KR100233950B1 - 촉매성분의 발현 및 농축을 위한 반응-기재선택 - Google Patents

촉매성분의 발현 및 농축을 위한 반응-기재선택 Download PDF

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Abstract

촉매 항체 또는 그의 촉매 부분을 발현하는 제조합 비루스, 파지 또는 세포의 선택 방법 및 성분에 의한 촉매활성 선택 방법이 공개되고 청구된다. 이 방법은 촉매 활성에 대한 반응-기재 선택을 사용한다. 또한 이 방법을 사용하여 촉매 성분을 함유하는 샘플 또는 촉매 성분을 발현하는 비루스, 파지 또는 세포를 농축(비-촉매 성분에 대한 촉매의 비율 증가)시킬 수 있다. 선택 또는 농축은 메카니즘-기재 억제자, 촉매작용-가속화된 이동, 온도의 함수로서 결합의 엔탈피 성분 변화, 경쟁에 의한 결합변화, 그의 조합물을 사용함으로써 할 수 있다. 또한 본 발명은 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분과 같은 촉매 성분을 발현하는 재조합 비루스 또는 세포계 생산 방법을 포괄하며 ; 이 방법은 적합한 숙주를 감염시켜 발현을 스크리닝하는 것을 포함할 수 있다. 게다가, 이렇게 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분과 같은 촉매 성분을 발현하는 비루스 및 세포계를 공개하고 청구한다.

Description

[발명의 명칭]
촉매 성분의 발현 및 농축을 위한 반응-기재 선택
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 광범위하게 촉매 성분에 대한 선택방법, 촉매 성분을 함유한 샘플내 촉매성분의 농도를 증가시키는 방법, 및 상기 방법으로부터의 실질적으로 순수한 또는 농축된 촉매 생성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 촉매 항체 또는 그의 촉매 성분을 발현시키는 비루스를 포함하는 것으로 추측되는 제조합 비루스 집단을 농축시키거나 선택하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 촉매 항체 또는 그의 촉매 성분을 발현시키고 촉매로 작용하는 제조합 비루스의 검출에 관한 것이다. 부가로 본 발명은 감염되기 쉬운 숙주를 촉매 항체 또는 그의 촉매 성분을 발현시키는 제조합 비루스에 의해 감염시켜 촉매 항체 또는 그의 촉매 성분을 발현시키는 세포계 또는 재조합 비루스를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 언급한 방법으로부터 촉매 항체 또는 그의 촉매 성분을 발현시키는 실질적으로 순수한 재조합 비루스 또는 세포 집단에 관한 것이다.
[발명의 배경]
본 명세서 전체에서 참고문헌은 공개된 문헌에 대해 괄호안 번호에 의해 작성될 것이다. 이들 번호의 참고 문헌은 본 명세서의 뒤에 있는 참고문헌의 목록에 상응하며 이들 참고문헌은 이로써 모두 본원에 참고 문헌으로 병합된다.
비루스는 세포를 감염시키고 세포의 생합성 기관을 전환시켜 비루스 후대를 합성한다. 특정 비루스는 숙주세포를 감염시키고, 숙주 DNA 를 파손시키고 비루스 후대가 세포내 형성되도록 하며 그 결과 세포는 용균되어 성숙 비루스 후대를 방출한다. 다른 비루스는 용원성이다. 상기 비루스는 숙주 세포를 감염시키고 비루스 DNA 는 숙주 염색체의 일구역내로 삽입되며 그 결과 여러 세대 동안 (감염 세포의 복제로 인해) 결과 얻어진 세포계는 비루스의 유전자 생산물을 발현시킨다. 최초의 감염된 세포의 후대는 그의 염색체로부터 비루스 DNA 를 자발적으로 방출하거나 방출하도록 유도될 수 있으며, 그 결과 비루스의 후대를 초래하는 용원 순환이 일어난다. 상기 용원성 유형 비루스의 예는 파지 람다이며 상기는 특정 경우에, 예를들어 특정 화학약품 또는 자외선과 같은 방사선에 노출될 때, 감염후 즉각적으로 용원 순환을 개시할 수 있지만 그렇지 않다면 여러 세대동안 이. 콜라이(E. Coli) 숙주 게놈내 프로비루스 또는 프로파지로서 존재할 수 있다.
항체 분야에서 최근 개발은 항체 또는 그의 성분에 대한 핵산 서열의 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의한 증폭이다. (1) 상기 개발의 확장은 비루스, 특히 파지 또는 박테리오 파지의 게놈 내로의 상기 상기 서열 삽입이다. (2, 3, 4, 11). 상기를 고려할때 참고문헌은 본원에 참고 문헌으로 병합된, "특정 결합 쌍의 성원 생산 방법"을 표제로 하여 1992년 1월 23일 공개된 PCT 특허 공개 WO 920 1047 에 대해 명백히 이루어진다. 상기와 같이, 파지 표면상 촉매-활성 효소의 발현이 성취되었다(32).
예를 들어, clackson 일동 (2)은 합텐 2-페닐옥사졸-5-온 (phox)에 대한 쥐의 면역으로부터 무거은 (heavy)(Vn) 사슬 및 캅파 (Vk) 가벼운 ( light) 사슬에 대해 재배열된 서열의 무작위 조합 라이브러리를 사용하여 fd 파지의 표면상 항체 단편의 다양한 라이브러리를 나타냄을 보고한다. 재조합 fd 파지는 그의 집단을 친화 컬럼상 통과시켜 선택했다.
유사하게, McCafferty 일동 (3)은 완전한 항체 V 영역을 재조합 fd 박테리오파지의 표면상에 나타낼 수 있고 항원에 결합한 것들을 (예컨대, 백만개 중 하나) 친화 크로마토그래피에 의해 분리할 수 있음을 보고했다. 그리고, MaCafferty 일동 (32)은 박테리오파지의 표면 상에서 기능성 알칼리성 포스포타제의 발현과 친화 크로마토그래피를 보고했다.
유사하게, Huse 일동(4)은, 이. 콜라이에서 Fab 단편의 재조합 라이브러리를 발현하는 박테리오파지 람다 벡터 시스템의 사용을 설명했다. 발현에 대한 선택은 항원에 대한 결합을 선택함으로써 했다.
합텐 또는 항원 결합 또는 친화도에 의해 촉매 항체 또는 그의 촉매 활성 성분을 발현한다고 추정되는 재조합 파지 선택 기술에 따른 문제점은 초기에 무한한 수의 파지가 생산된다는 것이다 ; 예컨대, 약 105이상이 생산된다. 여전히 상기 무수한 파지 집단으로부터의 합텐-결합 선택도 (결합한) 무수한 파지 부집단을 생산한다 ; 예컨대, 약 6,000-10,000 파지를 생산한다. 그러나, 결합한 이 첫번째 부집단에는 표면 상에서 항체를 발현할 뿐만아니라(그리하여 합텐에 결합함) 또한 촉매 항체 (즉, 발현되는 항체 또는 그의 성분이 촉매성임)를 나타내는 더 작은 두번째 부집단이 있다. 따라서, 첫번째 부집단 (항원 또는 합텐과 결합한)만을 단리하면 재조합 파지 집단을 스크리닝하여 촉매적으로 항체 또는 그의 성분을 발현하는 성원들을 단리하는데 적절하지 않다. 즉, 합텐-결합 선택은 부가적인 이용 ; 예컨대 이. 콜라이와 같은 숙주세포 감염 및 촉매 항체 또는 그의 촉매 성분을 발현하는 재조합 파지 또는 세포의 일관된 세대를 생산하기 위해 촉매 항체 또는 그의 성분을 발현하는 재조합 파지 집단의 성원들을 단리하는데 불충분하다. 사실, 더 넓은 범위에서, 촉매 항체와 같은 촉매 개발이 접하게 되는 문제점은 방대한 초과량의 비촉매 성분, 예컨대 동일한 전이 상태 동족체에 대해 생성된 방대한 량의 비촉매 항체들 중에 원하는 촉매 활성을 나타내는 성분, 예컨대 항체를 풍부하게 하거나 선택하는 것이 경제적이지 못하다는 것이다.
더우기, (광범위한 선택을 수행하는 동정에 반하여) 항체 단편의 촉매 활성을 선택하는 종래 방법은 단편을 발현하는 유기체에 유전적 결합을 주는 능력을 근거한 생물학적 선택법에 의존한다 (16). 지금까지 재조합 비루스 또는 세포의 촉매 성질에 근거하여 촉매 항체 또는 그의 촉매 성분을 나타내는 상기 비루스에 의해 감염된 재조합 비루스 또는 세포를 선택하는 방법은 없었다.
효소학 영역에서, 문헌 (5, 6)은 메카니즘-기재 억제자 (친화 라벨 또는 자기불활화 기질)로 불리는 반응물을 보고했다. 이들 반응물은 보통의 기질이 하는 것처럼 효소의 활성 부위에 결합하나, 보통의 기질과 반대로, 반응 메카니즘의 화학적 특징을 이용하여 효소와 비가역적 부가물을 형성한다. 상기 반응물은 많은 효소 및 효소 메카니즘에 대해 특이적으로 고안되었다. 일반적으로, 정상 기질 촉매 반응에 참가하는 친핵성 효소 아미노산 잔기는 대신에 메카니즘-기재 억제자와 반응하고 영구적으로 불활성화된다. 자기불활화 기질인 합텐을 사용하여 항체를 유발했다 (14). 자기불활화 기질은 촉매 활성을 갖는 항체의 선택에는 사용되지 않았다.
따라서, 이전에는 촉매 항체 또는 그의 촉매 성분을 발현하는 성원에 대해 재조합 파지 또는 재조합 파지 감염 세포를 선택하거나 촉매 성분을 발현하는 성원의 농도를 증가시키는데 메카니즘-기재 억제자를 사용하지 않았다. 촉매 성분, 예컨대 파지, 세포 또는 기타 자기-복제 시스템에 의해 발현된 촉매 성분, 또는 촉매 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 또는 효소에 대해 스크리닝하는데 메카니즘-기재 억제자의 적용이 없었다. 촉매 성분을 함유하는 샘플내 촉매 성분의 농도를 증가시키는 데도 메카니즘-기재 억제자의 적용이 없었다.
효소에 대한 연구는 활성 효소가 (마이크로미터 거리 스케일 상에서) 기질로써 덮힌 2차원 표면을 가로질러 "천천히 갈 수 있고", 한편 기질에 대해 동일한 결합 친화도를 갖는 불활성 효소는 그의 운동성이 크게 제한됨을 보여준다 (7, 8, 9). 그러나, 지금까지는, 촉매 항체 또는 그의 촉매 성분을 발현하는 성원에 대해 재조합 파지 또는 재조합 파지 감염된 세포 집단을 선택하거나 촉매 성분을 발현하는 성원의 농도를 증가시키기위해 원하는 촉매 반응의 기질을 포함하는 2차원 표면을 사용한 적이 없다. 촉매 성분을 함유하는 샘플내 촉매 성분의 농도를 증가시키거나 촉매 성분에 대해 선택하기위해 촉매 작용-가속화된 이동을 사용한 적이 없다.
고체-상의 고정된 항원에 결합하는 촉매의 운동성이 조사되었다 (10). 그러나, 비촉매 성분은 표면 결합에 기초하여 촉매 성분으로부터 분리되지 않았다. 예컨대, 재조합 파지 또는 재조합 파지 감염된 세포는 인큐베이션 시간에 무관하게 동일한 친화도로써 기질에 결합하는 비-촉매 항체를 발현하는 것들, 반면에 기질에 초기에 결합하나 일단 촉매 작용이 일어나면 해리하는 촉매 항체 또는 그의 촉매 성분을 발현하는 것들에 근거하여 스크리닝하거나 농축한 적이 없었다. 또한 촉매 성분을 함유하는 샘플에서 촉매 성분을 선택하는데 표면 결합을 사용한 적이 없었다.
게다가, 효소에 의한 결합 및 촉매 작용에 대한 온도의 효과가 조사된 한편(12), 지금까지는 촉매 성분을 선택하기 위해, 촉매 성분을 함유하는 샘플내 촉매 성분의 농도를 증가시키기 위해, 또는 촉매 성분을 발현하는 재조합 파지 또는 재조합 파지 감염 세포를 스크리닝하거나 농축시키기 위해, 온도의 함수로서 촉매 성분의 기질 결합 (비촉매 성분은 결합하지 않음)에서의 불연속성을 사용한 적이 없었다.
크로마토그래피 컬럼 상에서 분자의 보유력을 변화시키는 다양한 경쟁하는 용해성 리간드의 존재하에, 예컨대 고체 지지체에 공유 결합된 성분(17) 및 촉매 메카니즘(15)에 대해 비교적 약한 친화도를 갖는 리간드의 존재하에 "약한 친화도 크로마토그래피"의 원리가 조사된 한편, 지금까지는 비촉매로부터 촉매를 단리하거나 선택하기 위해 또는 촉매 농도를 증가시키기 위해 경쟁(competition)에 의한 촉매 결합에서의 변화를 사용한 적이 없었다.
고유하고 본질적으로 촉매 작용과 관련된 운동학 및 열역학 성질에 근거하여 촉매 성분을 선택할 수 있는 것이 바람직하다. 즉, 반응-기재 선택이 바람직하다. 또한 샘플내 촉매 성분의 농도를 증가시키고 이 증가된 농도를 촉매 성질을 이용하여 얻을 수 있는 것이 바람직하다. 즉 반응에 기초하여 촉매 성분의 농도를 증가시키는 것이 바람직하다. 더 나아가 촉매 성질에 근거하여 촉매 성분을 발현하는 재조합 비루스 또는 재조합 비루스 감염 세포 집단을 스크리닝하거나 농축하는 것이 바람직하다. 즉 상기 집단의 반응 기재 선택 또는 농축이 바람직하다.
앞서 언급된 바대로, 또한 항체를 발현하는 성원들에 대한 재조합 파지 집단 스크리닝 뿐만 아니라 (예컨대, 친화도 또는 합텐 결합에 의함), 촉매 항체 또는 그의 성분, 촉매 효소, 또는 보다 일반적으로 촉매 성분을 발현하는 성원들에 대한 상기 집단 스크리닝이 가능한 것이 바람직하다. 예컨대, 촉매 성질에 근거한 선택은 그렇게 하여 촉매 항체 또는 그의 성분을 발현하는 집단의 성원들을 사용하여 부가적 집단을 (항체 또는 그의 성분을 발현하지 않거나 그를 발현하더라도 촉매성이 아닌 성원으로 오염되는 일이 실질적으로 없이) 생산하거나, 원하는 반응을 (촉매 항체 또는 그의 성분을 발현하지 않는 성원에 의한 오염의 최소화 또는 그의 농도 감소로 인해 최적의 이동율을 갖도록) 촉매할 수 있는 것이 바람직하다. 사실, 재조합 파지 또는 반응을 촉매하는 재조합 파지 감염 세포의 생산물을 이용하려는 시나리오에서, 항체 또는 그의 성분을 발현하나 촉매적으로 활성 형태가 아닌 집단의 성원들을 반응 시스템에 해로우며, 이는 이들이 촉매 파지 또는 성분과 기질에 대해 경쟁할 수 있기 때문이다. 유사하게, 세포를 감염시키고 모노클로날 항체를 생산하는데 재조합 파지 집단의 사용에 관하여, 이 집단의 반응 기재 선택은 더 나아가 모노클로날 항체를 창출하기 위해 상기 집단을 더 작은 집단으로 달리 감소시키는데 수반되는 노동을 줄이는 것이 바람직하다. 따라서, 촉매 활성에 대한 재조합 파지 또는 재조합 파지 감염 세포 집단의 반응 기재 선택 또는 농축을 수행할 수 있는 것이 바람직하다.
[발명의 요약]
따라서, 본 발명은 촉매 활성을 갖는 성분에 대한 반응-기재 선택 및 상기 성분의 단리로 구성되는 촉매 성분 선택 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 촉매 활성을 갖는 성분에 대한 반응-기재 선택 및 상기 성분의 단리로 구성되는, 샘플내 촉매 성분의 농도를 증가시키는 방법을 제공한다. 선택은 메카니즘-기재 억제자, 촉매반응-가속화된 이동, 표면 결합, 온도의 함수로서 결합의 불연속성, 또는 경쟁에 의한 결합의 변화를 사용하는 방법에 의해 할 수 있다.
더 나아가 본 발명은 촉매 항체 또는 그의 촉매 성분과 같은 촉매 성분을 발현하는 제조합 비루스 또는 세포, 예컨대 제조합 비루스에 의해 감염된 세포를 선택하기 위한, 비루스 또는 세포의 샘플내 상기 비루스 또는 세포의 농도를 증가시키기 위한 방법을 제공하며 이는 촉매 성분을 발현하는 비루스 또는 세포를 포함한다고 추정되는 재조합 비루스 또는 세포의 집단의 촉매 활성에 대한 반응-기재 선택, 및 상기 집단으로부터 촉매로 작용할 수 없는 부집단의 단리로 구성된다.
유사하게, 본 발명은 촉매 항체 또는 그의 촉매 성분과 같은 촉매 성분을 발현할 수 있는 재조합 비루스 또는 세포계의 생산 방법을 제공하며, 이는 하기로 구성된다.
촉매 성분을 발현하는 비루스를 포함한다고 추정되는 재조합 비루스의 집단의 촉매 활성에 대한 반응-기재 선택을 하고, 상기 집단으로부터 촉매로 작용할 수 있는 부집단을 단리하고, 부집단의 비루스로써 재조합 비루스에 의해 감염되기 쉬운 숙주를 감염시킨다.
반응-기재 선택은 메카니즘-기재 억제자, 촉매반응-가속화된 이동, 표면 결합, 온도의 함수로서 결합의 불연속성, 또는 경쟁에 의한 결합의 변화를 사용하는 방법에 의해 할 수 있다. 이들 실시양태는 또한 반복을 고려한다. 원한다면, 예컨대 단리 단계 후에 반응 기재 선택을 반복할 수 있고 ; 이 반복은 동일한 기술에 의해(촉매 반응-가속화된 이동 반복과 같은), 또는 상이한 기술에 의해(예컨대, 반응-기재 선택을 통한 첫번째 통과중에 촉매 반응-가속화된 이동과 반응 기재 선택 단계를 통해 차후 반복되는 통과 중에 사용된 표면 결합, 메카니즘-기재 억제자, 온도의 함수로서 결합의 불연속성 또는 경쟁에 의한 결합 변화)에 의해 될 수 있다.
더 나아가 본 발명은 촉매 성분 (예컨대, 촉매 항체 또는 그의 촉매 성분)을 발현하는 재조합 비루스 또는 세포 감지를 위한, 또는 샘플내 상기 비루스 또는 세포의 농드를 증가시키기 위한 방법을 제공하며, 이는 하기로 구성된다 :
선택된 합텐에 결합하는 촉매 성분을 발현하는 비루스를 포함한다고 추정되는 비루스 또는 세포의 집단을 선택하고, 상기 집단으로부터 선택된 합텐에 결합할 수 있는 첫번째 부집단을 단리시키고, 촉매 활성에 대해 첫번째 부집단을 반응-기재 선택하고, 첫번째 부집단으로부터 촉매로 작용할 수 있는 두번째 부집단을 단리시킨다.
유사하게, 본 발명은 하기로 구성되는, 촉매 성분을 발현할 수 있는 재조합 비루스 또는 세포계의 생산 방법을 제공한다.
선택된 합텐에 결합하는 촉매 성분을 발현하는 비루스를 포함한다고 추정되는 재조합 비루스의 집단을 선택하고, 상기 집단으로부터 선택된 합텐에 결합할 수 있는 첫번째 부집단을 단리시키고, 촉매 활성에 대해 첫번째 부집단을 반응-기재 선택하고, 첫번째 부집단으로부터 촉매로 반응할 수 있는 두번째 부집단을 단리하고, 재조합 비루스에 의해 감염되기 쉬운 비루스를 두번째 부집단의 비루스로써 감염시킨다.
선택된 합텐에로의 결합에 대한 선택법은 고정된 합텐의 친화컬럼 상에 상기 집단을 통과시키는 것이다. 이에 관하여 첫번째 부집단의 단리는 친화 컬럼에 결합한 집단의 성분을 용출시키는 것이다.
촉매 활성에 대한 선택은 메카니즘-기제 억제자를 사용함으로써 할 수 있다 ; 예컨대, 선택법은 반응 혼합물을 형성하기 위해 첫번째 부집단을 메카니즘-기재 억제자와 접촉시키는 것으로 구성될 수 있다. 그리고, 두번째 부집단의 단리는 합텐 친화 컬럼 상에 반응 혼합물을 통과시키고 고정된 합텐에 결합하지 않은 비루스나 세포를 수집하는 것으로 구성될 수 있다. 또한 첫번째 부집단과 메카니즘-기재 억제자의 접촉은 첫번째 부집단을 입자에 결합된 억제자와 접촉시킴으로써, 예컨대 억제자가 절단가능한 기에 의해 결합된 컬럼상에 첫번째 부집단을 통과시킴으로써 수행할 수 있고 ; 두번째 부집단의 단리는 컬럼으로부터 억제자-비루스 (또는 세포) 복합체를 절단시키거나 억제자-비루스 (또는 세포)입자 복합체를 분리시키는 것으로 구성될 수 있다.
대안적으로, 촉매 활성에 대한 선택은 촉매 반응-가속화된 이동을 사용함으로써 할 수 있고 ; 예컨대, 선택은 첫번째 부집단을 촉매 반응의 원하는 지지체를 포함하는 표면과 접촉시키고, 이때 표면 상의 첫번째 지점에서 접촉하며, 촉매 활성을 갖는 첫번째 부집단의 성원이 표면 상의 두번째 지점에로 거리를 이동하기에 충분한 시간 후에, 두번째 지점에서 첫번째 부집단의 성원들을 감지하는 것으로 구성된다. 이 대안에서, 두번째 집단의 분리는 표면 상의 두번째 지점으로부터 첫번째 부집단의 성원을 수집하는 것으로 구성될 수 있다.
부가적으로 대안 실시양태에서, 촉매 활성에 대한 선택은 표면 결합에 의해 할 수 있고 ; 예컨대, 선택은 촉매 활성을 갖는 첫번째 부집단의 성원이 결합하고 촉매 활성을 갖는 첫번째 부집단의 성원이 결합하는 촉매 반응의 원하는 기질을 포함하는 표면과 첫번째 부집단을 접촉시키고, 촉매 활성을 갖지 않는 첫번째 부집단의 성원이 표면과 접촉하여 평행에 도달하기에 충분한 시간이나 촉매 활성을 갖는 첫번째 부집단의 성원이 상기 기질을 소비하기 전의 시간 후에, 표면을 세척하여 그로부터 촉매 활성을 갖는 첫번째 부집단의 성원을 제거하는 것으로 구성되고 ; 그다음 두번째 부집단의 단리는 세척물을 수집하는 것으로 구성될 수 있다. 상기 대안 실시양태에서, 촉매 활성에 대한 선택은 더나아가, 첫번째 집단을 표면과 접촉시킨 후에, 표면을 세척하여 그로부터 촉매 활성을 갖는 첫번째 부집단의 성원을 제거하기 전에 그리고 촉매 활성을 갖지 않는 첫번째 부집단의 성원과 촉매 활성을 갖는 첫번째 부집단의 성원 둘다에 대한 접촉으로부터 기질에 결합하기에는 충분한 시간이지만 촉매 활성을 갖는 상기 첫번째 부집단의 성원에 대한 접촉으로부터 기질을 소비하거나 촉매 반응을 완료하기 전의 시간 후에 기질에 대해 적은 친화도를 갖거나 친화도를 갖지 않는 상기 첫번째 부집단의 성원을 제거하기 위해 표면을 세척하는 것으로 구성될 수 있다.
부가적인 대안 실시양태에서 반응-기재 선택은 온도의 함수로서 결합의 엔탈피 성분을 변화시켜 할 수 있다. 예컨대, 선택은 첫 번째 온도에서 첫번째 부집단을 기질과 접촉시키고, 두번째 온도에서 첫번째 부집단을 기질과 접촉시키는 것으로 구성될 수 있으며, 이 때 상기 두번째 온도가 첫번째 온도보다 높고, 이후에 두번째 부집단의 단리는 겉보기 결합에 대한 온도의 효과가 상이하게 나타나는 첫번째 부집단의 성원들을 수집하는 것으로 구성된다. 이 실시양태에서, 기질을 예컨대 컬럼 상에 고정시킬 수 있고, 느슨하게 결합하거나 먼저 용출되는 첫번째 부집단의 성원과 첫번째 온도에서 단단히 결합하거나 나중에 용출되는 것들을 분획으로 수집한다. 그다음 두번째 온도에서 접촉시킨 후에 수집된 분획을 첫번째 부집단의 성원의 상대 농도에 대해 분석한다. 겉보기 결합에 대한 온도의 효과가 상이하므로 최저 농도를 갖는 분획은 최대 촉매 활성을 갖는 첫번째 부집단의 성원을 함유한다. 첫번째 온또는 결합이 일어나나 촉매 반응은 일어나지 않는 정도로 낮은 것이 바람직한다.
또 다른 대안 실시양태에서, 촉매 활성의 선택은 경쟁에 의한 결합 변화에 의할 수 있다. 예컨대, 선택은 운동성 비-반응성 기질 동족체의 존재하에 첫번째 부집단을 고정된 비-반응성 기질 동촉체와 접촉시키고 그로부터 고정된 동족체에 결합한 샘플 또는 샘플들을 수집하고 ; 기질의 존재하에 샘플 또는 샘플들을 고정된 동족체와 접촉시키고, 그로부터 대부분의 성원과 다른 겉보기 결합을 나타내는 첫번째 부집단의 성원들을 수집하는 것으로 구성될 수 있다. 예컨대, 고정된 동족체가 친화도 컬럼 크로마토그래피 상에 고정된 비-반응성 기질 동족체 라면, 샘플 또는 샘플들이 기질의 존재하에 고정된 컬럼과 접촉할 때, 대부분의 성원과 다른 겉보기 결합을 나타내는 첫번째 부집단의 성원들은 주 피이크보다 나중에 또는 빨리 용출되는 분획(들)이다.
다시 본 발명의 방법이 다음 단계로 가기 전에 임의 한 단계의 반복을 포괄함을 언급한다. 예컨대, 초기 집단을 선택된 합텐에 대한 결합으로 선택할 수 있고 결합한 것들을 분리할 수 있고 다시 분리된 성분을 합텐에 대한 결합을 선택한 다음 이 두번째 통과 단계에서 결합한 것들을 분리하고 반응-기재 선택 단계에 사용한다. 마찬가지로, 초기 "첫번째 부집단"을 촉매 활성에 대한 반응-기재 선택에 적용할 수 있고, 그로부터 촉매로 작용할 수 있는 두번째 부집단을 단리하고, 다시 이 두번째 부집단을 반응-기재 선택에 적용할 수 있고, 두번째 부집단을 단계-기재 선택 단계에 두번째 통과시켜, 두번째 "두번째 부집단"을 단리할 수 있다. 단계를 반복하여 더욱 더 이 과정의 생산물의 촉매 활성 (발현)을 풍부하게 하고 증가시킬 수 있다. 반응-기재 선택의 두번째 통과는 첫번째 통과와 동일한 절차에 의하거나 본 발명의 임의 다른 실시양태에 의할 수 있다. 게다가, 본 발명은 상기 서술된 부가적 대안을 제공한다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 본 발명 방법에 의해 생산된 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분과 같은 촉매 성분을 발현할 수 있는 재조합 비루스 또는 세포 집단을 제공한다. 상기 집단은 상기 방법이 촉매로 작용하지 않는 비루스, 세포 또는 성분, 또는 합텐에 결합하지 않는 것들 뿐만 아니라 촉매적으로 작용하지 않는 것들을 완전히는 아니지만 대부분 제거하는 한에 있어서 실질적으로 순수하다. 게다가, 본 발명은 상기 본 발명 방법에 의해 제조된 촉매 조성물을 제공한다. 상기 촉매 조성물은 상기 언급된 비루스 또는 세포 집단, 뿐만 아니라 기타 촉매 성분을 포함하고, 상기 조성물은 마찬가지로 상기 본 발명 방법이 비-촉매 성분, 또는 합텐에 결합하지 않는 것들 뿐만 아니라 비-촉매인 것들을 완전히는 아니지만 대부분 제거하기 때문에 실질적으로 순수하다. 본 발명에서 비루스는 M13 파지 또는 fd 파지와 같은 파지일 수 있고, 따라서 숙주는 이. 콜라이 같은 세균일 수 있다.
[도면의 간단한 설명]
하기 상세한 설명에서, 첨부된 도면을 참고하며, 도면은 본원에 참고로 병합되고 본 발명의 예시를 도우나 본 발명은 반드시 제한하는 것은 아니다, 이때 : 제1 및 2또는 2차원 분리 분포이며 첫번째 차원 용출 분포(부피)는 수직으로 비-반응성 동족체가 묘사되고 두번째 차원 용출(부피) 분포는 수평으로 기질이 묘사되며, 촉매를 함유하는 분획을 표시하도록 주 피이크 뒤나 앞에 작은 별표 피이크는 용출을 표시하고 이 분획은 그 다음에 풍부하게 할 수 있다.
[발명의 상세한 설명]
당 기술자는 이미 항체(또는 그의 부분) 발현을 위한 코드를 증폭하고 비루스 게놈 내로 삽입하여(1, 2, 3, 4, 11) 촉매 성분을 발현할 수 있는 성원이라고 추정되는 비루스 집단을 얻는 기술을 알고 있다고 가정하며 ; 당 기술자는 상기 재조합 배루스를 사용하여 이. 콜라이와 같은 숙주 세포를 감염시킬 수 있고 재조합 비루스가 촉매 성분을 발현하는 세포 및 그의 자손을 갖는 숙주 염색체에서 용원 주기가 개시될 때까지 프로비루스 또는 프로파지로서 존재할 수 있음을 알고 있다고 가정한다. 또한 당 기술자는 이미 촉매 부분을 함유하는 샘플을 얻기 위한 적절한 기술을 알고 있다고 가정한다. 따라서, 다음의 설명은 촉매 성분, 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분을 발현할 수 있는 비루스 또는 세포를 포함한다고 추정되는 재조합 비루스의 집단 또는 세포의 집단으로부터 ; 또는 그 안에 촉매 성분의 존재 여부를 측정하거나, 선택하거나 농축한 샘플로부터 출발한다.
본원에 사용된 바의 "촉매 항체" 및 "그의 촉매 부분"이란 화학 반응 속도를 변화시킬 수 있는 물질이며, 다른 모든 조건(예컨대, 온도, 반응물/기질 농도, 등)은 동일하고 화학 반응에 의해 비가역적으로 변하지 않으므로 반응시에 소모되지 않는다. 또한 이는 촉매 항체 몰당 다수 몰의 반응물/기질을 전화시키는 능력을 나타내고 ; 대사관점으로부터 반응물/기질을 결합시키고, 생성물에로 반응물/기질의 전환을 가속시킨 다음 생성물을 방출하고 ; 평형의 위치를 이동시키지 않고 화학 반응 속도를 변화시키는 기질이다. 상기 언급된 정의가 이상 촉매의 특성인 한편, 실질적으로, 심지어 최상의 촉매도 반응 시스템에서의 오염에 의하거나 반응 과정 중에 화학적 또는 물리적 파괴의 결과로서 억제되거나 실활화된다. 당업계에 잘 알려진 이유로, 촉매의 실제 작동은 반응 시스템의 구성분에 의하거나 반응 환경의 조건에 의해 명료하지 않을 수 있다.
게다가, 용어 "촉매 성분"이란 촉매로 작용하는 임의 성분에 대해 사용되고, 이 표현은 제한없이 "촉매 항채" ; "그의 촉매 부분" (촉매 항체의) ; 촉매 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 효소 또는 그의 촉매 부분 ; 자기-복재 시스템에 의해 발현된 촉매 분자 ; 유전자 코드에 촉매 분자 또는 그의 발현물을 함유하고 자체 복제될 수 있거나 촉매 분자가 부착되는, 예컨대 그상의 단백질 형성 작용에 의해 드러낸 mRNA, 리보솜 또는 폴리솜과 같이 반드시 자체-복제성이지는 않을 수 있는 것 전체 등을 포함한다.
용어 "표면-결합"이란 본원에서 예컨대 표면에 대한 물리적 인력 또는 화학적 결합에 의해 결합된 임의 부분에 대해 사용한다. 본원에 사용된 바의, 촉매 성분은 촉매 성분을 코딩하는 DNA 또는 RNA에 직접, 또는 촉매 성분을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 둘러싼 밀폐물에 표면-결합되는 것이 바람직하다. 이런 밀폐물은 세포막, 비루스 코우트, 또는 세포 벽을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 기술은 촉매 활성을 발현하는 특정 작업 정의들을 채택했다. 이들 표현은 다음을 포함한다 : (1) k 촉매, 또는 "전환(turnover" 수" ; (2) k촉매/k비촉매, "속도증진 인자" 및 (3) Km', "미카엘리스 상수". 전환수란 단위 시간 당 촉매 항체의 몰당 생성물로 전환될 수 있는 반응물/기질의 몰수를 나타낸다. 예컨대, 어떤 분자가 분당 기질 103의 전환을 나타내고 분자가 실온에서 그리고 그의 최적 pH에서 24시간동안 촉매 활성을 유지한다면, 촉매의 각 분자는 총 1.4×106전환을 이룰 것이며, 이는 분자의 촉매 행동을 의미한다. 상기 총 전환은 화학양론적 반응에서의 총 전환과 구별되며, 화학양론 반응은 반응이 얼마나 오랫동안 수행되던 간에 결코 1.0를 넘지 않는다. 속도 증진 인자란 촉매 존재하의 반응 속도 대 촉매 부재 하의 반응 속도를 나타내는 무차원 수이며, 모든 기타 반응 조건은 동일하다. 미카엘리스 상수란 겉보기 결합 상수이다. 이는 반응 속도가 최대치의 1/2일 때의 기질 농도와 동일하다([S]=k촉매에서의 Km/2).
본 발명에 따라, 항체는 정제 면역글로불린(IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE) 또는 항체 단편, 예컨대 면역글로불린의 Fab, F(ab')2, Fv등으로 구성될 수 있다. 촉매 항체는 특정 주요 종류를 포함한다. 제 1 범주는 이론적으로 고안된 항체, 즉 표적 항원 또는 기질에 대한 특이적 면역화에 의해 도입된 항원으로써 유발된 항체를 포함한다. 상기 촉매 항체, 그의 제조 방법 및 그의 용또는 1989년 12월 19일자로 특허 허여된 미국 특허 4,888,281, 1988년 12월 20일자로 특허 허여된 미국 특허 4,792,446, 및 1987년 6월 19일자로 출원된 미국 출원 일련 번호 064,239, 및 1991년 12월 10자로 출원된 805, 576에 서술되어 있고 ; 이들의 모든 명세서는 참고로 본원에 병합된다. 촉매 항체의 제 2 범주는 앞서 서술된 촉매 항체의 제 1 범주에 반하여, 동물 자체의 세포 성분(자기-항원)에 대한 동물의 면역 체계에 의해 생산된 자연 발생 항체를 포함한다. 이들 "자동 항체(autoantibodies)"는 1989년 4월 25일자로 출원된 미국 출원 일련 번호 343,081에 서술되어 있고, 이것의 명세서는 본원에 참고로 병합된다. 상기 두 유형의 촉매 항체를 코딩하거나 그의 촉매 단편을 코딩하는 DNA 는 증폭시킬 수 있고 비루스 게놈내로 삽입시킬 수 있다(참조 1, 2, 3, 4). 제 3 범주는 면역화를 수반하지 않는 방법에 의해 발생된 촉매 항체를 포함한다. 예컨대, 촉매 항체는 앞서 유발된 항체의 가변 영역을 랜덤화하여 새로운 특이성을 갖는 항체를 발생함으로써 생산할 수 있으나, 면역화로부터 유발되지 않았다.
용어 "화학 반응"이란 적어도 하나의 반응물이 적어도 하나의 생성물로 전환되는 반응을 말한다. 상기 화학 반응은 예컨대 산화환원 효소, 전사효소, 가수분해효소, 리아제, 아이소머라제 및 리가제와 같은 효소에 의해 촉매될 수 있는 화학 반응 뿐만 아니라 예컨대 산화, 환원, 첨가, 축합, 제거, 치환, 절단 및 재배열과 같은 효소가 공지되지 않은 화학 반응을 포함한다. 또한 화학 반응은 펩티드 결합의 절단일 수 있다. 본원에서 사용된 펩티드 결합은 두개의 인접한 아미노산 잔기를 연결하는 아미드 결합을 말하고 일반적으로 하기 식으로 표현되는데, 이때 펩티드 결합은 다음 상자 안에 도시된다.
아미노 산은 아미노기에 결합된 탄소 원자, 카르복실기, 수소 원자 및 "측쇄(상기 식에서 Ra및 Rb)로 불리는 독특한 기로 구성된다. 본원에 사용된 바의 아미노 산은 단백질의 형성 블럭을 구성하는 20개의 자연 발생 아미노산을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 당업자에게 인접한 아미노 산 중 하나가 프롤린이고, 대표 측쇄 Ra또는 Rb가 인접 질소 원자에 결합하여 특징적인 5-개 성원의 프롤린 고리를 형성함은 당연하다.
용어 "기질"이란 화학 반응에서 반응물과 동의어이며 에스테르, 펩티드, 단백질, 인지질, 탄수화물(예컨대, 글리코겐, 포도당 등) 및 약제(오용된 물질 및 외인원으로부터의 약제 및 전약제 포함)를 포함하나 이에 제한되지 않는 분자 및 이분자 다수 중 임의 것 일 수 있다. 이에 대해 1991년 8월 5일 출원된 동시 계류 중인 출원 일련 번호 07/740,501, 및 1991년 10월 10일 출원된 07/773,042를 참고로 하며 이들은 본원에 참고로 병합된다. 예컨대, 기질은 에스테르 결합 또는 결합들, 펩티드 결합 또는 결합들을 함유할 수 있다. 기질은 또한 임의 단백질성 분자, 예컨대 조절 단백질 또는 구조 단백질일 수 있으며, 이는 펩티드 호르몬(예컨대, 인슐린, 성장 호르몬, 세크레틴 등), 펩티드 신경송신기, 신경변조기 및 신경호르몬 인자(예컨대, VIP, 엔돌핀, 엔케프린, 브라디키닌, 물질 P 등), 암 단백질(예컨대, 종양원 생산물, 암배 항원 등), 중심절과 코우트 단백질(예컨대, 사람 면역결함 비루스(HIV) gp120 인플루엔자 당단백질 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 세균 단백질 및 비루스 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한 기질은 항원 또는 자체-항원, 즉 동물체가 자신의 유전자 코드를 사용하여 만든 임의의 항원일 수 있다. 따라서, 자체-항원은 외래 항원(예컨대, 세균, 비루스 항원)과 구별된다. 본원에 사용된 바의 용어 "동물"이란 면역체계를 갖는 임의 생물체를 말하며 포유 동물 및 비-포유 동물을 말한다.
[1. 메카니즘-기재 억제 선택]
[A. 방법의 개괄]
본 발명의 본 실시 양태의 일반 개관에서 잠재적으로 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분을 갖는 비루스 또는 세포 집단, 또는 촉매 성분을 함유하는 샘플은 바람직하게 :
1. 고정된 합텐의 친화 컬럼을 통과한다. 결합한 것들은 예컨데 pH 변화에 의해 또는 컬럼 상에 자유 합텐을 통과시켜 용출시킨다. 이들 결합 선택은 임의적이다.
2. a. 접촉하여 예컨대 혼합되고 적절히 고안된 메카니즘-기재 억제자와 반응하여 혼합물을 형성하는 합텐 친화도 컬럼에 결합시켜 찾은 비루스, 세포 또는 촉매 성분이다.
2. b. 대안적으로, 메카니즘-기재 억제자를 컬럼과 같은 입자에 바람직하게 절단가능한 기로써 결합시킬 수 있다. 비루스, 세포 또는 촉매 성분을 컬럼을 통과하고, 결합된 것들은 부가적 용도(예컨대, 감염)를 위해 컬럼으로부터 억제자를 절단시키거나 적당한 액체, 예컨대 산성 용액을 컬럼 상에 통과시킴으로써 용출시켜 비루스 또는 세포의 외피를 용해시키고 그로부터 DNA를 용출시키고, 그 후에 DNA를 사용하여 숙주 세포를 트랜스펙션시키거나 재조합 세포 또는 비루스를 생산한다.
3. 본 실시양태의 대안적인 2.a. 시나리오에서, 적당한 시간 후에, 비루스, 세포 또는 촉매 성분의 혼합물을 합텐 친화 컬럼 상에서 크로마토그래피시키거나 재크로마토그래피시킨다. 이는 흘러나가는(합텐에 결합하지 않고) 비루스, 세포 또는 촉매 부분이 수집되는 시간이다. 이들 비루스 또는 세포를 사용하여 이. 콜라이와 같은 적당한 숙주를 감염시키거나 용원 주기를 수행하도록 유도시키고 그로부터 숙주 감염 또는 용원으로부터 초래된 비루스를 촉매 용도 또는 촉매 반응을 위한 부가적 선택을 위해 늘린다.
이 실시양태는 보다 상세하게 다음과 같다.
[B. 합텐 친화도 크로마토그래피]
바람직한 실시양태에서, 메카니즘-기재 불활성화에 의한 촉매 선택에 앞서, 항체 발현 비루스 또는 비루스 성분을 예컨대 합텐 친화도 크로마토그래피에 의해 예비선택한다. 그러나, 촉매 선택을 합텐 결합에 의한 첫번째 예비-선택없이도 수행할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 합텐에 결합하는 이들 비루스, 파지, 세포 또는 성분(〉6000)을 메카니즘-기재 억제자와 반응시킬 수 있다. 고정된 합텐을 사용하여 항체를 갖는 비루스의 친화도 크로마토그래피는 문헌에서 성공적으로 수행했다(2, 3, 4). 현 발명에서, 촉매 선택의 첫번째 단계는 합텐 친화 크로마토그래피같은 결합을 사용하는 것이 바람직하다. 예컨대, 하기 에스테르 기질(II)의 가수분해를 원한다면 바람직하게 하기 합텐(I)를 사용할 수 있다.
텐(I)에 있어, R은 면역화 도중에 단백질을 접합시키는 링커이고(예컨대, KLH 또는 BSA) 친화 크로마토그래피 중에 컬럼과 같은 고형 매트릭스에 대한 링커이고 기질(II)에 있어, R1은 -H 또는 -NO2이다.
마찬가지로, 하기 에스테르(IIA) 및 (IIB)의 가수분해에 있어, 바람직하게 하기 합텐(IA) 및 (IB)를 사용할 수 있다.
이들 구조에 있어, Me=메틸기이고 ; 이들 화합물의 생산과 용도를 서술하며 본원에 참고로 병합되고 1991년 10월 10일 출원된 동시계류중인 출원 일련 번호 07/773,042/를 참고한다.
합텐에 결합하는 비루스, 세포 또는 성분은 pH 변화 또는 자유 합텐에 의해 용출되고(이어서 투석에 의해 결합된 합텐을 제거하고) 그 다음 단계 ; 즉 메카니즘-기재 반응물(들)에 노출시킨다.
[C. 메카니즘-기재 억제자와의 반응]
이 단계에서 합텐에 결합한 단리된 부집단을 적당한 메카니즘-기재 억제자(친화 라벨 또는 자기불활화 기질)와 접촉시킨다. 적절한 메카니즘-기재 억제자는 촉매적으로 활성인 항체 또는 그의 부분, 예컨대 비루스, 파지, 또는 세포의 외부 표면 상에 발현된 촉매 성분과 비가역적 부가물을 형성하는 반면, 상기 억제자는 항체 또는 그의 부분을 발현하나 촉매성이 아닌 비루스 또는 세포와 비가역적 부가물을 형성하지 않는다. 합텐 I, IA, 또는 IB와의 면역화로부터 유발된다고 예측되는 에스테르-가수분해 항체의 메카니즘-기재 억제자가 하기에 서술된다. 에스테르 가수분해 외의 반응을 불활성화하고 기타 반응을 촉매할 수 있는 촉매 항체와 같은 촉매 성분을 선택하는데 사용될 수 있는 기타 메카니즘-기재 억제자도 널리 공지되어 있다. 메카니즘-기재 억제자가 존재하는 촉매 반응은 합성 효소, 펩티다제, 산화/환원,-락타마제, 탈카르복실화, 아미노전이효소, 리아제, 라세마제, 및 히드록시라제 반응을 포함한다(5). 당업자는 이들 및 기타 반응에 있어 유사한 억제자의 고안과 사용을 수행할 수 있다.
예컨대, 상기 언급된 에스테르 분해에 관련하여 하기 구조식은 메카니즘-기재 억제자이다 :
(f) 에스테르 기질(II)의 가수 분해 :
이때, Rs는 컬럼에 충진되거나 유체(이동성에 현탁될 수 있는 입자에 대한 결합물이고 X는 Br, I, OSO2CH3등과 같은 이탈기이다. 물론 억제자가 운동성 형태로 사용된다면 결합물이 존재할 필요가 없다.
따라서, 기질 II와의 반응 조건하에 접촉된 합텐(I)(또는 상기 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분을 생산하는 파지 또는 세포등)에 의해 유발된 촉매 항체의 경우에 다음의 일이 일어난다.
즉, 복합체는 기질과 촉매 부분, 예컨대 촉매 항체 사이에 형성하는데, 이는 생성물(i) 및 (ii) 및 촉매의 재발생을 초래한다.
그러나, (XI)에 대한 억제자(III)의 경우에, 억제자의 반응은 합텐(I)에 의해 유발된 촉매 항체와 반응 조건하에 접촉될 때 일어나는 한편, 그의 일부는 촉매에 결합될 때 일어나는 한편, 그의 일부는 촉매에 결합된 채로 남고, 이로써 부가적 촉매 반응에서 그것이 종사하게 되는 것을 막고(재발생을 막고) 따라서 본 발명에 따라, 하기 표 I 에 제시된 바대로 단리할 수 있다.
(ii) 에스테르 기질(IIA)의 가수 분해 : 마찬가지로, 5-플루오로리딘 에스테라제 반응, 즉 반응 조건하에 화합물(IIA) 또는 (IIB)를 적절한 촉매와 접촉시켜 5-플루오로리딘을 산출하는 화합물(IIA) 또는 (IIB)의 가수분해(예컨대, 합텐(IA) 또는 (IB)에 의해 유발된 촉매 항체, 또는 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분을 발현하는 파지 또는 세포)에 있어서, 다음의 표 II는 촉매의 억제자 ; 촉매에 결합된 채로 있는 억제자의 부분(반응 생성물)을 제공하고 ; X 및 R 는 상기 정의된 바와 같다.
상기 에스테르 분해 반응에서 일반적으로 조건은 다음과 같다 : pH 6.0 내지 8.0, 전형적으로 7.0, 10 내지 100, 예컨대 30 내지 70, 전형적으로 50mM Hepes, 100 내지 300, 예컨대 100 내지 200, 전형적으로 150mM Nacl, 온도 20℃ 내지 40℃, 보통 30℃, 및 0.5 내지 3시간.
[D. 친화도 분류에 의한 비루스 또는 성분의 분리]
인큐베이션 후에, 항체 또는 그의 일부를 함유하고 촉매성인, 즉 메카니즘-기재 억제자와 반응하는 비루스 또는 세포는 더 이상 합텐에 반응하지 않으나 ; 반응물과 반응하지 않은 항체를 함유하는 파지 또는 세포는 합텐에 계속 결합할 것이다. 따라서, 비-촉매성 비루스 또는 세포로부터의 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분을 나타내는 비루스 또는 세포의 분리는 2회의 합텐 친화 크로마토그래피에 의해 확실히 수행할 수 있다. 이는 상기 서술된 바대로 수행되고 미반응 메카니즘-기재 억제자로부터 비루스 또는 세포의 분리가 필요치 않다. 촉매 항체 파지 또는 세포는 컬럼에 결합하지 않으나 비-촉매성 파지는 결합한다. 따라서, 결합되지 않고 컬럼을 통과하는 비루스 또는 세포는 촉매 항체 또는 그의 부분을 발현하는 파지이다. 이들 비루스를 사용하여 적당한 숙주를 감염시킨다 ; 예컨대 비루스가 M13, fd 또는 람다와 같은 파지라면, 이. 콜라이가 적합한 숙주이다. 감염 후에, 비루스 DNA 벡터내에 코딩된 항체를 차후 이용이나 특성화를 위해 증가시킨다. 특히, 상기 파지들로써 이. 콜라이를 그렇게 감염시킴으로써, 이. 콜라이는 촉매 항체 또는 그의 부분을 발현하는 파지 생산을 위한 : 또는 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분의 발현을 위한 제조소가 될 수 있다. 감염된 이. 콜라이의 비루스 생산물 또는 발현물을 예컨대 에스테르 가수분해에 또는 촉매적으로 대부분 활성인 비루스(파지) 및 숙주(예컨대, 이. 콜라이) 라인을 생산하기 의해 본원에 서술된 바의 부가적 선택시에 촉매적으로 사용된다. 유사하게, 세포를 촉매적으로 스크리닝하여 용출된 것들을 수집한다면 이 세포를 사용하여 촉매 생산물을 발현시키고, 또는, 세포가 비루스 감염으로 인해 촉매 생산물을 발현한다면, (비루스는 폴리오비루스 또는 프로파지이다), 또한 세포는 용해 주기를 수행하도록 유발될 수 있다.
대안적으로, 억제자는 입자에 결합될 수 있다. 넓은 의미로, 컬럼은 입자들의 표본이나, 충진된다(고정된다). 바람직하게 억제자는 억제자와의 반응이 비루스, 세포 또는 촉매성분과 접촉시킴으로서, 예컨대 그들을 컬럼 상에 통과시켜 수행되는 방식으로 절단가능한 기를 통해 입자에 결합된다. 컬럼의 사용시에, 비-촉매는 용출하는 한편 촉매는 결합하고 ; 촉매는 컬럼으로부터 억제자-촉매 복합체를 절단하거나 그렇지 않으면 억제자로부터 해리시켜 ; 예컨대, 비루스, 파지 또는 세포의 경우에 컬럼 상에 적당한 액체 예컨대 산을 통과시키고 부가적 용도(트랜스펙션, 재조합)를 위해 그로부터 DNA를 용출시켜 분리한다.
특히, 특수-고안된 메카니즘-기재 억제자로써 선택된, 촉매파지, 비루스, 세포 또는 성분은 억제자가 컬럼과 같은 고체 매트릭스에 고정된다면 친화 크로마토그래피를 사용하여 비촉매로부터 분리될 수 있다. 바람직한 실시양태에서 촉매가 고정 억제자와 반응한 후에 촉매를 회수할 수 있는 것이 바람직하다. 이를 성취하기 위해, 촉매를 용이하게 절단되거나 컬럼 매트릭스로부터 해리되어 촉매의 회수를 허용할 수 있는 분자나 분자들(절단가능한 기 또는 결합)을 경유하여 부착할 수 있다. 절단가능한 기는 억제자를 비공유 결합 또는 공유 결합으로 컬럼 매트릭스에 결합시킬 수 있다.
실제적으로, 적절한 완충액내 파지, 비루스, 세포 또는 성분의 현탁액을 적당한 억제자가 절단가능한 기에 의해 고정되어 있는 컬럼 상에 용출시킨다. 실험 절차는 하기 도식에 묘사되며 좌측은 공유 절단가능한 기의 실례이고 우측은 비공유 해리가능한 결합의 실례이다. 촉매는 억제자와 반응할 수 있고 억제자에 의해 컬럼(지지체)에 공유 결합 할 수 있는 한편(좌측과 우측 모두의 가운데 그림) 이들 실재물은 컬럼(도식에 도시되지 않음)을 통한 억제자 세척물과 반응할 수 없다. 그 다음 컬럼을 초기 용출 완충액의 대략 5배 컬럼 부피로 세척한다.
촉매와 억제자 사이의 반응을 최적화하는 완충액을 선택한다. 완충액 세척에 이어, 용출 조건을 절단가능한 기의 절단(도식의 좌측 하단) 또는 해리(도식의 우측 하단)을 야기하여 억제자와 반응한 실재물(촉매)을 확인할 수 있도록 변화시킨다.
비공유 상호작용은 억제자를 고체 매트릭스에 부착시키는 유용한 방법을 제공한다. 억제자는 해리가능한 비공유 방식으로 컬럼과 상호작용할 수 있는 리간드에 공유 결합된다. 컬럼은 억제자와 결합된 리간드와 특이적이고 단단하게 상호작용하는 부분을 나타내도록 변형된 세파로스 6B와 같은 기준 고체 매트릭스이다(효소 억제자의 컬럼 상에 고정하는 것이 일반 실례이다. 억제자는 그의 상응하는 효소에 가역적으로 및 비공유 결합하며 효소의 표면은 자기불활화 기질인 분자를 하나 이상 나타내도록 공유 변형 된다). 변형된 컬럼과 리간드 사이의 상호작용은 실험자가 용출 용매 시스템의 내용물을 변화시켜 상호작용을 방해할 때까지 고 친화성이다(21, 22). 리간드를 용출하는 용매 시스템에서 일어난 변화의 특성은 분자의 비공유 상호작용 쌍의 선택에 좌우되고 기술자는 부당한 실험없이 판단할 수 있다. 용출 조건의 변화 예는 하기 것들을 포함한다 : 리간드 경쟁, 알로스테릭 변형, 기질 용출, 억제자 용출, 이온 강도 변화, 유기 용매 또는 수성/유기 혼합물로의 용매 변화, 온도 변화, 완충액 또는 pH 변화, 금속 용출, 금속 착염 용출, 차오트로픽((chaotropic) 시약, 또는 전기 영동 탈착(23). 억제자를 고체 지지체에 비공유(그러나 단단히) 결합시키기 위해 사용할 수 있는 상호작용의 특정예는 하기 표 III 에 기재되어 있다. 또한 본원에 참고 문헌 24 ; 25, 26 ; 27 로 병합된 피어스, 아미콘, 시그마 케미칼사 카타로그 참조.
카르보디이미드 커플링 및 합텐을 키호올 림펫 헤모시아닌 또는 소 혈청 알부민에 커플링시키는 면역학에 사용되는 기타 방법들과 같은 표준 방법에 의해 억제자를 우측 컬럼에 기재된 분자에 결합시킬 수 있다.
상기 서술된 바대로 비공유 복합체를 해리시키는데 필요한 용출 조건은 선택된 분자쌍에 따라 좌우될 것이다. 용출제의 몇몇 특정 실례는 하기 표 Ⅳ에 기재되어 있다(또한 21 참조).
비공유의 절단가능한 상호작용에 대한 대안으로, 절단가능한 기를 컬럼과 억제자 둘 다를 공유 결합시킬 수 있다. 공유의 절단가능한 기가 분열될 수 있는 한 방법은 그것을 효소 기질로 만드는 것이다. 그 다음 컬럼을 통하여 적절한 효소를 통과시켜 촉매 작용으로 기를 절단하고 억제자와 결합된 촉매를 방출함으로써 기를 절단할 수 있다. 효소 절단의 아마도 가장 다 방면의 실례는 단백질 분해효소의 사용일 것이다.
억제자 및 컬럼 매트릭스를 둘 다 단백질 기질에 커플링시켜 컬럼 -- 단백질 분해효소 기질 -- 억제자 결합을 초래할 수 있으며, 여기서 --는 공유 결합을 의미한다. 이 결합을 적당한 단백질 분해효소에 노출시키면 단백질 분해 효소 기질을 가수분해시켜 컬럼으로부터 억제자를 방출시키고 부착된 촉매를 회수한다. 컬럼에 그리고 억제자에 단배질 분해 효소 기질을 부착하기 위한 커플링 절차는 구입가능한 시약을 사용하여 잘 이루어진다(예컨대, 피어스 케미칼사 카타로그 참조).
펩이드 공유 결합된 절단가능한 기의 특정예 및 그를 절단하는데 사용할 수 있는 효소들이 하기 표 Ⅴ 에 제시되어 있다. 기재된 모든 단백질 분해 효소와 기질은 정제 형태로 구입가능하다(예컨대 Boehringer-Mannheim 으로부터) :
다른 공유 결합기들은 온화한 화학적 방법을 사용하여 절단할 수 있다. 하기 표 Ⅵ 는 티올 또는 아미노 기를 갖는 억제자에 결합될 수 있고 티올로써 처리하여 분리될 수 있는 구입가능한 몇몇의 관능화된 매트릭스들을 기재한다. 또한 표 Ⅵ 는 필요한 매트릭스와 지지체 사이의 결합기와 그의 이용에 관한 참고 문헌을 기재한다.
두개의 프로토콜이 이어질 수 있다. 하나의 프로토콜에서, 관능화된 자기불활화 기질은 활성화 매트릭스 또는 매트릭스/결합과 반응한다. 그 다음 비루스, 파지, 세포 또는 부분의 현탁액을 컬럼을 통해 용출시키고 억제자와 반응시킨다. 비공유 결합 비루스, 파지, 세포 또는 성분을 세척한 후에, 고정된 파지, 비루스, 세포 또는 성분은 메르캅토에탄올 같은 티올로써 용출시켜 컬럼으로부터 분리시킬 수 있다.
나머지 프로토콜에서, 관능화된 억제자를 비루스, 파지, 세포 또는 성분과 반응시킨다. 촉매 활성을 갖는 파지, 비루스, 세포 또는 성분은 억제자에 의해 공유 결합된다. 적당한 시간 후에 비루스, 파지 세포 또는 성분의 현탁액을 활성화 매트릭스 또는 매트릭스/결합의 컬럼을 통해 용출시킨다. 촉매 활성을 가진 파지, 비루스, 세포 또는 성분만이 활성화 매트릭스 또는 결합기와 억제자의 티올 또는 아미노기의 반응에 의해 보유된다. 그 다음 티올로 처리하여 상기 비루스, 파지, 세포 또는 성분들을 분리할 수 있다.
또한 본 발명의 부가적 실시양태에 대해 하기 논의된 바대로 억제자를 운동성 인자에 부착시키기 위해, 또는 비반응성 기질 동족체 또는 기질을 컬럼 또는 막에 부착시키기 위해 상기 억제자를 컬럼에 부착시키는 것과 유사한 방법을 사용할 수도 있다.
대안적으로, 억제자는 고정되거나 충진되지 않은 운동성 (현탁) 입자, 즉 컬럼에 있지 않는 입자를 함유하거나 그에 결합될 수 있다. 상기 실례에서, 비루스, 세포 또는 촉매 성분은 입자와 접촉된다. 다시, 촉매는 입자에 결합하는 한편 비-촉매는 결합하지 않는다. 따라서 촉매와 비-촉매를 분리하기 위해, 접촉 후에 입자를 예컨대 중력, 여과, 원심분리, 전기영동, 또는 자기장(입자가 자기 반응성이라면)에 의해 접촉 매질로부터 분리된다. 입자를 분리한 후에 분리 도중에 입자와 함께 포함될 수 있는 비-촉매를 제거하기 위해 입자를 세척하는 것이 바람직하다.
입자는 이롭게 0.001 내지 200㎛, 예컨대 0.05 내지 200㎛ 또는 0.001 내지 100㎛ 직경을 갖는 미립자 물질, 바람직하게 0.1 내지 100㎛, 가장 바람직하게 억제자에 결합할 수 있는 표면 성분으로 선택적으로 구성된다. 예컨대, 미립자 물질은 가교 전분, 덱스트란, 셀룰로스, 단백질, 유기 중합체, 스티렌 공중합체 예컨대 스티렌/부타디엔 공중합체, 아크릴로니트릴/부티디엔/스티렌 공중합체, 비닐아세틸 아크릴레이트 공중합체, 또는 염화비닐/아세테이트 공중합체, 불활성 무기 입자, 이산화크롬, 철산화물, 실리카, 실리카 혼합물, 및 단백성 물질, 또는 그의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 입자-기재 실시양태에 넓은 범위의 입자를 사용할 수 있다. 일반적으로 입자는 1.0 내지 5.0g/mL의 밀도를 갖고 바람직하게 1.1 내지 2g/mL의 밀도를 갖는다. 최적 밀도의 선택은 당업계의 기술내이며, 중력-구동 분리시에 정착 속도를 고려한다.
또한 억제자 조성물내 다양한 농도 범위의 입자를 사용할 수 있다. 예컨대, 농또는 1 내지 10,000㎍/mL 범위일 수 있고 5 내지 1000㎍/mL가 바람직하다.
본 발명을 수행하는 여과 방식에서, 바람직하게 여과 수단은 평균 직경으로 측정하여 광범위하게 0.01 내지 90%의 입자 평균 직경 및 바람직하게 10% 내지 90%의 입자 평균 직경의 기공 크기를 갖는다. 필터의 기공 크기는 비-촉매가 통과하는 한편 촉매가 결합된 입자는 통과하지 못하는 정도이어야 한다.
본 기술은 본 발명의 억제자 조성물에서 사용될 수 다수의 자기 입자를 서술했다. 예컨대, 미합중국 특허 번호 4,628,037, 4,695,393, 4,698,302, 4,554,088 영국 특허 출원 GB 2,005,019 A 및 EP 0,180,384 는 성공적으로 사용될 수 있는 다양한 자기 입자들을 서술하며, 이들은 모두 본원에 참고로 병합된다. 입자는 상자성 또는 강자성일 수 있고 자기 입자를 본 발명에 사용할 수 있도록 억제자 화합물이 커플링된 다양한 물질로 입자를 피복할 수 있다. 바람직하게 본 발명에서 사용된 자기 입자는 적어도 0.001cgs 단위의 감수성을 갖고 바람직하게 감수성은 적어도 0.01cgs 단위이다. 자기 입자는 광범위한 범위의 밀도, 즉 실질적으로 물의 밀도로부터, 0.01 내지 5 g/mL 및 바람직하게 0.5 내지 2g/mL의 밀도를 가질 수 있다. 입자 크기는 0.001 내지 200, 예컨대 0.001 내지 100㎛ 및 바람직하게 0.01 내지 10㎛의 범위일 수 있다. 입자의 농또는 광범위하게 mL 당 1 내지 10,000㎍의 범위일 수 있고 mL 당 5 내지 100㎍이 바람직하다.
바람직하게, 사용된 자기 입자는 EP 0,180,384 에 서술된 바대로 자기장을 제거한 후에 입자가 탈자기화되도록 저자기 공명을 갖는다. 바람직하게 자기 입자의 밀도, 농도 및 입자 크기는 정착시간이 적어도 0.5㎜/분이도록 선택되며 상기 속도 이상이 바람직하다. 본 발명의 실행에 유리하게 사용할 수 있는 전기화학발광 입자-기재 분리 방법을 포함하는 입자 및 입자-기재 분리 방법에 대해, 1991년 2월 6일자로 출원된 07/652,427 및 1990년 6월 18일자로 출원된 동시계류중인 출원 일련 번호 07/539,389를 참고로 하며, 둘 다 본원에 참고로 병합된다.
[Ⅱ. 촉매-가속화 이동에 의한 선택]
[A. 방법 개괄]
촉매 선택 전에 비루스 또는 파지 또는 세포 모집단 또는 촉매 성분의 샘플을 합텐 친화 크로마토그래피에 의해 선택하는 것이 바람직하다. 합텐에 결합하는 이들 비루스, 세포 또는 성분(6000)을 촉매 선택에 사용하는 것이 바람직하다.
이 방법은 촉매 반응의 바람직한 기질에 의해 공유 결합하거나 하지 않는, 평편한 습윤 막 또는 기타 덮혀 있는 2차원 표면을 수반한다. 당업자는 특정 기질 및 막에 대해 최적 표면 기질 농도를 부당한 실험없이 측정할 수 있다. 매우 정확한 도구와 같은 적절한 도구를 사용하여, 잠정적으로 촉매 성분, 예컨대 촉매 항체를 발현하는 비리온 또는 세포의 페이스트-형 혼합물 또는 잠정적으로 촉매 성분을 함유하는 샘플을 표면(표면상의 첫지점)에 적용하는데 매우 가는 교차선으로 획선하는 것이 바람직하다. 획선을 가시화하기 위해 브로모페놀 블루와 같은 소량의 염료를 상기 페이스트에 첨가할 수 있다. 적당한 시간 길이 후에 (전형적으로 8시간 내지 3일이나 달리 특정 기질에 좌우될 수 있다, 즉 촉매는 반응과 그의 조건에 좌우되고 ; 기술자는 부당하 실험없이 이를 측정할 수 있다), 바람직하게 막의 표면을 첫번째 지점으로부터 적당한 거리의 두번째 지점에, 예컨대 첫번째 지점(또는 선)으로부터 0.05 내지 0.15㎜, 전형적으로 0.10㎜에서 레이저 칼날과 같은 예리한 도구로써 잘라낸다. 작은 거리의 가시화를 돕기 위해, 낮은 전력 현미경의 도움으로 잘라내기를 수행할 수 있다. 촉매 항체와 같은 촉매 성분을 갖는 비루스 또는 세포, 또는 보다 일반적으로 촉매 성분이 잘라낸 것에 존재하며, 촉매 작용으로 가속된 이동에 의해 이동하는 한편 비-촉매 항체 또는 비-촉매 성분을 갖는 비루스 또는 세포는 그렇게 확산되지 않을 것이다. 촉매 반응을 부가적으로 사용하거나 다음 파지 세대 생산에 사용하기 위해(예컨대, 이. 콜라이와 같은 숙주를 감염시킴으로써) 벗겨내기 전에 이 과정을 반복하여 촉매 성분 발현 비루스, 파지, 또는 세포 또는 보다 일반적으로 촉매 성분의 모집단 또는 농도를 강화시킬 수 있다. 또한 전기 영동을 사용하여 이 과정을 강화시킬 수 있다. 즉, 촉매 성분 또는 촉매 성분을 갖는 비루스 또는 세포의 이동 또는 확산은 표면을 가로지르는 전위 구배를 적용함으로써 강화될 수 있다.
[B. 표면]
표면은 다수의 다양한 물질, 예컨대 아가로그, 전분, 폴리아크릴아미드, 나일론, 활성화 나일론, 임모비론 AV (밀리포어사), 유리 또는 니트로셀룰로스로 구성할 수 있다. 상기 구체예의 중요한 특징은 선택된 기질이 표면을 (공유 또는 비공유적으로) 지지할 수 있고, 비루스 또는 파지 또는 세포 또는 촉매 성분은 표면에 대해 다소 약한 인력을 가지며, 적당한 시간, 예컨대 8 시간 내지 3일 (아마도 인위적-습윤 환경에서)동안 침수시키지 않고도 수분을 보유할 수 있다는 점이다. 표면상의 기질 농또는 기질 분자 하나하나가 멀리(1000 옹스트롬) 분리되어 있는 정도로 작지 않다. 바람직하게 표면을 개개의 기질분자가 바람직하게 500 옹스트롬 이하, 그리고 보다 바람직하게 100 옹스트롬 이하, 그리고 가장 바람직하게 50 옹스트롬 이하로 분리된 기질의 유착성 단층으로 덮는다. 유착성 단층보다 큰 기질 농도도 허용가능하면 몇몇 경우에 이것이 단층에 대해 바람직하다. 당업자는 부당한 시험없이 중량, 자외선 흡수도 또는 기타 정량법에 근거하여 표면에 적용되는 기질의 농도를 측정할 수 있다. 촉매 반응으로 가속화된 이동에 더하여 친화도 크로마토그래피 성분과 같은 몇몇 기타 성분으로 파지 분리를 돕는 것이 바람직하며, 표면은 이 능력에 맞아야 한다. 예컨대, 파지 이동이 기질 표면을 가로지르는 전기영동에 의해 가속된다면, 표면은 그것에 적용되는 전기 전위를 가질 수 있어야 한다.
[C. 촉매를 발현하는 비루스, 세포 또는 부분의 적용과 인큐베이션]
바람직하게 미세한 바늘이 달린 시린지를 사용하여 비루스 또는 파지 또는 세포 또는 촉매성분을 촉촉한 페이스트 또는 매우 농축된 용액으로 기질 표면에 적용한다. 비루스, 파지 세포 또는 촉매 부분이 적용되었는지 알아 볼 수 있게, 적용전에 브로모페놀 블루와 같은 소량의 염료를 첨가할 수 있다. 그다음 바람직하게 파지 또는 세포 또는 촉매 성분을 적당한 환경, 예컨대 50% 초과 또는 촉촉한 습도 ; 조건에 따라 시간 간격마다 20℃ 내지 40℃, 전형적으로 25℃ 또는 37℃, 전형적으로 8시간 내지 3일 사이의 시간간격으로 표면상에서 인큐베이션한다.
[D. 촉매 활성을 발현하는 비루스, 세포 또는 성분의 선택]
인큐베이션한 후에, 표면을 저전력 현미경에서 놓거나 달리 시력을 보조하는 것이 바람직하다. 레이저 칼날이나 기타 날카로운 도구를 사용하여 원점으로부터 한쪽 또는 다른쪽 또는 양면상의 선을 따라 표면을, 실질적으로 선이라면 원점으로부터 대략 0.05 내지 0.15, 전형적으로 0.10㎜ 잘라내고, 대안적으로, 원점이 실질적으로 선으로 적용되지 않았다면, 실질적으로 원주를 따라 또는 원점으로부터 0.05 내지 0.15, 전형적으로 0.10㎜ 직경을 갖는 원을 따라 실질적으로 잘라낼 수 있다. 촉매가 비-촉매보다 더 운동성이므로 잘라낼 때 촉매가 농축된다. 이 절차는 촉매 파지나 세포 모집단의 부가적 강화나 농축을 위해(즉, 가장 촉매적으로 활성인 집단을 생산하기 위해)반복할 수 있다. 유사하게, 이 절차는 일반적으로 샘플내 촉매 부분의 농도를 증가시키기 위해 사용할 수 있다.
특정 상황에서는 기질에 결합하지 않는 비루스, 파지, 세포 또는 성분, 예컨대 합텐에 결합하나 기질에 결합하지 않는 것들을 제거하는 것이 필수적인데, 이는 이들이 기질 표면상에서 쉽게 확산하기 때문이다. 이는 획선시에 바로 수행되며, 표면을 신속하고 가볍게 세척하거나 합텐으로 표면을 블로팅한다. 이 실례에서, 합텐과 결합하나 기질과 결합하지 않는 비루스, 파지, 세포, 또는 성분을 초기에 기질에 결합한 것들보다 신속하게 확산(촉매성이거나 비촉매성인)할 것이므로, 이들 기질-비결합 합텐-결합 및 기질-비결합 비루스, 파지, 세포, 또는 성분은 기진 표면으로 부터 즉시 분리하고 단리할 수 있다. 비촉매 확산은 심각한 문제가 아니다.
유사하게, 특정 실시양태에서 막 표면을 가로질러 전위를 적용시킴으로써 확산을 증진시키는 것이 바람직하다. 즉, 전기 영동에 의해 확산을 증진시킨다. 전기영동 증진된 이동을 위한 전형적 조건은 당업자가 부당한 실험없이 매질 (표면상의 비결합 물질, 예컨대 기질로서 표면 상의 수분은 표면에 대한 인력을 갖는다), 확산되는 물질 (파지, 세포, 촉매성분)등과 같은 인자를 고려하여 상기 물질 상의 전하와 매질의 전도도의 최소화 사이의 최적치를 실험적으로 측정할 수 있고, 이는 최대의 분리를 촉진한다. 표면에 대한 원적용점으로부터 잘라내는 (촉매를 수집하는)거리는 따라서 촉매에 의한 이동이 전기영동에 의해 증진될 때 조정한다.
[Ⅲ. 표면 결합에 의한 촉매 선택]
[A. 개괄]
이 실시양태는 몇몇이 상이한 항체 또는 성분들 (예컨대, 촉매성 대 비촉매성)을 나타내는 극히 많은 수의 비루스, 세포 또는 성분들 중에 촉매 활성을 선택하는 방법이다. 이 방법은 촉매 활성의 감지를 위해, 예컨대 촉매 성분의 발현을 감지하기 위해 ; 또는 샘플의 촉매 성분 농도를 증가시키기 위해 사용할 수 있다. 이는 기질에 결합하고 인큐베이션 시간과 무관하게 동일한 친화도를 갖는 막 또는 기타 2차원 표면 상에 고정되는 항체와 같은 비촉매 성분에 의해 단단한 결합을 관찰하는 것에 근거한다. 반면에, 촉매 항체나 그의 촉매 성분과 같은 촉매 성분은 초기에 기질에 결합하나, 일단 촉매 반응이 일어나면 더 이상 고체 표면에 결합하지 않는다. 즉, 비-촉매가 표면과 평형 상태에 이르기에 충분한 시간 후에, 그러나 촉매가 표면 상의 기질을 소비하는 접촉시간 미만으로, 비-촉매는 표면에 결합된 채로 남는 반면 촉매는 그로부터 세척할 수 있다(수집할 수 있다).
이 촉매 선택 실시양태는 바람직하게 약한 또는 비-합텐 결합 성분, 예컨대 항체로부터 합텐 결합 성분-예컨대 항체에 대한 초기 선택을 수반한다. 이는 바람직하게 친화도 크로마토그래피(2, 3, 4) 또는 필터 이동법(31)을 수반하는 상기 서술된 절차에 의해 수행할 수 있다. 유사하게, 본원의 기타 실시양태에서 합텐 결합 성분에 대한 초기 선택을 수행한다면, 필터-이동법을 사용할 수 있다. 합텐 결합에 의해 비루스, 파지, 세포, 또는 성분의 서브세트를 선택한 후에, 그다음 비루스, 파지, 세포, 또는 성분을 가질 촉매반응, 즉, 기재된 반응 또는 촉매 선택에 대해 스크리닝한다.
이 실시양태에서 촉매 선택은 임모빌론 AV(밀리포어사, 매사츄세츠주 브레드포드시)와 같은 막상의 기질의 공유 고정과 같은 고정화를 수반하는 것이 바람직하다. 막 표면에 비루스, 파지, 세포, 또는 성분의 용액을 첨가한다. 대안적으로, 비루스, 파지, 세포, 또는 성분은 기질-막을 감염된 숙주, 예컨대 세균 집략과 같은 샘플에 대해 압착시켜 관련 비루스 또는 파지 항체를 이동시킴으로써 직접 전달될 수 있다. 실질적으로 즉시, 막을 적당한 완충액으로 세척하여 기질에 대한 친화도가 낮거나 없는 비루스, 파지, 세포, 또는 성분, 예컨대 항체를 제거하는 것이 바람직하다. 세척 단계는 표면 세척이나 완충된 세척용액(선택된 pH, 예컨대 5.0 내지 9.0, 예컨대 7.0 및 100 mM Nacl 이상을 함유하도록 완충된)을 통해 흘림으로써 수행할 수 있다. 그후에, 막을 완충액으로 다시 세척하는 것이 바람직하다. 단단히 결합하는 비촉매 파지, 비루스, 세포, 또는 성분, 예컨대 항체는 막으로부터 용출되지 않으나 촉매성인 비루스, 파지, 세포, 또는 성분, 예컨대 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분 (또는 감염된 집락으로부터 이동된 그런 항체 또는 그의 부분)을 갖는 비루스, 파지, 또는 세포는 결합되지 않게 충분한 기질과 촉매작용하므로 용출될 것이다. 세척물을 농축할 수 있고 촉매적으로 사용하거나 이. 콜라이와 같은 숙주를 재감염시킨다. 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분을 갖는 파지, 비루스, 또는 세포 집단의 부가적 강화는 상기 절차를 반복함으로써 성취할 수 있다. 유사하게, 이 절차는 사용하여 샘플의 촉매 성분 농도를 증가시킬 수 있다.
이 절차에서, 비루스, 파지, 세포(또는 그로부터의 항체) 또는 성분은 확산이 극히 제한된 막의 국소 영역에, 촉매 파지, 비루스 또는 세포 (또는 그로부터의 항체) 또는 촉매성분이 기질의 국소 공급물을 소비하고 촉매화안된 기질을 결합시키는 먼 거리를 움직이지 않도록 남아야 한다. 더우기, 확산이 일어난다면 촉매 파지, 비루스 또는 세포 (또는 그로부터의 촉매 항체) 또는 촉매 성분은, 비촉매에 기질 공급이 고갈되고 또한 막으로부터 쉽게 세척되도록 결합, 비촉매 파지, 비루스 또는 세포 (또는 그로부터의 항체)와 또는 비촉매 성분과 경쟁하여 기질을 촉매한다. 촉매 성분, 예컨대 촉매 파지, 비루스 또는 세포 성분, 예컨대 항체의 이동을 막기위해, 가능한 한 막에 물과 같은 과량의 수분이 없도록 유지하고 단지 촉촉하게 ; 예컨대 습기찬 챔버에서 유지하는 것이 바람직하다. 또한, 인큐데이션 시간은 확산을 막기 위해 최고로 최소화할 수 있다. 촉매를 선택적으로 제거하기 위한 두번째 세척은 0.5 내지 16시간 사이, 전형적으로 1시간, 3시간, 6시간 및 16시간 간격과 같은 적당한 시간으로 할 수 있다.
[B. 고정 기질]
기질을 기질이 링커(linker)를 갖고 그를 통해 막에 연결될 수 있도록 친화도 크로마토그래피내 합텐과 동일한 방식으로 변형시키는 것이 바람직하다. 이 기질 결합은 본 발명의 메카니즘 기재 억제 선택 실시양태에서 억제자를 입자에 결합시키는데 사용된 것과 유사하며 반대의 경우도 마찬가지다. 그의 화학 성질의 자세한 점은 특정 기질에 따라 좌우되는 합텐 제조에 사용된 화학성질에 밀접하게 근거한다 ; 예컨데, 합텐-결합 성분에 대한 초기 선택을 수행한다면, 그에 동일하지 않을지라도 매우 유사한 것이 바람직하다.
[C. 막]
기질은 링커에 의해 막, 예컨대 임모빌론-AV 막과 같은 촉매 반응 가속화 이동에 의한 선택에 관해 상기 서술된 임의 표면 물질에 결합될 수 있다. 커플링은 공지된 절차에 의해, 예컨대 막 공급업자(밀리포어)의 권고사항과 같은 절차에 따라 수행할 수 있으며(1990 밀리포어 카타로그 페이지 177-178, 본원에 참고문헌으로 병합됨) ; 유사하게, 촉매반응-가속화 이동에 의한 선택도 상기 링커 절차를 사용할 수 있다. 임의 특정 이론에 구애됨이 없이, 본 구체예의 성공은 입체적 한계와 당업자가 전형적으로 고려하는 기타 요인들로 인한 막상에 기질의 농축에 관한 것이다 (㎜ol/㎠). 막상에서 기질 농축은 촉매 반응-가속화된 이동에 의한 선택 실시양테에서 처럼 할 수 있다. 따라서, 막에서 기질의 농축은 부당한 실험없이 특정 촉매 부분-기질 시스템에 대한 본 명세서로부터 최적화할 수 있다.
기타 고체상 표면으로 상기 막을 대신할 수 있음이 당업자에게 자명하다. 예컨대, 비-자기성 또는 자기 반응성 입자를 촉매 반응 가속화된 이동에 의한 선택에 관해 상기 서술된 바대로 사용할 수 있다.
[D. 파지, 비루스, 세포 또는 성분의 적용]
파지, 비루스, 세포 또는 성분을 항원에 대한 항체의 작성된 결합 운동학에 따라 막에 결합시킨다 (10). 상기 발견에 따라, 파지, 비루스, 세포 또는 성분-함유 용액을 기질-막에 노출시키는 시간은 2분(빠른 바인더) 및 10분 (느린 바인더)일 수 있다. 이 시간 후에 막을 바람직하게 실질적으로 즉시 그리고 바람직하게 신속하게 (1-10초, 바람직하게 1-5초) 표면 상을 또는 흐르게 하여 세척한다. 세척하여 기질에 약하게 결합한 비루스, 파지 또는 세포 항체와 같은 성분(예컨대, 극히 높은 겉보기 결합 상수, Km, 항체) 또는 막 표면에 비특이적으로 결합된 것들을 제거한다.
[E. 인큐베이션]
약간 촉촉한 막을 특정 부분, 예컨대 항체에 따라, 0.5 내지 16 시간, 전형적으로 1시간, 3시간 6시간, 또는 12시간과 같은 적당한 시간 동안 습기찬 방에서 20°-40°, 전형적으로 25°또는 37°에서 인큐베이션할 수 있다. 그다음 선택된 완충액에서 (보통 반응 완충액과 같은 것) 적당한 시간, 전형적으로 1-5초 동안 2차 세척을 수행한다. 훨씬 적은 노동강도이므로 1번의 세척이 바람직하지만 한번이상의 2차 세척을 할 수 있다. 2차 세척은 막의 표면 상에 수행하거나 막을 통해 완충액을 흘려 보낸다.
[F. 2차 세척의 사용]
촉매 파지, 비루스, 세포 또는 성분을 함유하는 2차 세척물은 촉매용도로 파지로써 이. 콜라이와 같은 적당한 숙주를 감염시키기 위해, 또는 세포에 의한 촉매의 발생을 위해, 예컨대 재조합 비루스 감염 세포가 용원 주기를 수행하도록 농축하고 준비할 수 있다. 본 발명의 상기 막 기술 실시양태를 2차 세척물(들)에 대해 반복하여 2차 세척물(들)에 포함될 수 있는 비촉매성 파지, 비루스, 세포(또는 그로부터의 항체) 또는 비-촉매성 성분의 양을 감소시키고 더나아가 촉매성 성분의 농도를 강화시킬 수 있다. 촉매 활성이 풍부하게된 파지 클론을 함유하는 숙주, 예컨대 이. 콜라이 집락을 중식시켜 정제하고 스크리닝하거나 촉매 활성을 직접 사용하기에 충분한 촉매, 예컨대, 촉매 항체 또는 그의 촉매 단편을 분비시킬 수 있다. 그다음 결과 생성된 촉매, 예컨대 촉매성 항체의 정제를 표준 절차에 의해 수행할 수 있다.
[Ⅳ. 온도 또는 경쟁과 같은 반응 조건의 함수로써 결합의 변화에 의한 선택]
[A. 온도에 관한 개관]
결합관 촉매 반응에 대한 온도의 효과는 단백질 촉매에 대해 주어진 것과는 다르다. 따라서, 온도가 결합되나 거의 촉매 반응이 없는 낮거나 보다 찬 온도와 같은 한 온도를, 실질적인 촉매 반응이 있는 두번째의, 일반적으로 더높은 온도로 증가시키면, 촉매와 그의 기질의 겉보기 해리 상수가 불연속적인 방식으로 변화할 것이다. 온도 변화에 의한 촉매의(비-촉매가 아님) 겉보기 기질 결합에 있어서의 상기 변화는 비촉매 성분, 파지, 비루스 또는 세포의 큰 풀로부터 촉매 성분 또는 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분과 같은 촉매 성분을 발현할 수 있는 파지, 비루스 또는 세포의 분리, 선택 또는 농축을 위한 본 발명의 실시양태의 기초를 형성한다.
[B. 결합 및 촉매 반응에 대한 온도 효과]
결합은 다음의 물리적 관찰과 현상에 따른다 :
상기식에서 E는 효소 또는 항체와 같은 촉매이고, s는 기질이며, ES는 촉매-기질 복합체(생성물, P가 될 수 있음)이고, G는 깁스 프리 에너지이고, R은 공통 기체 상수이고 T는 온도(켈빈 단위)이다.
따라서, 저온의 효소 또는 비 촉매 항체와 같은 결합 분자에 있어 T-1대 log Ks의 플롯은 (2.303R)/G 의 기울기를 갖는 직선을 산출할 것이다.
효소 또는 촉매 항체와 같은 촉매의 경우에, 겉보기 결합 상수는 Ks 가 아니라 Km 이다. 간단한 반응에 있어서는 다음과 같이 나타내진다 :
k-1/k+1(Ks) 에 대한 온도의 효과는 상기에 논의되었다. 온도 k+2의 효과는 절대 반응 속도의 에어링 이론을 사용하여 측정한다. 반응 (k+2)에 대한 온도의 효과는 log k+2= [ -(H + RT) / 2.303 ] × T-1이므로(여기서H는 활성화 엔탈피), log k+2(log Vmax) 대 1/T의 플롯은 -(H + RT / 2.303) 의 기울기를 제공한다.
따라서, Km 에 대한 온도의 효과는 k+2및 k-1의 상대 크기에 좌우되고 ; 극한 경우는 Km = k+2/k-1이고, Km = Ks이다. 그러나, 대부분의 경우에, Km은 속도 상수의 혼합과 동일하다 (Km = (k+2+ k-1)/k+1).
상기 개념과 관찰을 조합하면, 항체와 같은 결합 성분은 단지 하나의 온도 계수가 수반되므로 1/T 와 Ks 사이에 선형 상관관계를 갖는 반면, 촉매 성분(예컨대 효소, 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분)에 있어 겉보기 결합 상수 (Km)은 둘(또는 이상)의 온도-의존 현상에 좌우되므로 결합과 촉매 작용은 각각 자신의 온도 계수를 갖는다. 촉매 작용은 상기 등식에서 온도 의존성인 인자를 엔탈피 항에 도입한다. 따라서, 촉매 성분의 경우에 1/T 과 Km 사이의 상관관계는 선형이 아니라 촉매작용과 결합 온도 계수의 차이에 따라 곡선이 된다. 본 발명의 이 실시양태는 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분과 같은 촉매 성분을 발현할 수 있는 비루스, 파지 또는 세포와 같은 촉매 성분을 단리하고, 선택하고, 스크리닝하거나 그의 농도를 증가시키기 위해 겉보기 결합에 대한 온도의 효과를 조사한다.
[C. 일반적으로 온도에 근거한 분리에 있어서의 절차]
일반적으로, 이 실시양태에서 겉보기 기질 결합에 대한 온도의 효과에 근거해 파지, 세포 또는 성분을 분리하는 방법이 제공된다. 촉매성인 것들은 비-촉매성인 것들과 온도 변화에 다르게 반응한다. (촉매 작용이 실질적으로 일어나지 않는) 저온에서 유사한 Ks 값을 갖는 비루스, 파지 또는 세포 항체와 같은 성분들은 그의 Ks 값의 유사한 온도 의존성을 가질 것이다. 이는 성분, 예컨대 유사한 Ks 값을 갖는 비루스, 파지 또는 세포들의 방대한 다수에 대해 타당하다. 실제적으로 :
1. 성분들, 예컨대 합텐에 결합한 비루스가 첫번째의 일반적으로 저온 (예컨대, -30 내지 0℃, 예컨대 전형적으로 -20℃) 고정된 기질의 컬럼 상에 분리되고 ; 느슨하게 결합된 파지는 (고 Ks 를 가짐) 먼저 용출하고 단단히 결합된 파지는 (저 Ks 를 가짐) 나중에 용출한다.
2. 분획을 수집한다.
3. 두번째의, 일반적으로 더 높은 온도에서 (예컨대, +20℃ 내지 45℃, 예컨대 전형적으로 +25℃ 또는 +37℃), 개개의 농축된 분획을 동일 컬럼상에서 재용출시키고 다시 한번 각 용출액으로부터 분획을 수집한다.
4. 고농도의 비루스, 파지, 세포 또는 성분들을 함유하는 용출된 분획 또는 분획들을 흡수에 의해 직접 또는 웨스턴 블롯에 의해 간접적으로 검출하거나 파지의 경우에 각 분획의 분취량으로 이. 콜라이 같은 숙주를 감염시킨다. 주 분획(들)외의 분획에서 용출된 비루스, 파지, 세포 또는 성분들은 주 분획에서 용출된 비루스, 파지, 세포 또는 성분들(비-촉매성)과 다른 온도 계수를 갖는다. 이들이 괴상 (비촉매) 비루스, 파지, 세포 또는 성분들로부터 상이한 친화도로써 용출되므로, 주분획(들)의 외부에서 용출된 분획을 부가적으로 풍부하게 하거나 농축시킬 수 있다. 이유는 괴상 분획(들) 외부에서 용출되는 비루스, 파지, 세포 또는 성분들이 결합에 대한 온도 계수에 더하여, 촉매작용에 대한 온도 계수를 가지기 때문이다. 일반적으로 촉매 비루스, 파지, 세포 또는 성분의 일정한 겉보기 결합에 대한 온도의 효과는 비-촉매 비루스, 파지, 세포 또는 성분의 대부분과 실질적으로 다르다.
5. 그다음 강화된 띄엄띄엄 있는 비루스 또는 파지를 사용하여 이. 콜라이와 같은 숙주를 감염시키고 그로부터 성분들을 단리시키며, 예컨대 얻어진 항체를 촉매 작용에 사용하거나 더 나아가 촉매 활성에 대해 스크리닝한다. 마찬가지로, 풍부하게 세포를 단리하고 이를 사용하여 촉매 성분을 발현시키거나 용원 주기를 수행하도록 유도시켜 비루스 또는 파지 세대를 산출한다. 유사하게, 상기 절차에 의해 단리된 강화된 성분들을 촉매 작용을 위해 사용한다.
본 발명의 이 실시양태의 상기 상세한 설명은 성분에 따라 변할 수 있고 표준 방법(중력 또는 펌프 분리)에 의해, 전기영동 겔 상에서 (전기장 분리), 원심분리 튜브로(중력 분리), 예컨대 점성 용액에 현탁된 고정된 기질을 함유하는 원심 분리 튜브, 또는 현탁되거나 고정된 기질을 통해 비루스, 파지, 세포 또는 성분들을 분리시키는 기타의 기초 방법에 의해 컬럼 매트릭스에서 고정된 기질을 수반할 수 있다. 저온 분리는 냉장, 드라이 아이스 또는 액체 질소 또는 액체 헬륨으로 온도를 낮게 유지하면서 수성 매체에서 수행하는 것이 바람직하다. 수성 매체는 NaCl 또는 기타 염의 적절한 축합물을 봉입하거나 글리세롤로써 동결을 막는다. 그리고 촉매 성분 비루스, 파지 또는 세포의 샘플을 더욱더 농축시키기 위해 이 실시양태를 반복할 수 있다.
[D. 비-반응성 기질 동족체와의 경쟁에 의한 선택의 개관]
이 실시양태는 관심있는 촉매 반응에서 기질의 동족체를 사용한다. 동촉체에서, 표준 결합은 촉매 종 변화에 내성이나 ; 동족체는 촉매성이든 비촉매성이든, 성분에 대한 기질 분자로서 유사한 결합 친화도를 나타내기에 충분한 구조적 유사성을 갖는다. R3COOR4에스테르 기질의 에스테르 분해 반응에 대한 이의 실례는 R3COCH2R4구조로, 이는 에스테르 구조를 충분히 모방하나 에스테르와 구조적으로 유사한 한편 C(=0)CH2표적 결합은 에스테르 분해 촉매에 의한 변화에 대해 내성이다. 다수의 상기 비반응성 기질 동족체가 임의 특정 반응에 존재하고 사용을 위해 적절한 동족체의 선택법은 당업자가 부당한 실험없이 본 명세서로부터, 잠재적 비반응성 기질 동족체와 기질 자체 사이의 구조적 유사성, 동족체내 표적결합의 변화에 대한 내성, 수바된 화학 반응 동족체의 결합 친화도 및 당업자의 주위내의 기타 인자들을 고려하여 판단할 수 있다.
따라서, 본 실시양태는 샘플을 비반응성 기질 동족체와 바람직하게 컬럼내에 채워진 고체 상 지지체에 결합된 동족체와 같은 고정된 동족체와 접촉시켜 촉매성 파지, 비루스 또는 촉매 성분을 분리 또는 농축한다. 접촉을 상기 (이동성)동족체의 존재하에 하는 것이 바람직하다. 이로부터 접촉 분획을 수집한다. 개별적으로, 그러나 기질의 존재하에 분획을 고정된 비-반응성 기질과 다시 접촉시킨다. 분획을 다시 수집한다. 촉매 파지, 비루스, 세포 또는 촉매 성분을 비촉매성 대응물과 상이한 속도로 기질로부터 해리되므로 동족체가 컬럼에 채워진 고체 상 지지체에 결합한다면, 촉매는 주 분획 외에서 용출된다. 즉 촉매는 주분획 전이나 후에 용출된다.
구체적으로, 반응 평형식 (여기서 "S"는 기질이고, "P"는 생성물임) :
에서 k2〉 k-1인 것같은 충분한 촉매 활성(Ab)을 갖는 샘플에서 비루스, 파지, 세포 또는 성분은 두번째 용출에서 촉매가 그의 비촉매 대응물과 상이한 속도로 AbS 복합체로부터 해리하므로 용출하는 파지, 비루스, 세포 또는 성분의 주피크에 대해서와는 다른 지체 시간으로 용출한다.
주 피크 외의 비루스, 파지, 세포 또는 성분의 수집은 따라서 촉매 활성을 나타내는 것들을 풍부하게 하고 그를 선택할 것이다. 특정 촉매 메카니즘에 따라, 두번째 용출에서 촉매는 주 피크보다 나중에 또는 빨리 용출한다. (15) 또한 1 및 2도 참조 ; 그러나, 본 명세로부터 당업자는 예컨대 주 피크외의 용출이 주 피크 전이나 후에 용출하는지 판단하고 주 피크의 외부에 (전에 또는 후에) 용출하는 것에 의해 성취된 전환 수를 고려하고 당업자의 경계내의 다른 인자들을 고려함으로써 부당한 실험없이 촉매가 주 분획보다 빨리 또는 나중에 용출하는지 판단할 수 있다. 기질(또는 비-반응성 기질 동족체)와의 비촉매 결합/해리는 Ks : Ks = k-1/ k+2로서 표현되는데, 이는 비촉매(Nc)가 단지 하기와 같이 :
기질 또는 비반응성 기질(S*)와 결합하고 해리하기 때문이다.
상기 도식에 제시된 촉매 메카니즘에서(미카엘리스 복합체(AbS)와 생성물 형성, P 사이에 촉매 중간체가 발생하지 않음), 항체 및 기질의 겉보기 결합/해리는 Km: Km= (k2+ k-1) / k+2로 표현할 수 있다.
이들 환경 하에 Ks값은 항상 Km값보다 작아야 한다 ; 즉, 비-촉매 비루스, 파지 , 세포 또는 성분은 기질에 보다 단단하게 결합하므로 두번째 용출에서 촉매 비루스, 파지 , 세포 또는 성분보다 나중에 용출한다(1도 참조).
다른 한편, 촉매 비루스, 파지 , 세포 또는 성분 (Ab) 가, 반응 중간체(예컨대 공유 중간체)가 미카엘리스 복합체와 생성물 형상 사이에 조정하는 반응에서 발생하는 메카니즘, 예컨대 본원에 제시된 바의 아래 메카니즘(여기서 "S"는 기질이고, "AbS2"는 중간체이고, "P"는 생성물임) :
에 따른다면, 기질의 겉보기 결합/해리를 서술하는 항은 상기 등식에서 다르며, 이때 Km은 Ks값보다 작은 값을 갖는다, 즉 : Km= [Ks] [k3/(k2+k3)]. 따라서, 이 메카니즘 또는 중간체가 AbS 복합체 다음에 발생하는 임의 메카니즘에 있어, 촉매 비루스, 파지 , 세포 또는 성분이 함께 결합하고 두번째 용출에서 비-촉매보다 나중에 용출한다 (1도 참조).
그러나, AbS→Ab + P의 반응이 Ks가 Km보다 크게되는 경우처럼 매우 신속하다면, 또는 NcS 복합체에 대한 Ks가 Km보다 크다면, 촉매는 2도에 도시된 바대로 비-촉매보다 더 빨리 용출할 것이다. 따라서, 상이한 결합을 나타내는, 예컨대 더 늦게 또는 더 빨리 용출하는 성분, 세포, 비루스 또는 파지의 수집은 촉매를 단리할 뿐만아니라 샘플내 촉매를 최상으로 단리할 것이다.
E. 비-반응성 동족체와의 결쟁에 의한 선택의 특색
바람직하게 비-촉매성 기질 동족체는 고체상 지지체에 결합하여 친화 매트릭스를 제조하는데 이를 컬럼내로 채우는 것이 바람직하다. 항체 및 그의 발현이 유발되는 면역 반응을 발생하는데 사용되는 전이 상태 동족체에 결합하는 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분을 발현하는 파지, 비루스 또는 세포와 같은 촉매로 작용하는 것들을 잠재적으로 포함하는 비루스, 파지 , 세포 또는 성분들의 현탁액을, 기질 동족체에 대해 친화성을 갖는 비루스, 파지 , 세포 또는 성분이 고정된 리간드에 결합하여 리간드에 대해 친화성이 없는 것들에 비해 컬럼 상에 보유되도록 하는 온도, 완충액 조성물, 유량과 같은 조건하에 컬럼상에 적용한다. 연속적인 시간 간격으로 컬럼으로부터 용출되는 비루스, 파지 , 세포 또는 성분을 수집하고, 적당한 분획내로 모으고, 농축한다. 용출에 사용된 완충액내에 가용성 비-반응 기질을 포함시켜 샘플내 결합물이 비루스, 파지 , 세포 또는 성분에 대한 결합에 있는 고체상 리간드와 경쟁함으로써 컬럼 분포에서 빨리 용출하게 한다. 유사하게, 용출 완충액에 기질을 포함시키면 비촉매가 비-반응성 기질 동족체와 결합하므로 유사한 Ks를 갖는 기질에 결합하는 비촉매의 용출에 대해 동일한 효과를 갖는다. 따라서, 비-반응성 기질 동족체 컬럼으로부터 비-반응성 기질 동족체와 함께 용출된 분획을 다시 컬럼을 통과시키나, 기질의 존재하에 동족체를 사용하여 용출시켰던 농도와 같거나 낮은 농도에서 통과시키는 것이 바람직하다.
그러나, 촉매 성분, 비루스, 파지 또는 세포의 경우에, 기질이 결합부위로부터 방출된 촉매에 의해 생성물(들)로 전환되어 촉매를 고정된 리간드에 재결합하게 할 수 있으므로 기질은 컬럼으로부터 용출을 가속하는데 다소 덜 효과적일 것이다. 따라서 촉매는 촉매가 동일 컬럼으로부터 비-반응성 기질 동족체와 함께 용출되는 것보다 기질과 함께 용출되는 컬럼으로부터 나중에 또는 더 빨리 용출한다. 이는 제1 및 2도에 도시된 2차원 분리 분포의 기초를 형성한다. 제1 및 2도에서, 비-반응성 기질 동족체와의 1차 용출은 수직 방향으로 묘사되고 비-반응성 기질 동족체 컬럼으로부터 기질과의 2차 용출은 수평 방향으로 묘사된다. 점점이 나타난 피크는 주피크 외에서 용출한 분획(들)을 나타낸다. 점점이 나타난 피크는 제1 및 2도에 도시된 바대로 정규화되고 촉매는 주피크를 따라 뒤에 끌리는 끝머리로 용출할 수 있거나(제 1도) 뒤에 끌리는 끝머리가 주 피크에 선행할 수 있다 (제 2도), 즉 촉매는 주피크(들) 보다 상당히 나중에 또는 빨리 용출하므로 모여 촉매가 풍부한 집단이 수집되거나 농축된다. 제 1또는 Km〉 Ks(촉매가 비-촉매보다 오래 결합함)인 경우의 분포를 도시하고 제2또는 Ks〉Km(촉매가 비촉매보다 빨리 용출함)인 경우의 분포를 도시한다.
(상기 논의된 바의) 에스테르(Ⅱ)의 가수분해에 대해 ;
이때, 에스테르는 일반적으로 하기식 (XXXI)로 도시될수 있고
다음은 비-반응성 기질 동족체로서 직경한다:
따라서, 본원에 도시된 바대로, 에스테르에 대한 비-반응성 기질 동족체는 케톤, 카보네이트, 카바메이트, 메틸렌 에테르 같은 에테르, 역전된 에스테르, 티오 에스테르, 이미노 에스테르, 아미드 및 기질 에스테르와 동일한 또는 유사한 치환체(예컨데, R3및 R4)를 갖는 역전된 아미드일 수 있다. 물론, 본 명세서로부터 당업자는 부당한 실험없이 다른 기질에 대한 비-반응성 동족체에 대해 고안될 수 있다. 또한, 비-반응성 동족체는 펩티드 가수분해, 산화/환원, 첨가, 제거, 축합, 이성체화, 그리고 전이 반응을 포함하는 에스테르 분해효소 반응외의 반응에 대해 고안될 수 있다. 특히, 본원에 도시된 바대로 비-반응성 동족체는 기질과 구조적으로 유사하므로, 예컨대 동일하거나 유사한 치환기이나 기질의 반응 부위의 결합이 촉매에 의한 변형(반응)에 저항하도록 상이하나 그렇지만 표적 결합에 유사하다. 예컨대, 표적 결합이 전형적 에스테르, 역전된 에스테르, 티오 에스테르, 또는 이미노 에스테르와 같은 에스테르, 케톤, 카보네이트, 카바메이트, 전형적 에테르 또는 메틸렌 에테르와 같은 에테르, 및 전형적 아미드, 역전된 아미드 및 아미노 같은 아미드로부터 선택된 결합이라면, 비-반응성 동족체의 반응 부위의 결합이 그 군으로부터 선택된 다른 성원인 것이 바람직하다.
이 실시양태는 부가적인 대안 실시양태를 포함할 수 있다. 예컨대, 고체상에 대한 리간드의 결합 밀도, 고체 상 지지체의 성질, 완충액 조성물, 용출종의 유속 및 농또는 본 명세서로부터 부당한 실험없이, 특히 상기 등식의 관점에서 최적의 선택도(최고 촉매의 농축 또는 분리)를 얻기 위해 변할 수 있다. 게다가, 촉매가 촉매 행동으로 인해 상이하게 결합하고 따라서 상이하게 용출하도록 결합시에 결쟁이 있는 곳에 대해 상기 등식과 이 실시양태의 요점이 주어지므로 이 실시양태와 그의 본 명세서를 통해 당업자는 부당한 실험없이 상기 서술된 비-반응성 동족체 및 기질 뿐만 아니라 전이 상태 동족체(들) 및 심지어 관심있는 성분에 대한 결합을 위한 유의한 친화도를 갖는 무관한 화합물(들)을 용출종 및 고체 상리간드(들)에 대한 화합물로서 선택할 수 있다. 경쟁에 의한 결합 변화에 의한 선택으로 촉매를 단리 또는 농축할 수 있을 뿐만아니라, 본원의 지도에 의해 특히 선택이 촉매 작용(Km)에 근거하고 직접 그에 상관되므로 더 우수한 촉매를 분리할 수 있다.
본 발명의 이 실시양태의 부가적 대안으로, 비 반응성 동족체는 상기 서술된 바의 막과 같은 2차원 지지체에 부착되고, 샘플은(컬럼에서 사용된)중력외의 힘에 의해 막표면을 가로질러 가게 된다. 예컨대, 샘플은 전기장에 의해 (바람직하게 촉촉하게 한) 비-반응성-동족체 막을 가로질러 갈수 있다. 즉, 촉매와 비-촉매의 분리는 전기영동으로 유도된다. 이 경우에, 촉매는 다시 소수 분획에서 발견된다. 당업자는 상기 논의된 바의 전형적 인자들을 고려하여 부당한 실험없이 실험적으로 분리되는 샘플 상의 전하와 전하에 의한 최대 분리를 촉진하는 매체(촉촉하게 한 용액과 같은 막 표면 상의 비결합물질)의 최소 전도도 사이가 최적이 되도록 전기영동 유도된 분리에 대한 조건을 결정한다.
물론, 비루스, 파지 , 세포 또는 성분들의 촉매 집단 또는 샘플(때때로 본원에서 "부집단" 또는 "두번째 집단"으로 불림)을 본 발명의 한 방법에 의해 얻을 수 있고 그것 또는 그의 다음 세대(숙주 감염 또는 용원 주기 유도로부터와 같은)를 본 발명의 다른 방법에 의해 더욱더 선택하거나 농축할 수 있다. 예컨대 표면 결합에 의한 촉매 선택으로부터의 두번째 세척(물) (부집단 또는 두번째 부집단)을 촉매 작용-가속화된 이동에 의한 선택, 온도의 함수로서 결합의 엔탈피 성분 변화에 의해 선택, 경쟁에 의해 결합 변화에 의한 선택, 또는 메카니즘-기재 억제자 선택에 적용할 수 있다. 마찬가지로, 촉매 작용-가속화된 이동에 의한 선택으로부터의 스크래핑(부집단 또는 두번째 부집단)을 표면 결합에 의한 선택, 온도의 함수로서 결합의 엔탈피 성분 변화에 의한 선택, 경쟁에 의한 결합 변화에 의한 선택, 또는 메카니즘-기재 억제자 선택에 적용할 수 있다. 유사하게, 온도의 함수로서 결합의 엔탈피 성분 변화에 의한 선택에서 겉보기 결합에 대해 온도 효과를 나타내는 샘플(들) (예컨대, 주 분획(들)의 외부를 용출하거나 그에 결합하는 것들)을 표면 결합에 의한 선택, 촉매작용-가속화된 이동에 의한 선택, 경쟁에 의한 결합 변화에 의한 선택 또는 메카니즘-기재 억제가 선택에 적용할 수 있다. 그리고, 기질 존재하에 고정된 비-반응성 기질 동족체와 접촉할 때 상이한 결합을 나타내는 샘플(들)(예컨대, 주 분획(들)의 외부를 용출하거나 그에 결합하는 것들)을 표면 결합에 의한 선택, 촉매작용-가속화된 이동에 의한 선택, 온도의 함수로서 엔탈피 성분 변화에 의한 선택, 또는 메카니즘-기재 억제자 선택에 적용할 수 있다.
당업자는 본원에 논의된 억제자, 기질 및 비-반응성 기질 동족체를 당 기술의 다음 지도에 의해 부당한 실험없이 합성할 수 있다(예컨대 33 참조).
다음의 비제한 실시예는 예시를 위해 제공되고 본 발명의 제한이라고는 생각하지 않으며, 본 발명의 정신이나 범위를 이탈하지 않고 많은 명백한 변형이 가능하다. 모든 경우에, 이들을 에스테르 가수분해 반응 외의 반응, 예컨대 펩티드 가수분해, 산화/환원, 첨가, 제거, 축합, 이성질화, 및 전이 반응을 포함한다.
[실시예]
[실시예 1]
[재조합 파지 라이브러리의 구성]
fd 및 M13 파지의 표면 상의 발현을 위한 VH 및 VL 항체 영역의 라이브러리를 PCR 기술 및 적절히 고안된 컨센서스 프라이머를 사용하며 생성한다(1, 2, 3, 4, 11 ; 또한 참고로 본원에 병합된 1992년 1월 23일 공고된 PCT 공고 W0920 1049 참조). PCR 출발 물질은 합텐(I) 으로써 면역화된 생쥐로부터 얻은 비장 RNA 이다. 생쥐 항체 가변 영역의 증폭을 위한 PCR 컨센서스 프라이머의 세트가 아래에 제시되고 또한 이는 앞서 서술된 바 있으며 (2), 이때 SEQ A는 프라이머 서열의 부분적 정렬(SEQ ID NO : 1) 및 VH영역에 대한 코드(SEQ ID NO : 2)를 나타나기 위해 제공된다.
VH 및 VL 영역의 증폭에 이어 두번째 PCR 반응을 사용하여 짧은 펩티드에 의해 함께 영역들을 연결하여 단일 사슬 Fv를 생성한다. 연결 펩티드, PCR 프라이머 및 프로토콜은 앞서 서술된 바 있다 (2). 마지막으로, 세번째 PCR 반응을 사용하여 단일 사슬 Fv 라이브러의 5' 및 3' 말단에 적절한 제한 효소 부위를 가입하여 fd 표면 전시의 경우에 fdDOG1 (2) 또는 M13 표면 전시의 경우에 pComb3 (11)와 같은 파지 전시 발현 벡터내로 클로닝시킨다.
대안적으로, 가변 영역 라이브러리는 또한 면역화안된 생쥐 또는 사람과 같은 다른 포유동물로부터 얻을 수 있다. 이경우의 출발 물질은 비장(생쥐 또는 기타 포유동물) 또는 임파구(사람)로부터의 RNA이다. 증폭과 클로닝을 사람 라이브러리의 경우를 제외하고 상기 서술된 바대로 수행하고 PCR 컨센서스 프라이머의 서열을 생쥐와 사람 가변 영역들 사이의 차이를 반영하도록 변형한다. 사람 컨센서스 프라이머 및 사람 항체 파지 전시 라이브러리의 구성은 앞서 서술된 바 있다 (18).
더우기, 파지 라이브러리가 Fab 라이브러리를 포함하도록, 파지 표면상에서 Fab (scFv에 대한 반대로)의 발현은, 두 사슬 사이의 이황화물 결합의 형성시에 수반된 시스테인 잔기를 함유하는 긴 및 짧은 일정 영역의 부분을 증폭시키기 위하여 상기의 것들과 다른 3' PCR 프라이머의 세트를 사용하여 수행한다 ; 즉 앞서 서술된 바대로 수행한다 (4). Fab 라이브러리의 파지 표면 전시를 위한 벡터는 fd 파지의 경우에 pHenI (19) 그리고 M13의 경우에 pComb3 (11) 및 pTacCP(20)을 포함한다.
이들 기술을 사용하여, 기질 II의 에스테르 가수분해에 있어 합텐 I에 의해 유발된 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분을 발현하는 재조합 파지는 fd 및 M13 파지로부터 생성하고 ; 재조합 파지의 초기 집단은 본원에서 각각 cat1fd 및 cat1M3로 불린다.
[실시예 2]
[메카니즘-기재 억제자 선택]
cat1fd를 함유하는 용액을 결합 합텐으로서 (R을 통한 결합) 일반식 I의 화합물을 함유하는 친화 컬럼(세파로스)를 통과시킨다. 합텐에 결합한 파지 (catfdl)의 1차 부집단은 이어서 컬럼위에 자유로운 파지를 통과시키고 이어서 결합된 합텐을 제거하기 위해 자유로운 합텐 세척에 의해 용출된 파지의 투석에 의해 수집한다. 이 첫번째 부집단(cat1fdl)을 식 II(R1= NO2)의 화합물의 가수분해를 촉매하는 그의 능력에 대해 속도 향상 인자(pH 7.0, 50mM Hepes, 150mM NaCl, 30℃, 0.5-3시간)을 측정함으로써 시험하고 ; 첫번째 부집단은 소량의 촉매 활성을 보인다.
첫번째 부집단(cat1fdl)의 첫번째 부분을 식 II의 화합물의 가수분해를 위한 반응조건 하에 (pH 7.0, 50mM Hepes, 150mM NaCl, 30℃, 0.5-3시간) 식 III (Rs결합없음)의 화합물과 접촉시킨다. 그다음 이 첫번째 부분을 합텐 친화 컬럼 위로 통과시키고, 이 통과에서 컬럼에 결합하지 않은 파지를 수집하고 이를 사용하여 이. 콜라이를 감염시킨다. 이. 콜라이 감염으로부터 결과생성된 파지(cat1fd2)를 식 II (R1=NO2)의 화합물의 가수분해를 촉매하는 능력에 대해 시험하고 (속도증진) (pH 7.0, 50mM Hepes, 150mM NaCl, 30℃, 0.5-3시간) ; cat1fd2는 첫번째 부집단(cat1fdl) 보다 더 큰 촉매 활성(전환수)를 나타낸다.
첫번째 부집단(cat1fdl)의 두번째 부분을 식 II의 화합물의 가수분해를 위한 반응조건 하에 식 Ⅳ (Rs결합없음, X=Br)의 화합물과 접촉시킨다. 그다음 이 두번째 부분을 합텐 친화 컬럼 위로 통과시키고, 이 통과에서 컬럼에 결합하지 않은 파지를 수집하고 이를 사용하여 이. 콜라이를 감염시킨다. 이. 콜라이 감염으로부터 결과생성된 파지(cat1fd3)를 식 II(R1=NO2)의 화합물의 가수분해를 촉매하는 능력에 대해 시험하고 (속도 증진)(pH 7.0, 50mM Hepes, 150mM NaCl, 30℃, 0.5-3시간) ; cat1fd3는 첫번째 부집단(catltdl) 보다 더 큰 촉매 활성(전환수)를 나타낸다.
[실시예 3]
[메카니즘-기재 억제자 선택]
실시예 2의 절차를 사용하여, 첫번째 부집단(cat1fdl)의 세번째 내지 10번째 부분을 식Ⅱ의 화합물의 가수분해를 위한 반응 조건 하에 식 Ⅴ 내지 XI (Rs결합 없음, X=Br)의 화합물과 접촉시킨다. 그다음 각각의 세번째 내지 열번째 부분을 합텐 친화 컬럼 위로 통과시키고(R을 통한 합텐 Ⅰ 결합), 이 통과에서 컬럼에 결합하지 않은 파지를 수집하고 이를 사용하여, 이. 콜라이를 감염시킨다. 이. 콜라이 감염으로부터 결과생성된 파지(cat1fd 4 내지 cat1fd10)를 식 Ⅱ (R1-NO2)의 화합물의 가수분해를 촉매하는 능력에 대해 시험하고 (속도 증진) (pH 7.0, 50mM Hepes, 150mM Nacl, 30℃, 0.5-3시간), 각각의 cat1fd 4 내지 cat1fd10은 첫번째 부집단 (cat1fdl)보다 더큰 촉매 활성 (전환수)을 나타낸다.
[실시예 4]
[메카니즘-기재 억제자 선택]
실시예 2에 서술된 바의 절차를 사용하여, 첫번째 부집단, cat1M13을 합텐 친화 크로마토그래피에 의해 cat1M13으로부터 단리한다. 속도 증진 측정에 의해, cat1M131은 식 II의 화합물의 가수분해에서 소량의 촉매 활성을 보인다.
cat1M131의 첫번째 부집단을 식 II의 화합물의 가수분해를 위한 반응조건 하에 식 III (Rs결합없음)의 화합물과 접촉시킨다. 그다음 이 첫번째 부분을 합텐 친화 컬럼위로 통과시키고, 이 통과에서 컬럼에 결합하지 않은 파지를 수집하고 이를 사용하여 이. 콜라이를 감염시킨다. 이. 콜라이 감염으로부터 결과생성된 파지, cat1fd 132 를 식 II (R1=NO2)의 화합물의 가수분해를 촉매하는 능력에 대해 시험하고 (속도 증진)(pH 7.0, 50mM Hepes, 150mmM NaCl, 30℃, 0.5-3시간) cat1fd 132는 cat1M131보다 더큰 촉매활성 (전환수)을 나타낸다.
cat1M131의 두번째 부분을 식 II의 화합물의 가수분해를 위한 반응 조건하에 식 Ⅳ (Rs결합없음)Ⅳ (Rs결합없음, X=Br)의 화합물과 접촉시킨다. 그다음 이 두번째 부분을 합텐 친화 컬럼위로 통과시키고, 이 통과에서 컬럼에 결합하지 않은 파지를 수집하고 이를 사용하여 이. 콜라이를 감염시킨다. 이. 콜라이 감염으로부터 결과생성된 파지, cat1M 133 을 식 II (R1=NO2)의 화합물의 가수분해를 촉매하는 능력에 대해 시험하고 (속도 증진)(pH 7.0, 50mM Hepes, 150mM NaCl, 30℃, 0.5-3시간) cat1M133는 cat1M 131보다 더 큰 촉매활성 (전환수)을 나타낸다.
[실시예 5]
[메카니즘-기재 억제자 선택]
실시에 4의 절차를 사용하여, 첫번째 부집단(cat1M131)의 세번째 내지 10번째 부분을 식 II의 화합물의 가수분해를 위한 반응 조건 하에 식 Ⅴ내지 XI (Rs결합없음, X=Br)의 화합물과 접촉시킨다. 그다음 각각의 세번째 내지 열번째 부분을 합텐 친화 컬럼 위로 통과시키고(합텐 Ι, R을 통한 결합), 이 통과에서 컬럼에 결합하지 않는 파지를 수집하고 이를 사용하여 이. 콜라이를 감염시킨다. 이. 콜라이 감염으로부터 결과생성된 파지(cat1M134 내지 cat1M1310)를 식의 II (R1= NO2)의 화합물의 가수분해를 촉매하는 능력에 대해 시험하고 (속도 증진) (pH 7.0, 50mM Hepes, 150mM NaCl, 30℃, 0.5-3시간), 각각의 catlM34 내지 cat1M1310은 첫번째 부집단(cat1M131) 보다 더큰 촉매 활성(전환수)을 나타낸다.
[실시예 6]
촉매활성- 가속화된 이동에 의한 선택
실시예 2로부터 첫번째 부집단 cat1fd1의 부분을 브로모페놀 블루와 혼합하여 파지 페이스트를 만든다. 식 Ⅱ(R1=NO2)의 화합물은 임모빌론 AV 막상에 (R1을 통해 )지지된다. 파지 페이스트의 매우 가는 선을 식 Ⅱ의 화합물-임모빌론 AV막을 가로질러 긋는다. 막을 촉촉한 (50-100% 상대습도)환결에서 25℃에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션후에, 현미경의 도움으로, 레이저를 사용하여 원래 선으로부터 파지 0.10mm를 긁어 수집한다. 수집된 파지, cat1fd11을 화합물 Ⅱ(R1=NO2) (pH 7.0, 50mM Hepes, 150mM NaCl, 30℃, 0.5-3시간)의 가수분해를 촉매하는 능력에 대한 시험하고 ; cat1fd11은 cat1fd1 보다 더 큰 촉매 (전환수)활성을 보인다.
[실시예 7]
촉매활성- 가속화된 이동에 의한 선택
실시예 6의 절차를 사용하여, 실시예 6로부터 첫번째 부집단 cat1M131을 브로모페놀 블루와 혼합하여 파지 페이스트를 만들고 파지 페이스트의 매우 가는 선을 식 Ⅱ의 화합물-임모빌론 AV막을 가로질러 긋는다. 인큐베이션(50-100% 상대습도 25℃에서 48시간)후에, 현미경의 도움으로, 레이져를 사용하여 원래 선으로부터 파지 0.10mm를 긁어 수집한다. 수집된 파지, cat1M1311을 화합물 Ⅱ(R1=NO2) (pH 7.0, 50mM Hepes, 150mM NaCl, 30℃, 0.5-3시간)의 가수분해를 촉매하는 능력에 대한 시험하고 ; cat1M1311은 cat1M131 보다 더 큰 촉매 (전환수)활성을 보인다.
[실시예 8]
표면 결합에 의한 선택
실시예 2로부터 첫번째 부집단 cat1fd1의 부분을 식 Ⅱ-임모빌론 AV막 (실시예 6)에 용액으로서 첨가하고 2분 내지 10분 후에 막을 신속하게 완충액 (용액과 동일)으로 세척한다 (1-5초) 이렇게 세척하여 기질에 약하게 결합하거나 결합하지 않은 임의 파지를 제거하고 따라 버린다. 촉촉한 막을 12시간 동안 1시간, 3시간, 6시간 및 12시간 째에 신속하게 1-5초 세척하면서(용액과 동일한 완충액)인큐베이션한다(25℃, rh 50-100%) ; 이를 세척물을 수집하고, 농축하고 사용하여 이. 콜라이를 감염시킨다. 이.콜라이 감염으로부터 결과생성된 파지, cat1fd12를 식 Ⅱ (R1=NO2)의 화합물의 가수분해를 촉매하는 능력에 대해 시험하여(속도 증진)(pH 7.0, 50mM Hepes, 150mM NaCl, 30℃, 0.5-3시간); cat1fd12은 cat1fd1 보다 큰 촉매 활성(전환수)를 나타낸다.
[실시예 9]
표면 결합에 의한 선택
실시예 4로부터 첫번째 부집단 cat1M131의 부분을 식 Ⅱ-임모빌론 AV막 (실시예 6)에 용액으로서 첨가하고 2분 내지 10분 후에 막을 신속하게 완충액 (용액과 동일)으로 세척한다 (1-5초) 세척물을 따라 버린다. 촉촉한 막을 12시간동안 1시간, 3시간, 6시간 및 12시간 째에 신속하게 1-5초 세척하면서(용액과 동일한 완충액)인큐베이션한다(25℃, rh 50-100%) ; 이를 세척물을 수집하고, 농축하고 사용하여 이. 콜라이를 감염시킨다. 이.콜라이 감염으로부터 결과생성된 파지, cat1M1312를 식 Ⅱ (R1=NO2)의 화합물의 가수분해를 촉매하는 능력에 대해 시험하여 (속도 증진)(pH 7.0, 50mM Hepes, 150mM NaCl, 30℃, 0.5-3시간); cat1M1312은 cat1M131 보다 큰 촉매 활성(전환수)를 나타낸다.
[실시예 10]
온도의 함수로서 결합의 엔탈피 성분 변화에 의한 선택
실시예 1에서 처럼 cat1fd를 결합은 일어날 수 있으나 촉매 작용은 일어나지 않는 식 Ⅱ (R1=NO2, R1을 통한 결함)의 화합물의 컬럼 (세파로스)위로 통과시키고 ; 분획을 수집한다. 37℃에서 분획을 다시 화합물 식 Ⅱ 컬럼위로 통과 시키고, 분획을 다시 수집한다. 흡광도를 사용하여, (결합과 온도 사이에 비선형 관계인) cat1fd의 최저 농도를 함유하는 분획을 단리하고 사용하여 이. 콜로이를 감염시킨다. 이. 콜라이 감염으로 부터결과생성된 파지, cat1fd13을 식 Ⅱ(R1=NO2)의 화합물의 가수분해를 촉매하는 능력에 대해 시험하여 (속도증진)(pH 7.0, 50mM Hepes, 150mM NaCl, 30℃, 0.5-3시간); cat1fd13은 cat1fd1 보다 더 큰 촉매 (전환수)활성을 나타낸다.
[실시예 11]
[온도의 함수로서 결합의 엔탈피 성분 변화에 의한 선택]
실시예 1에서 처럼 cat1M13를 결합은 일어날 수 있으나 촉매 작용은 일어나지 않는 -20℃에서 식 Ⅱ (실시예 14에서 처럼)의 화합물의 컬럼 (세파로스)위로 통과시키고 ; 분획을 수집한다. 37℃에서 분획을 다시 화합물 식 Ⅱ 컬럼위로 통과 시키고, 분획을 다시 수집한다. 흡광도를 사용하여, (결합과 온도 사이에 비선형 관계인) cat1fd의 최저 농도를 함유하는 분획을 단리하고 사용하여 이. 콜로이를 감염시킨다. 이. 콜라이 감염으로 부터 결과생성된 파지, cat1fd1313을 식 Ⅱ(R1=NO2)의 화합물의 가수분해를 촉매하는 능력에 대해 시험하여 (속도증진)(pH 7.0, 50mM Hepes, 150mM NaCl, 30℃, 0.5-3시간); cat1fd1313.
[실시예 12]
[경쟁에 의한 결함 변화에 의한 선택]
실시예 1에서 처럼 cat1fd를 식 XXI (R1을 통한 결합)의 화합물의 컬럼(세파로스) 위로 통과시키고 식 XXI의 화합물을 함유하는 완충액으로 용출시킨다. 분획을 수집하고 농축시킨다. 이들 분획을 하나하나씩 동일한 컬럼에 적용하고 기질 (식 Ⅱ(R1=NO2)의 화합물)로써 용출시킨다.
2차원 분리 분포는 정규화된 1도에 도시된 바이다 : 두번째 컬럼 통과시의 파지 부피는 첫번째 컬럼 통과에서와 대랸 같은 지체도를 갖는 주 피크로서 용출한다. 상기 부피보다 나중에 용출하는 파지를 단리하고 모으고 사용하여 이. 콜라이를 감염시킨다. 이. 콜라이 감염으로부터 결과 생성된 파지, cat1fd14를 식 Ⅱ(R1=NO2)의 화합물의 가수분해를 촉매하는 능력에 대해 시험하여 (속도증진)(pH 7.0, 50mM Hepes, 150mM NaCl, 30℃, 0.5-3시간); cat1fd14은 cat1fd1 보다 더 큰 촉매 활성(전환수)를 나타낸다.
[실시예 13]
[결합 경쟁에서 변화에 의한 선택]
실시예 12의 절차를 사용하여, cat1fd의 부가적 분량 각각을 각각 컬럼 위로 통과시킨다. 각 컬럼은 식 XXII 내지 XXX 및 XXXII (R1을 통한 결합)의 화합물이다. 각 분량은 컬럼에 결합된 각각의 비-반응성 기질 동족체로써 용출시킨다. 그 다음 각 용출로부터의 분획들을 그것들이 용출된 동일한 컬럼에 적용하여 이 시간에 기질과 함께 용출된다 (식 Ⅱ의 화합물, R1=NO2). 각각에 대한 이차원 분리 분포는 정규화된 1 도에 도시된 바이다. 각 용출로부터 나중에 용출하는 파지를 하나하나 단리하고 모으고 사용하여 이. 콜라이를 감염시킨다. 이. 콜라이 감염으로부터 결과 생성된 파지, cat1fd14를 식 Ⅱ(R1=NO2)의 화합물의 가수분해를 촉매하는 능력에 대해 시험하여 (속도증진)(pH 7.0, 50mM Hepes, 150mM NaCl, 30℃, 0.5-3시간); 각각의 cat1fd15은 cat1fd1 보다 더 큰 촉매 활성 (전환수)를 나타낸다.
[실시예 14]
[경쟁에 의한 결함 변화에 의한 선택]
실시예 12에서 처럼 cat1M13를 식 XXI (R1을 통한 결합)의 화합물의 컬럼(세파로스) 위로 통과시키고 식 XXI의 화합물을 함유하는 완충액으로 용출시킨다. 분획을 수집하고 농축시킨다. 이들 분획을 하나하나씩 동일한 컬럼에 적용하고 기질 (식 Ⅱ(R1=NO2)의 화합물)로써 용출시킨다.
2차원 분리 분포는 정규화된 1 도에 도시된 바이다 : 두번째 컬럼 통과시의 파지 부피는 첫번째 컬럼 통과에서와 대략 같은 지체도를 갖는 주 피크로서 용출한다. 상기 부피보다 나중에 용출하는 파지를 단리하고 모으고 사용하여 이. 콜라이를 감염시킨다. 이. 콜라이 감염으로부터 결과 생성된 파지, cat1M1314를 식 Ⅱ(R1=NO2)의 화합물의 가수분해를 촉매하는 능력에 대해 시험하여 (속도증진)(pH 7.0, 50mM Hepes, 150mM NaCl, 30℃, 0.5-3시간); 각각의 cat1M1314은 cat1M131 보다 더 큰 촉매 활성 (전환수)를 나타낸다.
[실시예 15]
경쟁에 의한 결함 변화에 의한 선택
실시예 21의 절차를 사용하여, cat1M13의 부가적 분량 각각을 각각 컬럼 위로 통과시킨다. 각 컬럼은 식 XXII 내지 XXX 및 XXXII (R1을 통한 결합)의 화합물이다.각 분량은 컬럼에 결합된 각각의 비-반응성 기질 동족체로써 용출시킨다. 그 다음 각 용출로부터의 분획들을 그것들이 용출된 동일한 컬럼에 적용하여 이 시간에 기질과 함께 용출된다 (식 Ⅱ의 화합물, R1=NO2). 각각에 대한 이차원 분리 분포는 정규화된 1 도에 도시된 바이다. 각 용출로부터 나중에 용출하는 파지를 하나하나 단리하고 모으고 사용하여 이. 콜라이를 감염시킨다. 이. 콜라이 감염으로부터 결과 생성된 파지, cat1fd14를 식 Ⅱ(R1=NO2)의 화합물의 가수분해를 촉매하는 능력에 대해 시험하여 (속도증진)(pH 7.0, 50mM Hepes, 150mM NaCl, 30℃, 0.5-3시간); 각각의 cat1M1323은 cat1M131 보다 더 큰 촉매 활성(전환수)를 나타낸다.
[실시예 16]
[파지 라이브러리의 구성]
1991년 10월 10일 출원된 미합중국 출원 일련번호 07/773, 042에 나열된 절차를 사용하여, 생쥐를 합텐 ⅠA 또는 ⅠB로써 면역화시켜 5-플루오로리딘을 생성하는 화합물 ⅡA 또는 ⅡB의 가수분해를 촉매하는 촉매항체를 유발한다.
실시예 1의 절차, 면역화된 생쥐로부터의 비장 RNA, 증폭을 위한 PCR 컨센서스 프라이머, 짧은 펩티드에 의해 영역들을 연결시켜 단일 사슬 Fv를 생성하는 PCR, 단일 사슬 Fv 라이브러리의 5' 및 3' 말단에 제한 효소 부위를 삽입하는 PCR, 및 fd의 각각의 파지 전시 벡터 내로의 클로닝을 사용하여, 람다 및 M13을 사용하여 합텐 ⅠA 또는 ⅠB에 의해 유발된 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분을 발현하는 제조합 파지를 생산하거나 ⅡA 또는 ⅡB의 에스테르 가수분해를 위해 사용하고 ; 여시고 이들 제조합 파지의 초기 집단은 각각 cat2fd, ca2λ및 cat2M13으로 부른다.
[실시예 17]
[메카니즘-기재 억제자 선택 : 첫번째 집단의 생성]
cat2fd를 함유하는 용액을 결합 합텐으로서 (NH2을 통한 결합) 일반식 ⅠA의 화합물을 함유하는 친화 컬럼(세파로스)를 통과시킨다. 합텐에 결합한 파지 (cat2fd1A)의 1차 부집단은 이어서 컬럼위에 자유로운 파지를 통과시키고 이어서 결합된 합텐을 자유로운 합텐 세척에 의해 용출된 파지의 투석에 의해 수집한다. 이 첫번째 부집단 (cat2fd1A)을 식 Ⅱa 및 ⅡB의 두 화합물의 가수분해를 촉매하는 그의 능력에 대한 속도 향상 인자 (pH 7.0, 50mM Hepes, 150mM NaCl, 30℃, 0.5-3시간)을 측정함으로써 시험하고 : 첫번째 부집단은 소량의 촉매 활성을 보인다. 이 절차를 결합 합텐이 식 ⅠB의 화합물인 것을 제외하고 cat2fd를 함유하는 또다른 용액에 대해 반복한다. 반복된 절차로부터의 첫번째 부집단, cat2fd1B는 또한 식 ⅡA 및 ⅡB의 두 화합물의 가수분해에 약간의 촉매 활성을 보인다. cat2fd1A 및 cat2fd1B를 첫번째 부집단, cat2fd1에 의해 모은다.
동일 방식으로 cat2M13으로부터의 첫번째 부집단, 즉 cat2M131이 생성된다. cat2M131 뿐만아니라 그들이 발생된 부집단 (cat2M131A 및 cat2M131B)은 식 ⅡA 및 ⅡB의 두 화합물의 가수분해에 약간의 촉매 활성을 보인다.
[실시예 18]
[메카니즘-기재 억제자 선택]
첫번째 부집단 cat2fd1의 첫번째 부분을 상기 서술된 바대로 식 ⅡA 또는 ⅡB의 화합물의 가수분해를 위한 반응 조건 하에 (pH 7.0, 50mM Hepes, 150mM NaCl, 30℃, 0.5-3시간), 세파로스 컬럼에 공유 결합된 식 ⅩⅡ의 화합물과 접촉시킨다. 용출되는 것을 수집하고 따라 버린다. 온화한 무기산 (HC1) 용액 (pH4-5)을 컬럼 위로 통과시키고 이로써 용출된 DNA를 이. 콜라이 트랜스펙션에 사용한다. 이. 콜라이 감염으로부터 결과생성된 파지를 (cat2fd2) 식 ⅡA 및 ⅡB의 두 화합물의 가수분해를 촉매하는 능력에 대해 시험하여 (속도증진) (pH 7.0, 50mM Hepes, 150mM NaCl, 30℃, 0.5-3시간) ; cat2fd2는 첫번째 부집단 (catfd1)보다 큰 촉매 활성(전환수)를 나타낸다.
[실시예 19]
[메카니즘-기재 억제가 선택]
실시예 18의 절차에 따라, 두번째 부집단, cat2M123은 첫번째 부집단 cat2M131의 부분으로 부터 생성하고 촉매 활성에 대해 시험한다. cat2M123은 cat2M131 보다 큰 촉매 활성을 나타낸다.
[실시예 20]
[메카니즘-기재 억제자 선택 ]
식 XⅢ 내지 XX의 화합물이 컬럼에 결합되는 것을 제외하고 실시예 18의 절차에 따라, 두번째 부집단 cat2fd3 내지 cat2fd10을 각각 (식 XⅢ-XX의 화합물을 사용함) 첫번째 부집단 cat2fd1의 부분으로부터 생성하고 촉매 활성에 대해 시험한다. 각각의 cat2fd3 내지 cat2fd10은 cat2fd1 보다 큰 촉매 활성을 나타낸다.
[실시예 21]
[메카니즘-기재 억제자 선택]
실시예 20의 절차에 따라, 두번째 부집단 cat2133 내지 cat2M1310을 각각 식 XⅢ-XX의 화합물을 사용을 통해 첫번째 부집단 cat2M131의 부분으로부터 생성하고 ; 두번째 부집단을 촉매 활성에 대해 시험한다. 각각의 cat2M133 내지 cat2M1310은 cat2M131 보다 큰 촉매 활성을 나타낸다.
상기 실시예는 본 발명의 실시양태의 놀라운 장점을 증명한다 : 촉매를 비촉매로부터 선택하거나 농축할 수 있고, 더 우수한 촉매가 얻어진다.
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[서열목목]
(1) 일반 정보 :
(i) 출원인 : Martin, Mark T.
Smith, Rodger G.
Darsley, Michael J.
Simpson, David
Blackburn, Gary F.
(ii) 발명의 명칭 : 촉매 성분의 발현 및 농축을 위한 반응 기재 선택
(iii) 서열 수 : 4
(iv) 서신 주소 :
(A) 수신인 : Curtis, Moris & Safford, P.C.
(B) 거리 : 530 Fifth Avenue
(C) 도시 : New York
(D) 주 : New YOrk
(E) 국가 : United States
(F) 우편번호 : 10036
(v) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 형태 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종
(C) 운영 체계 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Relese # 1.0, Version #1.25
(vi) 현 출원 정보 :
(A) 출원 번호 :
(B) 출원인 :
(C) 분류 :
(viii) 대리인 정보 :
(A) 이름 : Evans, Barry
(B) 등록번호 : 22, 802
(C) 참고번호 : 370068-3581
(ix) 장거리 통신 정보 :
(A) 전화 : (212) 840-3333
(B) 텔레팩스 : (212) 840-0712
(2) SEQ ID NO : 1에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 22 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : SEQ ID NO : 1 :
AGGTGAAACT GCAGGAGTCA GG
(2) SEQ ID NO : 2에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 32 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : SEQ ID NO : 2 :
TGAGGAGACG GTGACCGTGG TCCCTTGGCC CC
(2) SEQ ID NO : 3에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : SEQ ID NO : 3 :
GACATTGAGC TCACCCAGTC TCCA
(2) SEQ ID NO : 4에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 97 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : SEQ ID NO : 4 :
CCGTTTGATT TCCAGCTTGG TGCCCCGTTT TATTTTCCAG CTTGGTCCCC CGTTTTATTT CCAACTTTGT CCCCCGTTTC AGCTCCAGCT TGGTCCC
본 발명의 바람직한 실시양태가 상세히 서술되지만, 첨부된 청구범위에 정의된 본 발명은 그의 명백한 변형이 본 발명의 정신이나 영역으로부터 벗어나지 않고 가능하므로 상기 서술에서 나열된 특정 상세한 설명으로 제한되지 않음은 물론이다.

Claims (15)

  1. 촉매 성분을 발현하는 비루스 또는 유기체를 포함한다고 추정되는 재조합 비루스 또는 유기체의 집단의 표면-결합 촉매 성분에 의해 촉매 활성에 대한 반응-기초 선택을 하고, 상기 집단으로부터 촉매로 작용할 수 있는 부집단을 단리하는 것으로 구성되는, 표면-결합 촉매 성분을 발현할 수 있는 재조합 비루스 또는 유기체 집단의 선택 방법.
  2. 제1항에 있어서, 촉매 활성에 대한 선택은 집단을 원하는 촉매 반응의 기질을 포함하는 표면과 접촉시키는 것으로 이루어지며, 상기 접촉은 상기 표면의 첫번째 지점에서 있고 촉매 활성을 갖는 상기 집단의 성원이 통과하기에 충분한 시간을 주어 표면 상의 두번째 지점으로 거리를 이동하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 부집단의 단리는 표면 상의 두번째 지점으로 부터 집단의 성원을 수집하는 것으로 이루어지는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 촉매 활성을 갖는 집단의 성원의 이동을, 표면에 전기장을 적용함으로써 증진시키는 방법.
  5. 샘플을 원하는 촉매 반응의 기질을 포함하는 표면과 접촉시키고, 상기 접촉은 상기 표면상의 첫번째 지점에서 있고, 그리고 촉매 활성을 갖는 상기 샘플의 성원이 통과하는데에 충분한 시간을 주어 표면상의 두번째 지점으로 거리를 이동하게 하고, 기질과의 반응을 기초로 하여 상기 샘플로부터 첫번째 샘플을 선택하고, 첫번째 샘플보다 더 높은 비율의 촉매 성분 대 비-촉매 성분을 갖는 두번째 샘플을 상기 첫번째 샘플로부터 단리시키는 것으로 구성되는, 샘플내 촉매성분 대 비-촉매 성분의 비율을 증가시키는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 촉매 활성에 대한 선택은 샘플을 촉매 반응의 원하는 기질을 포함하는 표면과 접촉시키는데, 이때 상기 접촉은 상기 표면상의 첫번째 지점에서 있고, 촉매 활성을 갖는 상기 샘플의 성분이 통과하기에 충분한 시간을 주어 표면 상의 두번째 지점에로 거리를 이동시키는 것으로 구성되는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 두번째 샘플의 단리는 표면 상의 두번째 지점으로부터 성분들을 수집하는 것으로 구성되는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 촉매 활성을 갖는 성분의 이동을, 표면에 전기장을 적용함으로써 증진시키는 방법.
  9. 제5, 6, 7 또는 8항중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 촉매 성분을 발현하는 집단을 포함하며, 재조합 비루스, 비루스를 포함한다고 추정되는 유기체 및 촉매 성분을 발현하는 다른 유기체의 집단으로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  10. 제9항에 있어서, 촉매 성분이 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분인 방법.
  11. 제1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8항중 어느 한 항에 있어서, 촉매 성분이 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분인 방법.
  12. 촉매 성분을 발현하는 비루스 또는 유기체를 포함한다고 추정되는 재조합 비루스 또는 유기체의 집단을 선택된 분자에 대한 결합으로 선택하고, 상기 집단으로 부터 선택된 분자에 결합할 수 있는 첫번째 부집단을 단리하고, 촉매활성에 대해 상기 첫번째 부집단을 반응-기재 선택하고, 상기 첫번째 부집단으로부터 촉매로 반응할 수 있는 두번째 부집단을 단리하는 것으로 구성되는, 표면-결합 촉매 성분을 발현할 수 있는 재조합 비루스 또는 유기체 집단의 선택 방법.
  13. 촉매 성분을 발현하는 비루스를 포함한다고 추정되는 재조합 비루스의 집단을 선택된 분자에 대한 결합으로 선택하고, 상기 집단으로부터 선택된 분자에 결합할 수 있는 첫번째 부집단을 단리하고, 표면-결합 촉매 성분에 의해 촉매 활성에 대해 상기 첫번째 부집단 반응을 기초하여 선택하고, 상기 첫번째 부집단으로부터 촉매로 작용할 수 있는 두번째 부집단을 단리하고, 재조합 비루스에 의해 감염되기 쉬운 숙주를 두번째 부집단의 비루스로써 감염시키는 것으로 구성되는, 표면-결합 촉매 성분의 발현이 가능한 재조합 비루스 또는 세포계 생산 방법.
  14. 제12 또는 제13항중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분인 촉매 성분을 발현하는 실질적으로 순수한 재조합 비루스 집단.
  15. 제13항의 방법에 의해 생산된 촉매 항체 또는 그의 촉매 부분인 촉매 성분을 발현하는 실질적으로 순수한 세포계.
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