CN103543270B - 一种蛋白质原位表达芯片及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种蛋白质原位表达芯片及其制备方法和应用，所述芯片包括固定有捕获载体的基底和置于基底上的微流控模板，所述基底上还分布有至少一个与表达捕获载体相结合的蛋白质，所述蛋白质通过在芯片上原位表达获得；所述流通池的两端分别设有流通池入口和流通池出口。本发明构建了不仅能用于传统的荧光检测，更重要的是还能用于生物传感器进行实时监测相互作用的动力学过程的蛋白质原位表达芯片；并且该蛋白质原位表达芯片可利用一定的重生缓冲液进行重生再利用。

Description

一种蛋白质原位表达芯片及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术和组织工程技术领域。本发明涉及一种蛋白质芯片，尤其涉及一种蛋白质原位表达芯片及其制备方法。
背景技术
蛋白质不仅是生命的重要构成部分，其功能以及其与生物分子的相互作用更是形成生命的关键一环。蛋白质阵列芯片是研究蛋白质（包括蛋白质分子之间，蛋白质分子和核酸及其其他小分子之间的相互作用）的重要方法和手段，其具有高通量的特性。目前蛋白质芯片的发展处于发展的瓶颈期，究其原因如下所分析。
传统的蛋白质芯片主要制备方法是，通过将纯化好的目标蛋白以特定的方式固定在固相基底上制备而成。这个方法是目前蛋白质阵列芯片最主要的制备手段，然而其大范围应用存在诸多尚未解决的问题：（1）蛋白质表达、纯化是蛋白质研究领域的一个重大难题，高通量化纯化蛋白质是一项耗费人力物力的巨大工程；（2）蛋白质是一个具有三级或者四级结构的生物分子，在分离纯化过程中容易造成蛋白质的失活，如何保持蛋白质的活性尚未有有效解决手段；（3）蛋白质容易受外界条件（温度，湿度以及盐浓度等）影响而失活，因此蛋白的存储问题也是亟需解决的问题；（4）纯化获得的蛋白质在基底上固定后，能否保持其原有的生物学活性也是阻碍传统蛋白质芯片技术发展的重要因素。针对传统蛋白质芯片制备的这几项难题，为解决蛋白质来源及其在基底固定等问题，国内外多个研究小组，利用无细胞表达技术，通过将基因芯片直接转化为蛋白质芯片的方法，制备出了蛋白质原位表达阵列（In Situ Protein Array），即蛋白质原位芯片（Joshua LaBaer et aL.,2005;DebK Chatterjee et aL.,2006;Mingyue He et aL.,2008;Mingyue He et aL.,2009;Mingyue He et aL.,2009;Mingyue He et aL.,2008）。其通用原理为：在芯片表面固定含有目标蛋白质基因的遗传物质，通过无细胞蛋白质表达体系进行转录和翻译联合合成蛋白质，最后表达出的蛋白质在原位经过抗体等捕获物得到固定从而形成蛋白质阵列芯片。原位构建蛋白质阵列的方法到目前为止主要有蛋白质原位阵列技术(PISA,Protein In Situ Array)(Mingyue He et aL.,2001)、多重点样技术（MIST,MuLtipLe Spotting Technique）(DoLores J.CahiLLet aL.,2003)、核酸编程性蛋白质阵列技术（NAPPA,NucLeic AcidProgrammabLe Protein Array）(Joshua LaBaer et aL.,2004)等技术。不同的原位表达芯片的构建的基于的原理大同小异，其优点是：（1）避免了由于分离纯化储存造成的蛋白质失活，并且可以表达在细胞内难以表达的毒素蛋白、膜蛋白以及真核细胞特有的转录后修饰蛋白。（2）针对蛋白质在基底表面的捕获问题，构建能够表达含有各种蛋白质标签（包括酶类、多肽结合位点、特异识别多肽的肽段以及识别生物素链霉素的肽段）的核酸模板，相应地在衬底表面孵育上捕获相应标签的捕获抗体或者其余捕获分子（anti-His，anti-GST,anti-FLag等，可以是一个或者一个以上），从而利用原位捕获的方法克服了传统蛋白质芯片中蛋白质固定的缺点。然而根据上述方法构建的蛋白质原位芯片还存在一定的缺点：（1）检测方法比较单一，基本都是基于荧光检测而构建的，因此无法实时监测蛋白质相互作用的动力学过程；（2）这些方法构建的蛋白质原位芯片都不能进行有效的重生，反复利用。
发明内容
因此，本发明的目的是针对现有技术中的蛋白原位表达芯片检测方法单一、不能重复利用的不足，提供一种蛋白质原位表达芯片及其制备方法和应用，该芯片能够重复利用，并且不仅能用于传统的荧光检测，更重要的是还能用于生物传感器进行实时相互作用的动力学过程的监测。
针对上述技术目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种蛋白质原位表达芯片，所述芯片包括固定有捕获载体的基底和粘合在基底上的流通池，所述基底上分布有至少一个与表达捕获载体相结合的蛋白质，所述蛋白质通过在芯片上原位表达，并干燥后获得；所述流通池的两端分别设有流通池入口和流通池出口，优选地，通过洗耳球或压缩空气干燥，更优选地，所述基底由金片制成。
优选地，所述蛋白质通过点样仪将用于表达与捕获载体相结合的蛋白质的核酸分子分布于基底上，再无细胞表达裂解液通入流通池中进行原位表达，获得与捕获载体相结合的蛋白质。
优选地，所述蛋白质通过微流控模板分布将用于表达与捕获载体相结合的蛋白质的核酸分子分布于基底上，再进行原位表达获得。
优选地，所述蛋白质通过包括以下步骤的方法分布于基底上：将所述用于表达与捕获载体相结合的蛋白质的核酸分子通入微流控模板中，使用于表达与捕获载体相结合的蛋白质的核酸分子分布于基底上，然后去掉微流控模板，再将无细胞表达裂解液装载于流通池中，使所述核酸分子进行原位表达获得与捕获载体相结合的蛋白质；
或将用于表达与捕获载体相结合的蛋白质的核酸分子和无细胞表达裂解液同时通入微流控模板中，进行原位表达反应后，使与捕获载体相结合的蛋白质分布于基底上，再去掉微流控模板。
优选地，所述无细胞表达裂解液为原核细胞表达裂解液或真核细胞表达裂解液，更优选地，所述原核细胞表达裂解液为大肠杆菌表达裂解液。
优选地，所述真核细胞表达裂解液为兔网织红细胞表达裂解液、麦胚表达裂解液或昆虫细胞表达裂解液。
优选地，当无细胞表达裂解液为原核细胞表达裂解液时，无细胞表达表达裂解液所用的模板需要的原件包括启动子、依赖于核糖体结合位点、起始密码子ATG和模板序列的3’端需含有终止密码子，更优选地，所述启动子为T7启动子，所述核糖体结合位点为AGGAGG。
优选地，当无细胞表达裂解液为真核细胞表达裂解液时，无细胞表达裂解液所用的模板需要的原件包括启动子、起始密码子ATG和模板序列的3’端需含有终止密码子，更优选地，所述启动子为T7启动子、SP6启动子或T3启动子。
优选地，所述捕获载体选自抗体、蛋白质、小分子、多肽和核酸分子中的一种或多种。
优选地，所述核酸分子表达的蛋白上含有标签，所述标签选自酶、多肽结合位点、特异识别多肽的肽段、识别金属螯合的肽段和识别生物素链霉素的肽段中的任意一种或多种。
优选地，所述酶选自b-半乳糖苷酶（b-Galactosidase）、谷胱甘肽转移酶（Glutathione stransferase,GST）、氯霉素（Chloramphenicolacetyltransferase）和二氢叶酸还原酶（Dihydrofolate reductase）中的任意一种或多种。
优选地，所述多肽结合位点选自蛋白质A（Protein A）、蛋白质G（Protein G）、蛋白Z（Protein Z）、链球菌G蛋白（Streptococcus Protein G，SPG）和雄激素结合蛋白（Androgen binding protein，ABP）中的任意一种或多种。
优选地，所述特异识别多肽的肽段选自FLAG标签（FLAG tag）、B-标签（B-tag）、T7标签（T7 tag）、S-标签（S-tag）、钙调蛋白结合标签（calmodulin-binding tag）和卷曲螺旋多肽（Coiled-coilpeptide）中的任意一种或多种。
优选地，所述识别金属螯合的肽段选自组氨酸标签（His）、ProHis5Pro、HAT和FIAsH tag CCXXCC中的任意一种或多种。
优选地，所述识别生物素链霉素的肽段选择生物标签（Biotag）、Avi标签（Avi-tag）、Strep tag II、链霉菌抗生素结合多肽（Streptavidin bindingpeptide）、Nano标签（Nanotag）和Photocleavable标签（PhotocleavableTag）中的任意一种或多种。
优选地，所述核酸分子为DNA分子和/或RNA分子。
优选地，所述DNA分子可以是质粒DNA或者PCR扩增后的产物。
更优选地，所述DNA分子需要含有多种元件，例如不翻译的前导序列、核糖体识别位点、启动子（T3、T7和SP6等启动子）、目标蛋白序列、标签序列以及终止子等。
优选地，所述微流控模板为设有至少一个微流凹槽的微流控模板或点状微流控模板，所述微流凹槽的两端分别设有流体出口和流体入口，所述微流控模板的微流凹槽与所述芯片形成微流通道。
优选地，所述微流凹槽宽为0.01-5000μm，高为0.01-5000μm，长为3～5cm，更优选地，所述微流凹槽间的间隔为0.01-5000μm。
还一方面，本发明提供一种蛋白质原位表达芯片的制备方法，包括制备基底和与其通过粘合剂相粘合的流通池，使蛋白质通过原位表达分布在基底上，再将其干燥后，即得。
优选地，所述蛋白质原位表达芯片具体通过包括以下步骤的方法制得：
步骤1：制备捕获载体的基底，优选地，所述基底由金片制得；
步骤2：制备微流控模板；
步骤3：将步骤2制得的微流控模板置于步骤1制得的捕获载体的基底上，再将所述用于表达与捕获载体相结合的蛋白质的核酸分子通入微流控模板中，使用于表达与捕获载体相结合的蛋白质的核酸分子分布于基底上，然后去掉微流控模板，流通池通过粘合剂粘贴于基底上，然后将无细胞表达裂解液装载于流通池中，使所述核酸分子进行原位表达获得与捕获载体相结合的蛋白质，再利用磷酸盐缓冲液清洗流通池后，然后用去离子水洗去流通池中的盐离子后，干燥，优选地，再利用磷酸盐缓冲液清洗流通池3次，或；
将步骤2微流控模板置于步骤1制得的捕获载体的基底上，再往微流控模板中通入用于表达与捕获载体相结合的核酸分子和无细胞表达裂解液，使与捕获载体相结合的蛋白质分布于基底上，再去掉微流控模板，然后利用磷酸盐缓冲液清洗基底，再用去离子水润洗，干燥后，将流通池通过粘合剂粘贴于基底上，即得；
优选地，通过洗耳球或压缩空气干燥。
优选地，所述蛋白质原位表达芯片具体通过包括以下步骤的方法制得：
步骤1：制备捕获载体的基底，优选地，所述基底由金片制得；
步骤2：制备流通池，再将其通过粘合剂粘贴于步骤1制得的基底上；
步骤3：通过点样仪将用于表达与捕获载体相结合的蛋白质的核酸分子分布于步骤2制得的基底上，再无细胞表达裂解液通入流通池中进行原位表达，获得与捕获载体相结合的蛋白质；
步骤4：再利用磷酸盐缓冲液清洗流通池后，然后用去离子水洗去流通池中的盐离子后，干燥，即得，优选地，利用磷酸盐缓冲液清洗流通池3次，优选地，通过洗耳球干燥。
优选地，在步骤1中，所述捕获载体的基底通过包括以下步骤的方法制得：
步骤1.1：使用等离子体清洗仪清洗基底表面；
步骤1.2：在步骤1.1清洗后的基底表面加载巯基十一酸；
步骤1.3：活化步骤1.2加载巯基十一酸的基底表面的巯基十一酸；
步骤1.4：将捕获载体固定于步骤1.3活化后的基底表面。
优选地，在步骤2中，所述微流控模板的制备方法包括以下步骤：
先根据需要的大小和尺寸预设模板，再通过通过选自子刻蚀、纳米压印和复模法的方法制成，优选地，所述子刻蚀包括光刻蚀或分子刻蚀。
再一方面，本发明提供一种用于蛋白质检测的系统，包括本发明所述的蛋白质原位表达芯片、检测仪和控制器，所述蛋白质原位表达芯片的流通池中灌装有检测液，所述检测仪包括生物传感器，所述生物传感器用于检测检测液与核酸分子表达的蛋白相结合的信号，所述控制器与检测仪相连用于控制检测和输出信号。
优选地，所述检测液包括与核酸分子表达的蛋白相结合的抗体。
优选地，所述生物传感器选自生物电极（bioelectrode）传感器、半导体生物传感器（semiconductbiosensor）、光生物传感器（opticalbiosensor）、热生物传感器（calorimetricbiosensor）和压电晶体生物传感器中的一种。
优选地，所述生物传感器位于检测仪上。
优选地，所述检测仪为表面等离子共振成像仪。
更优选地，当所述检测仪为表面等离子共振成像仪时，所述生物传感器包括光路系统和检测器，所述光路系统包括用于接收入射偏振光和反射光的棱镜，所述检测器用于接收由棱镜反射的光并向控制器输入反射光信号；所述蛋白质检测装置于所述棱镜上，所述流通池的流通池入口和流通池出口分别与检测仪的流路进、出口相连。
另一方面，本发明提供一种蛋白质原位表达芯片的检测方法，包括将上述本发明所述的蛋白质原位表达芯片与检测器和控制器相连，将检测液通过流通池的入口通入流通池中，在线封闭后，再通入将与检测蛋白质相结合的抗体孵育，进行在线检测；优选地，还包括封闭前用0.1M的氢氧化钠清洗流通池和在线检测后，通入磷酸溶液进行清洗，基线平稳后，再利用磷酸溶液对蛋白质原位表达芯片进行重生的步骤，更优选地，用0.1M的氢氧化钠清洗流通池3次，进一步优选地，所述磷酸溶液为体积比为1：200的磷酸溶液。
又一方面，本发明还提供一种蛋白质原位表达芯片的重生方法，包括通过上述本发明的方法将蛋白质原位表达芯片检测后，再通入磷酸溶液进行清洗，基线平稳后，再利用磷酸溶液对蛋白质原位表达芯片进行重生而得，更优选地，所述磷酸溶液为体积比为1：200的磷酸溶液。
还一方面，本发明提供一种本发明所述的蛋白质原位表达芯片在制备用于检测蛋白质的工具中的应用，优选地，所述工具为试剂盒。
再一方面，本发明提供一种用于蛋白质原位表达芯片检测的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的蛋白质原位表达芯片。
本发明所述目的蛋白中含有的标签与捕获载体对照如下表1所示：
表1 标签与捕获载体对照表
本发明的有益效果：（1）本发明以现有的蛋白质原位芯片为基础，结合生物传感器（比如表面等离子共振成像，石英晶体微天平等）的原理，构建不仅能用于传统的荧光检测，更重要的是还能用于生物传感器进行实时监测相互作用的动力学过程的蛋白质原位芯片；（2）为了解决重生利用问题，本发明所构建的用于生物传感器检测的原位蛋白质芯片，通过简单的方法固定原位表达的蛋白质，并通过干燥固定有原位表达的蛋白质的芯片，使得芯片可利用一定的重生缓冲液进行重生再利用。综上所述，本发明力求构建一种可以广泛应用于荧光检测，表面等离子共振，石英晶体微天平等生物传感器检测，并且可以有效重生的蛋白质原位芯片，节约了成本，操作方便。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明所述的蛋白质原位表达芯片的构建原理图；
图2为本发明所述的表面等离子共振成像仪的表面等离子共振成像原理图；
图3为本发明所用的微流控模板的结构示意图，图3a-b为设有至少一个微流通道的微流控模板的结构示意图；图3c为点状微流控模板的结构示意图；
图4为本发明所述的利用设有至少一个微流通道的微流控模板构建的蛋白质原位表达芯片（实施例2）的SPRi检测结果，图中从左到右四组曲线依次为直接加GST抗体检测的结果，重生后加抗GST抗体检测的结果，直接加抗P53抗体检测的结果，重生后加抗P53抗体检测的结果；
图5为本发明所述的利用设有至少一个微孔的微流控模板构建的蛋白质原位表达芯片（实施例3）的SPRi检测结果，图中，从左到右两组曲线依次为直接加GST抗体检测的结果和重生后加抗GST抗体检测的结果；
图6为NHS与EDC活化羧基原理示意图；
图7为E/K Coiled-coil相互作用示意图；
图8为本发明所述的用于蛋白质原位表达芯片检测的系统的流程图。
具体实施方式
除非另外指明，以下实施例中所用的无细胞表达裂解液为大肠杆菌无细胞表达裂解液，其组成包括大肠杆菌表达裂解液，氨基酸和一些盐离子缓冲液；金片购自PLEXERA公司。
大肠杆菌表达裂解液，模板所需要的原件有：启动子（常用的为T7启动子），依赖于核糖体结合位点（Ribosomal binding site,RBS）（其序列为：AGGAGG）,其实密码子ATG（ATG与RBS之间不超过10个碱基）以及模板序列的3’端需含有终止密码子（TAG，TGA或者TAA）。
除非另外指明，以下实施例中所用的试剂均为可从常规渠道获得的分析纯试剂。
除非另外指明，以下实施例中所用的等离子体清洗仪型号为PDC-MG，厂家为成都铭恒科技发展有限公司，表面等离子共振成像仪型号为Kx5，厂家为美国PlEXERA公司，金片购自PLEXERA公司；抗GST抗体（anti-GST）购自GE Healthcare公司，抗P53抗体（anti-P53）(DO1)购自SIGMA-ALDRICH，抗组氨酸抗体（anti-His）购自GE Healthcare公司，E-CoiL和K-CoiL为多肽，购自北京博奥森生物技术有限公司。
实施例1 质粒的构建
HG-GST质粒、HG-P53质粒、pBH-GST质粒和pBH-Fos质粒均以Novagen公司的pET-Dut-1为模板，并对其进行改造后构建而成的。构成具体构建方法如下：
1.以pET-Duet-1(Novagen公司)为模板骨架，在其第一组多克隆位点（MCS1）插入GST标签基因(SEQ ID NO:1)构建成表达载体HG-GST。
以pANT-P53-GST为模板，利用上游引物（5'-GCGGGATCCGCCTATACTAGGTTATTGG-3'(BamH I)(SEQ ID NO:2)以及下游引物5'-CGCGAATTCCTAACGCGGAACCAGATCCGATTTTGG-3'(EcoR I)(SEQ ID NO:3)通过PCR扩增出GST标签融合序列产物，PCR产物经过PromegaDNA回收试剂盒直接回收后，利用BamH I以及EcoR I进行限制性双酶切后，与相同的酶双酶切后的pET-Duet-1(Novagen公司)进行连接，再转化DH5α大肠杆菌感受态细胞(购自天根生化技术有限公司)，送至Invitrogen公司测序命名为HG-GST。
2.以pET-Duet-1(Novagen公司)为模板骨架，在其第一组多克隆位点（MCS1）插入（P53（SEQ ID NO:4）+GST（SEQ ID NO:1）的融合序列基因）（SEQ ID NO:5）构建成表达载体HG-P53。
以pANT-P53-GST为模板，利用上游引物5'-GCGGGATCCGGAGGAGCCGCAGTCAGATC-3'（BamH I)(SEQ ID NO:6)以及下游引物5'-CGCGAATTCCTAACGCGGAACCAGATCCGATTTTGG-3'（EcoR I)(SEQID NO:7)通过PCR扩增出P53和GST标签融合序列产物，PCR产物经过PromegaDNA回收试剂盒直接回收后，利用BamH I以及EcoR I进行限制性双酶切后，与经过相同双酶切处理的模板载体pET-Duet-1(Novagen公司)进行连接，再转化DH5α大肠杆菌感受态细胞(购自天根生化技术有限公司)，送至Invitrogen公司测序鉴定后命名为HG-P53。
3.以pET-Duet-1(Novagen公司)为模板骨架,在其第一组克隆位点和第二组克隆位点之间插入GST序列，并在GST序列前方插入两个限制性酶切位点（BamHI）和（EcoR I），构建成表达GST标签的母载体pBH-GST。
以pANT-P53-GST为模板，利用上游引物5'-GCGGGATCCGGAATTCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAG-3'(BamH I+EcoR I)(SEQ ID NO:8)以及下游引物5'-CGCCTCGAGTCAACGCGGAACCAGATCCGATTTTGG-3'(Xho I)(SEQID NO:9)通过PCR扩增出GST标签序列产物，其中PCR产物经过PromegaDNA回收试剂盒直接回收后，利用BamH I以及Xho I进行限制性双酶切后，与相同双酶切处理的模板载体pET-Duet-1(Novagen公司)进行连接，再转化DH5α大肠杆菌感受态细胞(购自天根生化技术有限公司),送至Invitrogen公司测序鉴定后命名为pBH-GST。
4.以pBH-GST为模板骨架，在GST标签前端两个限制性酶切位点BamH I和EcoR I之间插入Fos基因的序列构建成pBH-Fos。
以pANT-Fos为模板，利用上游引物5'-GCGGGATCCGATGTTCTCGGGCTTCAACGC-3'(BamH I)(SEQ IDNO:10)以及下游引物5'-CGCGAATTCCAGGGCCAGCAGCGTGGGTG-3'(EcoR I)(SEQ ID NO:11)PCR扩增出Fos基因序列，PCR产物经过PromegaDNA回收试剂盒直接回收后，利用BamH I以及EcoR I进行限制性双酶切后与用同样的酶双酶切后的模板载体pET-Duet-1(Novagen公司)进行连接，再转化DH5α大肠杆菌感受态细胞(购自天根生化技术有限公司)，送至Invitrogen公司测序鉴定后命名为pBH-Fos。
以上质粒构建的PCR反应体系为：在100μl的反应体系中，加入10ng左右的模板，正反向引物（终浓度为1μM），2μl 4×d NTP(10mM),10μl×Pfu酶，余量为超纯水。上述混合液充分混匀后，置于PCR扩增仪中，按照以下程序进行扩增：94℃ 5分钟；94℃ 40秒，56℃ 40秒，72℃ 3分钟；共进行30个循环；72℃延伸10分钟。
其中限制性内切酶和Pfu酶均购自NEB公司。
其中载有目标序列P53与GST融合序列的pANT-P53-GST以及载有Fos基因序列(SEQ ID NO:12)的pANT-Fos均购自美国亚利桑那州立大学，目标序列为
P53+GST的融合基因(SEQ ID NO:5)。
实施例2 利用微流管道进行蛋白质原位表达芯片的构建以及表面等 离子共振成像（SPRi）检测
步骤如下：
1.利用等离子体清洗仪（PLasma）清洗金片后，在金片表面固定500μg/mL抗GST抗体（anti-GST）（作为捕获载体），室温放置1小时，用1×PBS（磷酸缓冲液）清洗金片后，再用500mg/mL BSA（牛血清白蛋白）封闭金片1小时，清洗后，压缩空气吹干备用。
2.将如图3a中所示的具有微流管道的微流控模板（由PDMS（聚二甲基硅氧烷）材料制成的微流控模板）贴在金片表面，并在参考管道通入50μg/mLGST蛋白质作为参考信号，所述微流控模板先根据需要的大小和尺寸预设模板，再通过通过光刻蚀技术方法制成（参见Youna Xia et al,1998）。
3.在其他管道中通入相应的质粒（如图4所示）（其中HG-GST与pBH-GST都是可以表达GST标签蛋白的质粒DNA，而HG-P53是可以表达P53与GST融合蛋白的质粒DNA）和大肠杆菌无细胞表达裂解液的混合物，在30℃中孵育4小时后，利用1×PBS（磷酸缓冲液）清洗管道，撤掉微流控模板后，制得基底，再用压缩空气吹干后芯片，室温放置15分钟后，在金片表面贴上流通池（fLowceLL）后，制得蛋白质原位表达芯片，将芯片放置于表面等离子共振成像仪（SPRi）的检测棱镜上表面，并使芯片与机器本身的固定夹具对准后，合上机器的顶盖时，表面等离子共振成像仪的流路进出口刚好能与芯片流通池（fLowceLL）的进出口完全匹配后，便可进行相应地检测。
4.用0.1M的氢氧化钠清洗流通池3次，然后在线通入BSA蛋白对步骤3的室温放置后的蛋白质原位表达芯片进行再次封闭。
5.然后在线通入10μg/mL抗GST抗体（anti-GST抗体）（2μL/s,5min）后，通入磷酸缓冲液进行清洗基线平稳后，再利用体积比为1：200的磷酸对蛋白质原位表达芯片进行重生。
6.重复步骤5，结果如图4结合曲线所示，与阳性对照的50mg/mL GST蛋白相比，在能够表达GST蛋白的管道里，都检测到了GST与抗GST抗体特异结合的信号，并且两次实验结果类似，说明蛋白质原位表达芯片可通过1：200磷酸进行重生后重新利用。
7.在线通入10μg/mL抗P53抗体（anti-P53）(DO1)(2μL/s,5min),通入磷酸缓冲液进行清洗基线平稳后，再利用1：200磷酸对蛋白质原位表达芯片表面进行重生。
8.重复步骤7，结果如图4结合曲线所示，只有能够表达P53蛋白的管道里，特异性地检测到了P53与抗P53抗体(DO1)的结合信号，并且两次实验结果类似，进一步说明该蛋白质原位表达芯片可通过1：200磷酸进行重生后重新利用。
实施例3 利用点状微流模板进行蛋白质原位表达芯片的构建以及表 面等离子共振成像仪（SPRi）检测
步骤如下：
1.利用等离子体清洗仪（PLasma）清洗金片后，在金片表面固定500μg/mL抗GST抗体（作为捕获载体），室温放置1小时，用1×PBS清洗金片后，再用500mg/mL BSA封闭金片1小时，清洗后，压缩空气吹干备用。
2.将如图3c中的点状微流控模板（由PDMS（聚二甲基硅氧烷）材料制成的微流控模板）贴在金片表面，加入0.5μL质粒DNA(其中空白（Blank）为ddH2O,pBH-GST是可以表达GST蛋白的质粒DNA，而pBH-Fos是可以表达Fos与GST融合蛋白的质粒DNA)，保持湿度在50%左右，室温放置30分钟后，暴露在空气中30分钟，所述微流控模板先根据需要的大小和尺寸预设模板，再通过通过纳米压印的方法制成（参见Youna Xia etal,1998）。
3.加入0.5μL大肠杆菌无细胞表达裂解液，保持湿度50%左右，30℃反应5小时后，揭掉状微流控模板，制得基底，用1×PBS清洗芯片后，立刻用dd H2O润洗芯片，并用压缩空气吹干，室温放置20分钟后，在芯片表面贴上流通池（fLowceLL）后，制得蛋白质原位表达芯片，将蛋白质原位表达芯片放置于表面等离子共振成像仪（SPRi）的检测棱镜上表面，并使蛋白质原位表达芯片与机器本身的固定夹具对准后，合上机器的顶盖时，表面等离子共振成像仪的流路进出口刚好能与芯片流通池（fLowceLL）的进出口完全匹配后，便可进行相应地检测。
4.用0.1M的氢氧化钠清洗流通池3次，然后在线通入BSA蛋白对蛋白质原位表达芯片进行再次封闭。
5.然后在线通入15μg/mL抗GST抗体（2μL/s,5min）后，通入磷酸缓冲液进行清洗基线平稳后，再利用体积比为1：200的磷酸溶液对蛋白质原位表达芯片进行重生。
6.重复步骤5，结果如图5结合曲线所示，与阳性对照的50mg/mL GST蛋白相比，在能够表达GST蛋白的管道里，都检测到了GST与抗GST抗体特异结合的信号，并且两次实验结果类似，说明该芯片可通过1：200磷酸进行重生后重新利用。
实施例4 利用氨基三乙酸（NTA）表面与组氨酸标签构建的原位表 达蛋白质芯片构建及其SPRi检测
步骤如下：
1.NTA表面的制备：
a.使用等离子体清洗仪（PLasma）清洗金片表面；
b.配制1mM的巯基十一酸（MUA）的乙醇溶液（所述巯基十一酸（MUA）的乙醇溶液的浓度还可为3mM或5mM），将清洗好的金片放入其中，4℃过夜孵育后，取出金片，用乙醇溶液冲洗表面3次后，压缩空气吹干金片表面，备用；
c.使用1：1的N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）和1-（3-二甲氨基）-3-乙基碳化二亚胺（EDC）混合液溶液（NHS的初始浓度为：0.1M，EDC的初始浓度为0.4M）对金片表面的巯基十一酸进行活化（原理如图6所示）；
d.配制0.05M NTA水溶液（所述NTA水溶液的浓度还可为0.08M或0.1M），将螯合剂溶液平铺在活化后的SPR金片表面，室温放置1h,用1×PBS清洗3次后，立刻用dd H2O润洗后，压缩空气吹干表面，备用；
e.配制0.01M的二价镍离子（所述二价镍离子溶液的浓度还可为0.15M或0.3M）（硫酸镍或者氯化镍）溶液（Ni2+溶液），平铺在金片表面后，室温放置3小时，使得Ni2+与金片表面NTA螯合剂结合后，用1×PBS清洗金片表面3次，立刻用ddH2O润洗除去金片表面的盐离子，用压缩空气吹干后，室温放置40分钟，NTA金片制成，备用。
2.将如图3b的形状的微流控模板（由PDMS（聚二甲基硅氧烷）材料制成的微流控模板）贴在制备好的NTA金片表面，加入0.5μL质粒DNA（在目标蛋白核酸序列的5’末端或者3’末端含有可以表达组氨酸标签的核酸序列)，保持湿度50%左右，室温放置30分钟后，暴露在空气中30分钟。所述微流控模板先根据需要的大小和尺寸预设模板，再通过通过纳米压印的方法制成（参见Youna Xia etal，1998）。
3.再加入0.5μL大肠杆菌无细胞表达裂解液，保持湿度50%左右，30℃反应6小时后，揭掉微流控模板，制得基底，用1×PBS清洗芯片后，立刻用dd H2O润洗完，用压缩空气吹干，室温放置20分钟后，在芯片表面贴上流通池（fLowceLL）后，制得蛋白质原位表达芯片，将蛋白质原位表达芯片放置于表面等离子共振成像仪（SPRi）的检测棱镜上表面，并使蛋白质原位表达芯片与机器本身的固定夹具对准后，合上机器的顶盖时，表面等离子共振成像仪的流路进出口刚好能与芯片流通池的进出口完全匹配后，便可进行相应地检测。
4.用0.1M的氢氧化钠清洗流通池3次，然后在线通入BSA蛋白对步骤3室温放置后的芯片进行封闭。
5.然后在线通入20μg/mL抗组氨酸抗体（anti-His抗体）（2μL/s,5min）后（检测融合蛋白是否得到表达），通入磷酸缓冲液进行清洗，基线平稳后，再利用体积比为1：200磷酸溶液对芯片进行重生。
6.重复步骤5。
结果表明，经过无细胞表达之后形成的目标蛋白其羧基末端含有组氨酸标签，并通过组氨酸标签被捕获于NTA表面。在线通入20μg/mL anti-His抗体后，能够检测到抗组氨酸抗体与组氨酸标签的结合，其曲线图与实施例2与3中类似，并且同样可以通过体积比为1：200磷酸溶液重生后再利用。
实施例5 利用抗GST抗体为捕获抗体所构建的可用于SPRi检测的 蛋白质原位表达芯片
步骤如下:
1.参照实施例3中的步骤1修饰好金片，备用。
2.将含有目标蛋白（多种）+标签蛋白（GST）基因用于无细胞表达的质粒或者PCR核酸序列（浓度为10mg/mL），利用打印机点于1中准备好的金片表面，保持50%左右的湿度，室温放置30分钟~1小时后，暴露于空气中，使其干燥，利用dd H2O清洗金片表面除去游离在金片表面的质粒或者PCR核酸序列后，利用压缩空气吹干，制得基底，备用。
3.将流通池（fLowceLL）贴在金片表面，灌满无细胞表达裂解液50μL（所述无细胞表达裂解液还可为100μL、200μL），30℃反应6小时后，15℃放置40分钟左右，利用移液枪取1×PBS清洗流通池（fLowceLL）3次后，立刻用ddH2O洗去流通池（fLowceLL）中的盐离子后，用吸耳球吹干后制得蛋白质原位表达芯片，并利用SPRi对芯片进行检测。
4.用0.1M的氢氧化钠清洗流通池3次，然后在线通入BSA蛋白对蛋白质原位表达芯片进行再次封闭。
5.然后在线通入20μg/mL抗GST抗体（anti-GST抗体)(2μL/s,5min），检测融合蛋白是否表达后，再通入磷酸缓冲液进行清洗基线平稳后，再利用体积比为1：200的磷酸溶液对蛋白质原位表达芯片进行重生。
6.重复步骤5，检测蛋白质原位表达芯片的可再生性。
7.在线通入20μg/mL的目标蛋白的抗体（2μL/s,5min）后（检测目标蛋白是否得到表达），通入磷酸缓冲液进行清洗，检测目标蛋白是否得到表达后，蛋白原位表达芯片构建完成，可用于进一步的检测。实验结果与具体实施例3和实施例4类似，在能够表达GST标签蛋白的液滴中，都能检测到了GST与抗GST抗体特异结合的信号，并且同样都能够通过体积比为1：200的磷酸溶液进行重生。在通量上，理论上打印机点样法能够一次检测几百个样品。
实施例6 利用NTA表面可用于SPRi检测的蛋白质原位表达芯片
步骤如下：
1.参照实施例4制备NTA金片后，备用。
2.将含有目标蛋白（多种）+标签蛋白（6个组氨酸）基因可用于无细胞表达的质粒或者PCR核酸序列（浓度为1mg/mL），利用打印机点于1中准备好的芯片表面，保持50%左右的湿度，室温放置30分钟后，暴露于空气中，使其干燥，利用dd H2O清洗芯片表面除去游离在芯片表面的质粒或者PCR核酸序列后，利用压缩空气吹干，备用，制得基底。
3.将流通池（fLowceLL）贴在芯片表面，灌满大肠杆菌无细胞表达裂解液（30μL），30℃反应5小时后，15℃放置3半个小时，利用移液枪取1×PBS清洗流通池3次后，立刻用ddH2O洗去流通池中的盐离子后，用吸耳球吹干后，制得蛋白质原位表达芯片，再利用SPRi对芯片进行检测。
4.用0.1M的氢氧化钠清洗流通池3次，然后在线通入BSA蛋白对步骤3用吸耳球吹干后的蛋白质原位表达芯片进行再次封闭。
5.然后在线通入20μg/mL抗组氨酸抗体（anti-His抗体)(2μL/s,5min），检测融合蛋白是否表达后，再通入磷酸缓冲液进行清洗基线平稳后，再利用体积比为1：200的磷酸溶液对蛋白质原位表达芯片进行重生。
6.重复步骤5，检测蛋白质原位表达芯片的可再生性。
结果表明，经过无细胞表达之后形成的目标蛋白其羧基末端含有组氨酸标签，并通过组氨酸标签被捕获于NTA表面。在线通入15μg/mL抗组氨酸抗体抗体后，能够检测到抗组氨酸抗体与组氨酸标签的结合，其曲线图与实施例2与3中类似，并且同样可以通过体积比为1：200磷酸溶液重生后再利用。在通量上，理论上打印机点样法能够一次检测几百个样品。
实施例7 利用K-coiL和E-coiL的相互作用构建的可用于SPRi检测 蛋白质原位表达芯片
如图7所示，E-CoiL与K-CoiL可以通过静电作用形成稳定的异源二聚体（图7），不同长度的K-CoiL与不同长度的E-CoiL的亲和力不一样，其中E5与K5的亲和力为6.3±0.5×10-11M（Gregory et aL.,2003）,适合作为标签与捕获载体。
步骤如下：
1.使用等离子体清洗仪（PLasma）清洗金片表面。
2.配制1mM的巯基十一酸（MUA）的乙醇溶液，将清洗好的金片放入其中，4℃过夜孵育后，取出芯片，利用乙醇溶液冲洗表面3次后，利用压缩空气吹干表面后备用。
3.使用1：1的NHS和EDC混合液溶液（NHS的初始浓度为：0.1M，EDC的初始浓度为0.4M）对金片表面的巯基十一酸进行活化。
4.配制100mM的E5水溶液（所述E5水溶液还可为300mM或500mM），平铺于金片表面，室温孵育1小时后，用1*PBS清洗芯片3次，用压缩空气吹干后，用500mg/mL的BSA进行封闭，同样用1*PBS清洗金片3次后，用压缩空气吹干后，备用。
5.将含有目标蛋白（多种）+GST标签+K-Coil基因可用于无细胞表达的质粒或者PCR核酸序列（浓度为5mg/mL），利用打印机点于1中准备好的金片表面，保持50%左右的湿度，室温放置30分钟后，暴露于空气中，使其干燥，利用dd H2O清洗芯片表面除去游离在金片表面的质粒或者PCR核酸序列后，利用压缩空气吹干，备用。
6.将流通池（fLowceLL）贴在金片表面，灌满大肠杆菌无细胞表达裂解液（30μL），30℃反应6小时后，15℃放置半个小时，制得基底，利用移液枪取1×PBS清洗流通池（fLowceLL）3次后，立刻用ddH2O洗去流通池（fLowceLL）中的盐离子后，用吸耳球吹干后，再利用SPRi对蛋白质原位表达芯片进行检测。
7.用0.1M的氢氧化钠清洗流通池3次，然后在线通入BSA蛋白对用吸耳球吹干后的蛋白质原位表达芯片进行再次封闭。
8.然后，在线通入20μg/mL抗GST抗体抗体（2μL/s,5min），检测融合蛋白是否表达后，再通入磷酸缓冲液进行清洗基线平稳后，再利用体积比为1：200磷酸对蛋白质原位表达芯片进行重生。
9.重复步骤5，检测蛋白质原位表达芯片的可再生性。
实验结果与实施例3类似，含有目标蛋白+GST序列+KcoiL序列的目标载体在无细胞表达裂解液后进行体外表达后，形成目标蛋白+GST+KcoiL的融合蛋白，通过可K-coiL与E-coiL的相互作用被捕获于芯片表面，由于目标蛋白的羧基端带有GST标签，在线通入20μg/mL anti-GST抗体，结果与图5中的曲线类似，能检测到GST与抗GST抗体特异结合的信号，并且由于EcoiL与KcoiL结合力强，经过体积比为1：200的磷酸溶液重生后，蛋白质原位表达芯片可以重复利用。

Claims (43)

1.一种蛋白质原位表达芯片，所述芯片包括固定有捕获载体的基底和粘合在基底上的流通池，所述基底上分布有至少一个与表达捕获载体相结合的蛋白质，所述蛋白质通过在芯片上原位表达，并干燥后获得；所述流通池的两端分别设有流通池入口和流通池出口。
2.根据权利要求1所述的蛋白质原位表达芯片，其特征在于，所述干燥通过洗耳球或压缩空气干燥。
3.根据权利要求1所述的蛋白质原位表达芯片，其特征在于，所述基底由金片制成。
4.根据权利要求1所述的蛋白质原位表达芯片，其特征在于，所述蛋白质通过点样仪将用于表达与捕获载体相结合的蛋白质的核酸分子分布于基底上，再将无细胞表达裂解液通入流通池中进行原位表达，获得与捕获载体相结合的蛋白质。
5.根据权利要求1所述的蛋白质原位表达芯片，其特征在于，所述蛋白质通过微流控模板分布将用于表达与捕获载体相结合的蛋白质的核酸分子分布于基底上，再进行原位表达获得。
6.根据权利要求5所述的蛋白质原位表达芯片，其特征在于，所述微流控模板为设有至少一个微流凹槽的微流控模板或点状微流控模板，所述微流凹槽的两端分别设有流体出口和流体入口，所述微流控模板的微流凹槽与所述芯片形成微流通道。
7.根据权利要求5所述的蛋白质原位表达芯片，其特征在于，所述蛋白质通过包括以下步骤的方法分布于基底上：将所述用于表达与捕获载体相结合的蛋白质的核酸分子通入微流控模板中，使用于表达与捕获载体相结合的蛋白质的核酸分子分布于基底上，然后去掉微流控模板，再将无细胞表达裂解液装载于流通池中，使所述核酸分子进行原位表达获得与捕获载体相结合的蛋白质；
或将用于表达与捕获载体相结合的蛋白质的核酸分子和无细胞表达裂解液同时通入微流控模板中，进行原位表达反应后，使与捕获载体相结合的蛋白质分布于基底上，再去掉微流控模板。
8.根据权利要求4所述的蛋白质原位表达芯片，其特征在于，所述无细胞表达裂解液为原核细胞表达裂解液或真核细胞表达裂解液。
9.根据权利要求8所述的蛋白质原位表达芯片，其特征在于，所述原核细胞表达裂解液为大肠杆菌表达裂解液。
10.根据权利要求8所述的蛋白质原位表达芯片，其特征在于，当无细胞表达裂解液为原核细胞表达裂解液时，无细胞表达裂解液所用的模板需要的原件包括启动子、依赖于核糖体结合位点、起始密码子ATG和模板序列的3’端需含有终止密码子。
11.根据权利要求10所述的蛋白质原位表达芯片，其特征在于，所述启动子为T7启动子，所述核糖体结合位点为AGGAGG。
12.根据权利要求8所述的蛋白质原位表达芯片，其特征在于，所述真核细胞表达裂解液为兔网织红细胞表达裂解液、麦胚表达裂解液或昆虫细胞表达裂解液。
13.根据权利要求8所述的蛋白质原位表达芯片，其特征在于，当无细胞表达裂解液为真核细胞表达裂解液时，无细胞表达裂解液所用的模板需要的原件包括启动子、起始密码子ATG和模板序列的3’端需含有终止密码子。
14.根据权利要求13所述的蛋白质原位表达芯片，其特征在于，所述启动子为T7启动子、SP6启动子或T3启动子。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的蛋白质原位表达芯片，其特征在于，所述捕获载体选自抗体、蛋白质、小分子、多肽和核酸分子中的一种或多种。
16.根据权利要求15所述的蛋白质原位表达芯片，其特征在于，所述核酸分子表达的蛋白上含有标签，所述标签选自酶、多肽结合位点、特异识别多肽的肽段、识别金属螯合的肽段和识别生物素链霉素的肽段中的一种或多种。
17.根据权利要求15所述的蛋白质原位表达芯片，其特征在于，所述核酸分子为DNA分子和/或RNA分子。
18.根据权利要求1至14中任一项所述的蛋白质原位表达芯片的制备方法，所述方法包括制备基底和与其通过粘合剂粘合的流通池，使蛋白质通过原位表达分布在基底上，再将其干燥后，即得。
19.根据权利要求18所述的蛋白质原位表达芯片的制备方法，所述蛋白质原位表达芯片具体通过包括以下步骤的方法制得：
步骤1：制备捕获载体的基底；
步骤2：制备微流控模板；
步骤3：将步骤2制得的微流控模板置于步骤1制得的捕获载体的基底上，再将所述用于表达与捕获载体相结合的蛋白质的核酸分子通入微流控模板中，使用于表达与捕获载体相结合的蛋白质的核酸分子分布于基底上，然后去掉微流控模板，再将流通池通过粘合剂粘贴于基底上，然后将无细胞表达裂解液装载于流通池中，使所述核酸分子进行原位表达获得与捕获载体相结合的蛋白质，再利用磷酸盐缓冲液清洗流通池后，然后用去离子水洗去流通池中的盐离子后，干燥；将步骤2制得的微流控模板置于步骤1制得的捕获载体的基底上，再往微流控模板中通入用于表达与捕获载体相结合的核酸分子和无细胞表达裂解液，使与捕获载体相结合的蛋白质分布于基底上，再去掉微流控模板，然后利用磷酸盐缓冲液清洗基底，再用去离子水润洗，干燥后，将流通池通过粘合剂粘贴于基底上，即得。
20.根据权利要求19所述的蛋白质原位表达芯片的制备方法，特征在于，所述步骤1中所述基底由金片制得。
21.根据权利要求19所述的蛋白质原位表达芯片的制备方法，特征在于，所述微流控模板的制备方法包括以下步骤：
先根据需要的大小和尺寸预设模板，再通过选自刻蚀、纳米压印和复模法的方法制成。
22.根据权利要求21所述的蛋白质原位表达芯片的制备方法，特征在于，所述刻蚀包括光刻蚀或分子刻蚀。
23.根据权利要求19所述的蛋白质原位表达芯片的制备方法，特征在于，在所述步骤3中用去离子水洗去流通池中的盐离子后的所述干燥之后，再利用磷酸盐缓冲液清洗流通池3次。
24.根据权利要求19所述的蛋白质原位表达芯片的制备方法，特征在于，在所述步骤3之后，通过洗耳球或压缩空气干燥。
25.根据权利要求18所述的蛋白质原位表达芯片的制备方法，所述蛋白质原位表达芯片具体通过包括以下步骤的方法制得：
步骤1：制备捕获载体的基底；
步骤2：制备流通池，再将其通过粘合剂粘贴于步骤1制得的基底上；
步骤3：通过点样仪将用于表达与捕获载体相结合的蛋白质的核酸分子分布于步骤2制得的基底上，再将无细胞表达裂解液通入流通池中进行原位表达，获得与捕获载体相结合的蛋白质；
步骤4：再利用磷酸盐缓冲液清洗流通池3次后，然后用去离子水洗去流通池中的盐离子后，干燥，即得。
26.根据权利要求25所述的蛋白质原位表达芯片的制备方法，特征在于，所述步骤1中所述基底由金片制得。
27.根据权利要求25所述的蛋白质原位表达芯片的制备方法，特征在于，所述步骤4中，通过洗耳球干燥。
28.根据权利要求19至25中任一项所述的蛋白质原位表达芯片检测的系统的制备方法，其特征在于，在步骤1中，所述捕获载体的芯片通过包括以下步骤的方法制得：
步骤1.1：使用等离子体清洗仪清洗基底表面；
步骤1.2：在步骤1.1清洗后的基底表面加载巯基十一酸；
步骤1.3：活化步骤1.2加载巯基十一酸的基底表面的巯基十一酸；
步骤1.4：将捕获载体固定于步骤1.3活化后的基底表面。
29.一种用于蛋白质原位表达芯片检测的系统，包括权利要求1至16中任一项所述的蛋白质原位表达芯片、检测仪和控制器，所述蛋白质原位表达芯片的流通池中灌装有检测液；所述检测仪包括生物传感器，所述生物传感器用于检测检测液与核酸分子表达的蛋白相结合的信号，所述控制器与检测仪相连用于控制检测和输出信号。
30.根据权利要求29所述的用于蛋白质原位表达芯片检测的系统，特征在于，所述生物传感器选自生物电极传感器、半导体生物传感器、光生物传感器、热生物传感器和压电晶体生物传感器中的一种。
31.根据权利要求29所述的用于蛋白质原位表达芯片检测的系统，特征在于，所述检测液包括与核酸分子表达的蛋白相结合的抗体。
32.根据权利要求29所述的用于蛋白质检测的系统，其特征在于，所述生物传感器位于检测仪上。
33.根据权利要求32所述的用于蛋白质检测的系统，其特征在于，所述检测仪为表面等离子共振成像仪。
34.根据权利要求33所述的用于蛋白质检测的系统，其特征在于，所述生物传感器包括光路系统和检测器，所述光路系统包括用于接收入射偏振光和反射光的棱镜，所述检测器用于接收由棱镜反射的光并向控制器输入反射光信号；所述蛋白质检测装置于所述棱镜上，所述流通池的流通池入口和流通池出口分别与检测仪的流路进、出口相连。
35.一种蛋白质原位表达芯片的检测方法，包括将权利要求1至17中任一项所述的蛋白质原位表达芯片与检测器和控制器相连，将检测液通过流通池的入口通入流通池中，在线封闭后，再通入将与检测蛋白质相结合的抗体孵育，进行在线检测。
36.根据权利要求35所述的蛋白质原位表达芯片的检测方法，特征在于，还包括封闭前用0.1M的氢氧化钠清洗流通池和在线检测后，通入磷酸溶液进行清洗，基线平稳后，再利用磷酸溶液对蛋白质原位表达芯片进行重生的步骤。
37.根据权利要求36所述的蛋白质原位表达芯片的检测方法，特征在于，用0.1M的氢氧化钠清洗流通池3次。
38.根据权利要求36所述的蛋白质原位表达芯片的检测方法，特征在于，所述磷酸溶液为体积比为1：200的磷酸溶液。
39.根据权利要求1至17任一项所述的蛋白质原位表达芯片的重生方法，包括通过权利要求35的方法将蛋白质原位表达芯片检测后，再通入磷酸溶液进行清洗，基线平稳后，再利用磷酸溶液对蛋白质原位表达芯片进行重生而得。
40.根据权利要求39所述的蛋白质原位表达芯片的重生方法，特征在于，所述磷酸溶液为体积比为1：200的磷酸溶液。
41.根据权利要求1至17中任一项所述的蛋白质原位表达芯片在制备用于检测蛋白质的工具中的应用。
42.根据权利要求41所述的应用，特征在于，所述工具为试剂盒。
43.一种用于蛋白质原位表达芯片检测的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1至17中任一项所述的蛋白质原位表达芯片检测。
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CN104360060B (zh) * 2014-11-14 2016-11-02 国家纳米科学中心 一种基于微流控芯片的肺炎支原体和流感病毒特异抗体IgM的检测方法
CN105067821B (zh) * 2015-08-10 2017-02-22 国家纳米科学中心 一种利用小分子微阵列实现靶标垂钓和表征的方法
AU2017217609B2 (en) * 2016-02-08 2023-03-09 Lunaphore Technologies Sa Methods of sample cycle multiplexing and in situ imaging
CN108414480B (zh) * 2018-01-26 2023-03-24 中国海洋石油集团有限公司 一种原油荧光测量装置和方法
CN108693144B (zh) * 2018-04-28 2021-02-09 天津大学 基于sprm技术进行复用性单细胞蛋白质组学监测方法
CN110988353A (zh) * 2019-11-12 2020-04-10 晏妮 一种用于cm10芯片的重生液
WO2021219114A1 (zh) * 2020-04-30 2021-11-04 深圳市真迈生物科技有限公司 测序方法及其分析方法和系统、计算机可读存储介质和电子设备

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1376606A1 (en) * 2002-06-20 2004-01-02 STMicroelectronics S.r.l. A molecular memory obtained using DNA strand molecular switches and carbon nanotubes, and manufacturing method thereof
CN1512176A (zh) * 2002-12-30 2004-07-14 陈正豪 一种蛋白质芯片及其制备方法和应用
CN1959384A (zh) * 2005-11-01 2007-05-09 河南省生物工程技术研究中心 一种三维网格检测技术
CN101256145A (zh) * 2008-03-26 2008-09-03 深圳先进技术研究院 一种用于吸收光度法检测的微流控芯片装置
CN101285100A (zh) * 2008-03-11 2008-10-15 浙江理工大学 一种利用原位合成微流体芯片的检测方法
CN101290314A (zh) * 2008-03-07 2008-10-22 重庆大学 用于细胞固定和溶液稀释的微流控芯片
CN101526520A (zh) * 2008-03-07 2009-09-09 国家纳米科学中心 一种生物样品的检测方法及装置
CN101813701A (zh) * 2010-04-13 2010-08-25 无锡中美亿芯生物科技有限公司 一种用原位合成制备蛋白质芯片的方法
CN102445472A (zh) * 2010-10-14 2012-05-09 北京华凯瑞微流控芯片科技有限责任公司 一种基于微流控芯片的传感器及制备

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7612184B2 (en) * 2002-02-22 2009-11-03 New York University Polynucleic acid nanomechanical device controlled by hybridization topology

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1376606A1 (en) * 2002-06-20 2004-01-02 STMicroelectronics S.r.l. A molecular memory obtained using DNA strand molecular switches and carbon nanotubes, and manufacturing method thereof
CN1512176A (zh) * 2002-12-30 2004-07-14 陈正豪 一种蛋白质芯片及其制备方法和应用
CN1959384A (zh) * 2005-11-01 2007-05-09 河南省生物工程技术研究中心 一种三维网格检测技术
CN101290314A (zh) * 2008-03-07 2008-10-22 重庆大学 用于细胞固定和溶液稀释的微流控芯片
CN101526520A (zh) * 2008-03-07 2009-09-09 国家纳米科学中心 一种生物样品的检测方法及装置
CN101285100A (zh) * 2008-03-11 2008-10-15 浙江理工大学 一种利用原位合成微流体芯片的检测方法
CN101256145A (zh) * 2008-03-26 2008-09-03 深圳先进技术研究院 一种用于吸收光度法检测的微流控芯片装置
CN101813701A (zh) * 2010-04-13 2010-08-25 无锡中美亿芯生物科技有限公司 一种用原位合成制备蛋白质芯片的方法
CN102445472A (zh) * 2010-10-14 2012-05-09 北京华凯瑞微流控芯片科技有限责任公司 一种基于微流控芯片的传感器及制备

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
In situ synthesis of protein arrays;Mingyue He et al;《Current Opinion in Biotechnology》;20080118;第19卷(第1期);第4－9页 *
基于无细胞系统的蛋白质芯片技术及其应用;章杰;《万方数据库》;20101231;第1－128页 *
无细胞系统原位制备蛋白质芯片及其应用;章杰等;《生物化学与生物物理进展》;20090430;第36卷(第4期);第391－397页 *

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