CN101813701A

CN101813701A - 一种用原位合成制备蛋白质芯片的方法

Info

Publication number: CN101813701A
Application number: CN201010146013A
Authority: CN
Inventors: 王巍
Original assignee: WUXI ZHONGMEI YIXIN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: WUXI ZHONGMEI YIXIN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2010-04-13
Filing date: 2010-04-13
Publication date: 2010-08-25
Anticipated expiration: 2030-04-13
Also published as: CN101813701B

Abstract

本发明为了解决困扰学术界已久的如何将蛋白质分子不失活地且永久地结合到金属上、而且还能一步到位地将蛋白质分子固定于任何探测器金属表面或独立寻址电极上的难题，提供了一种蛋白质芯片的制备方法，通过采用原位电化学组合合成方法和独立寻址的微电极阵列技术，使带有生物活性单元的苯胺衍生物单体以活性自由基聚合方式与溶液中的苯胺共聚于电极上，一步直接在电极上原位生成具有生物活性并导电的电极覆盖物，并在仿生条件下使接有多种蛋白质的卵白素与其牢固结合从而制得蛋白质芯片。本发明为无标记的分析方法奠定了基础，使批量制作蛋白质芯片真正成为可能，第一次从可操作层面上提供了自动化生产蛋白质芯片的可能性并且具有很高的重现性。

Description

一种用原位合成制备蛋白质芯片的方法

技术领域

本发明涉及一种蛋白质芯片的制备方法，具体说，是涉及一种采用原位电化学组合合成(combinatorial synthesis)方法和独立寻址的微电极阵列技术，使带有生物活性单元的苯胺衍生物单体以活性自由基聚合方式与溶液中的苯胺共聚于电极上，一步直接在电极上原位生成具有生物活性并导电的电极覆盖物，并在仿生条件下使接有多种蛋白质的卵白素与其牢固结合从而制得蛋白质芯片的方法。

背景技术

生物芯片技术是上世纪九十年代以来在生命科学领域迅速发展起来的一项高新技术。它主要是指通过微加工和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析系统，以实现对生命机体的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其它生物组分进行准确、快速、大信息量的检测。目前以DNA芯片为生物芯片市场的龙头产品。而随着蛋白质组学对基因功能的理解和疾病认识的深入，随着蛋白质组学概念的提出及其研究的进行，人们需要一种新的技术来进行大规模的蛋白质分析，蛋白质芯片技术于是应运而生。在功能基因组时代，以生命活动的执行者和体现者一蛋白质为研究对象的蛋白质组学越来越显得重要。在细胞中参与各种反应的都是蛋白质。因此，如果能制造出蛋白质芯片，而且如果蛋白质表达强度和键合物能被发现，就有可能将研究拓展到DNA芯片鞭长莫及的领域。蛋白质芯片或蛋白质传感器的发展将会为蛋白质组学研究提供强有力的工具，从而推动疾病诊断、药物筛选、个性化药物的生产和应用等发生重大革新。因此，利用蛋白质芯片或蛋白质传感器分析蛋白质功能是一种必然趋势。

虽然蛋白质芯片可提供高通量蛋白质分析和蛋白质交互作用的研究，但目前大部分研究都仅限于使用荧光标记检测或放射性同位素技术分析平台。这些局限极大地制约了蛋白质芯片的潜力，并限制了此技术在蛋白质组学上得到更广泛应用。且现有技术中，蛋白质芯片一般不能直接在原位合成，只能采用点样或喷墨方法制作。制作蛋白质芯片或蛋白质传感器最大的难题在于如何将蛋白与基底材料(如金属表面)有效结合的同时，仍能保持其原有的生物活性(免疫性、抗体特异性)不变。蛋白质的固定有两个与生俱来的困难：1)背景(即非特异性键合)：蛋白质往往非特异地吸附于大多数固体表面。这是因为蛋白质分子具有疏水性和各种带电荷部位，可与疏水性或带相反电荷的表面强烈结合。疏水作用尤为普遍，是一个造成表面污染的主要原因。蛋白质分子和固体表面间的这种异动往往导致其三维结构的丧失乃至变性，即完全丧失活性。2)构象和取向：蛋白质分子是通过特定的功能部位与其他分子间进行交互作用的。然而，固体表面上化学吸附力无视任何功能部位的存在。如果顺其自然，固体表面上的蛋白质分子的构象和取向将不一定处于理想状态。

综上所述，虽然蛋白质芯片技术是一种强有力的蛋白质组学研究的新方法，从产生至今已有了很大的发展，但与基因芯片相比较，蛋白质芯片技术还处在初级阶段，无论在芯片的制备，具体应用过程以及结果的检测方面还有很多的不足。首先是成本问题，目前的蛋白质芯片的制作工艺还相当繁琐、复杂，而且信号的检测也需要专门的昂贵的仪器设备(如seldi-tof-ms)；其次，蛋白质芯片在制作过程中实验条件发生微小的变化便可能引起最后结果的不同，实验条件不易控制，使得实验结果的可重复性相对不足。这些问题已成为蛋白质芯片技术亟需解决的难题。

发明内容

本发明为了解决困扰学术界已久的如何将蛋白质分子不失活地且永久地结合到金属上、而且还能一步到位地将蛋白质分子固定于任何探测器金属表面或独立寻址电极上的难题，提供了一种用原位合成制备蛋白质芯片的方法，使蛋白质分子可实现一步到位固定于任何探测器的金属表面，为无标记的分析方法奠定基础，并使批量制作蛋白质芯片真正成为可能。

为实现上述发明目的，本发明采用的具体技术方案如下：

本发明的用原位合成制备蛋白质芯片的方法，包括如下具体步骤：

a)制备带有生物活性单元的苯胺衍生物单体

将带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺溶解在无水乙腈中，然后加入苯胺衍生物的无水乙腈溶液，其中：带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺与苯胺衍生物的摩尔比为10∶1～1∶10；加入适量5-乙硫基四氮唑(ETT)活化剂(activator)，使形成的活化剂无水乙腈溶液的浓度为0.25mol/L；在室温下搅拌20～40分钟后，进行减压蒸镏至粉末状；加入过量氧化溶液(oxidation solution)，所述氧化溶液是由单质碘溶于四氢呋喃∶水∶三乙胺＝8∶1∶1的混合溶剂中形成，溶液的质量百分比浓度为4％；室温下搅拌5～15分钟后，以硫代硫酸钠还原至中性，然后减压蒸出四氢呋喃，以氯仿萃取，有机层经无水硫酸钠干燥后，减压蒸干有机溶剂；最后加入10％氢氧化铵脱保护，减压蒸出过量氨气后以0.2M盐酸中和至中性，放入-4℃冰箱备用；

b)制备蛋白质芯片

将微电极阵列建立在独立寻址的逻辑电路芯片上，此电路上的每个电极由互补金属氧化物半导体(CMOS)晶体管的开关连接，通过发送电子地址信号到共同结点电路进而到与每个电极相关的SRAM(静态随机存取记忆体)导通该开关；微电极阵列放置在一个流体反应器中，反应器中的反应液为步骤a)制备得到的带有生物活性单元的苯胺衍生物单体与其摩尔量的1～10倍的苯胺及适量作为电解质的氯化钾混合而成；在逻辑电路控制下，以10毫秒开，10毫秒关的脉冲，在0.5～1.5伏，30秒总时间内，具有生物活性并导电的电极覆盖物在原位迅速生成，经去离子水清洗后用氮气吹干，与带有蛋白质的卵白素在PBS缓冲液中培养1～3小时，用PBS缓冲液反复冲洗后即得。

所述的带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺是指带有DNA、RNA、肽、蛋白质、酶、辅酶、抗体、组织或细胞单元的甘醇亚磷酰胺，优选生物素甘醇亚磷酰胺。

所述的苯胺衍生物是指通式为：其中的n可为1、2或3；其中的R2可以是氢，也可以是游离于苯胺邻位和间位的饱和或不饱和烃类取代基、芳香族(包括杂环)类取代基、烃类和/或芳香族(包括杂环)醚或硫醚类取代基、卤素类取代基、经硅烷保护的一级或二级醇类取代基、经FMOC或BOC保护的胺类取代基、对称或不对称取代的三级胺、酰胺或磺酰胺类取代基、饱和或不饱和烃取代的羧酸酯类取代基。

所述电极可以是金属、不锈钢、金属合金、碳纳米管、玻璃碳、网状玻璃碳、石墨、掺杂氧化物、铟锡氧化物、氧化硅、砷化镓半导体、金属掺杂聚合物或陶瓷材料，优选金属。

所述金属可选自铂、铱、钯、金、银、铜、汞、镍、锌、钛、钨或铝，优选铂。

正因为每个电极都与其下的独立寻址逻辑电路连接，所以都具有智能传感和讯号放大功能，当以一定的脉冲波扫描每个电极时，会产生一个微小的偶极化电子信号，此信号因电极所处的生物环境(有无分子识别反应)的变化而略有差异，因此，CMOS的运用提供了前所未有的可重复性，高度灵活的微米和亚微米范围内合成聚合物微阵列的能力，使无标记分析方法得以成为现实。这种方法大大简化了含多种内容的蛋白质芯片乃至蛋白质文库的制作，聚苯胺的微观结构不仅可将蛋白质伸展出电极表面，从而有利于其对目标分子的交互作用；而且它的导电性的优点对蛋白质的快速检测和进而测定其对目标分子的交互作用(比方说抗体与抗原的作用)也有着无可比拟的优越性。

本发明人还研究发现：通过调控单体浓度、电流密度和反应时间等活性自由基聚合条件，可以控制导电聚苯胺的聚合度。

与现有技术相比，本发明的突破点主要有以下几点：

1、使蛋白质分子通过高分子导体与电极链接，避免了蛋白质分子与固体表面的直接接触，从而避免了表面非特异吸附。

2、使蛋白质分子可一步到位固定于任何探测器金属表面或独立寻址电极上，避免了繁杂的操作带来的蛋白质构象和取向的不确定性。

3、稳定的共价键键合取代了其他不稳定的键合，使化学操作最小化，所有操作都在缓冲液中进行，使蛋白分子可保持活性。

4、可以实现高通量的实时检测分析，为无标记的分析方法奠定了基础，省却了荧光标记及后续的光学模拟检测和庞大昂贵的设备。

5、使批量制作蛋白质芯片真正成为可能，第一次从可操作层面上提供了自动化生产蛋白质芯片的可能性，将多个繁复的、技术性极强的操作分解成简单的步骤，可重复性、重现性有很大的提高。

附图说明

图1是本发明中的独立寻址逻辑电路芯片的结构示意图；图中：1是指聚合反应驱动电路；2是指通过内部寻址连接导通的电极；3是指通过内部寻址连接的电极但在实验中有意不通电而保持惰性；

图2是独立寻址逻辑电路芯片中的微电极阵列以荧光扫描仪(Axon4200A)扫描得到的照片；

图3是独立寻址逻辑电路芯片中的微电极阵列在室光下的照片(16微米直径的电极经100倍光学放大得到)；

图4是证明电流密度和反应时间与导电聚苯胺的聚合度的关系图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明；实施例中所用化学试剂均向美国Sigma-Aldrich公司采购，生物素甘醇亚磷酰胺及接有荧光基团Cy5的卵白素以及供DNA合成之用的活化剂(activator)和氧化溶液(oxidationsolution)是从美国Glen Research公司采购。

实施例1：制备带有生物活性单元的苯胺衍生物单体

将生物素甘醇亚磷酰胺溶解在无水乙腈中，然后加入苯胺邻甲醇的无水乙腈溶液，其中：生物素甘醇亚磷酰胺与苯胺邻甲醇的摩尔比为10∶1～1∶10；加入适量5-乙硫基四氮唑(ETT)活化剂，使形成的活化剂无水乙腈溶液的浓度为0.25mol/L；在室温下搅拌30分钟后，进行减压蒸镏至粉末状；加入过量氧化溶液，所述氧化溶液是由单质碘溶于四氢呋喃∶水∶三乙胺＝8∶1∶1的混合溶剂中形成，溶液的质量百分比浓度为4％；室温下搅拌10分钟后，以硫代硫酸钠还原至中性，然后减压蒸出四氢呋喃，以氯仿萃取，有机层经无水硫酸钠干燥后，减压蒸干有机溶剂；最后加入10％氢氧化铵脱保护，减压蒸出过量氨气后以0.2M盐酸中和至中性，放入-4℃冰箱备用即可，本实施例的化学反应式如下：

类似的合成方法也适用于带有饱和或不饱和烃类取代基、芳香族(包括杂环)类取代基、烃类和/或芳香族(包括杂环)醚或硫醚类取代基、卤素类取代基、经硅烷保护的一级或二级醇类取代基、经FMOC或BOC保护的胺类取代基、对称或不对称取代的三级胺、酰胺或磺酰胺类取代基、饱和或不饱和烃取代的羧酸酯类取代基的苯胺邻甲醇、苯胺邻乙醇或苯胺邻丙醇。

实施例2：制备蛋白质芯片

将微电极阵列建立在独立寻址的逻辑电路芯片上(见图1所示)，此电路上的每个电极由互补金属氧化物半导体(CMOS)晶体管的开关连接，通过发送电子地址信号到共同结点电路进而到与每个电极相关的SRAM(静态随机存取记忆体)导通该开关；微电极阵列放置在一个专门设计的流体反应器中，计算机以数字方式指示微电极阵列响应数字命令来组装导电聚合物；反应器中的反应液为制备得到的带有生物素取代基的苯胺单体与其摩尔量的1～10倍的苯胺及适量作为电解质的氯化钾混合而成；在逻辑电路控制下，以10毫秒开，10毫秒关的脉冲，在0.5～1.5伏，30秒总时间内，具有生物活性并导电的电极覆盖物在原位迅速生成，经去离子水清洗后用氮气吹干，在pH4的缓冲液中对每一电极进行扫描读数(包括空白和对比(control))，与带有荧光基团Cy5的卵白素在PBS缓冲液中培养2小时后，用PBS缓冲液反复冲洗，以Axon4200A扫描得到图2照片，室光下电极的照片见图3所示(16微米直径的电极经100倍光学放大得到，其中圆形为电极，电极周围为绝缘体)。

重复在pH4的缓冲液中对每一电极的扫描读数，得到卵白素的识别率在90％以上。此读数是在全无优化的条件下取得，证明不必借助光学方法，无标记的分析方法在蛋白质化学亲和力分子识别中有很大的潜力。本方法在不少于两个电极的芯片上操作，并采用不同蛋白质交联的卵白素以分次电化沉积-培养的方式，可以得到多元化的蛋白质芯片。

实施例中使用的电极为铂金属，可由铱或其他金属(例如：钯、金、银、铜、汞、镍、锌、钛、钨、铝)或不锈钢、金属合金、碳纳米管、玻璃碳、网状玻璃碳、石墨、掺杂氧化物、铟锡氧化物、氧化硅、砷化镓半导体、金属掺杂聚合物或陶瓷材料所替代。

实施例3：证明电流密度和反应时间与导电聚苯胺的聚合度的关系实验

使正电荷在不同的脉冲间隔时间在电极上通过，总电荷是由脉冲与时间的积分决定。对数字1，脉冲是2毫秒开，10毫秒关；对数字2，脉冲是4毫秒开，10毫秒关；即对每下一个数字，脉冲开启时间增加一倍，总时间不变一律为60秒，电压始终维持在1.0伏，见表1所示。

表1数字与脉冲的对应关系

数字	开/关(微秒)	脉冲数	峰值(mV)
数字	开/关(微秒)	脉冲数	峰值(mV)	1	2---10	5000	23
2	4---10	4285	40	1	2---10	5000	23
2	4---10	4285	40	4	8---10	3333	59
8	16--10	2307	47	4	8---10	3333	59

将电极经去离子水清洗后用氮气吹干，随即进行光学测量。如图4所示，数字1勉强可见，数字2以后逐步清晰，数字8呈蓝色，说明随着电流密度的增大和反应时间的延长，导电聚苯胺的聚合度逐渐增大，聚苯胺的氧化态逐步增高。

Claims

1.一种用原位合成制备蛋白质芯片的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

a)制备带有生物活性单元的苯胺衍生物单体

将带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺溶解在无水乙腈中，然后加入苯胺衍生物的无水乙腈溶液，其中：带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺与苯胺衍生物的摩尔比为10∶1～1∶10；加入适量5-乙硫基四氮唑(ETT)活化剂，使形成的活化剂无水乙腈溶液的浓度为0.25mol/L；在室温下搅拌20～40分钟后，进行减压蒸馏至粉末状；加入过量氧化溶液，所述氧化溶液是由单质碘溶于四氢呋喃∶水∶三乙胺＝8∶1∶1的混合溶剂中形成，溶液的质量百分比浓度为4％；室温下搅拌5～15分钟后，以硫代硫酸钠还原至中性，然后减压蒸出四氢呋喃，以氯仿萃取，有机层经无水硫酸钠干燥后，减压蒸干有机溶剂；最后加入10％氢氧化铵脱保护，减压蒸出过量氨气后以0.2M盐酸中和至中性，放入-4℃冰箱备用；

b)制备蛋白质芯片

将微电极阵列建立在独立寻址的逻辑电路芯片上，此电路上的每个电极由互补金属氧化物半导体(CMOS)晶体管的开关连接，通过发送电子地址信号到共同结点电路进而到与每个电极相关的静态随机存取记忆体(SRAM)导通该开关；微电极阵列放置在一个流体反应器中，反应器中的反应液为步骤a)制备得到的带有生物活性单元的苯胺衍生物单体与其摩尔量的1～10倍的苯胺及适量作为电解质的氯化钾混合而成；在逻辑电路控制下，以10毫秒开，10毫秒关的脉冲，在0.5～1.5伏，30秒总时间内，具有生物活性并导电的电极覆盖物在原位迅速生成，经去离子水清洗后用氮气吹干，与带有荧光的卵白素在PBS缓冲液中培养1～3小时，用PBS缓冲液反复冲洗后即得。

2.根据权利要求1所述的用原位合成制备蛋白质芯片的方法，其特征在于，所述的带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺是指带有DNA、RNA、肽、蛋白质、酶、辅酶、抗体、组织或细胞单元的甘醇亚磷酰胺。

3.根据权利要求2所述的用原位合成制备蛋白质芯片的方法，其特征在于，所述的带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺是指生物素甘醇亚磷酰胺。

4.根据权利要求1所述的用原位合成制备蛋白质芯片的方法，其特征在于，所述的苯胺衍生物是指通式为：

其中的n为1、2或3；其中的R2是氢或是游离于苯胺邻位和间位的饱和或不饱和烃类取代基、芳香族类取代基、烃类和/或芳香族醚或硫醚类取代基、卤素类取代基、经硅烷保护的一级或二级醇类取代基、经FMOC或BOC保护的胺类取代基、对称或不对称取代的三级胺、酰胺或磺酰胺类取代基、饱和或不饱和烃取代的羧酸酯类取代基。

5.根据权利要求1所述的用原位合成制备蛋白质芯片的方法，其特征在于，所述电极是金属、不锈钢、金属合金、碳纳米管、玻璃碳、网状玻璃碳、石墨、掺杂氧化物、铟锡氧化物、氧化硅、砷化镓半导体、金属掺杂聚合物或陶瓷材料。

6.根据权利要求5所述的用原位合成制备蛋白质芯片的方法，其特征在于，所述电极是金属。

7.根据权利要求6所述的用原位合成制备蛋白质芯片的方法，其特征在于，所述金属选自铂、铱、钯、金、银、铜、汞、镍、锌、钛、钨或铝。

8.根据权利要求7所述的用原位合成制备蛋白质芯片的方法，其特征在于，所述金属选自铂。