CN104688789A

CN104688789A - 番木瓜籽提取物缓释制剂及其应用

Info

Publication number: CN104688789A
Application number: CN201510073763.3A
Authority: CN
Inventors: 杨永亮
Original assignee: Skill (dalian) Co Ltd Of Neck Cisco
Current assignee: Skill (dalian) Co Ltd Of Neck Cisco
Priority date: 2015-02-12
Filing date: 2015-02-12
Publication date: 2015-06-10
Anticipated expiration: 2035-02-12
Also published as: CN104688789B

Abstract

番木瓜籽提取物缓释制剂及其应用，所述制剂是在酸性条件下将蒙脱土改性后与乙基纤维素、壳聚糖混合制备成改性蒙脱土-乙基纤维素-壳聚糖复合微球,并进一步将番木瓜籽提取物包埋在所述微球中制备而成的制剂。本发明通过加入可食用酸将蒙脱土改性，并与壳聚糖、乙基纤维素混合制备复合缓释微球，确保了包埋的番木瓜籽提取物中异硫氰酸苄酯化合物在酸性条件下的稳定性，抑制了其降解。另外，此番木瓜籽提取物缓释剂易于在pH值略高的肠液中释放，降低了异硫氰酸苄酯对胃的刺激性，大大提高了生物利用度。因此具有巨大的潜在市场空间和经济效益。

Description

番木瓜籽提取物缓释制剂及其应用

技术领域

本发明涉及医药领域。具体地,本发明涉及番木瓜籽提取物缓释剂的制备及其应用。

背景技术

番木瓜(Carica Papaya L.)是一种热带常绿果树，原产墨西哥和中美洲，在我国主要分布于广东、云南、台湾省、福建等南方省区。番木瓜果实除了作为一种经济价值较高的水果外,也常用于保健品和化妆品的开发。但是，番木瓜籽(种子)通常被认为没有任何经济价值而被遗弃，造成了宝贵资源的浪费。番木瓜籽中所含的主要化学成分为异硫氰酸苄酯等。已有相关文献报道了番木瓜籽提取物中异硫氰酸苄酯的抗肿瘤用途。(Carcinogenesis.2011；32(3):359-67；J Natl Cancer Inst.2009；101(3):176-193；Cancer Prev Res.2013；6(8):760-763.)。其中，异硫氰酸苄酯(Benzyl-isothiocyanate,BITC)结构如式a所示：

目前，关于番木瓜籽提取物的制备工艺方法及相关用途已有一些报道，例如CN101935295A，CN103951598A，均涉及到番木瓜籽提取物的制备工艺方法。然而,番木瓜籽提取物中所含的异硫氰酸苄酯化合物并不十分稳定，容易发生降解，因此极大的限制了番木瓜籽提取物的大规模应用。目前已有的相关专利及文献也并未涉及到如何实现番木瓜籽提取物在生物体上的高效利用。

蒙脱土(MMT)、壳聚糖常被用作药物缓释载体，乙基纤维素常用于药物载体的粘连剂,相关报道如CN101422426、CN 101703480、CN 103893152等。而现有技术中,将蒙脱土、壳聚糖及乙基纤维素三者混合制备成药物缓释载体则未见相关报道。与本发明的番木瓜籽提取物缓释剂的制备工艺及具体应用，尚未有相关记载。

发明内容

本发明的目的首先在于提供一种番木瓜籽提取物缓释制剂，所述制剂是在酸性条件下将蒙脱土改性后与乙基纤维素、壳聚糖混合制备成改性蒙脱土-乙基纤维素-壳聚糖复合微球,并进一步将番木瓜籽提取物包埋在所述微球中制备而成的制剂。

我们在研究中发现，一方面，番木瓜籽提取物对于炎症性肠病具有较好的潜在治疗效果，对于HIV病毒、乙肝病毒等也有较好的潜在治疗效果，并且它通过作为XPO1蛋白抑制剂发挥上述作用。另一方面，我们发现在酸性条件下将蒙脱土改性，并在酸性条件下使其与乙基纤维素、壳聚糖混合制备成改性蒙脱土/乙基纤维素/壳聚糖复合微球，并进一步将番木瓜籽提取物包埋在此微球中制备成番木瓜籽提取物缓释剂后，除保留番木瓜提取物作为XPO1蛋白抑制剂的所有功能外，此缓释制剂还具有如下的优点：

(1)由于在酸性环境下制备缓释剂并包埋药物，番木瓜籽中所含的异硫氰酸苄酯化合物在呈酸性的复合微球环境中较稳定,避免了降解；

(2)乙基纤维素作为载体粘连剂使用,减少了戊二醛有机交联剂的使用,生物安全性更高；

(3)该微球缓释剂在pH值较高的肠液内的释放率较高，而在偏酸性的胃液内释放率不高,从而避免了对胃的刺激，实现了较高的生物利用度。

基于以上原因，本发明另一反面的目的在于提供上述本发明的番木瓜籽提取物缓释制剂在制备XPO1蛋白抑制剂类药物中的应用。

具体实施方式

本发明所述的番木瓜籽提取物缓释制剂，通过以下方法制备：

(1)制备改性蒙脱土：酸性条件下，使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)对钠基蒙脱土(MMT)进行改性；

(2)制备改性蒙脱土-乙基纤维素-壳聚糖复合微球：按照质量比1:1:3-1:5:20将改性蒙脱土、乙基纤维素和壳聚糖混合，并将混合物分散至体积浓度为1～3％的可食用酸溶液中，然后以少量戊二醛水溶液交联固化，随后加入异丙醇分层，弃上清液；剩余物加异丙醇和石油醚反复抽滤，沉淀洗涤烘干得到改性蒙脱土-壳聚糖-乙基纤维素复合微球；

(3)制备番木瓜籽提取物：番木瓜籽洗净破浆粉碎后水解，其水解液以有机溶剂萃取，并经减压蒸馏去除有机溶剂后得干燥的番木瓜籽提取物；

(4)制备番木瓜籽提取物缓释制剂：将浓度为10-25g/100mL的番木瓜籽提取物/ 无水乙醇溶液滴加至改性蒙脱土-乙基纤维素-壳聚糖复合微球/可食用酸溶液的分散体系中，高速搅拌后以异丙醇分层，弃上清液；剩余物加异丙醇和石油醚反复抽滤，沉淀洗涤烘干得番木瓜籽提取物缓释制剂。

上述本发明的番木瓜籽提取物缓释制剂，具体实施方式之一，其制备方法中所述的步骤(1)是：将钠基蒙脱土(MMT)按照45-55g/1000mL的比例均匀分散至去离子水中，静置后取上层悬浮液，滴加浓度为3-5g/100mL的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)水溶液，并以可食用酸调pH值至1-4；然后于65±2℃搅拌2h；体系自然冷却后，离心所得沉淀经洗涤、干燥、研磨、过筛得改性蒙脱土。

另一具体实施方式中，其制备方法中所述的步骤(2)是：按照质量比1:1:3-1:2:5将改性蒙脱土、乙基纤维素和壳聚糖加入至体积浓度为1～3％的可食用酸溶液中，高速搅拌12h后逐滴加入少量戊二醛水溶液交联固化2h，随后加入异丙醇充分搅拌并静置分层，弃去上层清液；剩余物加异丙醇和石油醚反复抽滤，沉淀用无水乙醇洗涤后于40±2℃真空干燥得到改性蒙脱土-壳聚糖-乙基纤维素复合微球。

其中，对所述“高速搅拌”，本领域技术人员根据发明内容及现有技术应当容易理解和确认，本发明中一般选用3000rpm转速，并且该选择适用于本发明中其它相同记载的内容。

另外，本发明中使用戊二醛作为交联固化剂，本领域的技术人员从其功能限定及现有技术记载，应当很容易在具体操作中确定用量。

具体的实施方式中，所述的步骤(3)是：将番木瓜籽洗净破浆粉碎后，加入5-10倍体积的pH值为6.0-6.8的缓冲溶液，在25-55℃条件下搅拌水解30-300分钟；然后加入可食用酸溶液调节反应体系pH值为2-4以终止水解反应；所得水解液经固液分离，澄清水解溶液以1-3倍体积有机溶剂萃取3次，合并有机溶剂相，并经减压蒸馏去处有机溶剂，得干燥的番木瓜籽提取物。其中，所述的缓冲溶液优选pH值为6.5的缓冲溶液体系，尤其优选醋酸/醋酸钠缓冲溶液体系。

具体实施方式中，所述的步骤(4)是：将浓度为1-3g/10mL的番木瓜籽提取物-乙醇溶液加入至分散体系I中，室温下高速搅拌12h后加入异丙醇充分搅拌并静置分层，弃去上层清液，剩余物加异丙醇和石油醚反复抽滤，沉淀用无水乙醇洗涤后于40±2℃真空干燥得到番木瓜籽提取物缓释制剂；

所述的分散体系I是改性蒙脱土-乙基纤维素-壳聚糖复合微球加入到1-3％的可食用酸溶液中，室温下高速搅拌6h所得分散体系。

作为更为具体的实施方式，本发明提供一种番木瓜籽提取物缓释制剂，所述制剂通过下述方法制备：

(1)制备改性蒙脱土：将钠基蒙脱土(MMT)按照45-55g/1000mL的比例均匀分散至去离子水中，静置后取上层悬浮液，滴加浓度为3-5g/100mL的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)水溶液，并以可食用酸调pH值至2-3；然后于65±2℃搅拌2h；体系自然冷却后，离心所得沉淀经洗涤、干燥、研磨、过筛得改性蒙脱土；

(2)制备改性蒙脱土-乙基纤维素-壳聚糖复合微球：按照质量比1:1:3-1:2:5将改性蒙脱土、乙基纤维素和壳聚糖加入至体积浓度为1～3％的可食用酸溶液中，高速搅拌12h后逐滴加入少量的戊二醛水溶液交联固化2h，随后加入异丙醇充分搅拌并静置分层，弃去上层清液；剩余物加异丙醇和石油醚反复抽滤，沉淀用无水乙醇洗涤后于40±2℃真空干燥得到改性蒙脱土-壳聚糖-乙基纤维素复合微球；

(3)制备番木瓜籽提取物：番木瓜籽洗净破浆粉碎后，加入5-10倍体积的pH值为6.5的缓冲溶液，在25-55℃条件下搅拌水解30-300分钟；然后加入可食用酸溶液调节反应体系pH值为2-4以终止水解反应；所得水解液经固液分离，澄清水解溶液以1-3倍体积有机溶剂萃取3次，合并有机溶剂相，并经减压蒸馏去处有机溶剂，得干燥的番木瓜籽提取物；

(4)制备番木瓜籽提取物缓释制剂：

将浓度为1-3g/10mL的番木瓜籽提取物-乙醇溶液加入至分散体系I中，室温下高速搅拌12h后加入异丙醇充分搅拌并静置分层，弃去上层清液，剩余物加异丙醇和石油醚反复抽滤，沉淀用无水乙醇洗涤后于40±2℃真空干燥得到番木瓜籽提取物缓释制剂；

所述的分散体系I是改性蒙脱土-乙基纤维素-壳聚糖复合微球加入到体积浓度1-3％的可食用酸溶液中，室温下高速搅拌6h所得分散体系。

上述本发明的番木瓜籽提取物缓释制剂的任一具体实施方案中，所述的可食用酸选自柠檬酸、苹果酸、食用醋酸或乳酸。优选为乳酸或食用醋酸。

进一步提供本发明所述番木瓜籽提取物缓释制剂的最佳实施方式，所述制剂通过以下方法制备：

(1)制备改性蒙脱土：将钠基蒙脱土(MMT)按照50g/1000mL的比例均匀分散至去离子水中，静置后取上层悬浮液，滴加浓度为4g/100mL的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)水溶液，并以可食用酸调pH值为2-3；然后于65±2℃搅拌2h；体系自然冷却后，离心所得沉淀经洗涤、干燥、研磨、过筛得改性蒙脱土；

(2)制备改性蒙脱土-乙基纤维素-壳聚糖复合微球：按照质量比1:1:3将改性蒙脱土、乙基纤维素和壳聚糖加入至体积浓度为3％的可食用酸溶液中，3000rpm搅拌12h后逐滴加入少量戊二醛水溶液交联固化2h，随后加入异丙醇充分搅拌并静置分层，弃去上层清液；剩余物加异丙醇和石油醚反复抽滤，沉淀用无水乙醇洗涤后于40±2℃真空干燥得到改性蒙脱土-壳聚糖-乙基纤维素复合微球；

(3)制备番木瓜籽提取物：番木瓜籽洗净破浆粉碎后，加入5-10倍体积的pH值为6.5的醋酸/醋酸钠缓冲溶液，在35℃条件下搅拌水解30-90分钟；然后加入可食用酸溶液调节反应体系pH值为3以终止水解反应；所得水解液经固液分离，澄清水解溶液以1-3倍体积有机溶剂萃取3次，合并有机溶剂相，并经减压蒸馏去处有机溶剂，得干燥的番木瓜籽提取物；

(4)制备番木瓜籽提取物缓释制剂：

将浓度为3g/10mL的番木瓜籽提取物-乙醇溶液加入至分散体系I中，室温下3000rpm搅拌12h后加入异丙醇充分搅拌并静置分层，弃去上层清液，剩余物加异丙醇和石油醚反复抽滤，沉淀用无水乙醇洗涤后于40±2℃真空干燥得到番木瓜籽提取物缓释制剂；

另一方面，本发明提供上述任意技术方案中所述及的的番木瓜籽提取物缓释制剂在制备XPO1蛋白抑制剂类药物中的应用。其中，所述的XPO1蛋白抑制剂类药物是XPO1蛋白抑制剂类抗炎药物或XPO1蛋白抑制剂类抗病毒药物。

具体实施方案之一，所述的XPO1蛋白抑制剂类药物是XPO1蛋白抑制剂类抗炎药物，尤其优选用于治疗炎症性肠病的药物。

另一具体实施方式，所述的XPO1蛋白抑制剂类药物是XPO1蛋白抑制剂类抗病毒药物，其中所述的病毒包括：人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、登革热病毒(Dungee)、重度急性呼吸器官综合症冠状病毒、西尼罗河病毒、单纯性疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)或默克尔细胞多瘤病毒(MCV)。作为优选的，所述的病毒包括：人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)或人乳头瘤病毒(HPV)。

本发明通过加入可食用酸将蒙脱土改性，并与壳聚糖、乙基纤维素混合制备复合缓释微球，确保了包埋的番木瓜籽提取物中异硫氰酸苄酯化合物在酸性条件下的稳定性，抑制了其降解。另外，此番木瓜籽提取物缓释剂易于在pH值略高的肠液中释放，降低了异硫氰酸苄酯对胃的刺激性，大大提高了生物利用度。因此具有巨大的潜在市场空间和经济效益。

附图说明

图1是利用扫描电子显微镜对复合缓释微球的形貌分析。

图2是60μg/ml的番木瓜籽提取物缓释剂抑制Rev-GFP蛋白细胞核输出的激光共聚焦效果图。(图中，CPS代表番木瓜籽提取物缓释剂)。

具体实施例

为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1.番木瓜籽提取物的制备

1)称取1kg的番木瓜籽，去离子水洗净。用小型粉碎机破浆粉碎后，加入10L的pH值为6.5的醋酸/醋酸钠缓冲溶液，在35度的条件下搅拌水解。

2)水解反应60分钟后，加入10％的可食用醋酸，调整溶液pH值至3.0从而终止降解反应，收集水解混合物。

3)将水解混合物在减压条件下过滤后，用离心机离心，并收集上清液1L。

4)用1L的乙酸乙酯萃取上清液3次，收集萃取液，减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到干燥的番木瓜籽提取物0.665kg，产品回收率为66.5％。

实施例2.番木瓜籽提取物缓释剂的制备

1)将20克钠基蒙脱土(MMT)加入到500mL去离子水中，高速搅拌6h，静置12h。取150mL上层悬浮液，加入到500mL三口瓶中；称取1克十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)作为表面活性剂溶于20mL去离子水中并逐滴加入到三口瓶中。利用 3％的可食用醋酸溶液调整三口瓶中溶液的pH值至2.0，在酸性条件下将蒙脱土改性。改性后，在65℃恒温水浴中高速(转速:3000rpm)搅拌2h，自然冷却后经离心、洗涤、干燥。研磨和过筛得到改性蒙脱土。

2)将5克改性蒙脱土、5克乙基纤维素、15克壳聚糖混合并加入到3％的可食用醋酸溶液中,高速搅拌12h后(转速:3000rpm)逐滴加入0.5mL戊二醛水溶液交联固化2h。随后加入20ml异丙醇搅拌5min并静置分层，弃去上层清液，加异丙醇和石油醚反复抽滤后用无水乙醇洗涤。随后将沉淀在40℃真空烘箱中干燥,即得到改性蒙脱土-壳聚糖-乙基纤维素复合微球。

3)称取20克的上述步骤制备的复合微球，加入到3％的可食用醋酸溶液中，室温下高速搅拌6h。随后称取6克的番木瓜籽提取物并溶解于20mL无水乙醇溶液中，然后转移至壳聚糖/改性蒙脱土复合微球溶液中，室温下高速(转速:3000rpm)搅拌12h。随后加入异丙醇搅拌5min并静置分层，弃去上层清液，加异丙醇和石油醚反复抽滤后用无水乙醇洗涤。随后将沉淀在40℃真空烘箱中干燥,即得番木瓜籽提取物缓释剂。

4)收集步骤3所有滤液，用0.45μm的微孔滤膜过滤，取适量滤液应用紫外分光光度计测定紫外光吸光值，计算得剩余提取物1g。用紫外分光重量分析方法证实了重量比为25％的番木瓜籽提取物(5克)包埋入微球。

5)利用扫描电子显微镜(SEM,型号:ZEISS EVO)对复合微球进行形貌分析,具体结果见图1。实验表明番木瓜籽提取物微球粒度较小(直径～3μm),粒径分布较均匀，球形度较好。

实施例3.番木瓜籽提取物缓释剂的体外缓释效果

称取80mg的本发明番木瓜籽提取物缓释剂2份(各含有番木瓜籽提取物20mg),分别置于500ml广口瓶内。配置人工胃液和肠液(按照中国药典2005版配制)：1.人工胃液:取稀盐酸16.4ml，加水800ml与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释成1000ml即得；2.人工肠液:即含胰酶的磷酸盐缓冲液,pH～6.8。以人工胃液和肠液为释放介质，将广口瓶放置于37度的恒温水浴振荡器中，进行体外缓释，每隔30min取样5ml，经0.45μm微孔过滤膜过滤，并及时补充5ml释放介质，用紫外分光光度计测试番木瓜籽提取物的释放,并计算人工胃液和肠液中的番木瓜籽提取物的释放量。具体结果见表1和2。

表1紫外分光光度计检测番木瓜籽提取物在人工胃液中的缓释结果

时间(hr)	1	2	3	4	5	6
							释放量(mg)	5.8	6.2	6.3	6.5	6.7	6.9
百分比(％)	29％	31％	32％	33％	34％	35％

表2紫外分光光度计检测番木瓜籽提取物在人工肠液中的缓释结果

时间(hr)	1	2	3	4	5	6
							释放量(mg)	12.8	14.1	15.3	15.7	16.1	16.3
百分比(％)	64％	71％	77％	79％	81％	82％

实验结果表明，番木瓜籽提取物缓释剂在模拟胃液和模拟肠液中的释放状况明显不同。6h内番木瓜籽提取物缓释剂在模拟胃液中的累积释放量不到35％，而相同时间内在模拟肠液中高达80％以上。实验结果说明番木瓜籽提取物缓释剂更适合在pH值较高的肠液中释放。表明了该发明所制备的番木瓜籽提取物缓释剂具有良好的肠道缓释效果。

实施例4.番木瓜籽提取物缓释剂对IBD动物模型的治疗效果

炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)在世界范围内的发病率较高，已成为消化系统常见疾病和慢性腹泻的主要原因，并且患者多为儿童及青壮年。炎症性肠病泛指各种肠道炎性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis)及克罗恩病(Crohn's disease)等。炎症性肠病通常被认为是一种免疫系统疾病。临床上治疗方案可以利用氨基水杨酸制剂如5-氨基水杨酸(5-ASA)等。但此类药物仅对轻度患者有一定疗效，对重度患者往往没有疗效并容易产生耐药性。其他治疗方案如环磷酰胺、甲氨喋呤等免疫抑制剂，但可能产生较为明显的毒副作用，包括肝脏毒性以及骨髓抑制毒性等。

将6周龄雄性SD大鼠(每组8只)绝食24小时后，用二乙醚麻醉。将50％乙醇与TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)混合配制成溶液。在IBD模型组中，将乙烯树脂制造的导管从肛门插入5cm,用100mg/kg剂量的TNBS溶液灌肠。灌肠后30秒钟反吊，使TNBS溶液不泄漏。在对照组中，用生理食盐水取代TNBS并灌肠。在灌肠TNBS或生理食盐水7天后，处死动物并解剖。给药组中每组在TNBS灌肠前一日起，将本发明的番木瓜籽提取物缓释剂、5-ASA药物每天用灌胃的方式以100mg/kg的剂量给药。给药治疗2周后，处死动物并解剖，摘出动物大肠并在4％的福尔马林溶液中固定30分钟。将动物大肠从肠系膜侧纵切开用于为直肠部分拍照并测量直肠重量。以宏观观察判断评分(表3-1)为基础，根据宏观观察得分的基准对直肠部分的溃疡及出血状态进行评分。

表3-1.宏观观察判断得分标准

得分(0～5分)	宏观观察标准
		0分	无炎症、无糜烂、无出血
1分	小范围形成糜烂、轻度肿胀
		2分	轻度糜烂、肿胀并变红
3分	中度糜烂、轻度出血
		4分	小范围重度糜烂、出血
5分	大范围重度糜烂、出血

本发明代表化合物治疗后的具体宏观判断得分见表3-2所示。从结果可见：与生理盐水灌肠组比较，TNBS灌肠组的结肠组织溃疡、出血并坏死的现象比较显著，宏观病理判断得分较高。5-ASA给药组的结肠组织出血与溃疡的现象仅有较小程度的缓解。与之相比,本发明番木瓜籽提取物缓释剂给药组的结肠组织受损害程度均较小，结肠组织出血并溃疡的现象有较大缓解，证明番木瓜籽提取物缓释剂对于IBD具有较好的保护及治疗效果。

表3-2.给药治疗IBD动物模型后宏观观察判断得分

组别	剂量	动物(个)	宏观病理得分
				生理盐水组	-	8	0
TNBS灌肠组	-	8	5.0±0.3
				5-ASA给药组	100mg/kg	8	4.0±0.1
番木瓜籽提取物缓释剂给药组	100mg/kg	8	2.0±0.5

实施例5.番木瓜籽提取物缓释剂对Rev蛋白核输出抑制活性的测定

Rev蛋白是一个重要的调节HIV病毒基因复制的反式激活因子，其主要功能是从细胞核内携带病毒mRNA进入细胞质，从而促进HIV病毒基因表达并促进病毒转录的进行。XPO1蛋白是最重要的细胞核输出蛋白，Rev蛋白是XPO1的货物蛋白，其出核受XPO1蛋白的调控，因此，XPO1蛋白是HIV病毒的有效药物治疗靶点。(J Biol Chem.1998；273(50):33414-22；Proc Natl Acad Sci U S A.2002；99(22):14440-5)。

另外，XPO1介导的细胞核输出也与其他一些病毒颗粒的包被、完整、成熟的过程密切相关。例如：乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、登革热病毒(Dungee)、西尼罗河病毒、单纯性疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)等。(Mol Cell Biol.2003；23(15):5282-92；J Biol Chem.2001；276(25):22797-803；PLoS One.2011；6(10):e25854；Proc Natl Acad Sci U S A.2002,99(22):14440-5；J Virol.2008,82(21):10946-52；J Biol Chem.2009,284(23):15589-97；J Virol.2009；83(11):5353-62；J Biol Chem.2005；280(43):36088-98)。因此,除HIV病毒外,XPO1蛋白也是抗上述病毒的有效药物靶点。

Rev-GFP蛋白是用真核表达质粒将绿色荧光蛋白GFP与Rev耦合，在未加药情况下，Rev-GFP绝大部分分布在细胞质。通过检测番木瓜籽提取物缓释剂对Rev-GFP细胞定位的影响，可以判定番木瓜籽提取物缓释剂对XPO1蛋白的抑制、对Rev蛋白出核的抑制。因此，通过这个实验可以用来判断番木瓜籽提取物对上述病毒的潜在治疗效果。

将细胞胰酶消化、计数，按每孔1.5×10⁴/个接种在96孔板。16小时后，用脂质体转染Rev-GFP质粒。24小时后，加入60μg/ml的番木瓜籽提取物缓释剂溶液(折算成番木瓜籽提取物的有效浓度为15μg/ml)作用10小时，然后加入100μl Hochest33258(1mg/ml)将细胞核染色。用激光共聚焦显微镜(Olympus-IX71)观察Rev-GFP核输出的抑制效果并用百分率统计。其中,番木瓜籽提取物复合缓释剂对Rev-GFP蛋白出核抑制的激光共聚焦效果图具体见图2。从图2可见，能发出绿色荧光的Rev-GFP蛋白大部分被聚集在细胞核内。实验结果表明，番木瓜籽提取物具有较好的对Rev蛋白出核的抑制活性,因此具有较好的对XPO1蛋白的抑制活性。实验表明番木瓜籽提取物可以用于制备相关抗病毒药物及保健产品。

实施例6.番木瓜籽提取物缓释剂抗乙肝病毒的体外活性测定

中国是乙肝(HBV)患者大国，有接近10％的人口为病毒携带者或感染者。目前，乙型肝炎病毒(HBV)转染的HepG2细胞,即HepG2.2.2.15细胞，是体外评估抗乙肝病毒活性的常用细胞模型。将HepG2.2.2.15细胞株以每孔2×10⁴个/细胞接种在96孔细胞培养板，37℃下培养24小时。分别加入100μg/ml的番木瓜籽提取物缓释剂(折算成实际包埋的番木瓜籽提取物为25μg/ml)、100μg/ml的抗病毒药物阿昔洛韦(ACV)单独处理并培养。72小时后，吸出细胞上清液并在-20℃下冷藏保存。利用MTT或者CCK-8的方法测定对于HepG2.2.2.15细胞的抑制活性，同时,利用乙肝病毒表面抗原HBsAg酶联免疫检测试剂盒(上海科华生物工程股份有限公司)检测细胞上清液，测定对于HBsAg的抑制作用，具体结果见表4。其中,药物对细胞的抑制率＝(细胞对照OD值-给药组OD值)/细胞对照OD值×100％；药物对HBsAg抗原的抑制率＝(细胞对照OD值-给药组OD值)/细胞对照OD值×100％。

表4.番木瓜籽提取物缓释剂对乙肝病毒的体外抑制活性

测试药物	细胞株抑制率(％)	HBsAg抑制率(％)
			阿昔洛韦(ACV)	23	39
番木瓜籽提取物缓释剂	64	76

实验结果表明，番木瓜籽提取物缓释剂对于乙肝病毒具有较好的抑制效果，其抑制效果要优于传统的抗病毒药物阿昔洛韦。实验表明番木瓜籽提取物可以用于制备相关抗乙肝病毒药物及保健产品。

实施例7.番木瓜籽提取物缓释剂经口施用的安全性测试

向6周龄雄性SD大鼠灌胃施用番木瓜籽提取物缓释剂溶液(300mg/kg/天、500mg/kg/天、1000mg/kg/天)连续6周(每组10只动物)。结果，在任一剂量组中没有观察到动物在一般状态、体重改变、食品消耗或组织病理学上的异常。从这些结果中判断,番木瓜籽提取物缓释剂的无毒剂量在1000mg/kg/天以上。实验结果表明番木瓜籽提取物缓释剂属于无毒性的制剂。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.番木瓜籽提取物缓释制剂，其特征在于，是在酸性条件下将蒙脱土改性后与乙基纤维素、壳聚糖混合制备成改性蒙脱土-乙基纤维素-壳聚糖复合微球,并进一步将番木瓜籽提取物包埋在所述微球中制备而成的制剂。

2.根据权利要求1所述的番木瓜籽提取物缓释制剂，其特征在于，所述制剂通过以下方法制备：

(1)制备改性蒙脱土：酸性条件下，使用十六烷基三甲基溴化铵对钠基蒙脱土进行改性；

(4)制备番木瓜籽提取物缓释制剂：将浓度为10-25g/100mL的番木瓜籽提取物/无水乙醇溶液滴加至改性蒙脱土-乙基纤维素-壳聚糖复合微球/可食用酸溶液的分散体系中，高速搅拌后以异丙醇分层，弃上清液；剩余物加异丙醇和石油醚反复抽滤，沉淀洗涤烘干得番木瓜籽提取物缓释制剂。

3.根据权利要求2所述的番木瓜籽提取物缓释制剂，其特征在于，所述的步骤(1)是：将钠基蒙脱土按照45-55g/1000mL的比例均匀分散至去离子水中，静置后取上层悬浮液，滴加浓度为3-5g/100mL的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，并以可食用酸调pH值至1-4；然后于65±2℃搅拌2h；体系自然冷却后，离心所得沉淀经洗涤、干燥、研磨、过筛得改性蒙脱土。

4.根据权利要求2所述的番木瓜籽提取物缓释制剂，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备改性蒙脱土：将钠基蒙脱土按照45-55g/1000mL的比例均匀分散至去离子水中，静置后取上层悬浮液，滴加浓度为3-5g/100mL的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，并以可食用酸调pH值至2-3；然后于65±2℃搅拌2h；体系自然冷却后，离心所得沉淀经洗涤、干燥、研磨、过筛得改性蒙脱土；

(2)制备改性蒙脱土-乙基纤维素-壳聚糖复合微球：按照质量比1:1:3-1:2:5将改性蒙脱土、乙基纤维素和壳聚糖加入至体积浓度为1～3％的可食用酸溶液中，高速搅拌12h后逐滴加入的少量戊二醛水溶液交联固化2h，随后加入异丙醇充分搅拌并静置分层，弃去上层清液；剩余物加异丙醇和石油醚反复抽滤，沉淀用无水乙醇洗涤后于40±2℃真空干燥得到改性蒙脱土-壳聚糖-乙基纤维素复合微球；

(3)制备番木瓜籽提取物：番木瓜籽洗净破浆粉碎后，加入5-10倍体积的pH值为6.0-6.8的缓冲溶液，在25-55℃条件下搅拌水解30-300分钟；然后加入可食用酸溶液调节反应体系pH值为2-4以终止水解反应；所得水解液经固液分离，澄清水解溶液以1-3倍体积有机溶剂萃取3次，合并有机溶剂相，并经减压蒸馏去处有机溶剂，得干燥的番木瓜籽提取物；

(4)制备番木瓜籽提取物缓释制剂：

5.根据权利要求2、3或4所述的番木瓜籽提取物缓释制剂，其特征在于，所述的可食用酸选自柠檬酸、苹果酸、食用醋酸或乳酸。

6.权利要求1所述的番木瓜籽提取物缓释制剂在制备XPO1蛋白抑制剂类药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的XPO1蛋白抑制剂类药物是XPO1蛋白抑制剂类抗炎药物或XPO1蛋白抑制剂类抗病毒药物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的XPO1蛋白抑制剂类抗炎药物是用于治疗炎症性肠病的药物。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的XPO1蛋白抑制剂类抗病毒药物中所述的病毒包括：人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、登革热病毒(Dungee)、重度急性呼吸器官综合症冠状病毒、西尼罗河病毒、单纯性疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)或默克尔细胞多瘤病毒(MCV)。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的病毒包括：人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)或人乳头瘤病毒(HPV)。