JPH07504090A - 触媒性部分の発現および触媒性部分の濃縮に係わる反応−ベース選別 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 触媒性部分の発現および触媒性部分の濃縮に係わる反応−ヘース選別 増加させる方法、およびまたこのような方法による実質的に純粋もしくは濃縮さ れた触媒性生成物に関するものである。本発明はまた、触媒性抗体また（よその 触媒性部分を発現するウィルスを含存する可能性かある組換えウィルス集団の選 別または濃縮方法に関するものである。本発明はまた、触媒性抗体またはその触 媒性部分を発現し、触媒作用を発揮する組換えウィルスの検出に関するものであ る。

本発明はさらにまた、感染の可能性かある宿主に、触媒性抗体またはその触媒性 部分を発現する組換えウィルスを感染させることによって、触媒性抗体またはそ の触媒性部分を発現する組換えウィルスまたは細胞ラインを産生させる方法に関 するものである。本発明はまた、上記方法により得られる触媒性抗体またはその 触媒性部分を発現する、実質的に純粋な組換えウィルスまたは細胞の集団に関す るものである。

発明の背景 本明細書の記載の全体をとおして、公知刊行物はカッコ内の数字により示されて いる。これらの数字は、本明細書の最後の部分に記載の参考文献リストの数字に 対応する。これらの参考文献の全部を引用してここに組み入れる。

ウィルスは細胞に感染し、この細胞の生合成器官を転換させて、ウィルス子孫を 合成する。ある種のウィルスは宿主細胞に感染し、宿主ＤＮＡを分解し、細胞内 でウィルスの子孫を生しる。これにより細胞は、この成熟ウィルス子孫の放出を 佳い溶解する。池のウィルスは溶原性である。これらのウィルスは宿主細胞に感 染し、そのウィルスＤＮＡか宿主染色体の領域に挿入される。そこで世代交代の 間に、生成された細胞ライン（感染細胞の複製からの）は、このウィルスの遺伝 子産物を発現する。元の感染細胞の子孫は、その染色体からウィルスＤＮＡを自 発的に放出することができ、あるいはその染色体からのウィルスＤＮＡの自発的 放出を誘発させることができ、これによりウィルス子孫がもたらされる溶解ザイ クルか生しる。この後者のタイプのウィルスの例には、ラムダファージがあり、 これはある機会に、例えばある種の化学物質または紫外線なとの照射にさらされ ると、感染直後に溶解ザイクルを開始することかできるが、その他の点に関して は、かなりの世代にわたりイー、コリ（Ｅ、　ｃａｌ　ｉ）宿主ゲノムにプロウ ィルスまたはプロファージとして存在することができる。

抗体分野における近年の開発は、抗体またはその一部分のヌクレオチド配列のポ リメラーゼ鎖伸長反応（ＰＣＲ）により拡大されている（１）。この開発の拡大 部分には、これらの配列のウィルスゲノム、特にファージまたはバクテリオファ ージへの挿入がある（２．３．４、ＩＩ）。これらの点に関して、参考文献とし て、１９９２年１月２３日付けて発行された、［特異結合対のメンバーの生成方 法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｆｏｒ　Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｍｅｍｂｅｒｓ　ｏｆ　５ ｐｅｃ山ｃ　Ｂｉｎ市ｎｇ　Ｐａ１ｒＳ）Ｊと題するＰＣＴ特許公開ＷＯ９２０ １０４７を挙げることができ、この特許を引用してここに組み入れる。同様に、 ファージの表面上の触媒活性酵素の発現も達成されている（３２）。

一例として、クラクソン等（Ｃ１ａｃｋｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　（２）は、 ハブテン２−フェニルオキサゾール−５−オン（ｐｈｏｘ）に対して感作されて いるマウスから、Ｈ−１（Ｖ、）およびカッパ（Ｖ、　）Ｌ−ｉｌｍに係わる再 整列配列のランダム組み合わせライブラリィを使用して、このｆｄファージの表 面上に抗体フラグメントの種々のライブラリィを表示させたことを報告している 。この組換えｆｄファージは、その集団をアフィニティカラム上に通すことによ って選別されている。

同様に、マカファーティ等（ＭａＣａｆｆｅｒｔｙ　ｅｔ　ａｔ、　）　（３） は、完全抗体Ｖドメインを、組換えｆｄバクテリオファージの表面上に表示でき ること、および抗体に結合する（例えば、１００万分の１）、これらの完全抗体 Ｖドメインをアフィニティ　クロマトグラフィにより単離できることを報告して いる。そしてまた、マカファーティ等（３２）は、バクテリオファージの表面上 における機能性アルカリ性ホスファターゼの発現およびアフィニティクロマトグ ラフィを報告している。

同様に、ヒユーズ等（Ｈｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ、　）の刊行物（４）は、バクテリ オファージラムダヘクター系を使用して、Ｆａｂフラグメントの組み合わせライ ブラリィをＥ、ｃｏｌｉで発現させることに関連している。この発現の選別は抗 体に対する結合選択性によって行われている。

ハブテンまたは抗原に対する結合性または親和性により、触媒性抗体あるいはそ の触媒活性部分を発現する可能性がある組換えファージを選別する技術が伴う問 題には、初めに多大数のファージ、例えば１０’以上の程度のファージが得られ ることにある。この大多数のファージ集団からハブテン結合に係わり選別を行う と、依然として大多数の、例えば６，０００−１０．ｏ００ファージの程度のフ ァージ付属集団（結合性のもの）が得られる。しかしながら、この結合性の第一 付属集団の中にはまだ、それらの表面上で抗体を発現する（従って、ハブテンに 結合する）ばかりでなく、また触媒性抗体である（すなわち、発現された抗体ま たはその一部が触媒性である）狭い群の第二のファージ付属集団が存在する。

従って、第一付属集団（すなわち、抗原またはハブテン結合性の集団）のみを単 離する技術は、触媒性抗体またはその触媒性部分を発現するものを単離する、組 換えファージ集団の選別法としては不適である。すなわち、ハブテン結合性によ る選別は、後続の使用のために、例えばＥ、ｃｏｌｉなとの宿主細胞に感染させ 、触媒性抗体またはその触媒性部分を発現する組換えファージまたは細胞の一定 の発生を生じさせるために、組換えファージ集団から触媒性抗体またはその触媒 性部分を発現するものを単離するには不充分である。広い観点において、触媒性 抗体などの触媒の開発で直面する問題として、超過剰の無触媒性部分、例えば同 一遷移状態の類縁体に対して誘発される超過剰の無触媒性部分の中から、所望の 触媒活性を示す部分、例えば抗体、を選別するが、またはこのような部分に富ん だ部分の選別を経済的に行うことができないという問題がある。

さらにまた、抗体フラグメントの触媒活性の従来の選別方法（過度の選別操作に よるそれらの同定とは異なる）は、該当フラグメントを発現する存機体における 遺伝的欠失を補償する能力に基づく生物学的選別に依存している（１６）。従来 、触媒性抗体またはその触媒性部分を発現する組換えウィルスまたはこのような ウィルスで感染された細胞を、これらのウィルスまたは細胞の触媒性に基づき選 別する方法は存在していない。

酵素学分野の刊行物（５，６）では、メカニズム−ベース　インヒビター（アフ ィニティ標識または自殺基質）と称される反応体か報告されている。これらの反 応体は正常基質と同様に酵素の活性部位に結合するが、正常基質に反して、反応 メカニズムの化学的特徴を利用して、酵素との不可逆性付加物を形成する。この ような反応体が、多くの酵素および酵素メカニズムで特別にデザインされている 。一般に、正常基質で沈殿する請求核性酵素アミノ酸残基はむしろメカニズム− ベース　インヒビターと反応し、そして永久的に不活性化される。自殺基質であ るハブテンは、抗体の誘発に使用されている（Ｉ４）。これらの自殺基質は、触 媒活性を仔する抗体の選別には使用されていない。

従って、従来、紹換えファージまたは組換えファージ感染細胞集団からの触媒性 抗体またはその触媒性部分を発現する一団を選別するために、または触媒性部分 を発現する一団を濃縮するために、メカニズム−ベース　インヒビターが適用さ れたことはなかった。触媒性部分、例えばファージ、細胞、またはその他の自己 複製性系、あるいは触媒性ペプチド、オリゴペプチド類、ポリペプチド類、また は酵素により発現される触媒性部分を選別するためにメカニズム−ベース　イン ヒビターをいかなる方法でも利用したことはなかった。また、触媒性部分を含有 する試料中の触媒性部分の濃度を増加させるために、メカニズム−ベース　イン ヒビターをいかなる方法でも利用したことはなかった。

酵素を使用する研究で、活性酵素は基質で覆われている二次元表面を「はうよう にＪ槙切ることかてきるが（マイクロメーター距離規模で）、この基質に対して 同一の結合親和性を有する不活性酵素は、それらの移動性か格別に制限されるこ とか証明されている（７．　８．　９）。しかしながら、従来、組換えファージ または組換えファージ感染細胞集団からの触媒性抗体またはその触媒性部分を発 現する一団を選別するために、あるいは触媒性部分を発現する一団の濃度を増加 させるために、所望の触媒反応の基質を含む二次元表面を利用したことはながっ た。

触媒性部分の選別に、あるいは触媒性部分を含有する試料中の触媒性部分の濃度 の増加に、触媒加速移動を利用したことはなかった。

固相不動化抗原に結合する抗体の運動力学は研究されている（１０）。しかしな から、このような表面結合に基づいては、触媒性部分からの無触媒性部分の分離 は行われていない。例えば、インキュベーション時間に関係なく、同一の親和性 を存する基質に対して結合する無触媒性部分を発現させ、一方で初期にはこの基 質に結合するか、触媒作用を一旦生じると解離する触媒性抗体またはその触媒性 部分を発現する該当ファージまたは感染細胞に基づいて、組換えファージまたは 組換えファージ感染細胞集団が選別または濃縮されたこともない。触媒性部分を 含有する試料中の触媒性部分の選別に表面結合性か使用されたことはない。

さらにまた、結合および酵素による触媒作用に対する温度の影響は研究されてい るが（１２Ｌ触媒性部分の選別に、または触媒性部分を含有する試料中の触媒性 部分の濃度の増加に、または触媒性部分を発現する組換えファージまたは組換え ファージ感染細胞の選別あるいは濃縮に、触媒性部分の基質結合性（非触媒は非 結合性）に係わる、温度の関数としての不連続性が使用されたこともない。

クロマ）・グラフィ　カラムにおける分子の保持性を変更させる、種々の競合性 可溶性リガンド、例えば固体支持体に共有結合した基に対して比較的弱い親和性 を有するリガント、の存在の下におけるＦ弱親和性りロマトグラフィＪ（１７） およびその触媒メカニズムの原理は研究されているが、従来技術において、無触 媒からの触媒の単離または選別に、あるいは触媒の濃縮に、競合による触媒結合 性の変化か利用されたことはない。

触媒性部分の運動学的理論および本質的に、かつまた実質的に触媒作用を付随す る熱力学的理論に基ついて触媒性部分を選別できることが望ましい、すなわち反 応−ベース選別は望ましい方法である。また、反応に基づいて、試料中の触媒性 部分の濃度を増加させることかでき、そして触媒性性質を利用することによって 、その濃度の増加を達成できること、すなわち触媒性部分の濃度増加を得ること かできることは望ましいことである。さらにまた、触媒性部分を発現する組換え ウィルスまたは組換えウィルス感染細胞集団の選別あるいは濃縮を触媒性に基づ いて行うこと、すなわちこのような集団の反応−ベース選別または濃縮は望まし いことである。

前述したように、組換えファージ集団から抗体を発現するものを選別する（例え ば親和性またはハブテン結合性による）ことができるばかりでなくまた、この集 団から、触媒性抗体またはその部分、触媒性酵素、あるいはさらに一般的な触媒 性部分を発現するものを選別することかできることは望ましいことである。例え ば、この集団の中の触媒性抗体またはその部分を発現するものは、引き続く集団 （抗体またほぞの一部を発現しないもの、またはこれを発現するが、触媒性では ないものか実質的に夾雑していない集団）の産生に使用できることから、あるい はまた所望の反応（触媒性抗体またはその部分を発現しないものによる夾雑が最 低であるか、または触媒性抗体またはその部分を発現しないものの濃度か減少さ れている反応）を触媒させるために使用できることから、触媒性に基づく選別は 望ましい手段である。組換えファージまたは組換えファージ感染細胞の産物を使 用しようとする研究のシナリオでは、この集団の中の抗体またはその部分を発現 するが、触媒的に活性ではない形態のものは反応系において有害であることは確 かなことである。これは、これらが、基質に対して、触媒性ファージまたは触媒 性部分と競合できるからである。同様に、組換えファージ集団を使用して、これ を細胞に感染させ、モノクローナル抗体を産生させる場合に、この集団の反応− ベース選別は、この集団を引き続くモノクローナル抗体を産生させるためのさら に狭い群の集団に減少させることを含む労力の節約に望ましい手段である。

従って、組換えファージまたは組換えファージ感染細胞集団の選別または濃縮を 、触媒活性に係オ）り反応−ベースで行うことかできることは望ましいことであ る。

発明の要旨 従って、本発明は、触媒活性を存する部分の反応−ベース選別からなる触媒性部 分の選別およびまたこれらの部分の単離方法を提供するものである。本発明はま た、触媒活性を存する部分を反応−ベース選別に付し、これらの部分を単離する ことからなる、試料中の触媒性部分の濃度を増加させる方法を提供する。この選 別は、メカニズム−ベース　インヒビター、触媒加速移動、表面結合、温度の関 数としての結合の不連続性または競合による結合性の変更を使用する方法により 行うことができる。

本発明はさらにまた、触媒性抗体またはその触媒性部分なとを発現する、組換え ウィルスまたは細胞、例えば組換えウィルス感染細胞の選別方法およびまたウィ ルスまたは細胞試料中のこのようなウィルスまたは細胞の濃度を増加させる方法 を１是供し、この方法は、下記の工程からなる。

触媒性部分を発現するウィルスまたは細胞を含有する可能性がある組換えウィル スまたは細胞の集団の触媒活性を反応−ベース選別に付し、次いでこの集団から 、触媒作用を発揮できる付属集団を単離する。

同様に、本発明は、触媒性抗体またはその触媒性部分なとの触媒性部分を発現す ることができる細胞ラインまたは組換えウィルスの産生方法を提供し、この方法 は、下記の工程からなる： 触媒性部分を発現するウィルスを含をする可能性がある組換えウィルスの集団の 触媒活性を反応−ベース選別に付し、この集団から、触媒作用を発揮できる付属 集団を単離し、次いでこのｆ；Ｊ属集団のウィルスを含有する紹換えウィルスに より、感染させることのできる宿主を感染させる。

反応−ベース選別は、メカニズム−ベース　インヒビター、触媒加速移動、表面 結合性、温度の関数としての結合の不連続性、あるいは競合による結合性の変更 を使用することによって行うことかできる。これらの態様はまた、反復を包含す るものである。所望により、例えは反応−ベース選別は、単離工程の後に反復す ることかできる。この反復は同一技術によって行うことかできる（例えば、触媒 加速移動の反復）、あるいは別種の技術によることもてきる（例えば、−回目の 表面結合、メカニズム−ベース　インヒビター、触媒加速移動、温度の関数とし ての結合の不連続性、あるいは競合による結合性の変更による反応ベース選別工 程中における触媒加速移動を、引き続く反応−ベース選別工程中に使用する）。

本発明はさらにまた、触媒性部分（たとえば、触媒性抗体またはその触媒性部分 ）を発現する組換えウィルスまたは細胞の検出方法、あるいは試料中のこのよう なウィルスまたは細胞の濃度の増加方法を提供し、この方法は、下記の工程から なる： 触媒性部分を発現するウィルスを含有する可能性かある組換えウィルスまたは細 胞の集団を、選択されたハブテンに対する結合性に係わり選別し、この集団から 、この選択されたハブテンに結合できる第一付属集団を単離し、この第一付属集 団を、触媒活性に関して反応ベース選別に付し、次いでこの第一イτノ属集団か ら、触媒作用を発揮することかできる第二（＝Ｉ属集団を単離する。

同様に、本発明はまた、触媒性部分を発現することかできる組換えウィルスまた は細胞ラインを産生ずる方法を提供し、この方法は、下記の工程からなる・触媒 性部分を発現するウィルスを含有する可能性かある組換えウィルスの集団を、選 Ｕくされたハブテンに対する結合性に係わり選別し、この集団から、この選択さ れたハブテンに結合できる第一付属集団を単離し、この第一付属集団を、触媒活 性に関して反応ベース選別に付し、この第一付属集団から、触媒作用を発揮する ことかできる第二付属集団を単離し、次いて 組換えウィルスにより感染する可能性がある宿主に、この第二付属集団のウィル スを感染させる。

選択されたハブテンに対する結合性に係わる選別は、集団を不動化した）＼ブテ ンのアフィニティカラム上にａすことからなることができる。この点に関して、 第一付属集団の単離は、集団中のこのアフィニティカラムに結合する部分を溶出 することからなることかできる。

触媒活性に係わる選別は、メカニズム−ベース　インヒビターを使用して行うこ とかできる１例えはこの選別は、第−ｆ」属集団をメカニズム−ベース　インヒ ビターと接触させ、反応混合物を生成させることからなることかできる。そして また、この第二（マ」属集団の単離は、この反応混合物をハブテンアフィニティ カラム上に通し、不動化ハブテンに結合していないウィルスまたは細胞を採取す ることからなることかできる。第一付属集団とメカニズム−ベース　インヒビタ ーとの接触はまた、第一（」属集団を粒子に結合させたインヒビターとの接触に よって、例えばインヒビターか脱離性基により結合しているカラム上に、第一付 属集団を通すことによって行うことかできる。この場合の第二イづ属集団の単離 は、インヒヒビターーウイルス（または細胞）粒子状複合体を分離することから なることかできる。

別法として、触媒活性に係わる選別は、触媒加速移動を採用して行うこともてき る。例えば、この選別は、所望の触媒反応の基質を含有する表面と第一付属集団 とを接触させ、ここでこの接触を当該表面の第一の地点で生じさせ、次いて第一 （＝ｊ属集団中の触媒活性を存するものか当該表面の第二の地点まで離れて移動 するのに充分の時間の後に、この第二の地点て、第−付属集団中の一団を検出す ることからなることかできる。この別法において、第二付属集団の単離は、表面 上のこの第二の地点から第−付属集団中の一団を採取することからなることかで きる。

もう一つの別法においては、触媒活性に係わる選別は、表面結合により行うこと かできる。例えば、この選別は、第−付属集団中の触媒活性を存していない一団 は結合し、一方第一付属集団中の触媒活性を有する一団は結合し、次いて触媒作 用を発揮する、所望の触媒反応の基質を含有する表面と第一付属集団とを接触さ せ、次いてこの第−付属集団中の触媒活性を有していない一団が当該表面と平衡 に近付くには充分であるか、第一イ；ｊ属集団中の触媒活性を有する一団が当該 基質を消費する時間よりも短い時間の後に、当該表面を洗浄して、第−付属集団 中の触媒活性を存する一団をここから分離することからなることかでき、そして この第二付属集団の単離はこの洗浄液を採取することからなることができる。こ のもう一つの別法において、触媒活性に係わる選択はまた、表面を洗浄して、第 −付属集団中の触媒活性を有する一団を洗出する前であって、第−付属集団中の 触媒活性を有する一団と第一（＝Ｊ属集団中の触媒活性を存していない一団との 両方が１　接触して、そこに結合するのに充分の時間であって、第−付属集団中 の触媒活性を有する一団か当該基質を消費するか、またはその触媒作用を完了す る時間よりも短い時間の後に、当該表面を洗浄して、この第−付属集団中の基質 に対して弱い親和性を存するか、または親和性を存していない一団を分離するこ とからなることもてきる。

さらにもう一つの別法においては、反応−ベース選別は、温度の関数としての結 合性のエンタルピー要素の変化によることができる。例えば、この選別は、第一 付属集団を、第一の温度において基質と接触させ、次いでこの第一付属集団を、 第一の温度よりも高い第二の温度において基質と接触させ、その後に見掛は上の 結合に対する温度の作用か相違している第二（ツ属集団を採取することからなる 。

この態様において、基質は、例えばカラムに不動化させることができ、どの場合 には、第一（＝ｊ属集団中の弱く結合している、または初めに溶出される一団と 強固に結合し′Ｃいる、または後で溶出される一団とをフラクションとしてそれ ぞれ採取し、これらのフラクションを再度、第二の温度て基質と接触させ、その フラクションを再度、採取する。この第二の温度における基質との接触の後に採 取されたフラクションを次いで、第一付属集団中のこの一団の相対濃度に係わり 分析する。最低濃度（１種または２種以上）を有するフラクション（１つまたは ２つ以上）は、第一付属集団中の触媒活性か最大の一団を含有している。これは 、見掛けＦの結合に対する温度の作用か相違していることに基づいている。この 第一の温度は、結合は生じるか、触媒作用は発揮されないような低温であると好 ましい。

さらにもう一つの別法では、触媒活性に係わる選別は、競合による結合性の変化 によることかできる。例えば、この選別は、移動性の無反応性基質類縁体の存在 の下に、第一付属集団と不動化した無反応性基質類縁体とを接触させ、次いでこ こから当該不動化類縁体に結合する試料（１種または２ｆｆｆ１以上）を採取し 、この試料（１種または２種以上）を、基質の存在の下に、当該不動化類縁体と 接触させ、次いでここから第一付属集団中の大部分の一団とは見掛は上の結合性 か相違している一団を採取することからなることかできる。−例として、この不 動化類縁体かアフィニティクロマトグラフィカラムに不動化されている無反応性 基質類縁体である場合に、試料（１種または２種以上）を、基質の存在の下に、 この不動化カラムど接触させると、主ピーク（１つまたは２つ以上）に比較して 、後に、または直ぐに溶出されるフラクション（１つまたは２つ以上）か第一付 属集団中の大部分の一団とは見掛は上の結合１ｔｈか相違している一団である。

本発明の方法はまた、次工程に進行する前に、いづれかの一工程を反復して行う 方法を包含する。−例として、初めの集団を選ｖくされたハブテンとの結合に係 わる選別に付し、次いてこの２回目の工程により結合した集団を単離し、反応− ベース選別工程で使用することかできる。同様に、初めの「第一イづ属集団Ｊを 触媒活性に係わる反応−ベース選別に付し、次いて触媒作用を発揮てきる第二イ 」属集団をここから単離し、この第二付属集団を再度、反応−ベース選別に付し 、この第二の［第二イ１属集ＤＩ＋を単離することかできる。これらの工程の反 復は、当該方法の生成物の触媒活性（発現）を増加または増強するために使用す ることができる。この二回目の反応−ベース選別は、−回目の反応−ベース選別 と同一方法であってもよく、あるいは本発明の別の態様のいづれかによってもよ い。さらに、本発明は、上記態様のさらに別の態様をも包含する。

従って、本発明はまた、前記の本発明の方法により生成される触媒性部分、例え は触媒性抗体またはその触媒性部分を発現できる組換えウィルスまたは細胞集団 を提供する。これらの集団は、前記方法に従うかぎり実質的に純粋であり、触媒 として作用しないウィルス、細胞またはその部分、あるいはハブテンに結合せず 、カリまた触媒として作用しないものの、全部ではなくとも、大部分か除去され ている。さらにまた、本発明は、前記本発明の方法により調製された触媒組成物 を提供する。これらの触媒組成物には、前記ウィルスまたは細胞集団およびまた その他の触媒性部分か包含され、これらの組成物はまた、前記本発明の方法によ り無触媒性部分、あるいはハブテンに結合せず、無触媒性であるものの、全部で はなくとも、大部分か除去されているという点で、実質的に純粋である。本発明 におけるウィルスは、Ｍｌ、３フアージまたはｆｄファージのようなバクテリア であることかでき、従って宿主は、Ｅ、ｃｏｌｉのようなバクテリアであること ができる。

図面の簡単な説明 以−Ｆの詳細な説明において、添付図面が引用されており、これらの図面をここ に組み入れる。これらの図面は本発明を必ずしも制限するものではなく、本発明 を説明するものである。

図１および２は、縦軸に無反応性類縁体による第一の面積溶出プロフィール（ｖ ｏｌ、）および横軸に基質による第二の面積溶出プロフィール（ｖｏｌ、）を示 す二次元分離プロフィールを示すものであり、小さい星印のピークは主ピークの 溶出の前または後に溶出されたことを示し、従って引き続いて濃縮することかで きる、触媒含存フラクションを示している。

訂細な説明 抗体（またはその部分）の発現コードをウィルスゲノムに増幅、挿入することに 係わる技術およびこれにより触媒性部分を発現できる一団を含有する可能性があ るウィルス集団を得る技術は当業者にすてに認識されており（１，２，３，４゜ １１）、従ってこのような組換えウィルスかＥ、ｃｏｌｉなとの宿主細胞の感染 に使用できること、そして溶解サイクルか開始されるまで、この組換えウィルス か、触媒性部分を発現する細胞およびその子孫とともに宿主染色体中にプロウィ ルスま書　たはプロファージどして存在できることは当業者に認識されているこ とと見做される。また、触媒性部分を含有する試料を得る技術も当業者に認識さ れているものと見做される。従って、以下の説明は、触媒性部分、触媒性抗体ま たはその触媒性部分を発現できるウィルスまたは細胞を含佇する可能性かある、 組換えウィルスの集団または細胞の集団から、あるいはその中の触媒性部分の存 在を測定、選別、または濃縮しようとする試料から始めることにする。

本明細書で使用するものとして、［触媒性抗体（ｃａｔａ！ｙｊｉｃ　ａｎｔｉ ｂｏｄｙ）　Ｊおよび「触媒性部分（ｃａｔａｌｙｊｉｃ　ｐｏｒｔｉｏｎ　ｔ ｈｅｒｅｏｆ）　Ｊは、その他の条件の全部（例えは、温度、反応体／基質濃度 なと）か同一であるものとして、対象の化学反応の速度を変更でき、かつまたこ の化学反応により不可逆的に変性されず、従って当該反１、コ；でｌＩ！ｉ費さ れない物質である。この物質はまた、触媒性抗体の１モルに対して、多モルの反 応体／基質を変換する能力を示し、かつまたそのメカニズム上の観点から、反応 体／基質に結合し、反応体／基質の生成物への変換を加速し、次いて生成物の放 出を加速する作用をなし、およびまた平衡の位置を移動させることなく化学反応 の速度を変更させる物質である。この定義は、Ｉ！ｌ！想的触媒の特徴であるか 、実際には、最上の触媒でさえも、反応系の汚染により、または反応プロセス中 の化学的または物理的劣化の結果として、阻害化もしくは脱活性化されることか ある。当業者に周知の理由によって、真正の触媒動作は反応系の成分または反応 環境の条件により明確ではないこともある。

さらにまた、本明細書で使用するものとして、「触媒性部分」の用語は、触媒作 用を発揮する全−Ｃの部分を意味するものであり、この用語には、これらに制限 されないものとして、［触媒性抗体Ｊａｒその触媒性部分Ｊ　（触媒性抗体の） ：触媒性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、あるいは酵素またはその触 媒性部分二自己複製性系により発現される触媒性部分　それらの遺伝子コートに 触媒性分子またはその発現部分を含付し、自己複製性であるか、または必ずしも 自己複製性ではなくてもよい、例えば触媒性分子が結合している、例えばそこに 存在する蛋白質の結合作用により結合しているもの、例えば、裸のｍＲＮＡ、リ ポソームまたはポリソームなどが包含される。

本明細書で使用するものとして、　「表面結合」の用語は、例えば表面に対する 物理的吸引力による結合または化学的結合のどちらかで結合する部分に対して使 用される。本明細書で使用するものとして、触媒性部分は好ましくは、触媒性部 分をコートするＤＮＡまたはＲＮＡに対して直接に、あるいは触媒性部分をコー トするＤＮＡまたはＲＮＡを包含しているエンベロープに対して、表面結合して いるものである。このようなエンベロープには、これらに制限されないものとし て、細胞膜、ウィルスコート、または細胞壁か包含されうる。

触媒活性を表すには、ある種の作用上の定義がＡ当である。これらの表現方法に は、以下の方法か包含される・ （］）Ｋ、、、、または「ターンオーバー数Ｊ　；に、、、／に、、ｅ、、、ｒ 速度増加因子Ｊ　（ｒａｔｅ　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｆａｃｔｏｒ　）およ びに−１「ミカエリス定数」。ターンオーバーは、生成物に変換できる反応体／ 基質のモル数／触媒性抗体１モル／単位時間を示す。例えば、分子か１分光たり で１０３の基質ターンオーバーを示し、そしてこの分子か室温およびその最適ｐ Ｈにおいて、２４時間その触媒活性を維持する場合に、この触媒の各分子は総合 して、１．４Ｘ１０’の変換を生しさせる触媒活性を示す。この総合変換数は、 どんなに長い反応が行われても、１．０を決して越えることはない化学屋論的反 応における総合変換数とは区別されなけれはならない。速度増加因子は、その他 の反応条件力洞−であるとして、触媒の非存在下における反応速度に対する触媒 の存在下における反応速度を表す、大きさのない数である。ミカエリス定数は、 見掛は上の結合定数である。この定数は、反応速度か最大の２分のｌである基質 濃度に等しい：　（Ｋｃ、、／２において、「Ｓコ　−に、）。

本発明に従う場合に、抗体は純粋な免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ。

ＩｇＤまたはＩｇＥ）、あるいは免疫グロブリンの抗体フラグメント、例えばＦ ａｂ、　Ｆ　（ａｂ　−）　２　、Ｆｖなとを包含することかできる。触媒性抗 体は、ある種の主要カテゴリーに包含される。第一のカテゴリーには、純理的に デザインされた触媒性抗体、すなわち標的抗原または基質に対する特異免疫感作 により導入された抗原に対して誘発される抗体か包含される。このような触媒性 抗体、それらの調製方法およびそれらの使用は、１９８９年１２月１９日（引す で発行された米国特許４，８８８，２８１．１９８８年１２月２０日付けで発行 された米国特許４，７９２，４４６および１９８７年６月１９日付けて出願され た米国特許出願５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、　０６４．　２３９および１９９１年１２ 月ＩＯ日付けて出願された米国特許出願５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、　８０５．　５７ ６に記載されており、これらの記載を引用してここに組み入れる。触媒性抗体の 第二のカテゴリーには、前記の第一のカテゴリーの触媒性抗体とは異なり、動物 自身の細胞成分（自己抗原）に対する動物の免疫系によって産生される天然産生 抗体か包含される。これらの「自己抗体ｊは、１９８９年４月２５日付けて出願 された米国特許出願５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、　３４３．　０８１に記載されており 、これらの記載を引Ｉｌシてここに組み入れる。これらのタイプの触媒性抗体の 両方、あるいはその触媒性フラグメントをコードするＤＮＡは、増幅させ、ウィ ルスゲノム中に挿入することかできる（１．２．３．４参照）。

第三のカテゴリーには、免疫感作を含まない方法によって発現される触媒性抗体 が包含される。例えば、触媒性抗体は、予め誘発させた抗体をランダム化して、 新しい特異性を存するが、免疫感作から誘発されたものではない抗体を発生させ ることによって得ることかできる。

「化学反応」の用語は、少なくとも１種の反応体を少なくとも１種の生成物に変 換させる反応を表す。このような化学反応には、例えばオキシドレダクターゼ、 トランスフエラーセ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーセおよびリガーゼな との酵素により触媒されうる化学反応、およびまた例えは酸化、還元、付加、縮 合、ｔｒｊ去、置換、開裂および転移なとの酵素か未知の化学反応か包含される 。化学反応はまた、ペプチド結合の開裂であることもできる。本明細書で使用す るものとして、ペプチド結合の用語は、２個の隣接するアミノ酸残基を連結する アミド結合を意味し、一般的に次式で表される・特表千７−５０４０９０　（８ ） この式においで、ペプチド結合はカッコ内に示されている。

アミノ酸は、そこにアミノ基、カルボキシル基、水素原子および「側鎖」と称さ れる特別の基（」−記載ては、ＲｏおよびＲ１′で表されている）か結合してい る炭素原子からなる。本明細書で使用するものとして、アミノ酸は、これに制限 されないか、蛋白質の構築ブロックを構成している２０個の天然産出アミノ酸を 包含する。隣接するアミノ酸のどちらかかプロリンである場合に、側鎖、Ｒ１お よびＲｈ、はそれぞれ、隣接する窒素原子に結合して、特徴ある５−員ブロリン 環を形成するものと当業者に理解される。

「基質」の用語は、化学反応における反応体と同義であり、これらに制限されな いものとして、エステル、ペプチド、蛋白質、リン脂質、炭水化物（例えば、グ リコーゲン、グルコースなと）および薬物（有害薬物および医薬、ならびに外部 供給源からのプロトラッグを包含する）を包含する、多くの分子および生物分子 のいづれかであることかできる。この点に関しては、１９９１年８月５日付けて 出願された審査中の出願５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、　Ｏ７／　７４０．　５０１およ び１９９１年ｌＯ月ｌＯ日イ」けて出願された同０７／７７３，０４２を挙げる ことができ、これらを引用してここに組み入れる。−例として、基質は１個また は２個以上のエステル結合および１個または２個以上のペプチド結合を含有する ことかできる。基質はまた、いづれかの蛋白質分子、例えば調節蛋白質または構 造蛋白質であることかでき、これらに制限されないものとして、ペプチドホルモ ン類（例えば、インツユリン、成長ホルモン、セクレチンなと）、ペプチド神経 伝達物質、神経モジュレータ−１神経ホルモン因子（例えばＶＩＰ、エンドフィ リン類、エンドフィリン類、グラディキニン類、物質Ｐなと）、腫瘍蛋白質（例 えば、腫瘍遺伝子産物、癌胎児性抗原なと）、これらに制限されないか、核蛋白 質および膜蛋白質を含むバクテリア蛋白質およびウィルス蛋白質（例えば、ヒト 免疫不全ウィルス（）ＩＩＶ）ｇｐ＋２ｏ、インフルエンザ糖蛋白質なと）を包 含する。基質はまた、抗原または自己抗原、すなわぢ動物の身体かそれ自身の遺 伝子コードを用いて作り出す抗原であることかてきる。すなわち、自己抗原は、 異種抗原（例えば／＜クチリア抗原、ウィルス抗原）とは相違するものである。

本明細書で使用するものとして、　「動物」の用語は、免疫系を有する全ての有 機体を意味し、哺乳動物および非咄乳動物を包含する。

本発明のこの態様の一般的概略において、触媒性抗体またはその触媒性部分を潜 在的に有するウィルスまたは細胞の集団、あるいは触媒性部分を含有する細胞か 好適である。

１、不動化ハブテンのアフィニティカラム上を通過させたもの。結合しているも のか、例えはｐＨの変化により、またはこのカラムに遊離ハブテンを通すことに より、溶出されるもの。

２、ａ、ハブテンアフィニティ力ラムに結合することか見出ださねているウィル ス、細胞または触媒性部分を、例えば適当にデザインされたメカニズムーヘース 　インヒビターと混合し、次いて反応させて、混合物を生成させたもの。

２、ｂ　別様には、メカニズムーヘース　インヒビターをカラムなとの粒子に、 例えは脱離性基により結合させることができるもの。ウィルス、細胞または触媒 性部分を、このカラムに通し、結合したものは、カラムから溶出してさらに使用 される（例えば、感染に）。これは、結合したものをカラムからのインヒビター の脱離により、またはカラムに酸性溶液などの適当な溶液を通すことにより、ウ ィルスまたは細胞の破膜を溶解させ、そこからＤＮＡを溶出し、その後に、この ＤＮＡを使用して、宿主細胞を形質転換させるか、または組換え細胞またはウィ ルスを？表引き続き使用することによって行うことかできる。

３、この態様の２゜ａ、の別法では、適当な長さの経過時間の後に、ウィルス細 胞または触媒性部分の混合物を、ハブテンアフィニティ力ラムにおいてクロマＩ ・グラフィまたは再りロマトグラフィに付す。この時間の間に流出した（ハブテ ンに結合しない）ウィルス、細胞または触媒性部分を採取する。これらのウィル スまたは細胞を使用して、Ｅ、ｃｏｌｉなとの適当な宿主に感染させるか、また は溶解サイクルを受けるようにし、そこから、例えば宿主感染または溶解から得 られるウィルスをスケールアップし、触媒として使用するか、または触媒選別に 使用する。この態様を以下にさらに詳細に説明する。

Ｂ、ハブテン　アフィニティクロマトグラフィ好ａｇ３様において、メカニズム ーヘース無活性化により触媒性選別を行う前に、抗体発現性のウィルスまたは細 胞または触媒性部分を、例えばハブテンアフィニティクロマトグラフィにより、 予備選別する。しかしながら、触媒性選別はまた、ハブテン結合による初めの予 備選別を行うことな〈実施することもできる。好適態様においては、ハブテンに 結合するウィルス、ファージ、細胞または部分（＞６０００）を、メカニズム− ベース　インヒビターとの反応に付す。不動化したハブテンを使用する抗体保有 ウィルスのアフィニティクロマトグラフィは、刊行物で成功裏に行われている（ ２．　３．　４）。最近の発明において、触媒選別の第一工程は好ましくは、ハ ブテンアフィニティクロマトグラフィのような結合を用いる。例えは、下記のエ ステル基質（Ｉ　１）の加水分解か望まれる場合には、下記のハブテン（１）を 使用すると好ましい■ Ｉ ハブテン（１）において、Ｒは、免疫感作中における、共有結合型蛋白質に対す る、次いで固体マトリックス、例えばアフィニティクロマトグラフィヵラムに対 するリンカ−（例えば、ＫＬＨまたはＢＳＡ）であり、そして基質（Ｉ　ｌ）に おいて、Ｒ１は−Ｈまたは−Ｎｏ、である。

同様に、下記のエステル類（ＩＩＡ）および（ＪＩＢ）の加水分解の場合に、下 記のハブテン（ＩＡ）および（ＩＢ）か好ましく使用できる。

ＩＡ ＩＢ ＩＩＡ ＩＢ び使用を開示する、１９９１年１０月１０口付の審査中の出願５ｅｒｉａｌ　Ｎ ｏ、　０７／７７３．０４２を引用してここに組み入れる。

このハブテンに結合するウィルス、細胞または部分は、ｐＨを変えることによっ て、または遊離ハブテンにより（この場合には、引き続いて透析して、結合した ハブテンを分離する）溶離し、次いで引き続く工程に付す、すなわちメカニズム ーヘース反応体（１種または２種以上）にさらす。

Ｃ６メカニズム−ベースインヒビターとの反応この工程では、ハブテンに結合す る単離（；Ｊ属集団を、適当なメカニズムーベースインヒヒタ−（アフィニティ ラベルまたは自殺基質）と接触させる。適当なメカニズムーヘース　インヒビタ ーは、触媒的に活性の抗体またはその部分、例えばウィルス、ファージまたは細 胞の外側表面に発現される触媒部分と不可逆性付加物を形成させる。一方、この ようなインヒビターは、抗体またはその部分を発現するか、触媒性ではないウィ ルスまたは細胞とは不可逆性イ」加物を形成しない。

ハブテン１．ＩＡ、またはＩＢによる免疫感作から生じるものと予想することが できるエステル加水分解性抗体のメカニズム−ベース　インヒビターを以下に示 す。その池のメカニズムーヘース　インヒビターは、エステル加水分解以外の反 応に対して不活性であり、その他の反応を触媒できる、触媒性部分、例えば触媒 性抗体の選別に使用することかできることは周知である。メカニズム−ベースイ ンヒビターか存在する触媒反応には、シンテターゼ反応、ペプチダーゼ反応、酸 化／還元反応、β−ラクタマーセ反応、脱カルボキシル化反応、アミノトランス フエラーセ反応、リアーゼ反応、ラセマーゼ反応およびヒドロキシラーゼ反応か 包含される（５）。類似のインヒビターのデザインおよび使用は、これらのおよ びまたその他の反応に関して、当業者により実施できることである。

−例として、前記のエステル分解反応の場合に、メカニズムーヘース　インヒビ ターは下記の構造を有する・ ＩＩ Ｖ ■ ＩＩ ＶＩＩ ＸＨ ＩＩ これらの式において、Ｒ６はカラムに充填されているか、または液体（流動性） 中に懸濁されていてもよい粒子に対する結合基であり、そしてＸはＢｒ、Ｉ、０ ３Ｏ２ＣＨ，なとの脱離性基である。インヒビターか流動性形態て使用される場 合には、この結合基は存在する必要かないことは勿論のことである。

従って、ハブテン（１）により誘発された触媒性抗体、（または触媒性抗体また はその部分を産生ずるファージまたは細胞により誘発された触媒性抗体）を反応 条件の下に、基質ＩＩと接触させた場合には、次の反応か生起するＩＩ　−触媒 性部分Ｉ合体 すなわち、基質と触媒性部分、例えば触媒性抗体との間で錯（本カベ生成さ第１ 、その結果として、生成物（１）および（ｉ　ｉ）が得られ、触媒の再生力１生 じる。

しかしながら、インヒビター（Ｉ　Ｉ　１）−（ＸＩ）の場合（こ（よ、〕１ブ テン（１）により誘発された触媒性抗体と反応条件の下に接触させると、その一 部カベ触媒に結合したまま残り、これによりこの触媒が引き続き触媒としてｆ′ 「用することを妨害する（再生の妨害）。従って、下記の表Ｉに示されてしｓる よう（こ、本発明によるその単離か可能になる。

表１ （ｉ　ｉ）エステル基質（ＩＩＡ、）の加水分解同様に、５−フルオロウリジン エステラーゼ反応の場合における、すなわち化合物（ＩＩＡ）または（ＪＩＢ） を反応条件の下に、相当する触媒（例えば、ハブテン（ＩＡ）またはくＩＢ）に より誘発された触媒性抗体、あるいは触媒性抗体またはその触媒性部分を発現す るファージまたは細胞により誘発された触媒性抗体）と接触させることによって 、化合物（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）を加水分解させて、５−フルオロウリンン を生成させる場合における、触媒のインヒビターを下記の表１■に示す。このイ ンヒビターの一部（反応性生成物）は、触媒に結合したまま残る。この表ＴＩに おいて、ＸおよびＲ５は前記定義のとおりである。

上記エステル分解反応において、条件は一般に、次のとおりである：Ｉ）Ｈ６０ −８０、代表的には７．０．１０−１００ｍＭ、例えば３０−７０ｍＭ、代表的 には５０ｍＭのヘベス（ｔｌｅｐｅｓ　）、ｌ　００−３００ｍＭ、例えば１０ ０−２００ｍＭ、代表的には１５０ｍＭのＮａＣ１、温度２０−４０°Ｃ１通常 ３０″Ｃおよび時間０５−３時間。

Ｄ、アフィニティ分別によるウィルスまたは部分の分離インキュベーションの後 に、抗体またはその部分を担持しており、触媒性である、すなわちメカニズム− ベース　インヒビターと反応したウィルスまたは細胞はもはやハブテンとは結合 しないのに対して、反応体と反応しなかった抗体担持ファージまたは細胞は、ハ ブテンに結合しつづける。従って、無触媒性ウィルスまたは細胞から、触媒性抗 体またはその触媒性部分を表示するウィルスまたは細胞を分離するためには、第 二ラウンドのハブテンアフィニディクロマトグラフィを徹底的に行うことができ る。この処理は、前記のとおりに行われ、未反応のメカニズムベ−ス　インヒビ ターからのウィルスまたは細胞の分離は不必要である。触媒性抗体ファージまた は細胞はこのカラムに結合しないか、無触媒性ファージはこのカラムに結合する 。従って、結合しないでカラムを通過したウィルスまたは細胞は、触媒性抗体ま たはその部分を発現するファージである。これらのウィルスを使用して、適当な 宿主に感染させる１例えば、ウィルスかＭ１３、ｆｄまたはラムダなとのファー ジである場合には、Ｅ、　ｃｏｌ　ｉは適当な宿主”Ｃある。

感染の後に、ウィルスＤＮＡベクターにコードされている抗体をスケールアップ し、引き続いて使用するか、または特徴確認する。特に、これらのファージによ りＥ、ｃｏｌｉを感染させることによって、このε、　ｃｏｌ　ｉは触媒性抗体 またはその部分を発現するファージ生産のための工場になることかでき、あるい は触媒性抗体またはその部分の発現工場になることかできる。感染したし、ｃｏ ｌｉのウィルス産物または発現は、例えばエステル加水分解において、触媒とし て使用する。二とができ、あるいは前記の選別により触媒として最も活性なウィ ルス（ファージ）、および宿主（例えばＥ、ｃｏｌｉ）系の産生に使用すること かできる。同様に、細胞が触媒的に選別されており、その溶離物か採取されてい る場合には、この細胞は次いで、触媒性産生物の発現に使用することかできる： あるいはまた細胞がウィルス感染により（この場合に、ウィルスはプロウィルス またはプロファージである）触媒性産生物を発現する場合には、この細胞はまた 、溶解サイクルを受けるように誘発させることかできる。

別法では、このインヒビターを粒子に結合させる。広い観点において、刀ラムは 、この粒子の例であり、これらの粒子を「充填」　（不動化）する。インヒビタ ーは好ましくは、開裂性基により粒子に結合させ、インヒビターとの反応は、例 えばウィル人細胞または触媒性部分をこのカラムに通すことによって、ウィルス 、細胞または触媒性部分と接触させることにより行う。カラムを使用する場合に 、無触媒は溶離され、触媒は結合する。そしてこれらの触媒は、インヒビター− 触媒錯体をカラムから脱離させることによって、あるいはインヒビターからの別 設の解離によって、分離される。例えば、ウィルス、ファージまたは細胞の場合 に、このカラムに適当な液体、例えば酸を通し、次いでそこからＤＮＡを溶離し て、後で使用する（形質転換、組換え）。

特に、特異的にデザインされたメカニズムベース　インヒビターを用いて選別さ れＩこ触媒性ファージ、ウィルス、細胞または部分は、インヒビターがカラムな どの固体マトリックスに不動化されている場合に、アフィニティクロマトグラフ ィを使用して無触媒から分離することかできる。この態様において、触媒は、不 動化したインヒビターとの反応の後に、回収することができることが望まれる。

この目的を達成するためには、インヒビターを、カラムマトリックスから容易に 脱離または解離させることができ、これにより触媒の回収か可能になる、１種ま たは２種以上の分子（「開裂性基」または架橋）を介してカラムに結合させるこ とができる。この開裂性基は、非共有結合または共存結合によりインヒビターを カラムマトリックスに結合させることかできるものである。

実際には、適当な緩衝液中のファージ、ウィルス、細胞または部分の懸濁液を、 そこに適当なインヒビターか開裂性基を介して不動化されているカラム上で溶離 する。この実験方法を下記の経路で示す。この経路において、左側は共存結合型 開裂性基の例であり、そして右側は非共有結合型解離性架橋基の例である。触媒 は、インヒビターと反応することができ、インヒビター（左側および右側の両方 ともに、中央の図）を介してカラム（支持体）に共有結合するが、インヒビター と反応てきないものはカラムから洗出される（この経路図には示されていない） 。

このカラムを次いで、はぼ５カラム容積の初期溶離液により洗浄する。

この緩衝液は、触媒とインヒビターとの反応を最適にするように選択する。緩衝 液による洗浄の後に、溶離条件を変更して、開裂性基の開裂（経路図の左側下方 ）または解離（経路図の右側下方）を生しさせ、インヒビターと反応したもの（ 触媒）を採取する。

非共有結合相互反応は、固体マトリックスへのインヒビターの有用な結合手段を 提供する。インヒビターは、解離性非共有結合様相てカラムと相互反応すること かてきるリガンドに対して共有結合する。このカラムは、インヒビターに結合し ているリガントに対して特異的に、緊密に相互反応する部分を提示するように変 性されている、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　）　６　Ｂのような標準的 固体マトリックスである。（一般的例では、酵素インヒビターはカラムに不動化 されている。

このインヒビターは、自殺基質の１種または２種以上の分子が提示されるように 、その表面が共有結合型に変性されている、その相当する酵素に対して可逆的に 、かつまた非共有結合様相で結合することができる）。変性カラムとりガントと の相互反応は、溶離溶剤系の内容を変えることによって実験者がその親和性を故 意に破壊するまで、高親和性の反応である（２］、２２）。このリガンドを溶離 するための溶剤に対してなされる変更の種類は、非共有結合的に相互反応する一 対の分子の選択に依存し、過度の実験を行うことなく当業者が決定てきることで ある。溶離条件にお；プる変更の例には、リガント競合、アロステリー修飾、基 質溶離、インヒビター溶離、イオン強度の変（ｌｌＺ、有機溶剤または水性／有 機性混合物−＼の溶剤変更、温度変化、緩衝剤またはｐＨ変化、金属キレート溶 離、カオトロピック試薬、または電気泳動脱着（２３）か包含される。固体支持 体に対するインヒビターの非共有型の（しかし緊密な）結合に使用できる相互反 応の特定の例を、以下の表１１１１こ挙げる。また、Ｐｉｅｒｃｅ、Ａｍ１ｃｏ ｎ、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ、のカタログをまた参照でき、これらのカタログを引 用してここに組み入れる（２４．　２５゜２６．２７） インヒビターは、標準方法、例えば免疫学において、カルボジイミド　カプリン グおよびハブテンのキーホールリンベツトヘモソアニンまたはウシ血清アルブミ ンへのカプリングに使用されるその他のカプリングにより、右側側に挙げられて いる分子に結合させることかできる。

上記したように、非共有結合型錯体の解離に要する溶出条件は、選択された分子 対に依存する。若干の特定の溶離剤の例を以下の表ＩＶに示す（また２１を参照 することかできる）。

非共存結合の開裂性相互反応の代わりのものとして、開裂性基は、カラムとイン ヒビターとの両方に共有結合させることもできる。共存結合型開裂性基を脱離さ せることかできる手段の一つは、これらを酵素基質にすることである。この基を 接触開裂させる相当する酵素を、このカラムに通すことによって、この基を次い て開裂させる。多分、酵素による開裂の例の中で最も何にても有効な手段は、プ ロテアーゼ酵素を使用する手段である。インヒビターおよびカラムマトリックス は両方ともに、蛋白質基質にカプリングすることができ、′カラムーープロテア ーゼ基質−−インヒビター″結合をもたらす（ここで“−一“は、共有結合を表 す）。この結合を相当するプロテアーゼにさらすと、プロテアーゼ基質が加水分 計され、カラムからインヒビターか放出され、結合している触媒の採取が可能に なる。プロテアーゼ基質のカラムへの結合およびまたインヒビターへの結合に係 わるカプリング方法は、市販されている試薬を使用して、充分に確立されている （例えば、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、カタログ参照）。

ペプチドに共有結合した開裂性基およびこれらの開裂に使用できる酵素の特定の 例を下記の表Ｖに示す。挙げられているプロテアーゼおよび基質はいずれも、精 製形磐て市販されている（例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｃｊｍか ら）その池の共存結合基は、温和な条件を用いて開裂させることかできる。以下 の表Ｖｌに、チオール基またはアミノ基を有するインヒビターに結合することが でき、かつまたチオールて処理することにより脱離させることかできる、市場で 入手できる若干の官能性化されたマトリックスを挙げる。この表Ｖｌにはまた、 必要な基質とマトリックスとの間の架橋基およびまたこれらの使用に係わる参考 刊行物を単げろ。

２つの方法に従うことかできる。方法の１つでは、官能性化した自殺基質を、活 性マトリックスまたはマトリックス／架橋基と反応させる。ウィルス、ファージ 、細胞または部分の懸濁液を次いて、このカラムに通して溶出し、次いてインヒ ビターと反応させる。非共有結合したウィルス、ファージ、細胞または部分を洗 出しだ後に、不動化されたファージ、ウィルス、細胞または部分を、メルカプト エタノールなとのチオールにより溶離することによって、カラムから脱離させる ことかできる。

もう１つの方法では、官能性化したインヒビターを、ウィルス、ファージ、細胞 または部分の懸濁液と反応させる。触媒性活性を有するファージ、ウィルス、細 胞または部分は、インヒビターにより共有結合される。相応する時間の後に、こ のウィルス、ファージ、細胞または部分の懸濁液を活性マトリックスまたは７ト リックス／架橋基のカラムに通し溶出させる。触媒性活性を有するファージ、ウ ィルス、細胞または部分のみか、インヒビターのチオール基またはアミノ基と活 性７１−リックスまたは架橋基との反応を経て保持される。これらのウィルス、 ファージ、細胞または部分をチオールによる処理により脱離させることができる 。

インヒビターのカラムへの結合に係わる前記方法と同様の方法がまた、移動性粒 子に刻するインヒビターの結合に、あるいはカラムまたは膜に対する非反応性基 質類縁体または基質への結合に使用できることに留意されるへきてあり、これら の方法を、本発明のもう１つの態様として以下で説明する。

別法として、インヒビターは充填されていない、または不動化されていない粒子 、すなわちカラム中には存在していない粒子からなるか、あるいはこのような粒 子に結合されていることもてきる。この場合には、ウィルス、細胞または触媒性 部分を、これらの粒子と接触させる。この場合にもまた、触媒は、これらの粒子 に結合するか、無触媒性部分は結合しない。従って、無触媒から触媒を分離する には、接触の後に、これらの粒子を、例えば重力、濾過、遠心分離、電気泳動、 または磁場により（粒子か磁気に応答する場合）、接触メジウムから分離する。

粒子を単離した後に、これらの粒子は次いて、洗浄して、分離操作中に粒子に含 まれることかある無触媒をいづれも除去すると好ましい。

これらの粒子は有利には、０．００１−２００μｍ、例えば０．０５−２００μ ｍまたは０．００１−１００μｍ１好ましくは０、ｌ−１００１１ｍ、最も好ま しくは０．５−１０μｍの径を有し、かつまたインヒビターに結合できる表面部 分を有する、微粒モ物質である。−例として、この微粒子物質は、デンプン、デ キストラン類、セルロース類、蛋白質類、有機ポリマー類、スチレンコポリマー 類、例えばスチレン／ブタジェンコポリマー、アクリロニトリル／ブタジェン／ スチレンコポリマー、ビニルアセチルアクリレートコポリマーまたは塩化ビニル ／アクリレートコポリマー、不活性無機粒子、二酸化クロム、鉄酸化物、シリカ 、シリカ混合物、および蛋白質様物質あるいはその混合物に交差結合させること もできる。本発明の粒子を用いる態様においては、広範囲の粒子を使用すること かできる。一般に、これらの粒子は１．　０−５．　０ｇ／ｍＬ、好ましくは１ ．１．−２ｇ／ｍＬの比重を存する。最適比重の選択は、当業者の技術範囲にあ り、重力駆動分離では、沈降速度を考廖する。

インヒビター組成物中の粒子の濃度はまた、広範囲の濃度を使用できる。−例と して、この濃度は、ｌ−１０，０００μｇ／ｍＬ、好ましくは５−１０００μｇ ／ｍＬの範囲にわたることかできる。

本発明の実施方法で、濾過方式を使用する場合には、この濾過手段は好ましくは 、平均直径として測定して、粒子の径の広くて０．０１−９０％、好ましくは粒 子の径の広くて１０−９０％の孔寸法を有する。このフィルターの孔寸法は、無 触媒は通過させるか、粒子に結合している触媒は通過しないような司法であるべ きである。

本発明のインヒビターに使用できる多くの磁性粒子が公開されている。−例とし て、米国特許第４．６２８，０３７号、同第４．６９５，３９３号、同第４゜６ ９８．３０２号、同第４，５５４．０８８号、英国特許出願ＧＢ２，００５゜０ １９ＡおよびＥＰｏ、１８０，３８４には、成功裏に使用できる種々の磁性粒子 か記載されており、これらの記載を引用してここに組み入れる。これらの粒子は 常磁性または強磁性であることができ、そしてまたインヒビター物質がカプリン グして、本発明で使用できる磁性粒子か生成されるような、種々の物質により被 覆されていてもよい。望ましくは１本発明で使用される磁性粒子は、少なくども ０．００］ｃｇｓ単位、望ましくは少なくとも０．Ｏ１ｃｇｓ単位の感受性をを する。これらの磁性粒子は、広範囲、すなわち水の比重よりも小さい、比重、例 えば０．０１−５ｇ／ｍＬ、好ま（バは０．５−２ｇ／ｍＬの比重を存すること かできる。これらの粒子寸法は０．００１−２００μｍ、例えば０．００１−１ ００μｍ、好ましくはｏ、ｏ＋−ｉｏμｍの範囲にわたることができる。これら の粒子の濃度は、ｌ−１，０，０００μｇ／ｍＬの広範囲にわたることができ、 好ましくは５−１０００μｇ／ｍＬである。

望ましくは、使用される磁性粒子は、例えばＥＰｏ、１８０，３８４に記載され ているように、低磁気応答性を有していて、磁場が取り除かれた後には、粒子が 脱磁性化されるようにする。これらの磁性粒子の望ましい、比重、濃度および粒 子寸法は、沈降時間が、少なくとも０．５ｍｍ／分であり、望ましくは、電気化 学ルミネセンス粒子ベース分離方法（この方法は、本発明の粒子に存利に使用す ることかできる）を包含する粒子ベース分離方法および粒子に関連して、上記速 度以上であるように選択する。この点に関しては、１９９０年６月１８日付けで 出願された審査中の特許出願５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、０７１５３９，３８９および １９９１年２月６０付けて出願された同Ｎｏ、０７／６５２．４２７を参照する ことかでき、これらの特許出願を引用してここに組み入れる。

触媒性選別の前に、ウィルスまたはファージまたは細胞集団あるいは触媒性部分 の試料を好ましくは、ハブテン　アフィニティ　クロマトグラフィにより選別す る。ハブテンに結合するウィルス、細胞または部分（＞　６０００）を好まＩバ は次いで、触媒性選別に付す。

この方法は、触媒反応の所望の基質により、共有結合によって、または非共有結 合によって、被覆されている平坦な膜またはその池の２次元表面を包含する。

最適表面基質濃度は、特定の基質および膜に応じて、当業者による不当な実験を 用いなくても決定することかできる。非常に鋭い器具のような適当な器具を使用 して、触媒部分を潜在的に発現するピリオンまたは細胞、例えば触媒性抗体のぺ −１・状混合物を、好ましくは表面を横切る非常に細い線として、この表面に適 用する（表面上の第１の地点）。この線を可視化するために、少量の染料、例え ばブロモフェノールブルーをこのペーストに加えることができる。適当な時間の 後に（この時間は、代表的には、８時間−３日間であるが、別段には、特定の基 質に依存し、すなわち触媒される反応およびその条件に依存し、そして当業者に よる不当な実験を用いなくても決定することかできる）、この膜の表面を好まし くは、鋭い器具、例えばレーザー刃により、第１の地点（または線）から適当な ・　距離をおいた、例えば第１の地点から　０．０５−０．１５ｍｍ、代表的に は０゜１０ｍｍ離れている第２の地点でスクラップする。微小距離を目で見る助 けとして、このスクラッピングは、低倍率の顕微鏡を用いて行うことができる。

触媒性部分を存するウィルスまたは細胞、例えは触媒性抗体、あるいはさらに一 般的には、触媒性部分は、触媒加速移動により移動されて、このスクラッピング 部分に存在し、−力無触媒性抗体または無触媒性部分を有するウィルスまたは細 胞はこのようには拡散されない。この方法は反復することができ、これにより触 媒性部分を発現するウィルス、ファージまたは細胞、あるいはさらに一般的には 、触媒性部分の集団または濃度を、後続の触媒としての使用、または次のファー ジ世代の産生における使用（例えは、Ｅ、ｃｏｌｉなとの宿主の感染による）に 関わりスケールアップする前に、豊かにすることができる。この方法はまた、電 気泳動の使用により強化させることができる。すなわち、触媒性部分の、あるい は触媒性部分を有するウィルスまたは細胞の触媒性部分の移動もしくは拡散は、 表面を横切る電位の傾きを印加することによって増強させることができる。

Ｂ５表面 表面は、多くの種々の材料、例えばアガロース、澱粉、ポリアクリルアミド、ナ イロン、活性ナイロン、イモピロン（Ｉｎｙｎｏｂｉｌｏｎ　）　ＡＶ　（Ｍｉ ｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃｏｒｐ、　）、ガラスまたはニトロセルロースからなること かできる。この態様の重要な特徴は、この表面か選択された基質を支持する（共 有結合または非共存結合による）ことかできるへきであること、ウィルスまたは ファージまたは細胞、あるいは触媒性部分かこの表面に対して幾分弱い結合性を 存していなければならないこと、およびまた適当な時間の間、例えば８時間から ３日間の間（できれば人工的加湿環境中で）、浸蝕されることなく水分を保存す ることができなければならないことにある。この表面上の基質濃度は、各基質分 子力吠きい間隔（＞　Ｉ　０００オングストローム）で分離されているように、 あまり小さいことはできない。この表面は好ましくは、基質の一面に広かる単層 により被覆されており、ここに各基質分子か好ましくは、５００オングストロー ムより小さくない間隔、さらに好ましくは、１００オングストロームより小さく ない間隔で、最も好ましくは、５０オングストロームより小さくない間隔て分離 されている。この−面に広がる単層よりも大きい基質濃度も許容され、いくつか の場合に、単層が好ましい。当業者は、不当な実験を用いなくても重量測定、紫 外線吸収またはその他の定量法に基づいて、この表面に適用すべき基質濃度を決 定することができる。触媒加速移動に加えて、若干の他の特徴がファージの分離 、例えばアフィニティ　りロマトグラフィ、を補助するために望まれる場合には 、この表面は、そのキャパシティを提供するものであるへきである。例えば、フ ァージ移動を、基質表面を横切る電気泳動により加速しようとする場合には、こ の表面は、そこに適用される電位を保有することかできなければならない。

Ｃ１触媒を発現するウィルス、細胞または部分の適用およびインキュベーション ウィルスまたはファージまたは細胞あるいは触媒性部分は、含水ペーストまたは 非常に濃厚な溶液として、好ましくは注射側を使用して、基質表面に適用する。

ウィルス、ファージ、細胞あるいは触媒性部分が適用された場所を見ることがで きるために、適用前に、少量の染料、例えばブロモフェノール　ブルー、を試料 中に添加することができる。これらのファージ、細胞あるいは触媒性部分は好ま しくは次いで、適当な環境中で、例えば５０％より過剰の湿度または「湿った」 環境中で、適当な温度で、例えば２０−４０°Ｃ１代表的には２５°Ｃまたは３ ７°Ｃで、条件に応した時間（この時間は代表的には、８時間ないし３日間であ る）、表面上でインキュベ−１・する。

Ｄ、触媒活性を発現するウィルス、細胞あるいは部分の選別インキュヘーノヨン に引き続いて、この表面を好ましくは、低倍率のＩｆｆｆｆｆｉ鏡の下に置くか 、または視覚を別段の方法で補助する。レーザー刃またはその他の鋭い器具を使 用して、実質的な線である場合には、元の地点からこの線に沿って、この表面の 一面またはもう一つの面あるいは両面で、スクラッピングを行い、そして元の地 点か実質的に線として適用されていない場合には、元の地点がら０゜０５−０． １５ｍｍ、代表的には０．ｌ０ｍｍ、半径を有する円に実質的に沿って、または 円周に沿って、スクラッピングを行う。無触媒に比較して触媒はさらに移動性で あるから、このスクラッピング中に触媒か濃縮されて存在する。この方法は、さ らに反復して行うことによって、触媒性ファージまたは細胞集団の濃度をさらに 増加することができる（すなわら、触媒として最も活性な集団を生成させること かできる）。同様に、この方法は一般に、試料中の触媒性部分の濃度の増加に使 用することができる。

成る場合には、基質に結合していないウィルス、ファージ、細胞または部分、例 えば基質ではなく、ハブテンに結合しているウィルス、ファージ、細胞または部 分の除去か必要であることもある。これはこのようなウィルス、ファージ、細胞 または部分が基質表面上に容易に拡散するからである。これは、画線培養の直後 に、迅速にかつまた軽く１表面を洗浄するか、または表面をハブテンによりブロ ッティングすることによって、達成することができる。この場合には、ハブテン に結合するが、基質に結合しないウィルス、ファージ、細胞または部分が、基質 に結合するもの（触媒性または無触媒性のどぢらか）よりも先に、初めに拡散す る。従って、これらの基質非結合性ハブテン結合性で基質非結合性のウィルス、 ファージ、細胞または部分を直ちに単離することかでき、基質表面から分離する ことかできる。無触媒拡散は重大な問題ではない。

同様に、成る場合には、膜表面を横切る電位を印加して、拡散を増強させ、すな わち電気泳動により拡散を増強させることか望ましい、二ともある。電気泳動増 強移動に係わる代表的条件は、メジウム（表面に非結合性のもの、例えば基質か 表面に引き付けられたときの表面上の水分）、拡散されるものくファージ、細胞 、触媒性部分）なとの因子を考慮して、材料上の電荷とメジウムの電導性の最低 化との間の関係か最適にされるようにすることによって（これにより最大分離が 促進される）、不当な実験を行うことなく、当業者により実験的に決定すること ができる。表面に適用された元の地点からのスクラッピング点く触媒採取点）の 距離は、触媒による移動か電気泳動により増強される場合に合わせることかでき る。

Ｉｌｌ　表面結合による触媒選別 この態様は、その中の若干か相違する抗体または部分を示す、極めて大多数のウ ィルス、細胞または部分の中から触媒活性に係わる選別（例えば、触媒対無触媒 ）を行う方法である。この方法は、触媒活性の検出に、例えば触媒性部分の発現 の検出に、または試料中の触媒性部分の濃度の増加に、使用することができる。

この選別は、基質に結合する抗体なとの無触媒性部分か堅固に結合し、膜または その他の二次元表面に、インキュベーション時間には無関係に、同一の親和性を もって不動化されるようになることを観察することに基づいている。他方、触媒 性抗体またはその触媒性部分などの触媒性部分は先に基質に結合するか、触媒が 一旦、生成されると、これらは表面にもはや結合しない。すなわち、無触媒が表 面と平衡に達するのに充分な時間であって、表面上の基質と接触して、これを消 費する時間よりも短い時間の後に、無触媒は表面に結合したままであり、他方触 媒は、そこから洗出（採取）することができる。

この触媒選別態様は好ましくは、ハブテン結合部分、例えば抗体、を、／’％ブ テンに対して弱い結合性を有するか、またはハブテンに対して無結合性である部 分、例えは抗体、を選別する初期選別を包含する。この選別は好ましくは、アフ イニティ　りロマトグラフィ（２，３，４）またはフィルター−分離法（３１） を包含する前記方法により行うことかてきる。同様に、この種の別の態様におい ては、ハブテン結合部分に係わる初期選別が行われた場合に、フィルター−分離 法を使用することもできる。このウィルス、ファージ、細胞または部分のノＸブ テン結合による選別に引き続いて、これらのウィルス、ファージ、細胞または部 分を次いて、基質触媒性に係わり、すなわち反応−ベースまたは触媒性選別に係 わり、分別を行う。

この態様における触媒選別は好ましくは、膜、例えばイモピロンＡＶ　（Ｍｉｌ ｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、　、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）上に基質を共有結合 させて不動化するなどにより不動化させることを包含する。膜表面に、ウィルス 、ファージ、細胞または部分の溶液を添加する。別法として、感染させた宿主、 例えばバクテリアコロニーなどの試料に基質−膜を押し付けて、イ」随ウィルス またはファージ抗体を遊離させることにより、ウィルス、ファージ、細胞または 部分を直接に転移させることもてきる。

実質的に直後に、この膜を好ましくは、適当な緩衝液により洗出し、基質に対す る親和性か低いか、または親和性かないウィルス、ファージ、細胞または部分、 例えは抗体を迅速に除去する。この洗出工程は、表面を洗浄するか、または緩衝 洗浄液（この液は、選択されたｐＨ１例えば５．　０−９．　０、例えば７．０ に緩衝されでおり、］０００ｍより多いＮａＣ１を含有する）を流通させること によって行うことかてきる。その後で、この膜を好ましくは、緩衝液により再度 洗浄する。堅く結合する無触媒性のファージ、ウィルス、細胞または部分、例え ば抗体は、膜から溶出されないが、基質を充分に触媒し、非結合性になった、触 媒性であるファージ、ウィルス、細胞または部分、例えば触媒性抗体またはその 触媒性部分を存するウィルス、ファージまたは細胞（あるいは感染コロニーから 遊離されたこのような抗体またはその部分）は、溶出される。この洗液は、濃縮 することかでき、触媒として使用するか、またはＥ、ｃｏｌｉなどの宿主に再感 染させることかできる。触媒性抗体またはその触媒性部分を有するファージ、ウ ィルスまたは細胞の集団をさらに濃縮するには、上記方法を反復する。同様に、 この方法は、試料中の触媒性部分の濃度の増加に使用することもできる。

この方法において、ウィル人ファージ、細胞（またはそれからの抗体）または部 分は、極めて制限された拡散により膜の局所的領域に残留し、触媒性ファージ、 ウィルスあるいは細胞（またはそれからの抗体）または触媒性部分が、それらの 局所的基質供給物を枯渇させ、あまり遠くに離れずに、触媒作用を受けながった 基質に結合し一つづけなければならない。さらにまた、拡散が触媒性ファージ、 ウィルスあるいは細胞（またはそれからの抗体）で生じた場合には、結合性の無 触媒性ファージ、ウィルスあるいは細胞（またはそれからの抗体）と競合するが 、または無触媒性部分と競合して、基質を触媒し、無触媒か基質供給物を消費し 、膜からまた容易に洗出される。触媒性部分、例えば触媒性ファージ、ウィルス あるいは細胞部分、例えは抗体の移動を防止するためには、膜が過剰の湿分、例 えば水分、をできるだけ含有していないように保持し、例えば加湿器内で湿った 状態にのみ維持することか好ましい。また、このインキュベーション時間は、拡 散か防止されるように最短にすることか最良であることもある。触媒を選択的に 分離する、２回目の洗浄は適当な時点て、例えば０．５−１６時間、代表的には １時間、３時間、６時間および１２時間の間隔て行うことができる。

Ｂ、不動化基質 基質は好ましくは、アフィニティ　りロマトグラフィにおけるハブテンと同様の 方法で変性させ、この基質が膜とカプリングできるリンカ−を有するようにする 。この基質リンカ−は、本発明のメカニズム−ベース　インヒビジョン選別態様 における粒子に、インヒビターを結合させるために、およびまたその逆の結合に 使用されるものと同種である。その化学の詳細は、選択される特定の基質に依存 しつるか、例えば、ハブテン結合性に係わる初期選別か行われる場合には、この ハブテン調製に使用される化学にほとんと基づいていることができ、同一ではな い場合でも、好ましくは非常に類似している。

Ｃ膜 基質は、リンカ−を介して膜、例えば触媒加速移動による選別に関して上記した 表面物質、例えばイモピリオンＡＶｎ９、にカプリングさせることができる。こ のカプリングは、公知方法によって、例えば膜供給業者（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　 ）の推薦なとに従うことがてき（１９９０Ｍ１１１ｉｐｏｒｅカタログ、１７７ −１７８頁参照、この記載を引用してここに組み入れる）、触媒加速移動による 選別でも、このリンカ−法を使用することかできる。いづれか特定の理論に拘束 されることは必ずしも望むことではないが、この態様の成功は、当業者か代表的 に考慮する、立体的制限およびその他の因子により、股上の基質濃度（ミリモル ／ｃｍ２）に関連することがある。この股上の基質濃度は、触媒加速移動による 選別態様の場合と同様であることかできる。すなわち、この股上の基質濃度は、 不当な実験を行うことなく、いづれか特定の触媒性部分−基質系に係わる本明細 書の記載から最適にすることかてきる。

他の固相表面を膜の代わりに使用できることは、当業者に理解されることである 。例えば、非磁性の、または磁気応答性の粒子を触媒加速移動による選別態様の 場合と同様に使用することかできる。

Ｄ、ファージ、ウィルス、細胞または部分の適用ファージ、ウィルス、細胞また は部分は、抗体−抗原の確立されている結合運勧学に従って、膜に結合する（１ ０）。これらの発見に従い、ファージ−、ウィルス−１細胞−または部分−含有 溶液の基質−膜への結合は、２分（急速結合）ないし１０分（遅い結合）であり うる。これらの時間の後に、膜を好ましくは実質的に直ちに、そして好ましくは 迅速に（＋−１０秒、好ましくはＩ−５秒）、表面上の洗浄または流れを通すこ とにより、初期洗浄に付す。この洗浄は、基質に対して弱く結合しているファー ジ、ウィルス、細胞または部分のような部分（例えば、格別に高い見掛けの結合 定数、Ｋｍ、抗体）または膜表面に非特異的に結合しているものを分離するため に行われる。

Ｅ、インキュベーション 僅かに湿った膜を次いて、加湿容器内で、２０−４０°Ｃ１代表的には２５°Ｃ または３７°Ｃにおいて、特定の部分、例えば抗体、に応じて、適当な時間、例 えば０．５−１６時間、代表的には１時間、３時間、６時間またはＩ２時間、イ ンキュへ−１・することかできる。次いて第二の洗浄を、選択された緩衝液（通 常、反応緩衝液と同一の緩衝液）中で、適当な時間、代表的には１−５秒間、行 う。第二の洗浄をもう一度行って、触媒を分離することかできるが、過剰の労力 を節約するために、一度の洗浄か好ましい。この第二の洗浄（一度または温度以 上）は、膜の表面上で、または膜に緩衝液を流動させることにより行うこともで きる。

Ｆ、第二の洗浄液の使用 触媒性ファージ、ウィルス、細胞または部分を含有する第二の洗浄液（一度また は温度以上）は濃縮することができ、触媒として使用するために、またはこのフ ァージによるＥ、ｃｏｌｉなとの適当な宿主に感染させるために、あるいは細胞 による触媒の誘発に、例えば組換えウィルス感染細胞に溶解サイクルを受けさせ るために、調製することかできる。この本発明の膜技術態様は、第二の洗浄（一 度または温度以上）とともに反復することかでき、これにより第二の洗浄液（一 度または温度以上の）に含まれていることかある無触媒性部分の量または無触媒 性ファージ、ウィルスまたは細胞（あるいはそれからの抗体）の量を減少させ、 かつまた触媒性部分の濃度を増加させることかできる。触媒活性に富んだファー ジクローンを含有する宿主、例えばＥ、　ｃｏｌ　ｉのコロニーは、増殖させて 、充分な触媒、例えば触媒性抗体またはその触媒性フラグメン１〜を分泌させる ことかでき、これらの触媒は精製し、触媒活性に係わり分別するか、または直接 に使用することができる。生成した触媒、例えば触媒性抗体、の精製を次いで、 標準方法により行うことができる。

結合および触媒作用に対する温度の作用は、特定の蛋白質触媒毎に相違している 。すなわち、結合はするが、触媒作用は非常に弱い低温またはむしろ冷温のよう な第一の温度から、実質的な触媒作用か発揮される、一般にさらに高い温度にま で温度か上昇するにしたかって、当該触媒およびその基質の見掛は上の解離定数 は、不連続的様相で変化する。この変化は、触媒の見掛は上の基質結合（無触媒 は結合しない）における温度変化に伴う変化である。触媒性部分あるいは触媒性 抗体またはその触媒性部分なとの触媒性部分を発現することができるファージ、 ウィルスまたは細胞を大きい一団の無触媒性部分、ファージ、ウィルスまたは細 胞の集団から、分離、選別または濃縮することに係わる本発明の態様は、この変 化に基づいている。

結合は、下記の物理的観測および現象に属している・この式において、Ｅは触媒 、例えば酵素または抗体であり、Ｓは基質であり、ＥＳは触媒−基質複合体であ り（この複合体か生成物Ｐに進行する）、Ｇはギブス（Ｇｉｂｂｓ　）の遊離エ ネルギーであり、Ｒは普遍気体定数であり、モしてＴは温度（ケルビン単位）で ある。

すなわち、低温における酵素または無触媒性抗体などの結合性分子に係わる’ｌ ’−１対１ｏｇＫｓをプロットすると、（２，３０３Ｒ）／ΔＧの傾斜を存する 直線が与えられる。

酵素または触媒性抗体のような触媒の場合には、この見掛は上の結合定数はＫｓ ではなく、Ｋｍであり、この簡単な反応は次式で示されるに、、、／Ｋ。＋（Ｋ ｓ）に対する温度の効果は前記で説明した。温度効果Ｉく。２は、エイリング（ Ｅｙｒｉｎｇ）の絶対反応速度理論を使用して決定される。この反応に対する温 度の効果（Ｋ　４．２　’）は ｌｏｇ　ｘ＋２−　（−（ａＨ”　＋　ＲＴ）　／２．３０３］　Ｘ　Ｔ−”（ 式中、△Ｈ＊は活性化のエンタルピーである）であり、従って、ＩＯｇＫ−ｚ　 （ｌｏｇＶｍａｘ）対１／Ｔをプロットすると、−（△Ｈ＊＋ＲＴ／２．３０３ ）の傾斜か得られる。

従って、Ｋｍに対する温度効果は、Ｉ〈４２と■（−１との相対サイズに依存す る。極端な場合に、Ｋｍ＝＝に４．２／に−＋およびＫｍ＝Ｋｓである。しかし ながら、大部分の場合には、Ｋｍは速度定数の若干の混合に等しいＣＫｍ＝　（ Ｋ−ｚ十に−＋）／Ｉく、＝　＋　）　。

上記概念と観測とを組み合わせると、１つのみの温度か含まれることから、抗体 なとの結合性部分はＩ／ＴとＫｓとの間に直線関係を有する。一方、触媒性部分 （例えは酵素、触媒性抗体またはその触媒性部分）では、この見掛は上の結合定 数（Ｋｍ）は、それぞれかそれ自体の温度係数を有する、２つ（または３つ以上 ）の温度依存現象、結合性および触媒作用に依存する。触媒作用は、前記等式に 温度依存性因子である、エン１−ロビーの要素を持ち込む。従って、触媒性部分 の場合には、１．／ＴどＫｓとの関係は直線状ではなく、触媒作用および結合温 度係数における差異に依ｒｒシて曲線になる。本発明のこの態様は、触媒性抗体 またはその触媒性部分なとの触媒性部分を発現することかできるファージ、ウィ ルスまたは細胞なとの触媒性部分の単離、選別、分別または濃度増加に係わる見 掛上の結合性に対する温度の効果を活用するものである。

Ｃ１温度に基づく選別に係わる一般方法一般に、この態様において、見掛上の基 質結合性に対する温度の効果に基づく、ファージ、細胞または部分の分離方法か 提供される。触媒は温度変化に対する応答が、無触媒性のものとは異なっている 。低温において、類似のＫｓを有する、ウィルス、ファージ、または細胞抗体な との部分（触媒作用は実質的に存在しない）は、類似するそれらの温度依存性、 Ｋｓ値を存する。この数値は、はとんど大部分の部分に通用し、例えばウィルス 、ファージ、または細胞は類似するＫｓ値を有する。実際上で・ １、ハブテンに結合するウィルスなとの部分は、先ず一般的に低温（例えば、− ３０−０°Ｃ１代表的には一２０°Ｃ）で不動化基質のカラムで分離される。ゆ るく結合する（大きいＫｓ値を有する）ファージが最初に溶出され、堅く結合す る（小さいＫｓ値を有する）ファージは後で溶出される。

２、フラクションを採取する。

３、第二の一般にさらに高い温度（例えば、＋２０−４５°Ｃ１代表的には＋２ ５°Ｃまたは＋３７°Ｃ）で、濃縮フラクションをそれぞれ、同一カラムで再溶 出し、各溶出液からフラクションを再度、採取する。

４、最高濃度のウィルス、ファージ、細胞または部分を含有する溶出フラクショ ン（１つまたは２つ以上）を、吸収により直接に、あるいはウェスターン法によ り間接的に、あるいはＥ、ｃｏｌｉなとの宿主の感染後のファージの場合には、 一定量の各フラクションを用いて、検出操作する。主フラクション（１つまたは ２つ以上）以外のフラクション中に溶出されるウィルス、ファージ、細胞または 部分は、主フラクション中に溶出されるウィルス、ファージ、細胞または部分（ 無触媒性）とは相違する温度係数を有する。これらは相違する親和性をもって、 −団のウィルス、ファージ、細胞または部分（無触媒性）から溶出されるので、 主フラクション（１つまたは２つ以上）以外の溶出フラクションは次いで、さら に濃厚にするか、または濃縮することかできる。これは、主フラクション（１つ または２っ以上）以外で溶出されるウィルス、ファージ、細胞または部分は、結 合に係わる温度係数に加えて、触媒作用に係わる温度係数をまた存することによ る。

一般に、触媒性ウィルス、ファージ、細胞または部分の見掛上の結合定数に対す る温度の効果は、−団の無触媒性ウィルス、ファージ、細胞または部分とは実質 的に相違している。

５、濃縮された、希少ウィルスまたはファージを次いで使用して、５．ｃｏｌｉ などの宿主に感染させ、そこから部分を単離する、例えば、得られた抗体を触媒 として使用するか、または触媒活性に係わりさらに選別する。同様に、濃縮され た細胞は、単離し、触媒性部分の発現に使用するか、またはウィルスまたはファ ージ世代を産生させるための溶解サイクルを受けるようにする。同様に、この方 法によってｌｕｇされた濃厚部分は、触媒として使用される。

本発明に関するこの態様に係わる上記説明は、対象の部分に応じて変えることが でき、標準方法（重力または強制分離ンによるカラムマトリックスに、電気泳動 ゲル（電場分離）に、遠心分離管（ｇ力分離）、例えば粘性溶液中に懸濁された 不動化基質を含有する遠心分離管に、あるいはその他の懸濁または不動化基質を 通すウィルス、ファージ、細胞または部分の基本的分離手段に、不動化された基 質を包含することができる。低温分離は好ましくは、冷凍、ドライアイス、また は液状窒素あるいは液状ヘリウムにより温度を低温に維持して、水性媒質中で行 う。この水性媒質は、適当濃度のＮａＣｌまたは他の塩を、あるいはグリセロー ルを一緒に包含させることによって、凍結を防止する。

そしてまた、この態様は、触媒性の触媒性部分、ウィルス、ファージまたは細胞 の試料をさらに濃縮させるために、反復して行うこともできる。

Ｄ、無反応性基質類縁体との競合による選別の概説この態様では、対象触媒反応 における基質の類縁体を使用する。この類縁体において、目標結合は、触媒種に よる変更に対して抵抗性であるが、この類縁体はまた、基質分子の部分（この部 分は触媒性であるか、または無触媒性である）に対する結合親和性と同様の結合 親和性を示すのに充分な構造類似性を有する。

Ｒ２Ｃ０ＯＲ’エステル基質のエステル分解反応に関する、この例には、このエ ステル構造に充分に似ている構造Ｒ’　Ｃ０ＣＨ２Ｒ’かあり、構造的に充分に 似ているが、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２目標結合は、このニスデル分解性触媒による変性 に対して抵抗性である。多くのこのような無反応性基質類縁体かいづれか特定の 反応に関して存在しており、使用のための適当な類縁体の選択は不当な実験を行 うことなく、潜在的無反応性基質類縁体と基質そｔ′１泊体との間の構造上の類 似点、当該類縁体における目標結合の変更に対する抵抗性、包含される化学反応 、当該類縁体に対する結合親和性、およびまた当業者の技術範囲内にあるその他 の因子を考慮して、当業者により決定できることである。

従って、この態様により、触媒性ファージ、ウィルスまたは細胞あるいは触媒性 部分の試料を、無反応性基質類縁体、好ましくはカラムに充填されている固相支 持体にカプリングされている類縁体、と接触させることによって、これらの触媒 性ファージ、ウィルスまたは細胞あるいは触媒性部分を分離または濃縮させる態 様か提供される。この接触は好ましくは、このような類縁体の存在（移動性）の 下に行う。ここから、接触フラクションを採取する。それぞれ、フラクションを 不動化無反応性基質と、基質の存在の下に、再度接触させる。触媒性のファージ 、ウィルスまたは細胞あるいは触媒性部分は、それらの無触媒性相対物とは異な る速度て基質から解離され、この類縁体がカラムに充填されている固相支持体に カプリングされている場合には、これらの触媒は、主フラクション以外に溶出さ れる、すなわち触媒は、主フラクションの前または後に溶出される。

特に、反応方程式： （式中、”Ｓ“は基質であり、そして“Ｐ“は生成物である）において、ｒ＜ｚ 　＞Ｋ−１のような充分の触媒活性を有する試料中のウィルス、ファージ、細胞 あるいは部分（Ａｂ）は、それらの無触媒性相対物とは異なる速度でＡｂＳｆｆ １合体から解離する触媒として溶出する主ピークのファージ、ウィルス、細胞あ るいは部分とは相違する保有時間を存する第二の溶離操作で溶出される。

従って、この主ピーク以外のウィルス、ファージ、細胞あるいは部分の採取は、 触媒活性を示すものを濃縮（濃度増加）または選別ことになる。特定の触媒メカ ニズムに応じて、この第二の溶出において、触媒は主ピークよりも遅くまたは早 く溶離される（１５）。これは図１および２をまた参照できる。しかしながら、 この説明から、当業者は不当な実験を行うことなく、例えば主ピーク以外の溶出 液か主ピークの前に溶出されるか、後に溶出されるかを決定することによって、 そしてまた主ピーク以外（前または後）に溶出されるものにより達成されるター ンオーバー数を考慮することによって、およびまた当業者の技術範囲にあるその 他の因子を考慮することによって、触媒か主フラクションよりも後で溶出される か、あるいは前に溶出されるかを決定することかできる。基質または無反応性基 質（“Ｓ″）による触媒（Ｎｃ）の会合および解離は次式のとおりであるのみで あるから、 この基質（または無触媒性基質類縁体）による無触媒会合／解離は、Ｋｓて表さ れる。

ｉ、−に、７ｋ。

上記式で表される触媒メカニズムては（ミカエリスの複合体（ＡｂＳ）と生成生 成物“Ｐ“との間に生じる、無触媒性の中間体を伴う）、抗体および基質の見掛 上の会合／解離は、Ｋｍて表すことかできる・Ｋ、−（ｋユ＋Ｊｃ−、）　／に 、、。

これらの状況の下に、Ｋｓ値は常に、Ｋｍ値よりも小さくなければならない。

すなわち、無触媒性ウィルス、ファージ、細胞あるいは部分結合基質は、さらに 堅く結合するので、第二の溶出工程では触媒性ウィルス、ファージ、細胞あるい は部分よりも遅く溶出される（図１参照）。

他方、例えば下記： のメカニズムで示されるように（ここで、“Ｓ”は基質であり、“ＡｂＳｚ”は 中間体であり、そしてＰ”は生成物である）、反応中間体（例えば、共有結合型 中間体）かミカエリスの複合体と生成物生成との間の反応座標に存在するメカニ ズムに、触媒性ウィルス、ファージ、細胞あるいは部分（Ａｂ）が従う場合には 、基質の見掛上の会合／解離の説明は、この方程式で相違し、ＫｍはＫｓよりも 小さい数値を存する：すなわち・ Ｋｍ＝　［Ｋｓ］　［Ｋｓ　／　（Ｋ、＋に３　）　］である。

従って、このメカニズムまたは中間体がＡｂＳ複合体の後に生成されるメカニズ ムの場合には、触媒性ウィル人ファージ、細胞あるいは部分がさらに堅固に結合 し、第二の溶出において、無触媒性のものよりも遅く溶出される（図１参照）。

しかしながら、ＡｂＳ→Ａｂ十Ｐの反応が、ＫｓをＫｍよりも大きくするように 、非常に急速である場合、またはＮｃＳ複合体のＫｓがＫｍよりも大きい場合に は、図２に示されているように、触媒か、無触媒よりも早く溶出される。従って 、相違する結合性を示す、例えば後でまたは先に溶出される、部分、細胞、ウィ ルスまたはファージの採取は、単に触媒を単離するというばかりでなく、また試 料中の最上の触媒を単離することになる。

Ｅ、無反応性類縁体との競合による選別の要旨無反応性類縁体は好ましくは、固 相支持体とカプリングさせて、アフィニティマトリックスを調製することができ 、このマトリックスを好ましくはクロマトグラフィカラムに充填する。触媒とし て作用する部分を潜在的に含有するウィルスファージ、細胞または部分（例えば 抗体を誘発させる免疫応答の誘発およびその発現のために使用される遷移状態類 縁体に結合する、触媒性抗体またはその触媒性部分を発現するファージ、ウィル スまたは細胞）の懸濁液をカラムに適用する。

この適用は、この基質類縁体に対する親和性をもって、これらのウィルス、ファ ージ、細胞または部分か不動化リガ：ノドに結合し、これらがリガンドに対する 親和性を持たないものとは相対的に、カラムに保持されるような条件、例えば温 度、緩衝剤組成、流動速度などの条件の下に行なう。順次時間間隔で、このカラ ムから溶出するウィルス、ファージ、細胞または部分を採取し、適当なフラクシ ョン中に集め、次いて濃縮させる。可溶性の無反応性基質類縁体を、この溶出に 使用される緩衝液中でインキュベ−１・すると、ウィルス、ファージ、細胞また は部分を結合させるための固相リガンドとの競合によって、カラム様相で、試料 中の結槍物が先に溶出される。同様に、基質を、溶出用緩衝液中でインキュベ− １・すると、類似のＫｍを有する基質に結合する無触媒の溶出に対して、無反応 性基質類縁体と結合する場合と同一の効果か得られる。従って、無反応性基質類 縁体カラムから無反応性基質類縁体とともに溶出されるフラクションを次いで、 このカラムに再度通す。しかしながら、このカラムには、溶出の達成に使用され た類縁体の濃度に等しい濃度またはこの類縁体の濃度よりも小さい濃度の基質を 存在させると好ましい。

しかしながら、触媒性部分、ウィルス、ファージ、または細胞の場合には、この 基質はカラムからのそれらの溶出を促進させる効果を多少有する。これは、基質 が、当該触媒を不動化リガントに再結合させる、結合部位から放出される触媒に より生成物（１種または２種以上）に変換されることによるものである。この場 合には、触媒は、無反応性基質類縁体を用いて溶出させるカラムからに比較して 、基質を用いて溶出させる同一カラムから、後でまたは先に、溶出される。これ は−図１および２に示されている２次元分離プロフィールの基礎を形成してい、 る。図１および２において、無反応性基質類縁体カラムからの無反応性基質類縁 体による１次溶出が縦軸に示されており、そして無反応性基質類縁体カラムがら の基質による２次溶出か横軸に示されている。星印のピークは、主フラクション 以外の溶出フラクション（１つまたは２つ以上）を表す。図１および２に示され ているように、触媒は主ピークの後の後端部分として（図１）、または主ピーク のＩＦｌの後端部分として（図２）、溶出できる、すなわち触媒は主ピーク（１ つまたは２つ以上）よりも存意に遅れて、または先に溶出され、これらを次いで 集め、触媒的に濃厚な集団を採取または濃縮できるように、これらの星印ビ・− りは標準化させる。図１はＫｍ＞Ｋｓの場合（この場合には、触媒は無触媒より も長く結合している）の様相を示しており、そして図２はＫｓ＞Ｋｍの場合（こ の場合には、触媒は無触媒に比較して早く溶出される）の様相を示している。

前述のエステル（ＴＩ）： の加水分解の関して、このエステルは一般に、次式（ＸＸＸＩ）で表さすことが ＸＸＸＩ この式において、Ｒ３は であり、モしてＲ４は である。この場合に、下記の化合物は、無反応性基質類縁体として作用する：Ｘ Ｉ ＸＸＸＩ ＸＸＩ　工Ｉ ＸＩＶ ｘｘ■ ＸＶＩ Ｘ’ＶＩＩ ＸＶＩＩＩ ＸＸＩＸ ｘｘｘ 上記したように、エステルに係わる無反応性基質類縁体は、基質エステルと同一 または類似の置換基（例えばＲ３およびＲ４）を有する、ケトン、カーボネート 、カルバメート、エーテル（例えば、メチレンエーテル）、可逆性エステル、チ オエステル、イミノエステル、アミドおよび可逆性アミドである。この記載から 、当業者が、不当な実験を行うことなく、他の基質に対応する無反応性類縁体を 誘導できることは勿論のことである。さらにまた、ペプチド加水分解反応、酸化 ／還元反応、付加反応、脱離反応、縮合反応、異性体化反応、およびまた転移反 応を包含する、エスデラーゼ反応以外の反応に係わる無反応性類縁体を誘導する こともできる。特に、本明細書に示されているように、無反応性類縁体は基質と 構造上で類似している、例えば同一または類似の置換基を有するか、基質の反応 部位の結合は、触媒による変更（反応）に対して抵抗するように変えられている 。しかしながら、その目標結合は類似している。例えば、目標結合が、典型的エ ステル、可逆性エステル、チオエステル、またはイミノエステルなどのエステル 、ケトン、カーボネート、カルバメート、典型的エーテルまたはメチレンエステ ルなどのエーテル、および典型的アミド、可逆性アミドなどのアミドおよびアミ ノから選択される結合である場合には、無反応性類縁体の反応部位におけるこの 結合は、上記群から選択されるか、別種の結合であると好ましい。

この態様はまた、別の態様をさらに包含する。例えば、最適選別（最良の触媒の 濃縮または単離）を達成するために、固相に対するリガンドのカプリング濃度、 固相支持体の種類、緩衝剤組成、流動速度、および溶出剤の濃度を、不当な実験 を行うことなく、上記記載から、特に上記方程式を考慮して、変えることができ る。さらにまた、一定の上記方程式、およびまた触媒が、その触媒挙動により相 違して結合し、従って相違して溶出されるように、結合に係わり競合が存在する という、この態様の説明から、この態様およびその説明が、不当な実験を行うこ となく、当業者か固相リガンド（１種または２８Ｉ！以上）用の化合物および溶 出剤組成を、上記無反応性類縁体および基質のみでなく、また遷移状態類縁体（ １種または２種以上）について、およびまた対象部分への結合に係わり存意の親 和性を有する無関係の化合物（１種または２種以上）についてさえも、選択する ことを可能にする。この競合による結合性の変更による選別方法は、触媒の単離 および濃縮を可能にするばかりでなくまた、本明細書の開示によって、最良の触 媒の選別を可能にすること、特にこの選別か触媒作用（Ｋｍ）に基づいており、 かつまた触媒作用に直接に関連していること、は注目されることである。

本発明のこの態様のもう一〇の別法では、無反応性類縁体を２次元支持体、例え ば上記したような膜に結合させ、そして試料を、重力（カラムで利用される）以 外の力により膜表面を横切って施用する。例えば、試料を、電場により無反応性 類縁体膜を横切って適用することができる。すなわち、この場合には、触媒と無 触媒との分離が電気泳動により誘発される。この場合には、触媒はまた、小割合 のフラクション中にも見出だされる。この電気泳動誘発分離の条件は、前述の代 表的因子を考慮して、不当な実験を行うことなく、試料が受ける分離に係わる変 化と媒質（その上の含湿溶液なとの膜表面上の非結合物質）の最低導電率との間 か最適にされ、この変更により最高分離か促進されるように、実験的に決定する ことかできる。

ウィルス、ファージ、細胞または部分の触媒性集団または試料（本明細書におい て、時には、「付属集団」または「第二集団」の用語で表されている）は、本発 明の方法の１つにより得ることがてき、当該凹代またはその次の世代（例えば、 宿主感染から、または溶解サイクルから）をまた、本発明のもう一つの方法によ り選別または濃縮することができることは勿論のことである。−例として、表面 結合による触媒性選別からの第二の洗浄液（−回または二回以上の液）（付属集 団または第二集ＩＥ７１１）は次いて、触媒加速移動による選別、温度の関数と しての結合のエントロピー要素における変化による選別、競合による結合性の変 更による選別、またはメカニズムーヘース　インヒビター選別に付することがで きる。同様に、触媒加速移動による選別からのスクラッピング採取集団（付属集 団または第二集団）は次いてさらに、表面結合による選別、温度の関数としての 結合のエントロピー要素における変化による選別、競合による結合性の変更によ る選別、またはメカニズムーヘース　インヒビター選別に付することかできる。

同様に、温度の関数としての結合のエントロピー要素における変化による選別に おいて、見掛は−Ｅの結合に対する温度の効果が相違している試料（一種または 二種以上）（例えば、主フラクション以外で、溶出または結合するもの）はまた 次いで、表面結合による選別、温度の関数としての結合のエントロピー要素にお ける変化による選別、競合による結合性の変更による選別、またはメカニズム− ベース　インヒビター選別に何することかできる。そしてまた、基質の存在の下 に、不動化無反応性基質類縁体と接触させた時に、相違する結合性を示す試料（ 一種または二種以上）（例えば、主フラクション以外で、溶出または結合するも の）はまた次いて、表面結合による選別、触媒加速移動による選別、温度の関数 としての結合のエントロピー要素における変化による選別、またはメカニズム− ベース　インヒビター選別に付することかできる。

本明細書て検討されている、インヒビター、基質および無反応性基質類縁体は、 当該技術における教示（例えば、３３参照）に従い、不当な実験を行うことなく 、当業者か合成することかできるものである。

下記に、非制限的例を例示の目的で示す。これらの例は、本発明を制限しようと するものではなく、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、多くの明ら かな変更か可能である。いづれの場合にも、これらには、エステル加水分解反応 以外の反応、例えばペプチド加水分解反応、酸化／還元反応、付加反応、脱離反 応、縮合反応、異性体化反応、および転移反応か包含される。

例 例】 組換えファージ　ライブラリィの構築 ｆｄおよびＭ１３ファージの表面上での発現に係わるＶＨおよびＶＬ抗体ドメイ ンのライブラリィの作成は、ＰＣＲ技術および相当してデザインされたコンセン サス　プライマーを使用して達成される（１．　２．　３．　４．　ＩＩ；また 引用してここに組み入れる、１９９２年１月２３日発行＋７）ＰＣＴ公開ＷＯ９ ２０１０４７を参照できる）。このＰＣＲ用の出発材料はハブテン（Ｉ）により 免疫感作されたマウスから得たひ臓ＲＮＡである。マウス抗体可変ドメインの増 幅用の一組のＰＣＲコンセンサス　プライマーを以下の示す。これはまた従来技 術で開示されており、このプライマー配列の部分整列を示すために（ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　Ｎｏ：ｌ）、ＶＨドメインのコーディングとともに（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ： ２）、５ＥＱＡか与えられている。

）’＠ｎｄ−５’ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣＴ’ｒＧ ＧＣＣＣＣ３’　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２ｙシ ５’＠ｎｄ−５’ＧＡＣＡＴｒＧＡＧＦＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ：ｌ’ 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：：１コ’ｅｎｄ−５’ＣＣＧＴＴｒＧＡＴＩＴＣＣＡＧ ＣＴＴＧＧＴＧＣＣ３’Ｖ　Ｉ−（ドメインおよびＶＬドメインの増幅に引き続 いて、第二のＰＣＲ反応を使用して、これらのドメインを短鎖ペプチドにより一 緒に連結させて、−末鎖Ｆｖを生成させる。リンキングペプチド、ＰＣＲプライ マーおよび方法は、従来技術で開示されている（２）。さらにまた、第三〇ＰＣ Ｒ反応を使用して、この一本ｊＪＪＦｖライブラリ・イの５′および３′末端で 、相当する制限酵素部位を挿入し、ｆｄ表面表示用のｆｄ、ＤＯＧｌ　（２）ま たはＭ１３表面表示用のｐＣｏｍｂ３（１１）などのファージ表示発現ベクター 中にクローニングさせる。

別法として、可変ドメインライブラリィはまた、免疫感作されていないマウスま たはその他の動物、例えばヒトから得ることもできる。この場合の出発材料は、 ひ臓から（マウスまたはその他の咄乳動物の場合）またはリンパ球（ヒトの場合 ）からのＲＮＡである。増幅およびクローニングは、ヒト　ライブラリィの場合 を除いて、上記のとおりに行う。ヒト　ライブラリィの場合には、マウスの可変 ドメインとヒトの可変ドメインとの間の相違を反映させるために、ＰＣＲコンセ ンザスプライマーの配列を修飾する。ヒトコンセンサスブライマーおよびヒト抗 体ファージ表示ライブラリィの構築は、従来技術で開示されている（１８）。

さらにまた、ファージ表面におけるＦａｂ　（ｓｃＦｖと対立するものとして） の発現（従って、このファージライブラリィはＦａｂライブラリィを包含する） は、上記のものとは相違する異なる一組の３　”　ＰＣＲプライマーを使用して 、２本の鎖の間のジスルフィド結合の生成に含まれるシスティン残基を含有する ＨＶｉ不変部およびＬｊＪ１不変部の一部を増幅させることによって達成される ：これは、従来技術で開示されているとおりにして行うことかできる（４）。Ｆ ａｂライブラリィのファージ表面表示用のベクターには、ｆｄファージ用のｐＨ ｅｎｌ（１９）ならびにＭ１３用のＩ）Ｃｏｍｂ３　（ｌ　ｌ）およびｐＴａｃ ＣＰ　（２０）か包含される。

これらの技術を使用して、基質ＴＩのエステル加水分解のためのハブテンＩによ り誘発される触媒性抗体またはその触媒性部分を発現する組換えファージを、ｆ ｄファージおよびＭ１３ファージから生成させる。本明細書において、この組換 えファージの初期集団を、ぞれぞれｃａｔｌｆｄおよびｃａｔ１Ｍ］３と記する 。

例２ メカニズムーヘース　インヒビター選別ｃａｔｌｆｄ含有溶液を、結合ハブテン （Ｒを介して結合）として式Ｉで表される化合物を含有するアフィニテイカラム ［セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　）　］上に通す。このハブテンに結合し たファージの第一の付属集団（ｃａｔｌｆｄｌ）を、このカラムに遊離ハブテン を引き続いて通し、次いでこの遊離ハブテン洗浄により溶出されたファージを透 析することによって、結合したハブテンを除去することにより、採取する。この 第一付属集団（ｃａｔｌｆｄｌ）を、式ＩＩて表される化合物（Ｒ’　＝ＮＯ２ ）の加水分解を触媒するその能力を、その速度加速ファクターを測定することに よって評価する（ｐＨ７，０；　５０ｍＭヘベス（Ｈｅｐｅｓ）、１５０ｒｎＭ ＮａＣＩ、３０°Ｃ，０，５−３時間）、この第一付属集団は低い触媒活性を示 す。

この第一付属集団（ｃａｔｌｆｄｌ）の第一の部分を、式＋１で表される化合物 の加水分解反応条件の下に、式ＩＩＩて表される化合物（Ｒ”結合基を有してい ない）と接触させる（１）Ｒ７，０１５０ｍＭへペス、ｌ　５０ｍＭＮａＣ１， ３０°Ｃ１０，５−３時間）。この第一の部分を次いてハブテン　アフイニテイ 力うム上に通し、この通過でカラムに結合しないファージを採取し、次いてＥ、 ｃｏｌｊの感染に使用する。このＥ、ｃｏｌｉ感染から生成するファージ（ｃａ ｔｌｆｄ２）を、式ＩＩて表される化合物（Ｒ’　＝ＮＯ□）の加水分解を触媒 するその能力に関して試験する（＆度加速）（ｐＨ７，０：５０ｍＭヘペス、Ｉ 　５０ｍＭ　ＮａＣ＋、３０°Ｃ，０，５−３時間）、このｃａｔｌｆｄ２は、 第一付属集団（ｃａｔｌｆｄｉ）に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー 数）を示す。

上記第一付属集団の第二の部分を、式ＩＩで表される化合物の加水分解反応条件 の下に、式ＩＶで表される化合物（Ｒ’結合基を有しておらず、Ｘ＝Ｂｒである ）と接触させる。この第二の部分を次いてハブテン　アフィニティカラム上に通 し、この通過てカラムに結合しないファージを採取し、次いてＥ、　ｃｏｌ　ｉ の感染に使用する。このＥ、　ｃｏｔ　ｉ感染から生成するファージ（ｃａｔｌ ｆｄ３）を、式ＩＴで表される化合物（Ｒ’　＝ＮＯ２）の加水分解を触媒する その能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７，Ｏ；５０ｍＭヘベス、１５０ ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）、このｃａｔｌｆｄ３は、第一付属集 団（ｃａｔｌｆｄｌ）に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す 。

例３ メカニズム−ベース　インヒビター選別例２の方法を使用して、上記第一イ１属 集団（ｃａｔｌｆｄｌ）の第三から弟子までの部分をそれぞれ、式ＩＩで表され る化合物の加水分解反応条件の下に、式Ｖ−ＸＩで表される化合物（Ｒ”結合基 を有しておらず、Ｘ＝Ｂｒである）と接触させる。これらの第三から弟子まての 部分をそれぞれ、次いでハブテン　アフィニティ力ラム（Ｒを介してハブテンＩ に結合）上に通し、この通過てカラムに結合しないファージを採取し、次いてＥ 、　ｃｏｌ　ｉの感染に使用する。このＥ、ｃｏｌｉ感染から生成するファージ （ｃａｔｌｆｄ４−ｃａｔｌｆｄｌＯ）を、式目で表される化合物（Ｒ１＝ＮＯ ２）の加水分解を触媒するその能力に関して試験する（速度ＩＪＯ連）（ｐＨ７ ，Ｏ；　５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣ１、３０″Ｃ１０５−３時間）、こ れらのｃａｔｌｆｄ４−ｃａｔｌｆｄｌＯはそれぞれ、第一付属集団（ｃａｔｌ ｆｄｌ）に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。

例４ メカニズムーヘース　インヒビター選別例２の方法と同様の方法を使用して、第 一付属集団（ｃａ　ｔ　ＩＭＩ　３１）を、ハブテンアフィニティクロマ！−グ ラフィによりｃａｔ１ＭＩ３がら単離する。速度加速を測定することによって、 このｃａｔ１ＭＩ３１は、式ＩＩて表される化合物の加水分解を触媒するその能 力に関して、低い触媒活性を示す。

このｃａ、ｔ１ＭＩ３１の第一の部分を、式ＩＩて表される化合物の加水分解反 応条件の下に、式１冊で表される化合物（Ｒ’結合基を有していない）と接触さ せる。この第一の部分を、次いてハブテン　アフィニティ力うム上に通し、この 通過てカラムに結合しないファージを採取し、次いてＥ、ｃｏｌｉの感染に使用 する。

このε、　ｃｏｌ　ｉ感染から得られるファーム　ｃａｔ１ＭＩ３２を、式ＩＩ で表される化合物（Ｒ’　＝ＮＯｈ　）の加水分解を触媒するその能力に関して 試験する（速度加速）（ｐＨ７，０；　５０ｍＭへべ人１５０ｍＭＮａ　Ｃ＋、 ３０″Ｃ，０，５−３時間）、このｃａｔ１ＭＩ３２は、ｃａｔ１Ｍ１３１に比 較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。

上記ｃａｔ１ＭＩ３１の第二の部分を、式ＩＩで表される化合物の加水分解反応 条件の下に、式ＴＶで表される化合物（Ｒ”結合基を有しておらず、Ｘ＝Ｂｒで ある）と接触させる。この第二の部分を次いでハブテン　アフィニティカラム上 に通し、この通過てカラムに結合しないファージを採取し、次いてＥ、　ｃｏｌ 　ｉの感染に使用する。このＥ、ｃｏｌｉ感染から得られたファージ（ｃａ　ｔ 　ＩＭＩ　３３）を、式ＩＩて表される化合物（Ｒ’　＝ＮＯ，）の加水分解を 触媒するその能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７，Ｏ；５０ｍＭヘベス 、＋　５０ｍＭＮａＣ１゜３０°Ｃ１０，５−３時間）、このｃａｔ１Ｍ１３３ は、ｃａｔ１ＭＩ３１に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す 。

例４の方法を使用して、第一付属集団（ｃａ　ｔ　ＩＭＩ　３１）の第三から弟 子までの部分をそれぞれ、式ＩＩで表される化合物の加水分解反応条件の下に、 式Ｖ−ＸＩで表される化合物（Ｒｓ結合基を有しておらず、Ｘ＝Ｂｒである）と それぞれ接触させる。これらの第三から弟子までの部分をそれぞれ、次いてハブ テンアフィニティ力ラム（Ｒを介してハブテンＩに結合）上に通し、カラムに結 合しないファージを採取し、次いてＥ、　ｃａｌ　ｉの感染に使用する。このＥ 、ｃｏｌｉ感染から得られたファージ（ｃａｔ１Ｍ１３４−ｃａｔ１Ｍ１３１０ ）を、式ＩＩで表される化合物（Ｒ’　＝ＮＯ２）の加水分解を触媒するその能 力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７，０；　５０ｍＭヘペス、ｉ　５０ｍ ＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）：これらのｃａｔ１ＭＩ３４−ｃａｔ１ Ｍ］３１０はそれぞれ、第一付属集団（ｃａ　ｔ　ＩＭＩ　３１）に比較して、 大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。

例６ 触媒−加速移動による選別 例２からの第一イ」属集団ｃａｔｌｆｄｌの一部をブロモフェノールブルーと混 合し、ファージペーストを調製する。式ＩＩで表される化合物（Ｒ’　＝ＮＯｔ 　）を、イモピリオンＡＶ膜上に支持させる（Ｒ’を介して）。この式ＩＩ−（ ’表される化合物−イモビリオンＡＶ膜を横切るファージペーストの非常に細い 線を画線培養する。この膜を含湿（５０−１００９６相対湿度）環境の下に、２ ５°Ｃで４８時間、インキュベートする。インキュベーションの後に、！ＪＩ微 鏡を用いて、レーザーによりスクラッピングを行い、元の線から０．１０ｍｍの ファージを採取する。この採取したファージ、ｃａｔｌｆｄｌｌ、を式ＩＩで表 される化合物（Ｒ’　＝ＮＯ２）の加水分解を触媒するその能力に関して試験す る（速度加速）（ｐＨ７，０；　５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣＬ　３０° Ｃ，０，５−３時間）；このｃａｔｌｆｄｌｌは、ｃａ、ｔｌｆｄｌに比較して 、大きい触媒性（ターンオーバー数）を示す。

例７ 触媒−加速移動による選別 例６の方法を使用して、例６からの第一イ４属集団ｃａｔ１Ｍ１３１をブロモフ ェノールブルーと混合し、ファージペーストを調製し、式ＩＩで表される化合物 −イモビリオンＡＶ膜を横切るファージペーストの非常に細い線を画線培養する 。

インキュベーション（５０−１００％相対湿度、２５°Ｃ１４８時間）の後に、 顕微鏡を補助的に使用し、レーザーによりスクラッピングを行い、元の線から０ ．１０ｍｍのファージを採取する。この採取したファージ、ｃａｔ１ＭＩ３１１ ゜を式ＩＩて表される化合物（Ｒ’　＝ＮＯ２）の加水分解を触媒するその能力 に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７，０；５０ｍＭへペス、＋　５０ｍＭＮ ａＣ１，３０°Ｃ，０，５−３時ｆｌ助：このｃａｔ１Ｍ＋３１１は、ｃａｔ１ Ｍ］３１に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。

例８ 表面結合による選別 例２からの第一（−Ｊ属集団ｃａｔｌｆｄｌの一部を溶液として、式■Ｉで表さ れる化合物−イモヒリオンＡＶ膜（例６）に添加し、２分後および１０分後に、 この膜を緩衝液（溶液と同一）により、迅速に洗浄する（Ｉ−５秒）。この洗浄 は、この基質に弱く結合しているか、または結合していないファージをいづれも 除去するものであり、この洗浄液は廃棄する。この湿った膜を、１時間目、３時 間目、６時間目および１２２時間目、Ｉ−２秒の迅速洗浄（溶液と同一の緩衝液 ）を行いながら、１２時間インキュベートする（２５°Ｃ１５Ｏ−１００９ｃｉ 相対湿度）。

これらの洗浄液を採取し、濃縮し、次いてＥ、ｃｏｌｉ感染に使用する。Ｅ、ｃ ｏｌｉ感染から得られたファージ、ｃａｔｌｆｄｍ２、を式ＩＩて表される。化 合物（Ｒ１＝ＮＯ７）の加水分解を触媒するその能力に関して試験する（速度加 速）（ｐＨ７，０；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣ１，３０°Ｃ，０，５− ３時間）：このｃａｔｌｆｄｌ２は、ｃａｔｌｆｄｌに比較して、大きい触媒活 性（ターンオーバー数）を示す。

例９ 表面結合による選別 例４からの第一付属集団ｃａｔ１Ｍ１３１の一部を溶液として、式ＩＩで表され る化合物−イモビリオンＡＶ膜（例６）に添加し、２分後および１０分後に、こ の膜を緩衝液（溶液と同一）により、迅速に洗浄する（ｌ−５秒）。これらの洗 浄液は廃棄する。この湿った膜を、１時間目、３時間目、６時間目および１２２ 時間目、１−５秒の迅速洗浄（溶液と同一の緩衝液）を行いながら、１２時間イ ンキュベートする（２５°Ｃ１５Ｏ−１００％相対湿度）；これらの洗浄液を採 取し、濃縮し、次いてＥ、　ｃａｌ　ｉ感染に使用する。Ｅ、ｃｏｌｉ感染から 得られたファージ、ｃａｔ１Ｍｉ３１２、を式ＩＩで表される化合物（Ｒ’　＝ ＮＯ２）の加水分解を触媒するその能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７ ，０；５０ｍＭヘベス、１５０ｍＭＮａＣ１，３０°Ｃ，０，５−３時間）、こ のｃａｔ１Ｍ１３１２は、ｃａｔ１ＭＩ３１に比較して、大きい触媒活性（ター ンオーバー数）を示す。

例１Ｏ 温度の関数としての結合のエンタルピー要素における変化による選別例１に記載 のｃ　ａ　ｔ、　ｌ　ｆ　ｄを、式ＩＩで表される化合物（Ｒ’　＝ＮＯ２，Ｒ ’を介して結合）のカラム（セファロース）上に、−２０℃で、結合は生じるが 、触媒作用は生しないようにして、通し、次いでフラクションを採取する。３７ ℃で、これらのフラクションを、式１１で表される化合物のカラムに再度通し、 フラクションを再度、採取する。吸光度を使用して、最低濃度でｃａｔｌｆｄを 含有するフラクション（結合と温度とが非線状関係にある）を単離し、Ｅ、ｃｏ ｌｉ感染に使用する。Ｅ、ｃｏｌｉ感染から得られたファージ、ｃａｔｌｆｄｌ ３、を式ＩＴで表される化合物（Ｒ’　＝ＮＯ２）の加水分解を触媒するその能 力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７，Ｌ５０ｍＭヘベス、１５０ｍＭＮａ ＣＬ　３０°Ｃ１０，５−３時間）−二のｃａｔｌｆｄｌ３は、ｃａｔｌｆｄｌ に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。

例１１ 温度の関数としての結合のエンタルピー要素における変化による選別例１に記載 のｃａｔ１Ｍ１３を、式ＩＩで表される化合物（例１４に記載のものと同一）の カラム（セファロース）上に、−２０°Ｃで、結合は生じつるが、触媒作用は生 じないようにして、通し、次いてフラクションを採取する。３７°Ｃで、これら のフラクションを、式ＩＩで表される化合物のカラムに再度通し、フラクション を再度、採取する。吸光度を使用して、最低濃度でｃａｔｌｆｄを含有するフラ クション（結合と温度とが非線状関係にある）を単離し、Ｅ、ｃｏｌｉ感染に使 用する。Ｅ、ｃｏｌｉ感染から得られたファージ、ｃａｔ１Ｍ１３ｔ３、を式Ｉ Ｉで表される化合物（Ｒ’　＝ＮＯ２’）の加水分解を触媒するその能力に関し て試験する（速度加速）（ｐＨ７，Ｏ；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣＬ　 ３０°Ｃ１０゜５−３時間）：このｃａｔ１Ｍ１３１３゜例１２ 競合による結合の変化による選別 例１に記載のｃａｔｌｆｄを、式ＸＸＩて表される化合物（Ｒ’を介して結合） のカラム（セファロース）上に通し、次いて式ＸＸＩで表される化合物を含有す る緩衝液により溶出する。フラクションを採取し、次いて濃縮する。これらのフ ラクションを次いで、それぞれ同一カラムに通し、次いて基質［式目で表される 化合物（Ｒ’　＝ＮＯ□）］により溶出する。この２次元分離様相か標準化され て、図１に示されている。この図において、２回のカラム通過で溶離する一団の ファージは１回のカラム通過とほとんど同一の保持時間で、主ピークとして溶出 する。この−団よりも遅く溶出するファージを採取し、集め、次いで５．ｃｏｌ ｉ感染に使用する。Ｅ、ｃｏｌｉ感染から得られたファージ、Ｃａｔｌ、ｆｄ１ ４、を式ＩＩで表される化合物（Ｒ’　＝ＮＯ２）の加水分解を触媒するその能 力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７，０：５０ｍＭへベス、１５０ｍＭｔ ＪａＣＬ　３０°Ｃ１０，５−３時間）、このｃａｔｌｆｄｌ４は、ｃａｔｌｆ ｄｌに比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。

例１３ 競合による結合の変化による選別 例１２の方法を使用して、ｃａｔｌｆｄの別の一部をそれぞれ、カラム上に通す 。各カラムは、式ＸＸＩ　Ｉ−ＸＸＸおよび式ＸＸＸＩＩて表される化合物（Ｒ ’を介して結合）を含有する。各部分をカラムに結合している各無反応性基質類 縁体により溶出する。各溶出液からのフラクションを次いで、それぞれこれらの フラクションか溶出されたカラムと同一のカラムに通し、次いでこの時点で基質 ［式ＩＩで表される化合物（Ｒ’　＝ＮＯ２）］により溶出する。この２次元分 離様相が標準化されて、図１に示されている。各溶出液から遅くれて溶出するフ ァージをそれぞれ単離し、集め、次いてＥ、ｃｏｌｉ感染に使用する。Ｅ、ｃｏ ｌｉ感染から生成されたファージ、ｃａｔｌｆｄｌ５−ｃａｔｌｆｄ２４、を式 ＩＩで表される化合物（Ｒ１＝ＮＯ２）の加水分解を触媒するその能力に関して 試験する（速度加速）（ｐＨ７，０；５０ｍＭへベス、ｌ　５０ｒｎＭＮａＣＬ 　３０°Ｃ，０５−３時間）、このｃａｔ２ｆｄ１５−ｃａｔ　１ｆｄ２４はそ れぞれ、ｃａｔｌｆｄｌに比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示 す。

例１４ 例１に記載のｃａｔ１ＭＩ３を、式ＸＸＩで表される化合物（Ｒ’を介して結合 ）のカラム（セファロース）上に通し、次いて式ＸＸＩで表される化合物を含有 する緩衝液により溶出する。フラクションを採取し、次いで濃縮する。これらの フラクションを次いで、それぞれ同一カラムに通し、次いで基質［式ＩＩで表さ れる化合物（Ｒ’　＝ＮＯ□）］により溶出する。この２次元分離様相が標準化 されて、図１に示されている。この図において、２回のカラム通過で溶離する一 団のファージは１回のカラム通過とほとんと同一の保持時間で、主ピークとして 溶出する。この−団よりも遅く溶出するファージを単離し、集め、次いでＥ、ｃ ｏｌｉ感染に使用する。Ｅ、ｃｏ１ｉ感染から得られたファージ、ｃａｔ１Ｍ１ ３１４、を式＋１で表される化合物（Ｒ’　＝ＮＯ２）の加水分解を触媒するそ の能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７，０：　５０ｍＭへベス、１５０ ｍＭＮａＣ＋、３０°Ｃ１０，５−３時間）、ごのｃａｔｌＭｌ３１４は、ｃａ ｔｌＭｌ３１に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。

例１５ 競合による結合の変化による選別 例２１の方法を使用して、ｃａｔｌＭｌ３の別の一部をそれぞれ、カラム上に通 ず。各カラムは、式ＸＸＩＩ−ＸＸＸおよび式ＸＸＸＩＩて表される化合物（Ｒ ’を介して結合）を自存する。各部分をカラムに結合している各無反応性基質類 縁体により溶出する。各溶出液からのフラクションを次いて、それぞれこれらの フラクションか溶出されたカラムど同一のカラムに通し、次いでこの時点で基質 ［式ＩＩて表される化合物（Ｒ’　＝ＮＯ２）］により溶出する。この２次元分 離様相か標準化されて、図１に示されている。各溶出液から遅くれて溶出するフ ァージをぞれぞれ単離し、集め、次いてＥ、　ｃｏｌ　ｉ感染に使用する。Ｅ、 ｃｏｌｉ感染から生成されたファージ、ｃａｔｌＭｌ３１５−ｃａｔｌＭｌ３２ ３、をそれぞれ式Ｉ＋で表される化合物（Ｒ’　＝ＮＯ，’）の加水分解を触媒 するその能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７，０；５０ｍＭヘベス、１ ５０ｍＭＮａＣ１，３０°Ｃ１０５−３時間）、このｃａｔｌＭｌ３１５−ｃａ ｔｌＭｌ、３２３は、ｃａ　ｊ：　ＩＭＩ　３１に比較して、大きい触媒活性（ ターンオーバー数）を示す。

例１６ ファージライブラリィの構築 １９９１年１０月１０１引Ｊけ出願の米国出願５ｅｒｉａｌＮｏ、０７／　７７ ３０４２に記載の方法を使用して、マウスをハブテンＩＡまたはＩＢにより免疫 感作し、化合物１１ＡまたはＩＩＢを加水分解して、５−フルオロウリンンを生 成させる反応を触媒する、触媒性抗体を誘発させる。

例Ｉの方法を採用して、この免疫感作したマウスからのひ臓ＲＮＡ、増幅用のＰ ＣＲコンセンザスプライマー、短鎖ペブヂトによりドメインを連結させて、−末 鎖Ｆｖを生成させるためのＰＣＲｌこの一本ｊｊｌＦｖライブラリィの５′およ び３′末端に制限酵素部位を挿入するためのＰＣＲｌおよびｆｄ、ラムダおよび ＭＩ３の各ファージ表示ベクター中へのクローニングを採用して、ハブテンＩＡ またはｉＢにより誘発される、基質１１ＡまたはＪＩＢのニスデル加水分解に係 わる触媒性抗体またはその触媒性部分を発現する組換えファージを調製する。本 明細書においで、これらの組換えファージの初期集団を、それぞれｃａｔ２ｆｄ 、ｃａ２λおよびｃａｔ２Ｍ＋３と記する。

例１７ メカニズム−ベース　インヒビター選別・第一付属集団の生成ｃａｔ２ｆｄ含有 溶液を、結合ハブテンとして式ＩＡで表される化合物（Ｎ　Ｉ４２を介して結合 ）を自存するアフィニティカラム（セファロース）上に通す。このカラム上に遊 離のハブテンを引き続いて通し、次いでこの遊離ハブテン洗浄により溶出される ファージを透析して、結合したハブテンを分離することによって、カラムのハブ テンに結合するファージの第一付属集団（ｃａｔ２ｆｄｌΔ）を、採取する。こ の第一付属集団（ｃａｔ２ｆｄｌＡ）を、式１１ＡおよびＪＩＢで表される化合 物の両方の加水分解を触媒するその能力に関して試験し、その速度加速ファクタ ーをｉｌｌ、ｌＩ定する（ｐＨ７，０；　５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣ］ 、３０°Ｃ１０，５−３時間）、この第一イマ１属集団は、若干の触媒活性を示 すａｃａｔ２ｆｃｌを自存するか、結合ハブテンか式ＩＢで表される化合物であ る、別の溶液を用いて、上記方法を反復する。この反復操作により得られた第一 付属集団、ｃ　ａ　ｔ　２　ｆ　ｄ　Ｉ　Ｂ、はまた、式１１ＡおよびＪＩＢで 表される化合物の両方の加水分解において若干の触媒活性を示す。ｃａｔ：２ｆ ｄｌＡおよびｃａｔ２ｆｄｌＢを集め、第一付属集団、ｃａｔ２ｆｄ＋とする。

同様の方法て、ｃａｔ２Ｍ１３からの第一イ寸属集団、すなわちｃａｔ２ＭＩ３ １、を調製する。ｃａｔ２ＭＩ３１ならびにこれらから生成された付属集団（ｃ 　ａ　ｔ　２Ｍ１３１Ａおよびｃａｔ２ＭＩ３１Ｂ）は、式ＩＩＡおよびＩＩＢ で表される化合物の両方の加水分解において若干の触媒活性を示す。

例■８ メカニズム−ベース　インヒビター選別上記第一（＝Ｊ属集団（ｃａｔ２ｆｄｌ ）の第一の一部を、上記のとおりに、セファロースカラムに共有結合させた式Ｘ ｌｌで表される化合物と、式１１ＡおよびｌＩＢて表される化合物の加水分解反 応条件（ｐＨ７，０；　５０ｍＭヘベス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０°Ｃ，０， ５ｉ時間）の下に、接触させる。溶出するものを採取し、廃棄する。このカラム に、温和な無機酸（ＨＣＩ）溶液（ｐＨ４−５）を通し、これにより溶出された ＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ形質転換に使用する。

このε、ｃｏｌｉ形質転換から徘られたファージ（ｃａｔ２ｆｄ２）を、式１１ ＡおよびＪＩＢで表される化合物の両方の加水分解を触媒するその能力に関して 試験する（ｐＨ７，Ｏ；　５０ｍＭヘベス、Ｉ　５０ｍＭＮａＣ１，３０゛Ｃ１ ０５−３時間）：ｃａｔ２ｆｄ２は、第一イ；Ｊ属集団（ｃａｔ２ｆｄｌ）に比 較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。

例１９ メツＪニズｌ、−ベース　インヒビター選別例１８の方法に従い、第一付属集団 ｃａｔ２Ｍ＋３１の一部から、第二付属集団ｃａｔ２ＭＩ３２を生成させ、その 触媒活性を試験する。ｃａｔ２ＭＩ３２はｃａｔ２Ｍ＋３１に比較して、大きい 触媒活性を示す。

例２０ メカニズム−ベース　インヒビター選別例１８の方法に従うか、式ＸＩＩＩ−Ｘ Ｘで表される化合物をカラムに結合させて、第二（；Ｊ属集団、ｃａ、ｔ２ｆｄ ３−ｃａｔ２ｆｄｌＯをそれぞれ、第一付属集団ｃａｔ２ｆｄｌの一部から生成 させ、触媒活性を試験する。ｃａｔ２ｆｄ３−ｃａｔ２ｆｄｌＯはぞれぞれ、ｃ 　ａ　ｔ　２　ｆ　ｄ　Ｉに比較して、大きい触媒活性を示す。

例２１ メカニズム−ベース　インヒビター選別例２０の方法に従い、式Ｘ１ｌｌ−ＸＸ て表さオ］る化合物をそれぞれ使用して、第一付属集団ｃａｔ２Ｍ１３１の一部 から、第二付属集団ｃａｔ２１３３−ｃａｔ２ＭＩ３１０を生成させる。これら の第二付属集団の触媒活性を試験する。

ｃａｔ２Ｍ１３３−ｃａｔ２ＭＩ３１０はそれぞれ、ｃａｔ２ＭＩ３１に比較し て、大きい触媒活性を示す。

前記例は本発明の方法の凡くへき利点を証明している・触媒を無触媒から選別ま たは濃縮することかでき、かつまた良好な触媒を得ることかできる。

２−　Ｃ１ａｃｋｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍａｋｉｎｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　 ＦｒａｇＩ！ＩｅｎｔｓυｓｉｎｇＰｈ２１ｇａ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｌｉｂｒａ ｒｉｅｓ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９９１）　、　、Ｌ２２７６２４−２８−１２ 、Ｄｉｘｏｎ、　Ｍ、　＆　Ｗｅｂｂ　Ｅ、Ｃ，Ｅｎｚｙｍｅｓ　（１９７９］ 　Ａｃａｄａｍｉｃ　Ｐｒ＠ｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ、　１６９−４８１゜本発明の好適態様を詳細に説明 したが、添付請求の範囲により特定されている本発明は、Ｏｆｆ記の特定の訂細 な説明に制限されるものではなく、がなりの明白な変更か、本発明の精神または 範囲がら逸脱することなく可能であることは、理解されるへきである。

配列リスト （１）−４財１１報 （１）出願人 （１１、発明の名称コ触媒性部分の発現に係わる反応−ベース選別および濃縮（ ｉ　ｉ　ｉ）配列の数４４ （ｉｖ）相当する（」吃所 （△）住所　Ｃｕｒｔｉｓ、　Ｍｏｒｒｉｓ　＆　５ａｆｆｏｒｄ、　Ｐ、Ｃ。

（Ｂ）ストリ−ｈ　：　５３０　Ｆｉｆｔｈ　Ａｖｅｎｕｅ（Ｃ）　７１７　： 　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（Ｄ）州：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ （Ｅ）　国　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ（Ｆ）　ＺＩＰ　：　１００３Ｇ （Ｖ）コンピューター読取り可能フオーム（Ａ）メディアムタイプ、フロッピィ ディスク（Ｂ）コレビューター　ＩＢＮ　ＰＣコンバーティブル（Ｃ）　オベレ ーティ：／７　’ＪステＬ：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア （ｖｉ）本出願のデータ （Ａ）出願番号 （Ｂ）出願日。

（Ｃ）分類。

（ｖ　目ｉ）　ＰＣ埋人／エイノエント情報。

（Ａ）名前二Ｅｖａｎｓ　Ｂａｒｒｙ （Ｂ）登録番号：２２８０２ （Ｃ）参照／内容摘要番号：３７００６８−３５８１ぐｉｘ）電信情報。

（Ａ）（ｍ話＞（２］２）８４０−３３３３（ｔ３）ファックスｌ　（２１２） ８４０−０７１２（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌに係わる情報（ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ、２２塩基対 （Ｂ）タイプ、核酸 （Ｃ）線型ニー重鎖 （Ｄ）形態　線状 ぐ１１）分子の種類＝ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列表示・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：Ｉ：＾弱丁ＧＭＡＣＴ　ａｃＡｃｃＡα■講ＣＧ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： ２に係わる情報：（１）配列特徴 （Ａ）長さ、３２塩基対 （Ｂ）タイプ、核酸 （Ｃン線型、−重鎖 （Ｄ）形態、線状 （ｉ　ｎ分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列表示　ＳＥＱ　ＴＤ　ＮＯ ：２（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３に係りるＭ’１ＦＩ（１）配列特徴・ （Ａ）長さ　２４塩基対 （Ｂ）タイプ・核酸 （Ｃ）線型ニー重鎖 （Ｄ）形態　線状 （１１）分子のｆｉ類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：３（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４に係わる情報（ｉ）配列特徴。

（Ａ）長さ　９７塩７に丈ｊ （Ｂ）タイプ、核酸 （Ｃ）線型　−重鎖 （Ｄ）形態　線状 （１１）分子の種類、ＤＮＡ（ゲノム）（ｘ　ｉ）配列表示　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：４ｃｃｃｔｒ丁Ｇ＾τ丁　丁ＣＣ入ＧＣＴ丁ＧＧ　ＴＣＣＣＣ（＄τττ　 丁ＡＴＴＴＴＣＣ＾ＧＣ丁ＴＧＧτＣＣＣＣｅＧＴτｉ丁八ＴτＴへシ五σロ１ ℃τｃｃｃｃｃｒａｍｃ　＾ＧＣＴＣＣＡＧｃ＋ｒＴＧＧＴＣＣＣ容積 基質による２次元溶出プロフィール ＦＩＧ、１ 容積 基質による２次元溶出プロフィール ＩＧ−２ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３０／４８　 Ｒ８３１０−２Ｊ３０／羽　Ｅ　８３１０−２Ｊ ３３１５３　Ｙ　８３１０−２Ｊ ３３１５６９　Ｇ　９０１５−２Ｊ （７２）発明者　ダースリー、マイクル、ジェイ。

アメリカ合衆国２０８５１　メリーランド州ロックビル、ハルセイ　ロード　５ ９０５Ｉ （７２）発明者　シンプソン、デビット、エム。

アメリカ合衆国２０７８３　メリーランド州アデルフィ、ロセット　レーン　８ ３０６（７２）発明者　ブラックバーン、ゲーリー、エフ。

アメリカ合衆国２０８８２　メリーランド州ゲイサーズバーグ、ローリング　フ ォークウェイ　２３６２７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．表面結合した触媒性部分を発現できる、組換えウイルスまたは有機体の集団 の選別方法であって、 触媒性部分を発現するウイルスまたは有機体を含有する可能性がある組換えウイ ルスまたは有機体の集団の表面結合触媒性部分の触媒活性に係わり反応一べース 選別に付し、 この集団から、触媒作用を発揮できる付属集団を単離する、ことからなる選別方 法。 ２．触媒活性に係わる選別が、上記集団をメカニズムーベースインヒビターと接 触させて、反応混合物を生成させることからなる、請求項１に記載の方法。 ３．付属集団の単離が、上記反応混合物を不動化した基質またはハプテンを含有 するメジウムと接触させ、この不動化した基質またはハプテンに結合しないウイ ルスまたは有機体を採取することからなる、請求項２に記載の方法。 ４．上記反応混合物と不動化した基質またはハプテンを含有するメジウムとの接 触が、反応混合物を不動化した基質またはハプテンのアフィニティカラム上に通 すことからなる、請求項３に記載の方法。 ５．上記触媒活性に係わる選別が、所望の触媒反応の基質を有する表面と上記集 団とを接触させ、この接触をこの表面の第一の地点で生じさせ、次いでこの集団 の中の触媒活性を有する一団が、この表面上の第二の点地点にまで距離を移動す るのに充分な時間、通過させることからなる、請求項１に記載の方法。 ６．上記付属集団の単離が上記表面の第二の地点からの集団中の一団を採取する ことからなる、請求項５に記載の方法。 ７．上記集団の中の触媒活性を有する部分の移動を、この表面に電場を印加する ことによって増加させる、請求項６に記載の方法。 ８．上記触媒活性に係わる選別が、所望の触媒反応の基質を含有する表面と上記 付属集団とを接触させ、この接触を、この表面に上記集団中の触媒活性を有して いない一団は結合し、一方触媒活性を有する一団は結合して、触媒作用を発揮す るように行い、次いで上記集団中の触媒活性を有していない一団が当該表面と平 衡に近付くには充分であるが、上記集団中の触媒活性を有する一団が当該基質を 消費する時間よりも短い接触時間の後に、上記表面を洗浄して、この表面から上 記集団中の触媒活性を有する一団を分離することからなり、そしてこの付属集団 の単離が、この洗浄液を採取することからなる、請求項１に記載の方法。 ９．上記触媒活性に係わる選別がさらに、上記表面と上記付属集団とを接触させ た後であって、上記表面の洗浄により、この表面から上記集団中の触媒活性を有 する一団を分離する前であり、かつまた上記集団中の触媒活性を有していない一 団および上記集団中の触媒活性を有する一団の両方が基質に結合するのに充分の 時間であるが、上記集団中の触媒活性を有する一団が触媒反応を完了するよりも 短い時間の時点で、上記表面を洗浄して、上記集団中の、この基質に対して弱い 親和性を有するか、または親和性を有していない一団を分離する工程を包含する 、請求項８に記載の方法。 １０．上記触媒活性に係わる選別が、上記集団と基質とを結合は生じるが、実質 的な触媒作用は発揮されない第一の温度で接触させ、次いで結合と触媒作用の発 揮との両方が生じる温度であって、第一の温度よりも高い第二の温度において、 集団を基質と接触させることからなり、そしてこの付属集団の単離が、この集団 中の見掛上の結合に対する温度効果の相違する一団を採取することからなる、請 求項１に記載の方法。 １１．上記触媒活性に係わる選別が、開裂性基によりそこに結合しているメカニ ズムーベースインヒビクーを有するメジウムに、上記集団を通過させることから なり、そして上記付属集団の単離が、このメジウムからインヒビターを脱離させ ることによって、この集団中のインヒビターに結合している一団を採取すること からなる、請求項１に記載の方法。 １２．上記触媒活性に係わる選別が、上記集団を、移動性の無反応性基質類縁体 の存在の下に、不動化した無反応性基質類縁体と接触させ、この不動化した無反 応性基質類縁体に相違する結合特性で結合する複数の試料を採取し、次いでこの 試料を、移動性の基質の存在の下に、不動化した無反応性基質類縁体と接触させ ることからなり、そして上記付属集団の単離が、各試料中の大多数の一団に比較 して、相違する見掛上の結合を示す各試料中の一団を採取することからなる、請 求項１に記載の方法。 １３．試料中の無触媒性部分に対する触媒性部分の割合を増加させる方法であっ て、 表面結合した触媒性部分により触媒活性に係わり、試料を反応ーベース選別に付 し、 この第一の試料よりも無触媒性部分に対する触媒性部分の割合が大きい第二の試 料を、この試料から単離する、 ことからなる方法。 １４．上記触媒活性に係わる選別が、試料をメカニズムーベースインヒビターと 接触させて、反応混合物を生成させることからなる、請求項１３に記載の方法。 １５．上記第二の試料の単離が、上記反応混合物を不動化した基質またはハプテ ンを含有するメジウムと接触させ、次いでこの不動化した基質またはハプテンに 結合しない部分を採取することからなる、請求項１３に記載の方法。 １６．上記反応混合物と不動化した基質またはハプテンを含有するメジウムとの 接触が、反応混合物を不動化した基質またはハプテンのアフィニティカラム上に 通すことからなる、請求項１５に記載の方法。 １７．上記触媒活性に係わる選別が、所望の触媒反応の基質を含有する表面と試 料とを接触させ、この接触を当該表面の第一の地点で生じさせ、次いで試料中の 触媒活性を有する部分が当該表面の第二の地点まで距離を移動するのに充分の時 間、通過させることからなる、請求項１３に記載の方法。 １８．上記第二の試料の単離が、表面上の上記第二の地点から当該部分を採取す ることからなる、請求項１７に記載の方法。 １９．上記触媒活性を有する部分の移動を、当該表面上に電場を印加することに より増加させる、請求項１８に記載の方法。 ２０．上記触媒活性に係わる選別が、所望の触媒反応の基質を含有する表面と上 記試料とを接触させ、この接触を、この表面に上記試料中の触媒活性を有してい ない部分は結合し、そしてまた触媒活性を有する部分も結合して、触媒作用を発 揮するように行い、次いで上記試料中の触媒活性を有していない部分が当該表面 と平衡に近付くには充分であるが、上記試料中の触媒活性を有する部分が当該基 質を消費する時間よりも短い接触時間の後に、上記表面を洗浄して、この表面か ら上記試料中の触媒活性を存する部分を分離することからなり、そして第二の試 料の単離が、この洗浄液を採取することからなる、請求項１３に記載の方法。 ２１．上記触媒活性に係わる選別がさらに、上記表面と上記試料とを接触させた 後であって、上記表面の洗浄により、この表面から上記試料中の触媒活性を有す る部分を分離する前であり、かつまた上記試料中の触媒活性を有していない部分 および上記試料中の触媒活性を有する部分の両方が基質に結合するのに充分の時 間であるが、上記試料中の触媒活性を有する部分が触媒反応を完了するよりも短 い時間の時点で、上記表面を洗浄して、上記試料中の、この基質に対して弱い親 和性を有するか、または親和性を有していない部分を分離する工程を包含する、 請求項２０に記載の方法。 ２２．上記触媒活性に係わる選別が、上記試料と基質との接触を、結合は生じる が、実質的な触媒作用は発揮されない第一の温度で行い、次いで上記試料と基質 とを、この第一の温度よりも高い温度であって、結合と触媒作用との両方が生じ る第二の温度で行うことからなり、そしてこの第二の試料の単離が、見掛上の結 合に対する温度効果の相違する部分を採取することからなる、請求項１３に記載 の方法。 ２３．上記触媒活性に係わる選別が、上記試料を、移動性の無反応性基質類縁体 の存在の下に、不動化した無反応性基質類縁体と接触させ、この不動化した無反 応性基質類縁体に相違する結合特性で結合する複数の中間試料を採取し、次いで この中間試料を、移動性の基質の存在の下に、不動化した無反応性基質類縁体と 接触させることからなり、そして上記第二の試料の単離が、上記中間試料中の大 多数の部分に比較して、相違する見掛上の結合を示す中間試料中の部分を採取す ることからなる、請求項１３に記載の方法。 ２４．上記触媒活性に係わる選別が、開裂性基によりそこに結合しているメカニ ズムーベースインヒビターを有するカラムに、上記試料を通過させることからな り、そして上記第二の試料の単離が、このカラムからインヒビターを脱離させる ことによって、このインヒビターに結合している部分を採取することからなる、 請求項１３に記載の方法。 ２５．上記触媒活性に係わる選別が、上記試料を、開裂性基により移動性粒子に 結合させたメカニズムーベースインヒビターと接触させることからなり、そして この第二の試料の単離が、試料から粒子を分離し、この粒子からインヒビターを 脱離させることによって、このインヒビターに結合している部分を採取すること からなる、請求項１３に記載の方法。 ２６．上記粒子を、濾過により分離する、請求項２５に記載の方法。 ２７．上記粒子を、重力または遠心力により分離する、請求項２５に記載の方法 。 ２８，上記粒子が、磁気応答性であり、そしてこの粒子を磁場の印加により分離 する、請求項２５に記載の方法。 ２９．上記試料が、触媒性部分を発現するウイルスまたは有機体を含有する可能 性がある組換えウイルスまたは有機体の集団からなる、請求項１３、１４、１５ 、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７ または２８のいづれか一項に記載の方法。 ３０．上記触媒性部分が、触媒性抗体またはその触媒性部分である、請求項２９ に記載の方法。 ３１．上記触媒性部分が、触媒性抗体またはその触媒性部分である、請求項１、 ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６ 、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または ２８のいづれか一項に記載の方法。 ３２．表面結合した触媒性部分を発現することができる組換えウイルスまたは有 機体の集団の選別方法であって、 触媒性部分を発現するウイルスまたは有機体を含有する可能性がある組換えウイ ルスまたは有機体の集団を、選択された分子に対する結合性に係わり選別し、上 記集団から、この選択された分子に結合できる第一付属集団を単離し、この第一 付属集団を、触媒活性に係わり反応−ベース選別に付し、この第一付属集団から 、触媒作用を発揮することができる第二付属集団を単離する、 ことからなる方法。 ３３．表面結合した触媒性部分を発現することができる組換えウイルスまたは細 胞ラインの産生方法であって、 触媒性部分を発現するウイルスを含有する可能性がある組換えウイルスの集団を 、選択された分子に対する結合性に係わり選別し、上記集団から、この選択され た分子に結合できる第一付属集団を単離し、この第一付属集団を、表面結合した 触媒性部分による触媒活性に係わり反応一ベース選別に付し、 この第一付属集団から、触媒作用を発揮することができる第二付属集団を単離し 、 組換えウイルスにより感染させることができる宿主に、この第二付属集団のウイ ルスを感染させる、 ことからなる方法。 ３４．触媒活性に係わる選別が、上記第一付属集団を、メカニズムーベースイン ヒビターと接触させて、反応混合物を生成させることからなる、請求項３２また は３３のいづれか一項に記載の方法。 ３５．上記選択されたハプテンに対する結合性に係わる集団の選別が、上記集団 を、不動化した基質またはハプテンを含有するメジウムと接触させることからな り、上記第一付属集団の単離が、この集団中のこの基質またはハプテンに結合す る部分を採取することからなり、そして上記第二付属集団の単離が、この反応混 合物を不動化した基質またはハプテンを含有するメジウムと接触させ、次いでこ の不動化した基質またはハプテンに結合しないウイルスを採取することからなる 、請求項３４に記載の方法。 ３６．上記選択工程および単離工程のどちらか、または両方における不動化した 基質またはハプテンを含有するメジウムが、不動化した基質またはハプテンのア フィニティカラムからなる、請求項３５に記載の方法。 ３７．上記触媒活性に係わる選別が、所望の触媒反応の基質を含有する表面と上 記第一付属集団とを接触させ、この接触を当該表面の第一の地点で生じさせ、上 記第一付属集団中の触媒活性を有する部分を当該表面の第二の地点までの距離に 移動するのに充分の時間、通過させることからなる、請求項３２または３３のい づれか一項に記載の方法。 ３８．上記選択されたハプテンに対する結合性に係わる集団の選別が、この集団 を、不動化したハプテンのアフィニティカラムに通すことからなり、上記第一付 属集団の単離が、この集団中のこのアフィニティカラムに結合する部分を溶出す ることからなり、そして上記第二付属集団の単離が、この表面上の第二の地点か ら上記第一付属集団中の一部を採取することからなる、請求項３７に記載の方法 。 ３９．上記触媒活性に係わる選別が、所望の触媒反応の基質を含有する表面と上 記第一付属集団とを接触させ、この接触を、この表面に上記第一付属集団中の触 媒活性を有していない部分は結合し、そしてまた触媒活性を有する上記第一付属 集団中の部分も結合して、触媒作用を発揮するように行い、次いで上記第一付属 集団中の触媒活性を有していない部分が当該表面と平衡に近付くには充分である が、上記第一付属集団中の触媒活性を有する部分が当該基質を消費する時間より も短い接触時間の後に、上記表面を洗浄して、この表面から上記第一付属集団中 の触媒活性を有する部分を分離することからなり、そして上記第二付属集団の単 離が、この洗浄液を採取することからなる、請求項３２または３３のいづれか一 項に記載の方法。 ４０．上記選択されたハプテンに対する結合性に係わる集団の選別が、この集団 を、不動化したハプテンのアフィニティカラム上に通すことからなり、そして上 記第一付属集団の単離が、この集団中のこのアフィニティカラムに結合する部分 を溶出することからなる、請求項３９に記載の方法。 ４１．上記触媒活性に係わる選別がさらに、上記表面と上記第一付属集団とを接 触させた後であって、上記表面の洗浄により、この表面から上記第一付属集団中 の触媒活性を有する部分を分離する前であり、かつまた上記第一付属集団中の触 媒活性を有していない部分および上記第一付属集団中の触媒活性を有する部分の 両方が基質に結合するのに充分の時間であるが、上記第一付属集団中の触媒活性 を有する部分が触媒反応を完了するよりも短い時間の時点で、上記表面を洗浄し て、上記第一付属集団中の、この基質に対して弱い親和性を有するか、または親 和性を有していない部分を分離する工程を包含する、請求項３９に記載の方法。 ４２．上記触媒活性に係わる選別が、上記第一付属集団と基質との接触を、結合 は生じるが、実質的な触媒作用は発揮されない第一の温度で行い、次いで上記第 一付属集団と基質とを、この第一の温度よりも高い温度であって、結合と触媒作 用との両方が生じる第二の温度で行うことからなり、そして上記第二付属集団の 単離が、見掛上の結合に対する温度効果の相違する上記第一付属集団の部分を採 取することからなる、請求項３２または３３のいづれか一項に記載の方法。 ４３．上記触媒活性に係わる選別が、開裂性基によりそこに結合しているメカニ ズムーベースインヒビターを有するメジウムに、上記集団を通過させることから なり、そして上記第二付属集団の単離が、このメジウムからインヒビターを脱離 させることによって、第一付属集団中のこのインヒビターに結合している部分を 採取することからなる、請求項３２または３３のいづれか一項に記載の方法。 ４４．上記触媒活性に係わる選別が、上記第一付属集団を、移動性の無反応性基 質類縁体の存在の下に、不動化した無反応性基質類縁体と接触させ、この不動化 した無反応性基質類縁体に相違する結合特性で結合する複数の試料を採取し、次 いでこの試料を、移動性の基質の存在の下に、不動化した無反応性基質類縁体と 接触させることからなり、そして上記第二付属集団の単離が、上記第一付属集団 中の各試料の大多数の部分に比較して、各試料中の相違する見掛上の結合を示す 部分を採取することからなる、請求項３２または３３のいづれか一項に記載の方 法。 ４５．上記触媒活性に係わる選別が、上記第一付属集団を、開裂性基により移動 性粒子に結合させたメカニズムーベースインヒビターと接触させることからなり 、そして上記第二付属集団の単離が、上記第一付属集団から粒子を分離し、この 粒子からインヒビターを脱離させることによって、このインヒビターに結合して いる部分を採取することからなる、請求項３２または３３のいづれか一項に記載 の方法。 ４６．上記粒子を、濾過により分離する、請求項４５に記載の方法。 ４７．上記粒子を、重力または遠心力により分離する、請求項４５に記載の方法 。 ４８．上記粒子が、磁気応答性であり、そしてこの粒子を磁場の印加により分離 する、請求項４５に記載の方法。 ４９．上記第一付属集団中の触媒活性を有する部分の移動を、この表面に電場を 印加することによって、増強させる、請求項３７に記載の方法。 ５０．上記組換えウイルスが、ｆｄまたはＭ１３ファージであり、そして触媒性 部分が、エステル加水分解を触媒することができる触媒性抗体またはその触媒性 部分である、請求項３２または３３のいづれか一項に記載の方法。 ５１．上記組換えウイルスが、ｆｄまたはＭ１３ファージであり、そして触媒性 部分が、エステル加水分解を触媒することができる触媒性抗体またはその触媒性 部分である、請求項３４に記載の方法。 ５２．上記組換えウイルスが、ｆｄまたはＭ１３ファージであり、そして触媒性 部分が、エステル加水分解を触媒することができる触媒性抗体またはその触媒性 部分である、請求項３７に記載の方法。 ５３．上記組換えウイルスが、ｆｄまたはＭ１３ファージであり、そして触媒性 部分が、エステル加水分解を触媒することができる触媒性抗体またはその触媒性 部分である、請求項３９に記載の方法。 ５４．上記組換えウイルスが、ｆｄまたはＭ１３ファージであり、そして触媒性 部分が、エステル加水分解を触媒することができる触媒性抗体またはその触媒性 部分である、請求項４２に記載の方法。 ５５．上記組換えウイルスが、ｆｄまたはＭ１３ファージであり、そして触媒性 部分が、エステル加水分解を触媒することができる触媒性抗体またはその触媒性 部分である、請求項４３に記載の方法。 ５６．上記組換えウイルスが、ｆｄまたはＭ１３ファージであり、そして触媒性 部分が、エステル加水分解を触媒することができる触媒性抗体またはその触媒性 部分である、請求項４４に記載の方法。 ５７．上記組換えウイルスが、ｆｄまたはＭ１３ファージであり、そして触媒性 部分が、エステル加水分解を触媒することができる触媒性抗体またはその触媒性 部分である、請求項４５に記載の方法。 ５８．上記組換えウイルスが、ｆｄまたはＭ１３ファージであり、そして宿主が Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項３３に記載の方法。 ５９．上記細胞ラインが、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞ラインである、請求項３３に記載の 方法。 ６０．請求項３２または３３のいづれか一項に記載の方法により産生される、触 媒性抗体またはその触媒性部分である触媒性部分を発現する、実質的に純粋な組 換えウイルス集団。 ６１．請求項３３に記載の方法により産生される、触媒性抗体またはその触媒性 部分である触媒性部分を発現する、実質的に純粋な細胞ライン。 ６２．請求項３４に記載の方法により産生される、触媒性抗体またはその触媒性 部分である触媒性部分を発現する、実質的に純粋な組換えウイルス集団。 ６３．請求項３７に記載の方法により産生される、触媒性抗体またはその触媒性 部分である触媒性部分を発現する、実質的に純粋な組換えウイルス集団。 ６４．請求項３９に記載の方法により産生される、触媒性抗体またはその触媒性 部分である触媒性部分を発現する、実質的に純粋な組換えウイルス集団。 ６５．請求項４２に記載の方法により産生される、触媒性抗体またはその触媒性 部分である触媒性部分を発現する、実質的に純粋な組換えウイルス集団。 ６６．請求項４３に記載の方法により産生される、触媒性抗体またはその触媒性 部分である触媒性部分を発現する、実質的に純粋な組換えウイルス集団。 ６７．請求項４４に記載の方法により産生される、触媒性抗体またはその触媒性 部分である触媒性部分を発現する、実質的に純粋な組換えウイルス集団。 ６８．請求項４５に記載の方法により産生される、触媒性抗体またはその触媒性 部分である触媒性部分を発現する、実質的に純粋な組換えウイルス集団。 ６９．請求項５０に記載の方法により産生される、実質的に純粋な組換えｆｄま たはＭ１３ファージ集団。 ７０．請求項５１に記載の方法により産生される、実質的に純粋な組換えｆｄま たはＭ１３ファージ集団。 ７１．請求項５２に記載の方法により産生される、実質的に純粋な組換えｆｄま たはＭ１３ファージ集団。 ７２．請求項５３に記載の方法により産生される、実質的に純粋な組換えｆｄま たはＭ１３ファージ集団。 ７３．請求項５４に記載の方法により産生される、実質的に純粋な組換えｆｄま たはＭ１３ファージ集団。 ７４．請求項５５に記載の方法により産生される、実質的に純粋な組換えｆｄま たはＭ１３ファージ集団。 ７５．請求項５６に記載の方法により産生される、実質的に純粋な組換えｆｄま たはＭ１３ファージ集団。 ７６．請求項５７に記載の方法により産生される、実質的に純粋な組換えｆｄま たはＭ１３ファージ集団。