CN101285100A - 一种利用原位合成微流体芯片的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用原位合成微流体芯片的检测方法，包括以下步骤：1)利用现有模式植物上公开报道的非编码小RNA的序列，优选miRNA的序列信息，依据其正义链或其负义链序列设计互补的寡核苷酸杂交探针；2)用原位合成方法制备寡聚核苷酸芯片；3)从待检测植物中提取小于50核苷酸碱基的小RNA，进行末端标记后与上述芯片中的探针杂交，获得芯片杂交的结果，进行定性和定量分析。本发明的检测方法，可用于生物信息学方法预测获得的miRNA(和其它sNC－RNA)的验证，也可用于新的植物物种中miRNA(和其它sNC－RNA)的检测、鉴定，还可用于不同处理条件下(如病毒侵染条件下)miRNA(和其它sNC－RNA)变化关系的测定。

Description

一种利用原位合成微流体芯片的检测方法

技术领域

本发明涉及植物中非编码小RNA的检测和鉴定方法，尤其涉及采用芯片检测已知miRNA的方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核生物中的非编码小RNA，它们通过与靶标mRNA序列互补而进行转录后调控，在植物生长发育的基因表达调控过程中发挥着重要作用。保守性是miRNAs功能的指示器，保守miRNAs在保守基因的调节过程中扮演着非常重要的角色，如叶和花的形态学以及信号转导。不保守miRNAs可能在特定的植物物种中扮演着更多特定的角色，如棉花纤维的分化和延伸。miRNA在动物或者植物的不同种群中都存在高度的保守性。例如，在动物中miRNAs，如miR7和miR18在从蠕虫到人类都是保守的。miRNAs的保守性在植物中也同样存在，研究发现一些植物miRNAs不仅存在于单子叶和双子叶植物中，而且也存在于蕨类和苔类植物中。miRNA的种间保守性特征为根据现有报道预测其它植物中的miRNA提供了可能，但至今还没有公开报道这方面的系统方法。根据Sanger miRbase数据库(Release 7.1，http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)，到2006年为止已经在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicago truncatula)、水稻(Oryza sativa)、毛果杨(Populus trichocarpa)、高粱(Sorghum bicolor)、甘蔗(Saccharumofficinarum)和玉米(Zea mays)等8种高等植物中报道了731条前体miRNA，分布于68个保守的miRNA家族中。以上miRNA主要是根据miRNA结构特征通过生物信息学方法推测得到，其中只有少部分miRNA得到实验验证。

目前获得植物中miRNA存在信息的方法，主要是根据已经报道的植物基因组序列进行计算机推测。其确定标准是：1)序列必须能折叠出发夹结构，且发夹中不存在突环；2)miRNA成熟序列必须位于发夹结构的臂；3)miRNA与其对侧的miRNA^*存在少于6个碱基的失配；4)pre-miRNA具有30～75％的A+U含量；5)预测得到的发夹结构具有较高的minimalfree energy index(MFEIs)和较低的negaive minimal free energies(MFEs)。但是这些推测得到的miRNA需要通过试验验证才能确定。

目前对基于生物信息学手段得到的miRNA(或其他sNC-RNA)进行生物学验证，或对于未进行生物信息学预测的物种中的miRNA(或其他sNC-RNA)进行鉴定和检测的方法还比较欠缺。

以miRNA为例，迄今为止进行验证的方法有基因克隆、Northern杂交、RT-PCR鉴定等。

基因克隆方法：对完全未知的生物物种的miRNA主要是采用(试剂盒)提取小于200nt(或50nt)的单链RNA(ssRNA)，用3′和5′接头连接，或用RACE试剂盒进行扩增获得其全长cDNA，然后与载体连接、克隆、测序。对于其他sNC-RNA其基因克隆方法也是一样。该方法由于涉及到小RNA操作，而单链RNA极容易降解，在操作上对实验条件和技术要求较高。尤其是，不同miRNA表达丰度存在差异，采用该方法往往容易获得那些高丰度的miRNA的克隆，对于低丰度表达的miRNA则不容易获得其克隆产物。用该方法获得一条新的miRNA，连接、扩增、克隆及其鉴定、测序和序列比较的时间至少需要2天以上。用该方法获得一个物种样品的大部分miRNA需要耗费较长时间、人力和试剂。

Northern杂交方法：首先，在获得miRNA的cDNA克隆或通过DNA合成方法获得待检测的miRNA(如经过生物信息学手段已经预测到)的cDNA序列，然后对该cDNA克隆进行同位素或荧光标记，通过提取样品中的小RNA或总RNA，进行电泳分离，获得小RNA条带，然后进行转膜(将RNA转到杂交膜上)、用上述标记探针杂交，根据有无杂交信号来确定样品中该miRNA的存在和含量。由于miRNA较小(目前发现的miRNA均在22nt左右)，作为同位素标记探针的杂交效率比较低，尤其是转膜杂交条件下，检测的灵敏度和特异性不容易保证。显然该方法每次杂交只能检测一条miRNA(或sNC-RNA)，用其检测同一物种中所有可能存在的miRNA，需要制备相当量的探针进行相同参数的杂交试验。比如，需要检测某一物种中可能存在的100个miRNA，就需要制备100条对应的探针，进行100次独立的杂交试验。但是该方法一次杂交可以检测数个样品。该方法目前广泛用于对少数样品中已知miRNA的检测。

RT-PCR方法：在miRNA序列已知的条件下，可以用ssRNA的RT-PCR扩增方法进行检测。但是，miRNA比较短小，不是非常适合进行PCR扩增，其扩增效率和特异性难以保证。目前采用了在miRNA两端加上已知接头后再进行RT-PCR扩增或用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)来增加其灵敏度和进行量化分析。但是，用以上方法同样每次PCR反应只能检测一条miRNA(或sNC-RNA)，比如，需要检测某一物种中可能存在的100个miRNA，则需要制备100对特异性引物，进行100次独立的PCR试验。用该方法获得一条新的miRNA，逆转录、PCR扩增及其电泳检测(RT-PCR)或数据分析(Real-Time PCR)的时间至少需要2天以上。

芯片检测是基于杂交方法建立起来的高通量检测技术。原位合成芯片检测的特点是：1)对单个探针进行定位定量合成；2)同一条探针在不同的芯片位点上分别合成，在同一杂交环境下同时杂交，保证了结果的重复性；3)探针原位合成和杂交的条件用计算机控制，因此，不同芯片的杂交结果能够横向比较，便于进行量化分析与比较；4)同一张芯片可以用两种荧光染料(如Cy3和Cy5)分别标记不同的样品，使得杂交结果可以平行比较；5)标记样品可以在条件实验的基础上，对数千个探针进行同时杂交，其杂交信号结果可以在条件实验的基础上进行归一化处理。因此，与现有核酸杂交检测方法相比，原位合成芯片具有灵敏度高、高通量和简便快捷的优点。原位合成微流体芯片方法所制备的探针在纯度、密度和均一性方面明显优于其它芯片方法，并已成功应用于人类小RNA的定量研究。高通量、高灵敏度的基因芯片方法的开发，使之可能成为一种最理想的有效检测miRNA表达的方法。2004年，Liu等首次用该方法在哺乳动物的不同肿瘤细胞中检测到了245个miRNA，而且被Northern杂交，RT-PCR所证实。之后，基因芯片技术在miRNA的快速鉴定和表达研究中的应用取得了快速发展。2005年，Bentwich等运用miRNA芯片技术，检测人类细胞内的miRNA表达图谱，克隆到了89条新miRNA。但是，以上研究仅限于对一个物种已经报道的miRNA进行高通量检测，至今还没有用现有物种已知的miRNA去检测、发现其它物种的未知miRNA的报道。

主要参考文献：

1.段成国，王春晗，郭惠珊.microRNA对植物生长发育和病毒侵染的调控.科学通报，2006，(04)：369-377.

2.马立人，蒋中华.生物芯片.北京：化学工业出版社，2001-2171.

3.Zhang B H，Pan X P，Wang Q L，et al.Identification and characterization of new plant microRNAs usingEST analysis.Cell Res，2005，15：336-360.

4.Sunkar R，Girke T，Zhu，J K.Identification and characterization of endogenous small interfering RNAsfrom rice.Nucleic Acids Res，2005，33：4443-4454.

5.Liu C G，Calin G A，Meloon B，et al.An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profilingin human and mouse tissues.Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101(26)：9740-9744.

Bentwich I，Avniel A，Karov Y，et al.Identification of hundreds of conserved and nonconserved humanmicroRNAs.Nat Genet，2005，37(7)：766-770.

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种原位合成微流体芯片，利用该芯片的高通量检测方法，可用于生物信息学方法预测获得的miRNA(和其它sNC-RNA)的验证，也可用于新的植物物种中miRNA(和其它sNC-RNA)的检测、鉴定，还可用于不同处理条件下(如病毒侵染条件下)miRNA(和其它sNC-RNA)变化关系的测定。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用原位合成微流体芯片的检测方法，包括以下步骤：

1)、利用现有模式植物上公开报道的非编码小RNA的序列，优选miRNA的序列信息，依据其正义链或其负义链序列设计互补的寡核苷酸杂交探针，用于制作植物sNC-RNA或miRNA的检测芯片；

2)、用原位合成方法制备寡聚核苷酸芯片，并通过与DNA互补探针杂交以检测其特异性和灵敏度；

3)、从待检测植物中提取小于50核苷酸碱基的小RNA，进行末端标记后与上述芯片中的探针杂交，获得芯片杂交的结果，进行定性和定量分析。

作为本发明的利用原位合成微流体芯片的检测方法的改进：步骤1)为：收集源自高等植物的miRNA序列或者是根据生物信息学预测的序列；然后通过序列比对，去除冗余序列后获得成熟非编码小RNA序列；再根据上述非编码小RNA序列设计互补探针，探针包括成熟miRNA的互补序列及其相同的序列，探针大小为全长的或近全长的非编码小RNA。

作为本发明的利用原位合成微流体芯片的检测方法的进一步改进：步骤2)为：

先采用原位合成技术在微流体芯片上合成序列互补探针：

在原位合成微流体芯片上，依次合成化学修饰过的寡聚核苷酸探针序列和延伸臂片段，所述寡聚核苷酸探针序列为miRNA互补序列、单链cDNA；所述延伸臂片段使与其连接的寡聚核苷酸探针序列片段离片基有一定的距离，延伸臂为在miRNA探针基部的8～25个碱基的非特异性序列，是已知动物或人类基因组序列中与植物miRNA同源性低于25％的序列；

然后再进行芯片质量检测：

对合成好的芯片在芯片扫描仪上进行荧光分析，以检测芯片本身的荧光本底；用质控cDNA或体外转录获得的小RNA进行末端标记后与芯片进行杂交，包括用已知样品进行标记、杂交和检测，以分析芯片特异性、灵敏度和重复性。

作为本发明的利用原位合成微流体芯片的检测方法的进一步改进：步骤3)为选用以下两种方法中的任意一种：

方法A、用常规方法或试剂盒从待检测植物中提取小于50nt的RNA，用末端标记试剂进行末端标记后与上述芯片探针进行杂交，用扫描仪(如GenePix 4000B，Molecular Device)扫描芯片，获得杂交图谱；

方法B、用芯片分析软件获取每个探针的荧光信号强度和标准误，信号值经过背景噪音减除后，通过调整该扫描通道下的平均信号值到同一水平对数据进行归一化处理；

对以上获得的数据可以进行横向或纵向的比较分析，相同合成条件下获得的芯片，其杂交数据也可以进行对比分析，确定检测结果。

为了获得本发明的利用原位合成微流体芯片的检测方法，发明人根据其它植物上报道的miRNA序列设计探针，并用原位合成方法制备微流体基因芯片，以实现在一张芯片上检测数百种(甚至上千种)植物miRNA(和其它sNC-RNA)。

本发明的技术路线如图1所示，具体表述如下：

1)、收集其它模式植物上公开报道的非编码小RNA(small non-coding RNA，sNC-RNA)，尤其是miRNA的序列信息。源自高等植物的miRNA序列主要来自以下网站：http://microrna.sanger.ac.uk/sequences。截至2006年，已有拟南芥、大豆、苜蓿、水稻、毛果杨、高粱、甘蔗和玉米等8种植物报道了miRNA。

2)、通过序列比对，除去那些冗余序列：亦即对于在不同物种上出现的序列完全相同的miRNA(或其它sNC-RNA)只保留一条序列。常见的植物miRNA探针序列见表1所示。

3)、根据以上成熟的miRNA(或其它sNC-RNA)的序列，设计互补探针；探针包括成熟miRNA的互补序列及其相同的序列，探针大小为全长的或近全长的miRNA(或其它sNC-RNA)。

4)、在原位合成微流体芯片上，依次合成延伸臂(8～12nt)和化学修饰过的寡聚核苷酸探针序列：即miRNA互补序列，均为单链cDNA。延伸臂为重复的连续的T或连续的A，或为植物组织中未见出现的其它序列；寡聚核苷酸探针的化学修饰是为了保护探针不被核酸酶识别和降解，如将采用所有甲基化的A。

5)、芯片质量检测：对合成好的芯片在芯片扫描仪上进行荧光分析，以检测芯片本身的荧光本底；用质控cDNA或体外转录获得的小RNA进行末端标记后与芯片进行杂交，包括用已知样品进行标记、杂交和检测，以分析芯片特异性、灵敏度和重复性。

6)、应用方法：A、用常规方法(或试剂盒)从待检测植物中提取小于50nt的RNA，用末端标记试剂(如TaKaRa-大连宝生物公司5′末端标记试剂盒)进行末端标记后与上述芯片探针进行杂交，用扫描仪(如GenePix 4000B，Molecular Device)扫描芯片，获得杂交图谱。

B、用芯片分析软件(如Array-Pro分析软件：美国Media Cybernetics公司)，获取每个探针的荧光(Cy3或Cy5)信号强度和标准误。信号值经过背景噪音减除后，通过调整该扫描通道下的平均信号值到同一水平对数据进行归一化处理。对以上获得的数据可以进行横向或纵向的比较分析，相同合成条件下获得的芯片，其杂交数据也可以进行对比分析，确定检测结果。

表1

miRNA	探针序列(5′-3′)
		ath-miR156a	GTGCTCACTCTCTTCTGTCA
ath-miR156g	TGTGCTCACTCTCTTCTGTCG
		ath-miR156h	GTGCTCTCTTTCTTCTGTCAA
ath-miR157a	GTGCTCTCTATCTTCTGTCAA
		ath-miR157d	GTGCTCTCTATCTTCTGTCA
ath-miR158a	TGCTTTGTCTACATTTGGGA
		ath-miR158b	TGCTTTGTCTACATTTGGGG
ath-miR159a	TAGAGCTCCCTTCAATCCAAA
		ath-miR159b	AAGAGCTCCCTTCAATCCAAA
ath-miR159c	AGGAGCTCCCTTCAATCCAAA
		ath-miR160a	TGGCATACAGGGAGCCAGGCA
ath-miR161	CCCCGATGTAGTCACTTTCAA
		ath-miR162a	CTGGATGCAGAGGTTTATCGA
ath-miR163	ATCGAAGTTCCAAGTCCTCTTCAA
		ath-miR164a	TGCACGTGCCCTGCTTCTCCA
ath-miR164c	CGCACGTGCCCTGCTTCTCCA
		ath-miR165a	GGGGGATGAAGCCTGGTCCGA
ath-miR166a	GGGGAATGAAGCCTGGTCCGA
		ath-miR167a	TAGATCATGCTGGCAGCTTCA
ath-miR167c	AAGATCATGCTGGCAGCTTAA
		ath-miR167d	CCAGATCATGCTGGCAGCTTCA
ath-miR168a	TTCCCGACCTGCACCAAGCGA
		ath-miR169a	TCGGCAAGTCATCCTTGGCTG
ath-miR169b	CCGGCAAGTCATCCTTGGCTG
		ath-miR169d	CGGCAAGTCATCCTTGGCTCA
ath-miR169g*	AGCCAAGGTCAACTTGCCGGA
		ath-miR169h	CAGGCAAGTCATCCTTGGCTA

ath-miR170	GATATTGACACGGCTCAATCA
		ath-miR171a	GATATTGGCGCGGCTCAATCA
ath-miR171b	CGTGATATTGGCACGGCTCAA
		ath-miR172a	ATGCAGCATCATCAAGATTCT
ath-miR172b*	GTGAATCTTAATGGTGCTGC
		ath-miR172c	CTGCAGCATCATCAAGATTCT
ath-miR172e	ATGCAGCATCATCAAGATTCC
		ath-miR173	GTGATTTCTCTCTGCAAGCGAA
ath-miR319a	GGGAGCTCCCTTCAGTCCAA
		ath-miR319c	AGGAGCTCCCTTCAGTCCAA
ath-miR390a	GGCGCTATCCCTCCTGAGCTT
		ath-miR391	TGGCGCTATCTCTCCTGCGAA
ath-miR393a	GATCAATGCGATCCCTTTGGA
		ath-miR394a	GGAGGTGGACAGAATGCCAA
ath-miR395a	GAGTTCCCCCAAACACTTCAG
		ath-miR395b	GAGTCCCCCCAAACACTTCAG
ath-miR396a	CAGTTCAAGAAAGCTGTGGAA
		ath-miR396b	AAGTTCAAGAAAGCTGTGGAA
ath-miR397a	CATCAACGCTGCACTCAATGA
		ath-miR397b	CATCAACGATGCACTCAATGA
ath-miR398a	AAGGGGTGACCTGAGAACACA
		ath-miR398b	CAGGGGTGACCTGAGAACACA
ath-miR399a	CAGGGCAAATCTCCTTTGGCA
		ath-miR399b	CAGGGCAACTCTCCTTTGGCA
ath-miR399d	CGGGGCAAATCTCCTTTGGCA
		ath-miR399e	CGAGGCAAATCTCCTTTGGCA
ath-miR399f	CCGGGCAAATCTCCTTTGGCA
		ath-miR400	GTGACTTATAATACTCTCATA
ath-miR401	TGTCGGTCGACACCAGTTTCG
		ath-miR402	CAGAGGTTTAATAGGCCTCGAA
ath-miR403	CGAGTTTGTGCGTGAATCTAA
		ath-miR404	GCTGCCGCAACCGCCAGCGTTAAT
ath-miR405a	AGTTATGGGTTAGACCCAACTCAT
		ath-miR406	CTGGATTACAATAGCATTCTA
ath-miR407	ACCAAAAGTATATGATTTAAA
		ath-miR408	GCCAGGGAAGAGGCAGTGCAT
ath-miR413	GTGCAGAACAAGAGAAACTAT
		ath-miR414	TGACGATGATGATGAAGATGA
ath-miR415	ATGTTCTGTTTCTGCTCTGTT
		ath-miR416	TGAACAGTGTACGTACGAACC
ath-miR417	TCGAACAAATTCACTACCTTC
		ath-miR418	GGTCAGTTCATCATCACATTA
ath-miR419	CAACATCCTCAGCATTCATAA
		ath-miR420	TGCATTTCCGTGATTAGTTTA
ath-miR426	CGTAAGGACAAATTTCCAAAA
		ath-miR447a	CAACAAAACATCTCGTCCCCAA
ath-miR447c	CAACAAAAGATGTCGTCCCCAA

ath-miR771	GAGGGCTACCACAGAGGCTCA
		ath-miR772	GTATGGGCGGAGTAGGAAAAA
ath-miR773	GAGACAAAAGCTGGAAGCAAA
		ath-miR774	GATGGCCATATGGGTAACCAA
ath-miR775	TTGGCACTGCTAGACATCGAA
		ath-miR776	AACATCAATAGAAGACTTAGA
ath-miR777	AGCAACGAAACTCAATGCGTA
		ath-miR778	CGGTGTACATAAACCAAGCCA
ath-miR779	ATGAGCAGCAACATAGCAGAA
		ath-miR780	TGCCAGATATTCACGAAGAAA
ath-miR781	TAAGTATCCAGAAAACTCTAA
		ath-miR782	AAGAACATCCAAGGTGTTTGT
ath-miR783	GAACATGAACGAGCAAAGCTT
		gma-miR156b	TGTGCTCTCTCTCTTCTGTCA
gma-miR319c	AGGAGCTCCTTTCAGTCCAA
		mtr-miR171	GATATTGGCACGACTCAATCA
mtr-miR395a	GAGTTCCCCCAAACACTTCAT
		mtr-miR395b	GAGTTCCCCCAAATACTTCAT
mtr-miR395g	GAGTTCCCCCAAACACTTCAA
		mtr-miR395h	AAGTTCCCCCAAACACTTCAT
mtr-miR395p	GAGTTCCCCCAAACGCTTCAA
		mtr-miR399a	CTGGGCAAATCTCCTTTGGCA
mtr-miR399b	CAGGGCAGCTCTCCTTTGGCA
		mtr-miR399d	TAGGGCAGCTCTCCTTTGGCA
osa-miR156l	TATGCTCACTCTCTTCTGTCG
		osa-miR159a	CAGAGCTCCCTTCAATCCAAA
osa-miR159c	TGGAGCTCCCTTCAATCCAAT
		osa-miR159d	CGGAGCTCCCTTCAATCCAAT
osa-miR159e	AGGAGCTCCCTTCAATCCAAT
		osa-miR159f	TAGAGCTCCCTTCAATCCAAG
osa-miR160e	CGGCATACAGGGAGCCAGGCA
		osa-miR160f	TGGCATTCAGGGAGCCAGGCA
osa-miR162b	CTGGATGCAGAGGCTTATCGA
		osa-miR164c	TGCACGTACCCTGCTTCTCCA
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		osa-miR164e	CTCACGTGCCCTGCTTCTCCA
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		osa-miR166g	GAGGAATGAAGCCTGGTCCGA
osa-miR166i	GAGGAATGAAGCCTGATCCGA
		osa-miR166k	AGGGATTGAAGCCTGGTCCGA
osa-miR166m	AGGGAATGAAGCCTGGTCCGA
		osa-miR167d	CAGATCATGCTGGCAGCTTCA
osa-miR168a	GTCCCGATCTGCACCAAGCGA
		osa-miR168b	TTCCCGAGCTGCACCAAGCCT
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		osa-miR169p	CCGGCAAGTTTGTCCTTGGCTA
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		osa-miR171b	GATATTGGCACGGCTCAATCA
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		osa-miR171h	AGTGATATTGGTTCGGCTCAC
osa-miR171i	GATATTGACGCGGCTCAATCC
		osa-miR172c	GTGCAGCATCATCAAGATTCA
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		ptc-miR171c	GATATTGGCGCGGCTCAATCT
ptc-miR171j	AGTATTGGCGCGGCTCAATCC
		ptc-miR171k	GATATTGGCGCGGCTCAATCC
ptc-miR172g	CTGCAGCATCATCAAGATTCC

ptc-miR172i	TTGCAGCATCATCAGGATTCT
		ptc-miR319i	GGGAGCTCCCTTCAGCCCAA
ptc-miR395a	GAGTTCCTCCAAACCCTTCAG
		ptc-miR396f	CAGTTCAAGAAAGCCGTGGAA
ptc-miR396g	AAGTTCAAGAAAGCCGTGGAA
		ptc-miR397b	CATCAACGCTGCACTCAATGG
ptc-miR397c	CATCAAAGCTCCACTCAATGA
		ptc-miR399d	CGGGGCAAATCTTCTTTGGCA
ptc-miR399h	CAGGGAAACTCTCCTTTGGCA
		ptc-miR399j	CCGGACAAATCTCCTTTGGCA
ptc-miR399k	GTGAGCAAATCTCCTTTGGCA
		ptc-miR399l	GAGGGCAACTCTCCTTTGGCG
ptc-miR472a	GGGATGGGTGGAGTAGGGAAAA
		ptc-miR472b	GGGATGGGTGGAGTTGGGAAAA
ptc-miR473a	TGGAAGCCTTGAGGGAGAGT
		ptc-miR473b	TGGAAGCCCTGAGGGAGAGC
ptc-miR474a	CCCAGCCAAACCCAGCAACTTTTG
		ptc-miR474b	CCCAGCCAAACCCAACAACTTTTG
ptc-miR474c	CCCAGCCAAACCCAACAGCTTTTG
		ptc-miR475a	CTTAATCAATGGGCACTGTAA
ptc-miR475c	CTTAATCAATGGACATTGTAA
		ptc-miR475d	CTTAATCAATGGACTCTGTAA
ptc-miR476a	CTTTGCAAAGAAGGATTACTA
		ptc-miR476b	TTTTGCAAAGAAGAATTACTA
ptc-miR477a	TTGGAAGCCTCTGAGGGAGAT
		ptc-miR478a	TCCCTAAAAATAGAAGACACGTCA
ptc-miR478d	TTCCTAAAAATAGAAGACACGTCA
		ptc-miR478e	TCCCTAAAAATAGAAGACTCGTCA
ptc-miR478f	TCCCTAAAAATAGAAGACATGTCA
		ptc-miR478h	TCCCTAAAAATAGGAGACACGTTA
ptc-miR479	GATGAGCCGGACCAATATCACA
		ptc-miR480a	GTTCAACGTCAATGATGTAGTAGT
ptc-miR480b	GTTCAACATCAATGATGTAGTAGT
		ptc-miR481a	GCTTAAGCTGTTAAGTGAGGTCCT
ptc-miR481d	GCTTAAGCTGTTAGGTGAGGTCTT
		ptc-miR481e	GCTTAAGCTGTTAGGTGAGGTCCT
ptc-miR482	GGAATGGGAGGAGTAGG
		sbi-miR156e	GTGCTCGCTCTCTTCTGTCA
sbi-miR164c	CTCACGTGTCCTGCTTCTCCA
		sbi-miR166a	GGGAATGAAGCCTGGTCCGA
sbi-miR171f	AGTGATATTGGTTCGGCTCAT
		sbi-miR172a	TGCAGCATCATCAAGATTCT
sbi-miR172b	TGCAGCATCATCAAGATTCC
		sof-miR159e	AAGAGCTCCTTTCAATCCAAA
sof-miR168b	GTCCCGATCTGCCCAAGCGA
		sof-miR408e	GCCAGGGAAGAGTCAGTGCAG
zma-miR162	TGGATGCAGAGGTTTATCGA

zma-miR169d	CATAGGCAGTCTCCTTGGCTA
		zma-miR169e	CGTAGGCAGTCTCCTTGGCTA
zma-miR171a	ATATTGGCGCGGCTCAATCA
		zma-miR171b	GTGATATTGGCACGGCTCAA
zma-miR171c	GATATTGGCACGGCTCAGTCA
		zma-miR171f	TGTGATATTGGCACGGCTCAA
zma-miR399b	CAGGACAGCTCTCCTTTGGCA

注表1中：ath：拟南芥；gma：大豆；mtr：苜蓿；osa：水稻；ptc：毛果杨；sbi：高粱；sof：甘蔗；zma：玉米。

对于根据生物信息学方法预测得到的miRNA(或其它sNC-RNA)检测芯片构建，完全参照以上步骤。但是，不需要收集已知序列，而直接利用预测得到的miRNA(或其它sNC-RNA)序列及其互补序列作为探针。

本发明在原位合成微流体芯片上合成11～23个碱基，优选9～21个碱基的单链cDNA作为杂交探针，以上探针序列分别与成熟的植物miRNA(或其它sNC-RNA)完全互补。

本发明的特点在于：不需要进行ncRNA的基因克隆而检测和鉴定这些miRNA和其它非编码小RNA；同时，本项目利用芯片杂交的高通量特征，可以同时检测一个样品中的数千个miRNA；同一张芯片可以用Cy3和Cy5分别标记两个样品，进行平行检测，因此可以比较样品之间的量化变化，或根据杂交信号强弱对不同处理样品的miRNA表达进行量化比较。本发明所检出的miRNA是物种间保守的和序列已知的，序列未知的miRNA不能用本方法检测。

本发明的方法是原位合成微流体芯片在检测植物miRNA方面的应用，是收集现有植物物种已知的miRNA合成检测芯片，用于检测其它植物物种未报道的miRNA(和其它sNC-RNA)。

本发明的优点为：与现有核酸杂交、RT-PCR检测方法检测待检测的植物miRNA相比，原位合成芯片检测方法具有灵敏度高、高通量和简便快捷的优点。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是植物sNC-RNA检测芯片制备的技术路线示意图。

具体实施方式

实施例1、植物sNC-RNA的制备及其对番茄miRNA的检测：

通过公共数据库Sanger miRbase(2005 Version 6.0)获得了7个物种(拟南芥、水稻、大豆、苜蓿、甘蔗、高粱和玉米)的513条miRNA中的165条非冗余序列信息和511条miRNA^*中的365条非冗余miRNA^*序列信息；5S Ribosome RNA Database和NCBI数据库4个物种(拟南芥、水稻、玉米和番茄)的7条序列信息；tRNA Database interface数据库5个物种(拟南芥、水稻、玉米、大豆和番茄)的113条序列信息；Non-coding RNAdatabase数据库5个物种(拟南芥、水稻、玉米、大豆和番茄)的349条序列信息。针对较短序列的miRNA和miRNA^*(21～29nt)，探针设计为其原始序列的互补链，较长序列5S rRNA、tRNA、ncRNA(42～303nt)，用探针设计软件Array designer 2(PREMIER Biosoft)设计了长度均为25nt，GC含量40～60％，自身无二级结构的寡核苷酸探针，每条序列筛选2～7条作为备用探针。寡核苷酸探针委托美国Atactic公司采用μParaflo^TM技术在31×128矩阵的微流体芯片上原位合成(530条miRNA、miRNA^*和65条番茄小分子RNA探针具有3个重复区，908条其它7个物种的小分子RNA探针具有2个重复区)。利用植物小分子RNA芯片分析了不同物种、不同类型的小分子RNA在健康番茄和CMV侵染组织样品中的表达。杂交结果显示：(1)设计的番茄探针中，5S rRNA、tRNA和ncRNA的序列检出率均为100％；(2)在设计的其它物种的探针中，5S rRNA序列检出率为100％，tRNA序列检出率为70.00％，其它sNC-RNA序列检出率为11.11％。

实施例2、番茄miRNA检测芯片及番茄miRNA对黄瓜花叶病毒(CMV)侵染的反应：

利用番茄miRNA芯片检测番茄miRNA及其互补序列(miRNA^*)的表达对植物病毒侵染的反应：通过公共数据库Sanger miRbase(2005Version6.0)获得了7个物种(拟南芥、水稻、大豆、苜蓿、甘蔗、高粱和玉米)的513条miRNA中的165条非冗余序列信息和511条miRNA^*(miRNA的互补序列)中的365条非冗余miRNA^*序列信息。在微流体芯片上设置6个重复区，分别研究番茄受CMV侵染和不侵染对照的miRNA响应。T-test检验方法分析CMV侵染和健康番茄组织小RNA样品中的基因差异表达(芯片P＜0.01)显示：51条番茄miRNA序列存在显著性差异表达，其中上调序列32，下调序列19。此外，一些miRNA^*在CMV侵染的番茄样品中出现了异常积累。此外，我们发现miR159/319家族(ath-miR159b、ath-miR159c、ath-miR319c、osa-miR159a、osa-miR159c、osa-miR159d、osa-miR159e和osa-miR159f)，miR160家族(ath-miR160a)，miR390家族(ath-miR390a)的部分miRNA成员没有发生差异表达。

实施例3、用原位合成微流体芯片鉴定甘蔗microRNA：

将Sanger数据库中收录、报道的拟南芥、大豆、苜蓿、水稻、毛果杨、高粱、甘蔗和玉米等8种高等植物中的731条前体miRNA序列进行比较，发现它们对应231条成熟miRNA。因此，本研究设计231条特异性探针，并采用原位合成技术制作植物miRNA微流体芯片。利用该芯片首次对甘蔗幼苗中表达的成熟miRNA和miRNA互补序列(miRNA^*)进行了检测。结果发现前人根据EST序列推测到可能存在于甘蔗中的16条前体miRNA中的15条分别对应于本研究的9条探针而被检测到。另外102条在其它植物上报道的成熟miRNA在甘蔗中被首次发现。以上111条探针对应的成熟miRNA分布在30个保守miRNA家族中。本研究验证了有关甘蔗miRNA的存在，其结果说明miRNA在高等植物具有高度保守性和普遍分布。

实施例4、用植物miRNA芯片测定番茄miRNA对不同致病性表型的响应的结果：

基于miRNA物种间高保守特性，我们采用原位合成技术，构建了植物miRNA检测芯片。参照Sanger miRbase 9.0数据库(2006)，芯片包含8个物种的294条miRNA和633条miRNA^*序列相应的探针。为了证明芯片杂交的可靠性，对芯片检测结果的特异性和芯片上重复矩阵的检测重复性进行了分析。错配探针均无杂交信号，说明芯片具有较强的检测特异性。同时，从重复区域随机选取部分探针对应点，比较其检测信号强度差异，结果CV值介于1％～5％，说明芯片检测重复性极佳。

番茄miRNA对不同致病性表型的响应的结果显示：利用本研究构建的第二代miRNA芯片，检测不同的CMV株系及其携带不同卫星RNA侵染35d番茄miRNA的响应情况，显示存在显著性的差异表达，且多数miRNA与致病性表型存在密切联系。芯片检测出的82条miRNA中有30条miRNA表达差异显著(经Cyclic LOWESS方法规一化，t检验P＜0.01，且倍性检验＞2)，占36.6％，分属于12个miRNA家族。其中，miR167、miR168和miR396家族在拟南芥中的研究结果已经证实与植物抗病性、叶柄形成及与逆境胁迫有关。对芯片检测结果进行聚类分析，发现miR398、miR390、miR403和miR168家族中部分成熟miRNA随着致病性表型的加重表达量逐渐增大，miR319、miR396和miR156家族中部分成熟miRNA随着致病性表型的加重表达量逐渐减少。以上结果说明：不同致病性的CMV侵染番茄，引起寄主miRNA表达量的变化具有明显差异，通过后者参与致病性表型发生。

实施例5、用原位合成微流体芯片鉴定半夏microRNA：

三叶半夏(Pinellia ternate(Thunb.)Breit)为天南星科(Araceae)半夏属多年生草本植物，是我国一种名贵的中药材，但是迄今为止还没有该药用植物序列和基因组学的系统研究，也极少有关于其序列和编码小RNA的报道。我们以Sanger数据库中收录的拟南芥等8种高等植物中的231条成熟miRNA作为探针，用原位合成技术制作植物miRNA微流体芯片。利用该芯片对三叶半夏不同种群和不同发育阶段成熟miRNA的表达情况进行了研究。结果发现：123条在其它植物上报道的成熟miRNA在三叶半夏均有存在发现。它们分布在31个保守miRNA家族中。柳叶型、桃叶型和心叶型三种叶型的三叶半夏miRNA种群数量基本一致。但是，23条miRNA(如miRNA169)在半夏的生长发育过程中变化较大，它们与半夏珠芽形成、块茎膨大和倒苗现象关系密切，如miRNA172b在半夏块茎形成过程中快速积累。

对照例1：

人工合成miR166a、miR159a、miR165a^*(该miRNA的互补序列，下同)、miR162a^*和miR172a的DNA杂交探针，委托上海生工合成并进行同位素末端标记。通过提取＜50nt的RNA，进行Northern杂交。采用包括以上探针的植物miRNA检测芯片进行对比试验。结果显示：Northern杂交方法3次重复实验中均获得了miR166a、miR159a、miR165a^*和miR162a^*的杂交信号，但是，只有1次获得了miR172a的杂交信号。植物miRNA检测芯片的3次杂交的9个重复中均检测到miR166a、miR159a、miR165a^*、miR162a^*和miR172a的杂交信号，其中miR172a的杂交信号均低于miR166a，约为其1/4。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1、一种利用原位合成微流体芯片的检测方法，其特征是包括以下步骤：

1)、利用现有模式植物上公开报道的非编码小RNA的序列，优选miRNA的序列信息，依据其正义链或其负义链序列设计互补的寡核苷酸杂交探针，用于制作植物sNC-RNA或miRNA的检测芯片；

2)、用原位合成方法制备寡聚核苷酸芯片，并通过与DNA互补探针杂交以检测其特异性和灵敏度；

3)、从待检测植物中提取小于50核苷酸碱基的小RNA，进行末端标记后与上述芯片中的探针杂交，获得芯片杂交的结果，进行定性和定量分析。

2、根据权利要求1所述的利用原位合成微流体芯片的检测方法，其特征是，所述步骤1)为：收集源自高等植物的miRNA序列或者是根据生物信息学预测的序列；然后通过序列比对，去除冗余序列后获得成熟非编码小RNA序列；再根据上述非编码小RNA序列设计互补探针，探针包括成熟miRNA的互补序列及其相同的序列，探针大小为全长的或近全长的非编码小RNA。

3、根据权利要求1或2所述的利用原位合成微流体芯片的检测方法，其特征是，所述步骤2)为：

先采用原位合成技术在微流体芯片上合成序列互补探针：

在原位合成微流体芯片上，依次合成化学修饰过的寡聚核苷酸探针序列和延伸臂片段，所述寡聚核苷酸探针序列为miRNA互补序列、单链cDNA；所述延伸臂片段使与其连接的寡聚核苷酸探针序列片段离片基有一定的距离，延伸臂为在miRNA探针基部的8～25个碱基的非特异性序列，是已知动物或人类基因组序列中与植物miRNA同源性低于25％的序列；

然后再进行芯片质量检测：

对合成好的芯片在芯片扫描仪上进行荧光分析，以检测芯片本身的荧光本底；用质控cDNA或体外转录获得的小RNA进行末端标记后与芯片进行杂交，包括用已知样品进行标记、杂交和检测，以分析芯片特异性、灵敏度和重复性。

4、根据权利要求3所述的利用原位合成微流体芯片的检测方法，其特征是，所述步骤3)为选用以下两种方法中的任意一种：

方法A、用常规方法或试剂盒从待检测植物中提取小于50nt的RNA，用末端标记试剂进行末端标记后与上述芯片探针进行杂交，用扫描仪(如GenePix 4000B，Molecular Device)扫描芯片，获得杂交图谱；

方法B、用芯片分析软件获取每个探针的荧光信号强度和标准误，信号值经过背景噪音减除后，通过调整该扫描通道下的平均信号值到同一水平对数据进行归一化处理；

对以上获得的数据可以进行横向或纵向的比较分析，相同合成条件下获得的芯片，其杂交数据也可以进行对比分析，确定检测结果。

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