CN104651366A - 小麦microRNA408及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小麦microRNA408及其编码基因与应用。本发明提供了一种microRNA，是如下1)或2)：1)序列表中序列2所示的RNA；2)将序列表中序列2所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物开花相关的由序列2衍生的RNA。本发明的实验证明，本发明通过克隆TamiR408基因，发现利用该基因所得的转基因农作物具有抽穗时间提前、株型改变等表型。本发明要解决的技术问题是在小麦中过表达TamiR408基因，改良小麦成熟期和株型等农艺性状，明确其在农业生产中的应用，挖掘其潜在的经济价值和社会价值。

Description

小麦microRNA408及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及小麦microRNA408及其编码基因与应用。

背景技术

microRNA(简称miRNA)是一类内源、非编码的小分子RNA，通过对靶基因mRNA的降解或翻译的抑制来调控遗传信息的传递(Carrington and Ambros,2003)。据统计，约有1％的miRNA存在于真核生物的基因组中，负责调控约10-30％的基因(Cui et al.,2006)。在植物中，研究发现miRNA基因常位于编码基因之间，通过靶基因mRNA来调节植物生长发育、激素响应、生长时期转换、抗逆抗病等，对植物生长发育具有重要的调控作用(Rubio-Somoza et al.,2011)，例如：叶和花的发育(Kidner et al.,2010)、花器官的形成(Chen et al.,2004)、生殖细胞代谢(Allen et al.,2005)、茎端分生组织的发育(Hao et al.,2011)等。同时，miRNA能够响应外界胁迫(Kruszka et al.,2012)，包括干旱胁迫(Zeng et al.,2010)、温度胁迫(Barakat et al.,2012)、盐胁迫(Frazier et al.,2011)、氧化胁迫(Sunkar etal.,2006)和紫外胁迫(Wei et al.,2009)等，调节植物体内的miRNA种类和数量随环境的变化而发生变化(周婧，2010)。

miR408是一段21个核苷酸组成的miRNA分子(王波，2006)，是植物中高度保守的32个miRNAs之一(李培旺，2007；魏强，2013)。目前，已在33个物种中发现miR408基因，包括拟南芥、水稻、白杨属、苜蓿物种中各1个，松柏类的1个物种，苔藓类2个物种(魏强，2013)，另外还包括其他一些不常见物种。有报道表明，5个保守的miRNAs：miR159、miR164、miR167、miR171和miR444在植物的激素信号调节中起作用(Reinhart et al.，2002；Guo et al.，2005)，miR159a通过MYB转录因子作用于GA和ABA信号系统(Achard et al.，2004；Schwab et al.，2005)，miR164a和miR167a则分别通过转录ARFs和NAC来控制生长素信号系统(Rhoades et al.，2002)；miR171和miR444控制的则是花的形态和发育，其作用机制是分别调控转录因子SCL和MADS box(Rhoades et al.，2002；Lang et al.，2011；Zhang et al.，2006)。

关于miR408靶基因的功能认知基本是一致的。miR408保守的靶基因是铜离子结合蛋白(马圣运，2012)、Laccase(Abdel-Ghany and Pilon,2008)和plantacyanins(Weigel etal.,2003；Abdel-Ghany and Pilon,2008；Trindade et al.,2010)。第一类：铜离子结合蛋白在拟南芥、苜蓿、水稻和白杨属中均已得到证实，主要是维持植物体内铜的稳态；第二类：目前在拟南芥中发现的基因较多，如LAC3，LAC12和LAC13，除了维持铜的稳态外，还可以参与干旱胁迫和植物细胞壁的生物合成；第三类：质体蓝素家族的一种蓝铜结合蛋白，主要是参与植物的生殖发育。在拟南芥中，预测到miR408的靶基因是铜类蛋白的转录因子plantacyanins和laccases，确认LAC3，LAC12和LAC13是靶基因(Abdel-Ghany and Pilon,2008)。

在小麦miRNA的研究中，高通量测序是一种高效快速的方法。2013年，Meng等人对小麦谷粒中的miRNA进行了研究，发现了605个保守的miRNA以及268个新的miRNA。其中104个miRNA参与对谷粒饱满度的调控，miRNA在调控谷粒的产量以及面粉的质量上发挥了极为重要的作用(Meng et al.,2013)。Bharati等人在小麦miRNA研究中，得到4677个miRNA，分别属于50个miRNA家族，其中有5个响应非生物胁迫的miRNA被发现，分别是：Ta-miR5653，Ta-miR855，Ta-miR819k，Ta-miR3708和Ta-miR5156。其中有四个先前就被预测得到的四个miRNA：Ta-miR1122，miR1117，Ta-miR1134 and Ta-miR1133也被预测到，它们的靶基因是参与泛素转运的蛋白(Pandey et al.,2013)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种microRNA。

本发明提供的microRNA，其为microRNA408，是如下1)或2)：

1)序列表中序列2所示的RNA；

2)将序列表中序列2所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与植物开花相关的由序列2衍生的RNA。

上述一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。

编码上述microRNA的DNA分子也是本发明保护的范围。

上述DNA分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码与植物开花相关RNA的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码与植物开花时间相关RNA的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

转基因细胞不包括植物繁殖材料。

上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体中，得到表达上述microRNA的重组载体。

在本发明的实施例中，表达载体为pZP211::UBI。

上述重组载体为将序列表中序列1所示的核苷酸替换pZP211::UBI载体的BamH Ⅰ与Kpn Ⅰ酶切识别位点间的DNA片段得到的质粒，命名为pZP211 UBI::TamiR408，为表达miR408的重组载体。

扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。

上述引物对具体为如下：

上游引物(TaMIR408-F)：5′-CTGGATCCGAGAGAAAGAGAGTTGATTTTGTGAG-3′(序列3)；

下游引物(TaMIR408-R)：5′-TTGGTACCCTATAACAGGGGCAGAAAATGG-3′(序列4)。

上述microRNA、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物开花时间和/或改变植物株型中的应用也是本发明保护的范围；

所述调节植物开花时间具体体现在抽穗时间提前和/或提高FT基因表达量；

所述改变植物株型具体体现在增加旗叶夹角、增加株高、增加节间距和/或提高叶绿素含量；

所述植物为双子叶植物或单子叶植物，所述单子叶植物具体为小麦。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为将编码上述microRNA408的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，

所述转基因植物具有如下特征：

1)所述转基因植物的抽穗时间早于所述目的植物；

2)所述转基因植物的FT基因表达量大于所述目的植物；

3)所述转基因植物的旗叶夹角大于所述目的植物；

4)所述转基因植物的株高大于所述目的植物；

5)所述转基因植物的节间距大于所述目的植物；

6)所述转基因植物的叶绿素含量大于所述目的植物。

上述方法中，所述编码上述microRNA的DNA分子通过上述的重组载体导入目的植物。

所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为小麦。

本发明的实验证明，本发明通过克隆TamiR408基因，该基因为miRNA前体，用包含TamiR408基因全长片段的DNA序列构建过表达载体，并导入农杆菌菌株，利用农杆菌介导法侵染小麦幼胚，建立了转基因小麦株系。将转基因小麦株系进一步培育后与野生型植株进行比较，发现利用该基因所得的转基因农作物具有抽穗时间提前、株型改变等表型。本发明要解决的技术问题是在小麦中过表达TamiR408基因，改良小麦成熟期和株型等农艺性状，明确其在农业生产中的应用，挖掘其潜在的经济价值和社会价值。

附图说明

图1为TamiR408基因在小麦不同组织和器官的表达模式分析图；

图2为TamiR408基因在小麦茎端分生组织单棱期、二棱期、穗分化期、小穗期等不同发育时期的表达模式；

图3为植物表达载体pZP211 UBI::TamiR408载体结构图；

图4为候选转基因小麦植株的获得过程，

图中A为小麦幼胚接种于预培养基；B为转基因愈伤组织在筛选培养基上进行筛选；C为愈伤组织分化候选转基因幼苗；D为候选转基因植株炼苗；E为候选转基因植株移栽；

图5为候选转基因植株的分子检测示意图，

图中A为筛选标记基因NPT Ⅱ的检测结果，B为目的基因TamiR408基因Southern blot杂交结果，C为实时定量PCR检测结果；其中，PC表示阳性质粒pZP211 UBI::TamiR408，M表示分子量标记2000，NC表示阴性对照，WT表示野生型植株，Gu105、S2-5、Gu107、Gu108为候选转基因株系；

图6为阳性转基因株系的抽穗时间表型及统计分析和开花相关基因FT基因表达情况，

图中A为抽穗时间表型观察，a为Gu105株系，b为S2-5株系，c为Gu107株系，d为Gu108株系；B为小麦植株生长至抽穗所需的发育时间统计；C为开花相关基因FT基因的相对表达量；其中，WT为野生型植株，TL为阳性转基因株系；

图7为阳性转基因株系旗叶夹角数据统计图；

图8为阳性转基因株系株高及节间距统计分析图，

图中A为株高表型观察，B为株高统计分析，C为植株节间距长度统计；

图9为阳性转基因株系叶绿素含量分析图；

以上图中，如无特别说明，WT表示野生型植株，Gu105、S2-5、Gu107、Gu108为阳性转基因株系；星号表示差异显著(T检验，**P(T<＝t)<0.01，*P(T<＝t)<0.05)，基因表达量分析均以小麦TaActin基因作为内参。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中进一步定义本发明，根据以上描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件；其中本发明将上述表达载体导入植物细胞中，导入方法都是本领域人员熟知的，这些方法包括但不仅限于：农杆菌介导的转化法、基因枪法、电激法、子房注射法等。本发明所用选择标记基因为新霉素磷酸转移酶基因(NPT Ⅱ)，可进一步包括其它选择标记基因和报告基因。本发明选用的筛选抗生素为G418，选用卡那霉素和巴龙霉素等抗生素也可起到相同筛选效果；除此之外，本发明所采用的均为本领域现有技术。

除非另有说明，否则本发明实例中的试剂药品和材料均可从商业途径得到，实验方法均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook and Russell,2001)。

实施例1、TamiR408基因克隆

一、TamiR408基因克隆

1、小麦RNA的提取和纯化

(1)称新鲜的小麦冬性品种轮选987(北京中农作科技发展有限公司，国审麦2003017号)材料0.1g，于液氮中研磨成粉末，向研钵中加入1ml Trizol，振荡混匀，使其充分裂解，室温静置5分钟；

(2)匀浆后，12000rpm，4℃离心10分钟；

(3)将上清(约900μl)吸入1.5ml的离心管中，加入200μl氯仿，涡旋振荡15秒，室温放置2-3分钟；

(4)12000rpm，4℃离心15分钟，取上层液相(大约500-600μl)移入另一离心管中(勿吸白色中间相)；

(5)加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒充分混匀，室温放置10分钟；

(6)12000rpm，4℃，离心10分钟，小心吸去上清；

(7)加入1ml-20℃预冷的75％乙醇水溶液，7000rpm，4℃离心10分钟，小心吸去所有乙醇，重复该步骤，室温干燥5分钟；

(8)加入20-30μl DEPC ddH₂O，55℃溶解10-15分钟，得到总RNA；

(9)为确保RNA质量达到测序要求，分别使用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测纯化后的RNA样品纯度和浓度，其中纯度和浓度标准为：RNA纯度为OD260/280和OD260/230均在1.8-2.0范围内，RNA浓度在1.0-2.0μg/μl范围内。

确定RNA质量合格后置于-80℃保存。

2、miRNA的qRT-PCR检测

miRNA cDNA第一链合成，采用在miRNA 3'末端加多聚A尾Poly(A)，再使用Oligo(dT)-Universal Tag进行逆转录反应，得到miRNA对应的cDNA第一链。

1)miRNA 3'末端加多聚A尾Poly(A)：

RNase free反应管冰浴预冷，加入如下试剂：2μg上述1得到的总RNA，0.4μl E.coliPoly(A)Polymerase(5U/μl)，2μl 10×Poly(A)Polymerase Buffer，4μl 5×rATP solution，加RNase-free ddH₂O将总体积补充至20μl。其中E.coli Poly(A)Polymerase最后加入；在反应中使用的total RNA必须含有小分子RNA。此过程也可以使用小分子RNA，建议加入量为2-5μl，可根据目的miRNA丰度决定加入量。

用移液器轻轻混匀反应液，瞬时离心，于37℃反应1小时。

2)Poly(A)修饰的miRNA逆转录反应

在RNase free反应管内加入如下试剂：2μl Poly(A)反应液，2μl 10×RT primer，2μl10×RT Buffer，1μl Super Pure dNTP Mixture(2.5mM each)，1μl Rnasin(40U/μl)，0.5μl Quant RTase，加RNase-free ddH₂O将总体积补充至20μl。

轻轻混匀后，瞬时离心，于37℃反应1小时。程序结束后，样品于-80℃冻存待用，得到cDNA。

3、TamiR408基因的克隆

根据TamiR408基因表达序列的相关信息(http://www.mirbase.org AccessionMI0006177)，采用RT-PCR方法设计加酶切位点的引物，以反转录的cDNA为模板进行扩增：

上游引物(TaMIR408-F)：5′-CTGGATCCGAGAGAAAGAGAGTTGATTTTGTGAG-3′(序列3)；

下游引物(TaMIR408-R)：5′-TTGGTACCCTATAACAGGGGCAGAAAATGG-3′(序列4)。

上游引物(TaMIR408-F)划横线部分为BamH Ⅰ酶切位点，下游引物(TaMIR408-R)划横线部分为Kpn Ⅰ酶切位点。

PCR扩增体系如下：1μl上游引物(TaMIR408-F，10μmol/μl)，1μl下游引物(TaMIR408-R，10μmol/μl)，5μl GC PCR buffer，4μl dNTP混合液(10mmol/L)，0.5μl Phusion酶(5U/μl)，2μl cDNA模板，加ddH₂O将总体积补充至50μl。扩增条件为：94℃预变性8分钟；94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸30秒，循环35次；72℃延伸10分钟。

扩增程序结束后，1％琼脂糖凝胶电泳，利用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司，北京)回收243bpPCR扩增产物。

2)基因测序

将胶回收产物与pZeroBack vetor(天根生化科技(北京)有限公司，北京)连接，按照pZeroBack vetor(天根生化科技(北京)有限公司，北京)说明书进行操作。

将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含羧苄青霉素(50mg/L)的LB固体培养基上过夜培养；挑取单菌落于LB液体培养基中(50mg/L)中培养，经菌液PCR鉴定(鉴定引物及体系同扩增程序)后进行测序分析(上海生工生物工程技术服务有限公司，上海)，其序列如序列表中序列1所示，该PCR产物所示的基因命名为TamiR408，其编码的MirRNA的核苷酸序列为序列表中序列2。

二、TamiR408基因表达模式分析

提取小麦冬性品种轮选987不同组织和器官的总RNA，并反转录为cDNA，实时定量PCR分析TamiR408基因的表达水平。

内参基因TaActin引物对序列如下：

上游引物：5'-TATGCCAGCGGTCGAACAAC-3'，如序列5所示；

下游引物：5'-GGAACAGCACCTCAGGGCAC-3'，如序列6所示；

目的基因TamiR408引物对序列如下：

上游引物：5'-GGATGGAGCAGAGCAAGG-3'，如序列7所示；

下游引物：5'-TGGCAACTCTCTCCCTCTTCTC-3'，如序列8所示；

实时定量PCR扩增体系为：SYBR，10μl；上游引物，0.5μl；下游引物，0.5μl；模板，2μl；ddH₂O将总体积补充至20μl。扩增条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火10秒，72℃延伸15秒，45个循环。

结果如图1所示，TamiR408基因在根、茎、叶鞘的表达量较高。

为明确TamiR408基因在茎端分生组织发育过程中的作用，分析了TamiR408基因在茎端分生组织不同生长发育时期的表达水平(图2)，TamiR408基因在小麦单棱期和二棱期的茎端分生组织及小穗中表达水平较低；在穗分化时期的茎端分生组织表达水平非常高，推测TamiR408基因可能在茎端分生组织发育成穗的时期具有重要作用，其作用机理需要进一步研究。

实施例2、TamiR408基因的功能研究

一、植物重组载体pZP211 UBI::TamiR408的构建

用限制性内切酶BamH Ⅰ与Kpn Ⅰ酶切pZP211::UBI表达载体(《玉米ZmAATP基因的克隆及遗传转化载体的构建》，山东农业大学学报(自然科学版)，2012,43(3)321-327；公众可从山东农业大学获得)和实施例1的一的3得到的PCR产物，将空表达载体酶切大片段和PCR产物酶切产物用用T4连接酶连接，操作步骤参照Fermentas公司产品T4 DNA ligase说明书进行。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有壮观霉素(50mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落，在含有壮观霉素(50mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA并进行BamH Ⅰ与Kpn Ⅰ酶切鉴定，得到243bp为阳性质粒。

该阳性质粒为将序列表中序列1所示的核苷酸替换pZP211::UBI载体的BamH Ⅰ与Kpn Ⅰ酶切识别位点间的DNA片段得到的质粒，命名为pZP211 UBI::TamiR408(图3)，为表达miR408的重组载体。

将表达载体pZP211 UBI::TamiR408(图3)转化农杆菌C58C1感受态细胞，并获得可供转化使用的农杆菌菌株,命名C58C1/pZP211 UBI::TamiR408(提取质粒BamH Ⅰ与Kpn Ⅰ酶切鉴定，得到243bp为C58C1/pZP211 UBI::TamiR408)。

二、农杆菌介导的小麦幼胚转化及抗性植株的获得

侵染前一天挑取农杆菌C58C1/pZP211 UBI::TamiR408单菌落，接种于含有50mg/L壮观霉素的YEP液体培养基中，28℃，180rpm振荡过夜。

收集小麦品种轮选987(以下也称为野生型小麦)授粉后10-12天的幼胚(长度在1.0mm-1.2mm之间)接种在预培养基上25℃暗培养4天(图4A)，将愈伤组织集中至灭菌小培养皿中，加入农杆菌悬浮液至愈伤组织全部浸没，室温放置30分钟。将农杆菌悬浮菌液吸出后，侵染的愈伤组织转移至带滤纸的灭菌空培养皿中，25℃暗培养2天，移至筛选培养基中(图4B)筛选2-3周，筛选剂为G418，筛选浓度为25mg/L，同时添加250mg/L羧苄青霉素抑制农杆菌生长；筛选后的愈伤组织转入分化培养基(图4C)。2周后，将分化得到的幼苗转入壮苗培养基(图4D)，将生长健壮的幼苗炼苗后，移栽至花盆(图4E)置于可控温室，得到T0代转TamiR408小麦。

本实验的培养基为添加了2.0mg/L dicamba的MS培养基(Murashige and Skoog,1962)，其中的dicamba为3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸。

三、转TamiR408小麦的分子检测

1、候选转基因植株的PCR检测

采用CTAB法(Sambrook and Russell，分子克隆实验指南，2001)提取T0代转TamiR408小麦株系S2-5、Gu105、Gu107、Gu108植株基因组DNA，设计引物检测标记基因NPT Ⅱ。以野生型小麦为对照。

标记基因NPT Ⅱ基因引物对如下：

上游引物：5'-GTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTG-3'，如序列9所示；

下游引物：5'-AGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGC-3'，如序列10所示；

标记基因NPT Ⅱ扩增序列长度为650bp，扩增条件为：94℃预变性8分钟；94℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸45秒，循环35次；72℃延伸10分钟。

结果如图5A所示，可以看出，得到650bp的为含有标记基因NPT Ⅱ的T0代转TamiR408小麦，表明S2-5、Gu105、Gu107、Gu108为阳性转基因植株。

野生型小麦没有650bp标记基因NPT Ⅱ。

2、利用Southern blot技术对候选转基因植株进行鉴定

以T0代转TamiR408小麦株系S2-5、Gu105、Gu107、Gu108叶片为实验材料，参照CTAB法提取总基因组DNA，按照Roche公司地高辛试剂盒的说明书步骤进行Southern杂交检测。以野生型小麦为对照。

探针引物对序列如下：

上游引物：5'-GAGAGAAAGAGAGTTGATTTTGTGAG-3'，如序列11所示；

下游引物：5'-CTATAACAGGGGCAGAAAATGG-3'，如序列12所示；

结果如图5B所示，小麦为异源六倍体，野生型植株可检测到三条内源带，候选T0代转TamiR408小麦株系Gu105、S2-5、Gu107和Gu108中均能检测到四条带，由此可知目的基因TamiR408为单拷贝插入，确定为阳性转基因植株。

3、实时定量PCR分析TamiR408基因在阳性转基因株系中的表达水平

提取T0代转TamiR408小麦株系S2-5、Gu105、Gu107、Gu108叶片的总RNA，并反转录为cDNA。

内参基因TaActin引物对序列如下：

上游引物：5'-TATGCCAGCGGTCGAACAAC-3'，如序列5所示；

下游引物：5'-GGAACAGCACCTCAGGGCAC-3'，如序列6所示；

目的基因TamiR408引物对序列如下：

上游引物：5'-GGATGGAGCAGAGCAAGG-3'，如序列7所示；

下游引物：5'-TGGCAACTCTCTCCCTCTTCTC-3'，如序列8所示；

实时定量PCR扩增体系为：SYBR，10μl；上游引物，0.5μl；下游引物，0.5μl；模板，2μl；ddH₂O将总体积补充至20μl。扩增条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火10秒，72℃延伸15秒，45个循环。

结果如图5C所示，阳性转基因株系Gu105、S2-5、Gu107、Gu108中TamiR408基因的表达量均高于野生型植株，说明TamiR408基因不仅整合到阳性转基因植株的基因组内，而且在阳性转基因小麦体内转录水平得到有效表达。

从上述结果可以看出，T0代转TamiR408小麦株系S2-5、Gu105、Gu107、Gu108为阳性转TamiR408小麦。

采用同样的方法将空载体pZP211::UBI转入野生型小麦中，得到T0代转pZP211::UBI小麦，按照上述方法检测，结果与野生型无显著差异。

将上述T0代植株播种，培育，得到T1代植株。

四、阳性转基因株系表型分析

1、抽穗时间

将T1代转pZP211::UBI小麦、T1代转TamiR408小麦株系S2-5、Gu105、Gu107、Gu108和野生型小麦同时播种，对各株系的抽穗时间进行观察和统计，每个株系20株，实验重复3次，结果取平均值。

在播种后第193天，观察表型如图6A所示，可以看出，T1代转TamiR408小麦株系抽穗时间早于野生型小麦；

在播种后第193天，统计抽穗时间结果如图6B所示，Gu105株系抽穗时间比野生型植株提前约5天；S2-5、Gu107、Gu108株系抽穗时间比野生型植株提前约4天。统计结果分析达到极显著差异，说明阳性转基因株系的抽穗时间明显提前。

T1代转pZP211::UBI小麦和野生型小麦抽穗时间结果统计分析无显著差异。

2、FT基因表达量检测

FT基因编码产生的成花激素能调控植物的开花时间，因此FT基因是成花转变所必需的(Kardailsky et al.,1999；Kojima et al.,1999)。

提取T1代转pZP211::UBI小麦株系Gu105、S2-5、Gu107、Gu108小穗的总RNA，并反转录为cDNA，实时定量PCR分析FT基因的表达量，以T1代转pZP211::UBI小麦和野生型小麦为对照。

内参基因TaActin引物对序列如下：

上游引物：5'-TATGCCAGCGGTCGAACAAC-3'，如序列5所示；

下游引物：5'-GGAACAGCACCTCAGGGCAC-3'，如序列6所示；

目的基因FT引物对序列如下：

上游引物：5'-CTTCGTCCGGACCACCAACCTC-3'，如序列13所示；

下游引物：5'-GGTTGGGATCGCTTGGACTTG-3'，如序列14所示；

实时定量PCR扩增体系为：SYBR，10μl；上游引物，0.5μl；下游引物，0.5μl；模板，2μl；ddH₂O将总体积补充至20μl。扩增条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火10秒，72℃延伸15秒，45个循环。

结果如图6C，与野生型小麦相比，在不同转基因株系中FT基因的表达量均为上调，并且上调幅度与转基因小麦的抽穗时间提前程度相一致。表明FT基因表达量的上调是引起阳性转基因小麦株系抽穗时间提前的重要因素之一。

T1代转pZP211::UBI小麦和野生型小麦结果无显著差异。

3、旗叶夹角

将T1代转pZP211::UBI小麦、T1代转TamiR408小麦株系S2-5、Gu105、Gu107、Gu108和野生型小麦同时播种，小麦进入乳熟期后，统计各株系旗叶夹角度数。每个株系20株，实验重复3次，结果取平均值。

结果如图7所示，野生型植株旗叶夹角为90度，Gu105株系旗叶夹角达到150度，有极显著差异；S2-5株系旗叶夹角为130度，有显著性差异；Gu107株系和Gu108株系旗叶夹角变化较小，约为105度，与野生型植株相比，无显著性差异。可见转基因植株具有旗叶夹角变大的表型。

T1代转pZP211::UBI小麦和野生型小麦结果无显著差异。

4、株高和节间距

将T1代转pZP211::UBI小麦、T1代转TamiR408小麦株系S2-5、Gu105、Gu107、Gu108和野生型小麦同时播种，小麦进入完全成熟后，统计各株系株高。每个株系20株，实验重复3次，结果取平均值。

结果如图8所示，8A显示表型，8B为株高统计数据；与野生型小麦植株相比，阳性转基因株系Gu105株高约高出6.9cm，阳性转基因株系S2-5高出约6.4cm，均有极显著差异。

统计上述株系的节间距，结果如图8C所示，第一节间距至第六节间距的节间长度依次缩短，不同的转基因株系同一节间距长度有所差异，阳性转基因株系Gu105的第一节间距最长；所有株系第四节间距和第五节间距长度变化较为明显。总体来说，与野生型小麦相比，阳性转基因株系节间距增长。

T1代转pZP211::UBI小麦和野生型小麦结果无显著差异。

5、叶绿素含量

将T1代转pZP211::UBI小麦、T1代转TamiR408小麦株系S2-5、Gu105、Gu107、Gu108和野生型小麦同时播种，小麦植株自授粉之日起28天内每隔7天进行一次叶绿素含量测定，测定方法参照《植物叶绿素测定方法的再探讨》(刘秀丽等，江苏农业研究，1990，20(3)：46-47)。

结果如图9所示，叶绿素含量总体变化趋势一致。授粉之日到授粉后21天，叶绿素含量维持较高水平，阳性转基因株系Gu105、S2-5、Gu107和Gu108的叶绿素含量均比野生型植株高；至授粉后28天，阳性转基因株系和野生型植株的叶绿素含量均急剧下降，可能与植株成熟有关。由此可见，自授粉开始至植株成熟，阳性转基因植株的叶绿素含量高于野生型植株。

T1代转pZP211::UBI小麦和野生型小麦结果无显著差异。

本发明将上述表达载体导入植物细胞中，导入方法都是本领域人员熟知的，这些方法包括但不仅限于：农杆菌介导的转化法、基因枪法、电激法、子房注射法等。本发明所用选择标记基因为新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)，可进一步包括其它选择标记基因和报告基因。本发明选用的筛选抗生素为G418，选用卡那霉素和巴龙霉素等抗生素也可起到相同筛选效果。本发明中TamiR408基因及含有该基因的植物表达载体也可以用于生产其它可以改良农艺性状的转基因植物，包括此类转基因植物的器官、组织、细胞及其种子和后代。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种microRNA，是如下1)或2)：

1)序列表中序列2所示的RNA；

2)将序列表中序列2所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与植物开花相关的由序列2衍生的RNA。

2.编码权利要求1所述microRNA的DNA分子。

3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码与植物开花相关RNA的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码与植物开花时间相关RNA的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：

所述重组载体为将权利要求2或3所述DNA分子插入表达载体中，得到表达权利要求1所述microRNA的重组载体。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述表达载体为pZP211::UBI。

7.扩增权利要求2或3所述DNA分子全长或其任意片段的引物对。

8.权利要求1所述microRNA、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物开花时间和/或改变植物株型中的应用；

所述调节植物开花时间具体体现在抽穗时间提前和/或提高FT基因表达量；

所述改变植物株型具体体现在增加旗叶夹角、增加株高、增加节间距和/或提高叶绿素含量；

所述目的植物具体为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物进一步具体为小麦。

9.一种培育转基因植物的方法，为将编码权利要求1所述microRNA的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，

所述转基因植物具有如下特征：

1)所述转基因植物的抽穗时间早于所述目的植物；

2)所述转基因植物的FT基因表达量大于所述目的植物；

3)所述转基因植物的旗叶夹角大于所述目的植物；

4)所述转基因植物的株高大于所述目的植物；

5)所述转基因植物的节间距大于所述目的植物；

6)所述转基因植物的叶绿素含量大于所述目的植物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述编码权利要求1所述microRNA的DNA分子通过权利要求4或5所述的重组载体导入目的植物；

所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为小麦。