结果见图1以及表1。

表1 实施例1中黄色素终品的高效液相色谱结果

根据表1可知，实施例1中的黄色素终品的纯度为95.185％。

实施例2

将2kg腊八蒜破碎至70目后，浸泡于pH＝2(三氟乙酸调pH)的5000mL90％乙醇水溶液中，在10℃提取2次，每次14h，将2次的提取液合并。

将提取液按体积比1:2的比例与二氯甲烷混合，萃取2次，每次4h，取2次有机相合并，制得第一粗提物。

将上述第一粗提物在35℃旋转蒸发进行浓缩至干，按照重量体积比1:1的比例溶于双蒸水，以XAD-7树脂作为固定相，固定相的质量与第一粗提物的质量比为40:1，进行柱层析处理。首先采用4倍柱体积的pH＝3(三氟乙酸调pH值)的纯水进行洗涤，控制流速为3mL/min，而后用4倍柱体积的pH＝3(甲酸调pH值)的乙醇进行洗脱洗，控制流速为6mL/min，收集第洗脱液，制得第二粗提物。

在35℃下将上述第二粗提物旋转蒸发进行浓缩，并将该浓缩物按重量体积比1:3的比例溶于pH＝3的酸水(三氟乙酸调pH值)制成第二粗提液，用凝胶树脂柱进行凝胶层析，收集440nm处的洗脱液。具体的，控制第二粗提液的进样量为4mL，加载至Sephadex G-20，用2倍柱体积的pH＝3(三氟乙酸调pH值)的酸性溶液和有机溶剂的混合液作为洗脱剂(体积比，pH＝3的水溶液：乙醇＝1：4)进行洗脱，控制流速2mL/min，收集440nm下最大吸收峰处的洗脱液，35℃下旋转蒸发浓缩，冷冻干燥制得黄色素初品，该黄色素初品为黄色粉末。

将上述黄色素初品加入双蒸水中配置成浓度为65mg/mL的黄色素溶液，进行梯度液相色谱处理。采用XBridge C18(250×9.4mm内径)的C18色谱柱，控制柱温30℃，流速4mL/min，进样量2000uL；其中，流动相A为0.5％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈溶液，控制梯度洗脱条件0-3min 15％B，3-10min20％B，以440nm为检测波长，收集最大吸收峰处的洗脱液，在温度35℃下，旋转蒸发浓缩至干，冷冻干燥，得到0.95g黄色素终品。图2为本发明实施例2制备的黄色素终品的高效液相色谱图，结果见图2以及表2。

表2 实施例2中黄色素终品的高效液相色谱结果

根据表2可知，实施例2中的黄色素终品的纯度为90.483％。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种从腊八蒜中提取和分离黄色素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

4)采用酸性溶液将所述第二粗提物制成第二粗提液后，用凝胶树脂柱进行凝胶层析，收集440nm处的洗脱液，制得黄色素初品；其中，所述凝胶层析采用的洗脱剂为酸性溶液和有机溶剂的混合液，所述混合液中酸性溶液与有机溶剂的体积比为(2：8)-(5：5)，所述酸性溶液为pH值2-4的水溶液，所述有机溶剂为乙醇、乙腈或正丁醇；

5)采用高效液相色谱对所述黄色素初品进行纯化，所述高效液相色谱采用C₁₈色谱柱，流动相A为0.3-0.6％的甲酸水溶液，流动相B为0.3-0.6％乙腈溶液，洗脱梯度为0-3min15％B，3-10min 20％B，收集最大吸收峰值处的洗脱液，并去除洗脱液中的有机溶剂，制得黄色素终品；

步骤3)包括：

对所述第一粗提物浓缩，并将浓缩物溶于双蒸水中，制得第一粗提液，其中控制所述浓缩物与双蒸水的质量体积比为1：(0.5-4)；

将所述第一粗提液上装有所述大孔树脂的层析柱，采用pH值为2-4的水溶液以3-8mL/min的流速洗涤2-4个柱体积，随后采用pH值为2-4的酸性乙醇进行洗脱，收集洗脱液，制得第二粗提物；

步骤5)中，所述C₁₈色谱柱为XBridge C₁₈或ZORBAX SB-C₁₈；

步骤5)中，将所述黄色素初品制成浓度为55-65mg/L的黄色素溶液后再进行所述纯化，并且控制所述液相色谱的进样量500-3000μL，柱温20-30℃，流速4-7mL/min，检测波长440nm。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，采用所述酸性乙醇溶液提取腊八蒜一次以上，并且控制所述酸性乙醇溶液中乙醇的体积含量为50-90％，所述腊八蒜与所述酸性乙醇溶液的质量体积比为1:(1-8)，提取温度为-4-25℃，提取时间为12-24h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，采用所述有机溶剂萃取所述提取液一次以上，并且控制所述提取液与所述有机溶剂的体积比为1:(1-5)，萃取时间为2-6h；其中，所述有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔树脂为XAD-7大孔树脂、AB-8大孔树脂或YWD-01大孔树脂。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝胶树脂柱中填装的凝胶树脂为SephadexG-25凝胶树脂、Sephadex LH-20凝胶树脂、SephadexG-20凝胶树脂或SephadexG-15凝胶树脂。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，步骤4)中，在将所述第二粗提物制成第二粗提液之前，先对所述第二粗提物进行浓缩，并将浓缩物溶于所述酸性溶液中，制得第二粗提液，其中控制所述浓缩物与酸性溶液的质量体积比为1：(0.5-3)，并且控制第二粗提液的进样量为2-6mL，所述洗脱液的流速为1-4mL/min。