CN104644627A - 基于基因靶向使用布新洛尔的治疗方法 - Google Patents

基于基因靶向使用布新洛尔的治疗方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及应用评估布新洛尔治疗患者、尤其是心力衰竭患者的方法的用途。它涉及基于患者β1-肾上腺素能受体(AR)中Arg 389多态性是否纯合来确定是否向患者施用或处方布新洛尔的方法。

Description

基于基因靶向使用布新洛尔的治疗方法
本申请是申请号为200580038580.2的中国专利申请的分案申请，原申请是2005年9月14日提交的PCT国际申请PCT/US2005/032901于2007年5月11日进入中国国家阶段的申请。
发明背景
本申请要求在2004年9月14日提交的美国临时专利申请60/609,689和在2004年9月17日提交的美国临时专利申请60/610,706的优先权，它们通过引用整体并入本文中。
根据国家卫生研究院(the National Institutes of Health)的资助HL052318、HL07071609、ES06096、HL071118、和HL48013，政府可能拥有本发明中的权利。
技术领域
本发明涉及药物遗传学和心脏病学。更具体的是，本发明涉及基于患者肾上腺素能受体基因中多态性的基因型应用布新洛尔的个体化心力衰竭治疗的方法，其中所述肾上腺素能受体基因包括β1-肾上腺素能受体(β1AR)基因和α2c-肾上腺素能受体(α2cAR)基因。
背景技术
根据美国心脏协会(the American Heart Association，AHA)，大约六千二百万美国人有某种形式的心血管病，其可包括高血压、冠心病(心脏病发作和胸痛)、中风、心脏和血管的出生缺陷、和充血性心力衰竭，并且每年有接近上百万人死于这些病症。AHA的年报还说心血管病造成的美国人死亡人数比接下来包括癌症的7种死亡原因的总和还多。意外的是，在总体上心血管病的女性患者稍多于男性患者。美国在1999年，心脏病占所有死亡的40％。尽管最近治疗方法已有发展，但是在5年内心力衰竭的死亡率还是接近50％。
单在美国就有近六百万人患有慢性心力衰竭(“HF”)，大约占人口的1.5％，并且每年确诊550,000名新患者。尽管在治疗HF上医学疗法已取得很大进步，但是发病率和死亡率仍然很高(Mann et al.，2005)。当前对HF的标准护理方法涉及应用肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的抑制剂(ACE抑制剂、ARB、和/或醛固酮受体拮抗剂)、和竞争性抑制心肌细胞上β-肾上腺素能受体的β-阻断剂。β-阻断剂在降低死亡率方面是有效的并且被认为是总体上最有效的HF药物类型，但是仍然只对50-60％的治疗患者有作用。此外，关于已批准β-阻断剂在死亡率试验中疗效的美国患者临床数据不是非常吸引人的，来自唯一大规模、意向性治疗死亡率试验中的公开数据显示，在美国患者中的死亡率与安慰剂相比有增加。
因此，对于改进的HF治疗有实质性需要，这些改进的HF治疗具有更高疗效和响应速率、被更好地耐受、并且更好地适合于具有特殊需要如糖尿病的亚群体。然而，针对这种治疗背景开发新药剂已经证明面临极大的挑战。从2001年以来，在HF的13个III期临床试验中，只有三个是正面的。这些正面试验中的两个应用ARB(坎得沙坦，candesartan)(McMurray et al.，2003；Granger et al.，2003)。第三个正面试验，应用BiDil(二硝酸异山梨酯和肼苯哒嗪的组合)的A-HeFT试验是一个亚组试验(非裔美国人)，其中只包含12％的美国HF人群(Taylor et al.，2004)。清楚的是，需要继续开发新一代HF药物。
虽然应用β1激动剂治疗急性恶化的心室功能衰竭患者，但是延长心脏与所施用激动剂的接触、或由身体产生儿茶酚胺的升高导致更加恶化心力衰竭。相比之下，β-肾上腺素能受体拮抗剂(被称为β-阻断剂)已经作为主要的治疗模式在慢性心力衰竭中应用。
在二十世纪九十年代早期，一组在心力衰竭中应用β-阻断剂的美国心力衰竭研究人员判断，为了证实这种仍有争议的疗法，需要进行死亡率试验。一个美国小组起草了一个方案和基金申请，此申请随后被VA合作临床研究计划和NHLBI批准资助。经批准的方案没有具体规定药物，而是规定基于II期数据成果和强度的潜力选择最佳β-阻断剂。所考虑的药物是卡维地洛、酒石酸美多心安、琥珀酸美多心安CR/XL、和布新洛尔。酒石酸美多心安被排除，因为在MDC试验中酒石酸美多心安对死亡率的效果低于期望(Waagstein et al.，1993)；不选择琥珀酸美多心安CR/XL，因为它缺少在心力衰竭中疗效和耐受性的数据；不选择卡维地洛，部分是因为它在晚期心力衰竭中耐受性差(Krum et al.，1995)。基于布新洛尔的优异耐受性(Eichliorri et al.，1997；Gilbert et al.，1990；Bristow et al.，1994；Pollock et al.，1990)、疗效(Gilbert et al.，1990；Bristowet al.，1994；Pollock et al.，1990；Eichhorn et al.，1990)、和发起人的关注水平，布新洛尔是选择委员会的一致选择。布新洛尔因此成为β-阻断剂生存率评价试验(“BEST”)的对象，这是计划并启动的第一个HF死亡率试验。
BEST试验在1995年开始，在1999年结束。启动BEST后，计划并启动了另外三个死亡率试验，应用琥珀酸美多心安CR/XL的MERIT-HF(MERIT-HF Study Group，1999)、应用比索洛尔的CIBIS-II(CIBIS-II Investigators，1999)、和应用卡维地洛的COPERNICUS(Packer et al.，2002)。由于这些试验入组更快速和限制更少，CIBIS-II和MERIT-HF在BEST之前完成，并且这两个试验都获得了正面结果。
BEST试验在完成之前，在1999年被过早地结束，这部分是由于研究人员失去了均衡，以及基于对其他两个正面试验的了解而对开放β-阻断剂标签的比例持续增加(BEST Trial Investigators，2001；Domanski etal.，2003)。发起人基于在试验停止时的已知结果没有选择继续进行布新洛尔的商业开发。尽管BEST研究人员在第3类(Class III)非-非裔美国人中观察到有益结果，这与六个月前CIBIS II和MERIT-HF中所报导的正面结果相似，研究人员在第4类(Class IV)和非裔美国人患者中观察到较差的结果。此外，当试验停止时，BEST没有满足它的全部原因死亡率的主要研究终点(降低10％，p＝0.10)(BEST TrialInvestigators，2001)。研究人员推测在其它β-阻断剂和布新洛尔之间的差异也许可归因于“布新洛尔独特的药理学特性”(BEST Trial Investigators，2001)，这突出了该多样性类型化合物的化学和功能特性中间所观察到的差别。
此外，即使在心力衰竭中大部分β-阻断剂已经显示出分组有益的效果，但是在不能由基线临床特征解释的结果中有很大的个体间差异(CIBIS-II Investigators，1999)。事实上对于几乎所有药物都发现了在对药物疗法的反应中的个体间差异。在某些情形比如用β-阻断剂治疗发病率和死亡率都高的慢性心力衰竭中，滴定算法是复杂的，个体间差异是大的，并且存在另外的治疗选项，于是评估对药物疗法的有利(或不利)长期反应的可能性对决策有重要的影响。心力衰竭患者近50％的5年死亡率已经促使对治疗选择的大量研究并且已经产生多药物方案，其中通常包括β-阻断剂、血管紧张素转化酶抑制剂(或血管紧张素受体拮抗剂)、利尿剂、和地高辛。在相对稳定患者中，以低剂量(即约10mg)起始β-阻断剂治疗，并在几个月期间缓慢增加到靶剂量或者可耐受剂量。在向上滴定期间，其它药物的剂量调整、或额外药物的起始并非不常见。因此用β-阻断剂治疗心力衰竭的方法必须被个体化。事实上，“给药必须被个体化并且被严密监测”的声明可以在美国批准用于治疗心力衰竭的两种β-阻断剂制剂的处方信息中发现。此外，在动物模型和人中的研究显示衰竭心脏的细胞和整体重建的β-阻断剂促进的逆转可能需要几个月的稳定治疗(Lowes et al.，2002)。已经注意到对β-阻断剂反应的实质性差异，包括左心室射血分数(LVEF)变化(van Campen et al.，1998)、运动耐量(Bolger，2003)和生存率(Packe et al.，2001)。然而，基于数据重要性，应考虑用β-阻断剂治疗大部分慢性心力衰竭患者，其中假设没有禁忌症比如体积过载(volumn overload)、需要变力性输注(inotropic infusions)、心动过缓、血液动力学不稳定性、和哮喘。
因此，不但在各种β-阻断剂之间，尤其是布新洛尔与其它β-阻断剂相比，可感觉到差异，而且在不同患者偏向对特定β-阻断剂治疗发生反应的能力方面也观察到差异。需要对布新洛尔治疗价值的证据，尤其是解释这些个体间差异的证据。
发明内容
本发明提供基于对影响个体对布新洛尔反应的肾上腺素能受体中多态性的鉴定从而针对个体化心血管疾病治疗的方法。在某些实施方案中，它涉及针对心力衰竭的个体化治疗。
在某些实施方案中，提供评估布新洛尔治疗患者的方法，其包括获取患者肾上腺素能受体基因中有关至少一个多态性的序列信息，其中所述信息可以预示布新洛尔在患者中的疗效。序列信息可以是核酸序列信息和/或氨基酸序列信息。在特定实施方案中，肾上腺素能受体基因是β1AR或α2cAR。在某些情况中，获取两个基因中有关多态性的序列信息。
此外，所述多态性包括在β1-肾上腺素能受体(β1AR)基因中1165位核苷酸上的一个，其对应所编码蛋白质中389位氨基酸，另一个在α2cAR基因的964-975位核苷酸上，其对应所编码蛋白质中322-325位氨基酸。
本发明是基于发明人确定，如果编码基因产物中389位精氨酸的β1AR基因是纯合的，就向患者提供可服从布新洛尔治疗的生理条件。此外，本发明是基于确定，导致基因产物322-325位氨基酸缺失的α2cAR基因中的缺失对于用布新洛尔治疗晚期心力衰竭是有害的。术语“治疗”应理解为对有关诊断为心血管疾病的患者或有心血管症状患者的治疗，与预防性措施相对。
通常地理解是多态性出现在基因背景下；然而，在多态性影响所编码基因产物的情况中，在该基因产物中的变化也可以被称为多态性。
根据本发明，所述方法包括评估是否开处方或者施用布新洛尔给心血管疾病患者，其包括从患者获取有关他/她的肾上腺素能受体基因中、和/或影响对布新洛尔反应的其编码基因产物中多态性的信息。
因此，本发明涉及直接地或通过确定β1AR基因上1165位和/或α2cAR基因上964-975位核苷酸序列推导来获取有关β1AR和/或α2cAR蛋白质中多态性的信息，和基于所获取的信息开处方或施用布新洛尔。应该理解的是，对于β1AR或α2cAR蛋白质的同族核酸包括编码所述蛋白质的mRNA转录物、从所述mRNA转录物产生的任意cDNA的两条链、和关于β1AR或α2cAR基因的基因组DNA的两条链。
对心血管病患者在β1AR的389位和/或α2cAR的322-325位具有哪种多态性的知识提供了评估是否施用或开处方布新洛尔给患者的基础。
本发明还鉴别将对应用β-阻断剂尤其是布新洛尔的治疗有积极反应的心力衰竭患者。
本发明还提供给需要这种治疗的个体递送β-阻断剂尤其是布新洛尔的装置和组合物。
本发明的方法包括确定心力衰竭患者在个体的β1AR基因上的基因型，其中如果患者不是β1Gly389的携带者(即，有一个或两个Gly389等位基因)，那么患者可能对标准剂量的布新洛尔显示积极的反应。在一个实施方案中，开处方布新洛尔给β1Arg389纯合的心力衰竭患者。本发明的方法还可以考虑，在知道患者是“纯合β1Arg389”的基础上，即意味着患者的两个β1AR基因都编码基因产物中389位精氨酸，在此基础上开处方或施用标准剂量的布新洛尔给需要这种治疗的患者。本发明的方法涉及开处方或施用布新洛尔给纯合β1Arg389患者，并且这是无论如何确定，患者具有该基因型。
在另外的实施方案中，本发明的方法包括确定心力衰竭患者在个体α2cAR基因上的基因型，其中如果患者不是α2cDel322-325的携带者，那么患者可能对标准剂量的布新洛尔显示出积极的反应。在某些实施方案中，布新洛尔被处方给α2c中322-325位氨基酸是纯合野生型(即，氨基酸没有缺失)的心力衰竭患者。本发明的方法还可以考虑，在了解患者是“纯合野生型α2cAR”的基础上，即患者在编码α2cAR中322-325位氨基酸的α2cAR基因序列中没有缺失，在此基础上开处方或施用标准剂量的布新洛尔给需要这种治疗的患者。本发明的方法涉及开处方或施用布新洛尔给对于缺失是纯合野生型的患者(不是缺失携带者)并且这不考虑如何确定患者的基因型。
在某些情形中的考虑是，患者可以对这些多态性之一进行基因型分析，随后接着确定另外的多态性；在这种情形中，评估两个不同的样本。作为替代，可以获得单个样本并评估两种分开的多态性。在另一个实施方案中，布新洛尔被处方给具有纯合β1Arg389和纯合野生型α2cAR双基因型(diplotype)的心力衰竭患者。本发明的方法还可以考虑，在了解患者对于β1Arg389或对于野生型α2cAR、或双基因型组合是纯合的基础上，开处方或施用标准剂量的布新洛尔给需要这样治疗的患者。
本发明的方法还包括，在根据个体相对于β1AR基因上Arg389是否为纯合的(并且不是389Gly携带者)和/或对于α2cAR基因而言个体是否为纯合野生型并且不是α2cDel322-325携带者的基础上，确定个体是否具有相似病理生理状态、比如但不限于扩张性心肌病、缺血性心肌病、缺血性心脏病(心绞痛(angina)、心肌梗塞)、嗜铬细胞瘤、偏头痛、心律失常、高血压和各种焦虑症(焦虑症)可能对标准剂量布新洛尔有积极的反应。
在某些实施方案中，本发明涉及用于评估布新洛尔治疗患者的方法，其包括了解(i)在患者β1AR基因的一个或两个编码序列的1165位核苷酸上的序列或者(ii)在患者β1AR蛋白质的389位氨基酸，其中所述个体正在考虑用布新洛尔治疗。
在另外的实施方案中，本发明涉及用于评估布新洛尔治疗患者的方法，其包括了解(i)在患者的一个或两个α2cAR等位基因的964-975位核苷酸的序列中或(ii)在患者α2cAR蛋白质的322-325位氨基酸中是否有缺失，其中所述个体正在考虑用布新洛尔治疗。
可以考虑不是对本发明任何实施方案中所有患者的蛋白质都进行评估，而是考虑获得样本并对样本中一些蛋白质评估其蛋白质序列。
本发明还可以考虑根据术语“了解”的普通和平常的意思来表示具有特定信息。可以考虑通常情况下医学从业人员将评估是否开处方或施用布新洛尔给患者并且在实施该评估中所述医学从业人员将安排一个或多个关于患者一个或两个β1AR等位基因或其编码蛋白质和/或关于患者一个或两个α2cAR等位基因或其编码蛋白质的检验。在本文中所讨论的多态性背景下，术语“等位基因”和“基因”使用时可相互替换。
本发明的另一些方面包括用于治疗具有心脏病况的患者的方法，其可以包括开处方或施用有效量的布新洛尔给患者，其中患者没有可检测水平的在389位置为甘氨酸的β1AR蛋白质或者其中对于在两个β1AR等位基因的核苷酸编码序列中1165位胞嘧啶而言患者是纯合的。在任一种情形中，如果医生或医学从业人员通过患者在β1AR基因中具有Arg389/Arg389多态性而知道布新洛尔对于患者是适当的药物，那么他们就可以开处方和施用布新洛尔。
作为替代或除此之外，治疗具有心脏病况的患者的方法可以包括开处方或施用有效量的布新洛尔给患者，其中患者没有可检测水平的具有氨基酸322-325缺失的α2cAR蛋白质或者其中对于在两个α2cAR等位基因的编码序列中存在有核苷酸964-975(“无缺失”)而言患者是纯合的。在任一种情形中，如果医生或医学从业人员通过患者不是α2cAR基因中Del322-325多态性的携带者、即对于所述缺失不是杂合也不是纯合的而知道布新洛尔对于患者是适当的药物，那么他们就可以开处方和施用布新洛尔。
另外的方法包括评估是否心力衰竭患者将对布新洛尔产生积极的反应，其包括：a)获取指示i)患者的一个或两个β1AR基因的编码序列中1165位编码位置上存在多态性或ii)在β1AR蛋白质的389位氨基酸位置上存在多态性的信息；和b)开处方或施用布新洛尔。
此外，本发明所包含的另一些方法涉及用布新洛尔治疗患者，其包括：a)获取指示i)患者的一个或两个β1AR等位基因的编码序列中1165位编码位置上存在多态性或ii)在β1AR蛋白质的389位氨基酸位置上存在多态性的信息；和b)或者开布新洛尔治疗处方给患者，其中患者的基因型表明患者对于β1AR蛋白质中的Arg389是纯合的，或者不给患者开布新洛尔处方，其中患者的基因型表明患者对于β1AR蛋白质中的Arg389不是纯合的。
还可以考虑本发明涉及布新洛尔在制备治疗具有β1AR基因中Arg389/Arg389多态性的患者中心脏病况的药物中的用途。讨论有关方法的实施方案可以使用布新洛尔制备药物来实施。
本发明还涉及，从正考虑用布新洛尔治疗的患者中获取生物样本，并通过确定(i)患者β1AR基因的一个或两个编码序列中1165位核苷酸的序列或(ii)患者β1AR蛋白质中389位置氨基酸来确定Arg389多态性从而对其进行评估。本发明考虑如果评估β1AR蛋白质，那么可以寻找是否样本中含有任何在389位置为甘氨酸的β1AR蛋白质。
另外的方法包括评估心力衰竭患者是否对布新洛尔有积极的反应，其包括：a)获取指示是否i)在患者的一个或两个α2cAR等位基因中964-975位核苷酸序列已经缺失或ii)在患者的α2cAR蛋白质中322-325位氨基酸序列已经缺失的信息；和b)开处方或施用布新洛尔。本发明考虑如果考虑α2cAR蛋白质，那么可以寻找是否样本中含有任何具有相关缺失的α2cAR蛋白质。
此外，本发明包含的另一些方法涉及用布新洛尔治疗患者，其包括：a)获取指示是否i)在患者的一个或两个α2cAR等位基因中964-975位核苷酸序列已经缺失或ii)在患者的α2cAR蛋白质中322-325位氨基酸序列已经缺失的信息；和b)或者给患者开布新洛尔治疗的处方，其中患者的基因型指示患者对于α2cAR等位基因是纯合野生型，或者不给患者开布新洛尔治疗的处方，其中患者的基因型指示患者对于α2cAR蛋白质不是纯合野生型。
还可以考虑本发明涉及布新洛尔在制备治疗在α2cAR等位基因中322-325多态性上为纯合野生型的患者中心脏病况的药物中的用途。讨论有关方法的实施方案可以使用布新洛尔制备药物来实施。
本发明还涉及，从正考虑布新洛尔治疗的患者中获取生物样本，并通过确定(i)患者β1AR等位基因的一个或两个编码序列中1165位核苷酸的序列、(ii)患者β1AR蛋白质中389位氨基酸、(iii)在一个或两个α2cAR等位基因的编码序列中964-975位核苷酸是否有缺失、和/或(iv)在患者的α2cAR蛋白质中322-325位氨基酸是否有缺失，来确定β1AR蛋白质中Arg389多态性和/或α2cAR蛋白质中Del322-325多态性从而对其进行评估。
为实现这些方法，医生、医学从业人员、或他们的同事可以获取用于评估的生物样品。所述从业人员或他们的同事可以对所述样本进行分析，或者它可以交给外面的或独立的实验室。医学从业人员可知晓所述检测是否正提供与从所编码蛋白质识别一样的有关患者β1AR基因或等位基因的信息，或者医学从业人员可以只了解所述检测直接或间接指示患者的基因型反映Gly389/Gly389表型(“纯合Gly”序列)、Arg389/Gly389表型(“杂合”序列)、或Arg389/Arg389表型(“纯合Arg”或“纯合野生型”序列)。
相似地，医学从业人员可以知道所述检测是否正提供与从所编码蛋白质识别一样的有关患者α2cAR基因或等位基因的信息，或者医学从业人员可以只了解所述检测直接或间接指示患者的基因型反映纯合野生型序列(在任一等位基因中没有缺失)、杂合Del322-325表型(“杂合”序列)、或Del322-325/Del322-325表型(“纯合缺失”序列)。
在实施例中所讨论的一些实施方案中，对于β1AR具有或者杂合序列或者纯合Gly序列的患者被称作“Gly携带者”。同样地，对于α2cAR具有或者杂合序列或者纯合缺失序列的患者被称为“Del322-325携带者”或“缺失携带者”。
在任何的这些情形中，医学从业人员“知道”将允许他或她确定是否布新洛尔是适当医疗选择的相关信息。可以考虑，例如，实验室实施所述检测以确定患者的基因型，于是它的工作人员也知道适当的信息。他们可以将实施检测的具体结果报告给所述专业人员或者实验室可以简单地报告基于实验结果布新洛尔是合适的药物。
在进一步的实施方案中，患者在一个或两个β1AR等位基因编码序列中核苷酸1165位上的基因型是已知的。在本发明中，在一个或两个等位基因中编码序列的1165位置是否包含鸟嘌呤或胞嘧啶是重要的。这指示能够在β1AR蛋白质中389位置发现什么氨基酸。在编码序列中1165位胞嘧啶编码精氨酸，而编码序列中的鸟嘌呤编码甘氨酸。在特定实施方案中，在患者两个β1AR等位基因中1165位序列是已知的。结果可以是在两个等位基因中都是鸟嘌呤、两个等位基因中都是胞嘧啶、或者在一个等位基因中是鸟嘌呤和在另一个等位基因中是胞嘧啶。
在某些实施方案中，患者在一个或两个α2cAR等位基因编码序列中核苷酸964-975位上的基因型是已知的。在本发明中，在α2cAR基因的一个或两个等位基因中是否有缺失是重要的。这指示在α2cAR蛋白质序列的322-325位氨基酸(氨基酸322、323、324和325)中是否有氨基酸缺失。在特定实施方案中，在对应患者两个β1AR等位基因中964-975位核苷酸序列中是否有缺失是已知的。
本领域技术人员很容易理解，基因的编码序列表示用于转录信使RNA的基因链。编码序列的序列互补于所转录的转录物序列。由于编码序列和非编码序列之间的序列互补性，可以通过了解转录物、非编码链、或编码蛋白质的序列来确定任何编码序列的序列。本领域技术人员已知有很多方式可以确定一个或两个等位基因中所述位置的核酸序列。这样的方式包括，但不限于，链终止测序、限制酶消化、等位基因特异性聚合酶反应、单链构象多态性分析、小量遗传分析(genetic bit analysis)、温度梯度凝胶电泳、或连接酶链式反应。
作为替代，可以评估β1AR蛋白质序列。在某些实施方案中，在患者的一个或多个β1AR蛋白质中389位氨基酸是已知的。可以考虑所评估的任何来自患者的样本将包含多种β1AR蛋白质可被分析。这些蛋白质的分析可以确定是否患者具有在389位上只是精氨酸、在389位上只是甘氨酸、或两种类型混合的β1AR蛋白质。相似地，可以评估α2cAR蛋白质序列。在特定实施方案中，在患者的一个或多个α2cAR蛋白质中322-325位氨基酸是否有缺失是已知的。
可以考虑所评估的任何来自患者的样本将包含多种β1AR和α2cAR蛋白质可被分析。这些蛋白质的分析可确定是否患者具有在389位上只是精氨酸、在389位上只是甘氨酸、或两种类型混合的β1AR蛋白质。同样地，它可以确定是否患者在322-325位氨基酸仅具有野生型序列(无缺失)、仅具有对应322-325位氨基酸的缺失、或两种类型混合的α2cAR蛋白质。
确定蛋白质中特定位置序列的方法对本领域的技术人员是众所周知的。它们可涉及应用抗体、高压液相色谱、或质谱分析。
如上所述，β1AR基因或蛋白质和/或α2cAR基因或蛋白质中特定位置的序列可以是已知的。本发明的一些方法涉及确定β1AR基因或蛋白质序列和/或α2cAR基因或蛋白质序列中的序列。
因此，可以考虑所述实施方案可涉及从患者获取生物样本。生物样本是包含生物材料比如所有或部分器官、组织、细胞、核酸、蛋白质、或其它这样的大分子和物质的样本。所述样本可包括唾液、血清、血、血浆、脊髓液、精液、淋巴液、尿、粪、胸膜积液、腹水、组织样本、组织活检样本、细胞拭子、或它们的组合。在本发明另外的实施方案中，所述样本可包含来自肺、皮肤、肌肉、肝、肾、结肠、前列腺、乳房、脑、膀胱、小肠、大肠、宫颈、胃、胰、睾丸、卵巢、骨、骨髓、或脊柱的细胞。在一些实施方案中，所述样本是全血、血浆或血清样本，然而在另一些实施方案中，通过灌洗、涂、或拭患者之上或之中的区域获得所述样本。在某些实施方案中，生物样本是血样本。
在本发明的一些实施方案中，患者的β1AR基因和/或蛋白质的序列和/或患者的α2cAR基因和/或蛋白质的序列可以是已经被评估过的。本发明的意图是可以在患者正考虑布新洛尔治疗之前或作为综合检查的一部分完成此分析。例如，患者的β1AR基因和/或蛋白质的序列、以及他的α2cAR基因和/或蛋白质可以被确定并输入数据库或输入患者的病历。在此情况中，医学从业人员可以通过获得患者有关i)一个或两个β1AR等位基因编码序列中1165位置或ii)β1AR蛋白质的氨基酸序列中389位置、iii)一个或两个α2cAR等位基因编码序列中964-975位置、和/或iv)α2cAR蛋白质的氨基酸序列中322-325位置的序列的历史数据来了解序列是什么。
本发明还涉及报告在β1AR等位基因或蛋白质和/或α2cAR等位基因或蛋白质中相关位置上核酸或蛋白质序列的测定结果。在某些实施方案中，所述方法包括准备包括测定前段中所述的(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)的结果的报告。这个报告将通过姓名、社会保险号、和/或其它识别号码或资格来识别患者。它也可以包含作为测定结果或其数据总结的实际数据。
在一些实施方案中，所述方法包括鉴定可能需要布新洛尔治疗的患者。对于正考虑把布新洛尔作为治疗选项的患者可以具有一些症状或者已经被确诊患有一些医学病况，比如心力衰竭、扩张性心肌病、缺血性心脏病、嗜铬细胞瘤、偏头痛、心律失常、高血压或焦虑症。在某些实施方案中，患者具有缺血性心脏病的症状或已经被确诊为缺血性心脏病，其可以具体的是绞痛和/或心肌梗塞。在一些具体情况中，患者具有心力衰竭的症状或已经被确诊为心力衰竭。所述心力衰竭可以被考虑为晚期心力衰竭，尽管本发明可以不限于这种患者。根据心脏病学领域中普通和平常的意思应用术语“晚期心力衰竭”。在一些实施方案中，开布新洛尔处方的患者可以具有根据NYHA分级系统的III级或IV级心力衰竭。NYHA分级系统是一种评估系统，然而，本发明的意图并不限于这种方式并且这只是举例说明而不是限制的意思。患者可以根据另一个这样的系统进行分类。本发明另外的意图是患者可以根据不同的方法进行分类，但是本发明将以相似的方式实施。
然而，在另一些实施方案中，患者可以具有心力衰竭但不是晚期心力衰竭的征兆或症状。在这种情形下，根据NYHA分类系统，患者可以已经是或可以被特征化为I或II级心力衰竭患者。在这些实施方案中，可以测定患者有关Arg389β1多态性的基因型，在此情况下具有Arg/Arg表型的人是布新洛尔治疗的候选者。因此，本发明的方法可以包括，通过确定患者是否具有Arg389/Arg389多态性并且如果他们有的话就施用布新洛尔来预防患者的心力衰竭。特定的患者也许特别适用于此，但并不限于具有心力衰竭症状、具有心力衰竭风险因素、或具有心力衰竭家族史或在先发病史的患者。
此外，所述方法可以涉及为了治疗患者而施用或开处方其它治疗剂或实施外科治疗或其它介入策略。
根据本发明，所述方法还可以涉及在了解患者关于389位多态性的基因型是Arg389/Arg389、也已知是纯合精氨酸基因型之后开处方或施用布新洛尔给患者。除此之外或作为替代，可以在了解患者具有纯合的野生型α2cAR多态性(在α2cAR基因的任一等位基因不携带964-975位核苷酸的缺失)之后，开处方或施用布新洛尔给患者。此外，可以是这种情况，不表现任一或两种基因型的患者将不给其处方或施用布新洛尔。可以给患者处方或施用特别不是布新洛尔的β-阻断剂。
在另外的实施方案中，所述方法可以包括了解在(iii)患者的一个或两个α2cAR基因编码序列中964-975位核苷酸序列中或(iv)患者的一个或多个α2cAR蛋白质的322-325位氨基酸序列中是否有缺失。此外或独立地还可以了解患者在β1AR基因1165位置(蛋白质的389位置)的基因型。
如果晚期心力衰竭(即，NYHA III级或IV级)患者表现出纯合的α2cARDel322-325基因型并且患者不表现Arg389/Arg389基因型，那么考虑将不给患者开处方或施用布新洛尔。在某些实施方案中，患者被鉴定为黑色人种患者。作为替代，如果患者不表现纯合的α2cAR Del322-325基因型，可以给患者开处方或施用布新洛尔。
在确定对于患者而言布新洛尔是否是合适药物时还可以考虑其它信息。这可以包括人种、性别、年龄、以前的外科治疗、心力衰竭的阶段、患者有关心血管疾病的历史、其它疾病或病况的诊断、其它疾病或病况的风险、药物过敏、药物毒性、和/或正服用的其它药物。
因此，本发明的意图也涉及实施双基因型分析或获得双基因型分析的结果。在具体实施方案中，双基因型分析涉及直接或间接评估(1)β1AR中389位多态性从而确定是否患者有Arg389/Arg389基因型和(2)α2cAR中322-325位多态性从而确定是否患者有Del322-325/Del322-325基因型。另外的多态性可以包括在单体型中，尤其是那些被影响或影响患者对作为治疗剂的布新洛尔作出有利反应能力的多态性。
关于本发明一个方面所讨论的任何实施方案同样将应用于本发明的其它方面。这包括关于β1AR和α2cAR中每一个所讨论的实施方案。特别地，有关β1AR基因、等位基因、或蛋白质所讨论的任何实施方案可以实施于α2cAR基因、等位基因、或蛋白质，并且反之亦然。
在实施例部分中的实施方案应被理解为可应用于本发明所有方面的本发明实施方案。
术语“或”在权利要求中的应用被用来表示“和/或”的意思，除非明确指出只是其中之一或者这些选项是相互排斥的，尽管所公开内容支持仅表示其中之一和“和/或”的定义。
在本申请中，术语“大约”用于表示数值包括用于确定该值所用装置或方法中的标准误差或偏差。
根据长期存在的专利法，当单词“一个”和“一种”与单词“包含”在权利要求或说明书中结合使用时，除非具体指明，其表示一个或多个的意思。
从以下的详细描述中，本发明其它的目的、特征和益处将是显而易见的。然而，应该理解的是，尽管详细说明和具体实施例说明本发明的具体实施方案，但是它们只是用来举例说明，因为在本发明精神和范围内的各种变化和改进，从这些详细说明中对本领域技术人员将是显而易见的。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分并且用来进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并联合本文中详细描述的具体实施方案可以更好的理解本发明。
图1.描绘几种β-阻断剂、包括布新洛尔、的化学结构。
图2.基于II或III期心力衰竭临床试验数据或其它研究数据的不同抗肾上腺素能剂和治疗的比较图。
图3.该图举例说明布新洛尔在稳定表达β1Arg389-或β1Arg389的细胞中的等位基因特异性作用。结果是4次试验的平均值±SE。
图4.条形图举例说明在具有靶向过表达Gly389和Arg389β1AR的转基因小鼠中心脏对β-阻断的反应。所显示的是从β1-Arg389和β1-Gly389小鼠(每组中n＝3-4)心脏中所指示蛋白质的Western印迹中获得的平均值(±SE)结果。数据相对于对照(未处理)数值被标准化。只从β1-Arg389小鼠的心脏中发现对普萘洛尔(普萘洛尔)的总体治疗反应(ANOVA，p＜0.002)。
图5.该图举例说明根据β1AR基因型分类的心力衰竭结果的95％置信区间和风险比。
图6.该图举例说明在根据治疗和β1AR基因型分类的布新洛尔-安慰剂研究中患者的生存率。
图7.该图举例说明在根据治疗和β1AR基因型分类的布新洛尔-安慰剂研究中达到死亡或心力衰竭住院治疗联合终点的可能性。
图8.在3个月和12个月从基线去甲肾上腺素水平±SEM的按照治疗组的变化。在A和B中在条形下的数字是每组中患者的数目，所述患者具有基线上和在每个时间点上的间隔测量；p值被用来比较在每个治疗组中的变化。
图9.相对于全原因死亡率第一四分之一部分，基线去甲肾上腺素四分之一部分的风险比。确定四分之一部分的去甲肾上腺素切点是：第一，≤304pg/ml；第二，305pg/ml至436pg/ml；第三，437pg/ml至635pg/ml；第四，≥636pg/ml。每个四分之一部分的患者数是：安慰剂组中第一294、第二255、第三248、第四264；布新洛尔组中第一239、第二274、第三284、第四267。
图10.相对于全原因死亡率+CHF住院治疗的联合终点，根据基线去甲肾上腺素四分位值的第一四分之一的风险比。
图11.在安慰剂组和布新洛尔治疗组中去甲肾上腺素在3个月对比随后全原因死亡率的可能性分析。
图12.非衰竭和衰竭人心室离体收缩反应与β1AR基因型相关。根据方法中所述利用来自非衰竭和衰竭人心脏的右心室小梁。在四组中的每组中有11个心脏的小梁进行研究。所有Arg带(strps)都来自纯合的对象。Gly携带者由非衰竭组中10个杂合体和衰竭组中9个杂合体组成，余下的为Gly纯合体。得自剂量效应曲线的最大反应在非衰竭组(P＝0.01)和衰竭组(P＝0.008)中对于Arg389都是较大的。
图13A-D.布新洛尔或扎莫特罗逐步增加的剂量对从衰竭人心脏中所分离的右心室小梁峰值心脏收缩力(mN/mm2)的影响。以无(布新洛尔，组A；扎莫特罗，组C)和有(布新洛尔，组B；扎莫特罗，组D)通过10-5M福斯高林预处理来增强β-AR信号转导从而完成剂量效应曲线。在福斯高林预处理试验中，允许在整个治疗期间培育仅应用福斯高林的小梁，并且从布新洛尔或扎莫特罗处理的小梁中减去任何对力的影响。＊，＝p＜0.05对基线张力；对基线张力；§，p＜0.05对整个曲线为0斜率；对10-9M至10-6M剂量的0斜率；括号相关的p值是对曲线斜率之间相互作用的检验，其中第一p值针对10-9M至10-6M的剂量，和第二p值针对整个曲线。
图14.慢性心肌β1肾上腺素能刺激的对立结果。
图15.在风险组和用布新洛尔治疗患者中去甲肾上腺素变化的特征。标准偏差(SD)包括在图中。
图16.在风险组和用布新洛尔治疗患者中去甲肾上腺素变化的另外特征。标准偏差(SD)包括在图中。
图17.在BEST患者中α2CAR基因型和全身去甲肾上腺素水平之间相关性的举例说明。
图18.在三个月之后，在BEST患者中α2CAR基因型和全身去甲肾上腺素反应(pg±SEM)之间相关性的举例说明。
图19.在三个月之后，在BEST患者中α2C-AR基因型、全身去甲肾上腺素反应(pg±SEM)之间的相关性，以及BEST患者中治疗组的生存率。
图20A-D.β1-AR Arg/Gly 389基因变体对在分离的人RV小梁中对异丙肾上腺素(isoproterenol)反应的影响。A.纯合β1-AR Arg 389衰竭的Iso反应。B.β1-AR Gly 389携带者衰竭的Iso反应。C.纯合β1-ARArg 389非衰竭的Iso反应。D.β1-AR 389Gly携带者非衰竭的Iso反应。
图21.α2C-AR和β1-AR基因变体：在BEST中的治疗作用(死亡率)。
图22.在美国人群中的β-阻断剂死亡率试验，死亡率风险比±95％C.I.s。
图23.β-阻断剂在NF hRV小梁中对心脏收缩功能的影响。
图24.β-阻断剂在经10μM福斯高林(F)处理而扩大信号转导的NF hRV小梁中心脏收缩功能的影响。
图25.β-阻断剂在衰竭的hRV小梁中对心脏收缩功能的影响。
图26.β-阻断剂在经10μM福斯高林(F)处理而扩大信号转导的衰竭hRV小梁中对心脏收缩功能的影响。
图27.研究设计I。
图28.研究设计II。
图29.研究设计III。
具体实施方式
本发明的发明人面临这样的数据，布新洛尔在某些患者亚组中似乎提供更少有利的治疗反应，和根据某些标准与其他β-阻断剂相比更少有利的反应。他们提出假设在心力衰竭(HF)中对布新洛尔反应的个体间变化是由于遗传变化并确定了这种假设的基础。在此过程中，发明人能够获得对布新洛尔治疗价值及其治疗人心力衰竭中适当性的显著实例。
评估了β1AR在蛋白质中389位氨基酸(基因中1165位核苷酸)的遗传变异性。这是基于在此称为Arg389和Gly389的两种受体的特性，这已经在转染细胞中确认，其中基础水平和激动剂刺激的腺苷酰环化酶活性对于Arg受体是约3倍更高(Mason et al.，1999)。然而，在本研究之前，不清楚是具有Arg389、还是具有Gly389的患者可以从布新洛尔治疗中更多受益。例如，Arg389的功能增强可能已经使布新洛尔不可能作为有效的拮抗剂。对该假说的终极检验还没有实现，其中评估死亡、心脏移植或HF住院治疗(在用安慰剂或布新洛尔治疗的实际患者中心力衰竭的恶化)。
因此本发明使用三级方法着手解决是否Arg(或Gly)389β1AR等位基因代表预测心力衰竭对β-阻断剂反应的药物遗传学基因座位，其中包括在转染细胞(见以下详细讨论的实施例1)、转基因小鼠(见以下详细讨论的实施例2)和大规模多中心安慰剂对照的临床试验(见以下详细讨论的实施例3)中进行研究。临床试验被表示为BEST(β-阻断剂评估生存试验)。在所述转染细胞中，评价了布新洛尔对去甲肾上腺素刺激cAMP的功能性拮抗作用。即使Arg389受体显示出明显更高的去甲肾上腺素刺激的cAMP生成，但是布新洛尔拮抗这种反应。与Gly389表达细胞相比，Arg389表达细胞中cAMP生成的绝对降低明显更大，这是由于Arg389的高度去甲肾上腺素刺激作用以及布新洛尔完全拮抗所述反应的功效。在0.1μM布新洛尔，观察到Arg389cAMP反应的约80％抑制，这相当于在BEST中所用剂量的药物血浆浓度(未公开数据)。这些结果提示，与β1-Gly389基因型相比，由于布新洛尔治疗而引起心脏β1AR活性在β1-Arg389基因型患者中更大变化是可能的，并且潜在地导致更有利的临床反应。在转基因小鼠研究中，发明人检查了在6个月期间β-阻断剂对心脏中关键信号传递和Ca2+操作蛋白(Ca2+handling protein)表达的影响。在Gly389小鼠中，处理对这些蛋白质的表达没有影响。另一方面，β-阻断的总体治疗作用在Arg389小鼠中是显著的，并且具有在分子水平上的逆向重建一致的变化。接下来，利用来自BEST的保存DNA，BEST是提供广泛表型分析和匹配安慰剂组的研究；由于转染细胞和转基因小鼠的结果，发明人已经预先假设β1-Arg389是对生存最有利的基因型。在此，假设了显性模式(dominant model)。因此，两个基因型组是Arg389纯合体和具有一个或两个Gly389等位基因的患者(即，对Gly是纯合的或杂合体；这个组被称作“Gly389携带者”)。从BEST的临床终点结果指出，与安慰剂相比，在β1-Gly389携带者患者中死亡率、心力衰竭住院治疗或死亡率+心力衰竭住院治疗没有从布新洛尔治疗中获得益处，但是在β1-Arg389患者中用布新洛尔治疗的所有三种结果都获得了临床相关的改善。包括心率、血压和LVEF的基线临床参数、或心力衰竭病因在包括所有β1AR基因变体的整个组中不能预示终点反应。此外，β1-Gly49多态性对这些关系没有明显的影响。结合起来看，这些研究的结果强烈提示，β1AR的389位变体可以预测心力衰竭对布新洛尔的反应。
此外，遗传变体在α2cAR基因中的角色也被用来假设布新洛尔的功效。本发明的发明人假设，在心力衰竭中个体间对布新洛尔反应的差异是由于α2cAR基因的遗传性变异。因此本发明用BEST着手解决α2cDel322-325AR等位基因是否可以代表预测心力衰竭对布新洛尔反应的药物遗传学基因座位的问题，所述BEST是大规模多中心安慰剂对照试验(见以下详细说明的实施例)。利用来自BEST(提供广泛表型分析和匹配安慰剂组的研究)的保存DNA。在此，假设了显性模式。因此，两个基因型组是1)α2c野生型纯合体(在任一等位基因上不具有322-325位缺失的患者)和α2cDel322-325杂合体或纯合体(在一个或两个等位基因中具有该缺失的患者，称作“α2cDel322-325携带者”)。从BEST的临床终点结果指出，与安慰剂相比，在α2cDel322-325携带者患者中死亡率、心力衰竭住院治疗或死亡率+心力衰竭住院治疗没有从布新洛尔治疗中获得益处，但是在α2c野生型纯合患者中用布新洛尔治疗的所有三种结果都获得了临床相关的改善。包括心率、血压和LVEF的基线临床参数、或心力衰竭病因在包括所有α2cAR基因变体的整个组中不能预示终点反应。结合起来看，这些研究的结果强烈提示，α2cDel322-325多态性可以预测心力衰竭对布新洛尔的反应。
因此，本发明涉及利用在Arg389β1AR多态性和布新洛尔疗法之间以及在Del322-325α2cAR多态性和布新洛尔疗法之间的遗传关系的方法。
I.肾上腺素能受体和β-阻断剂
心力衰竭的治疗已经涉及靶向肾上腺素能受体(AR)。有至少9个肾上腺素能受体亚型(Dohlman et al.，1991；和Liggett et al.，1993)，其中至少3个亚型是β-肾上腺素能受体。
通过表型的家族聚类分析、家族心肌病的外显率降低以及进程合治疗结果的显著个体间差异，提示常见遗传变体在易感性、疾病进程合治疗反应中的潜在作用。尽管肾上腺素能受体中的多态性已经被鉴定，但是还没有研究涉及这样的患者数据，其中已经鉴定了任何多态性与对治疗剂的临床反应之间的相关性。本发明涉及两种多态性：1)编码β1-AR中389位氨基酸的多态性和2)编码α2C-AR中322-325位氨基酸的多态性。然而，在本发明之前仍然没有任何临床证据确定在这些具体遗传变异和任何治疗结果之间的关系，也没有证明与布新洛尔的任何相关性。
A.β1肾上腺素能受体
β1肾上腺素能受体(β1-AR)是心肌细胞上表达的主要亚型。人心脏既表达β1AR又表达β2AR亚型(Bristow et al，1986；Bristow et al.，1988)。每种受体介导对内源性儿茶酚胺和外源施用激动剂的变力性和变时性反应(Bristow et al.，1986；Brodde et al.，1986；Brodde et al.，1992)。
当被活化时，例如被去甲肾上腺素活化时，β1AR引发心脏收缩性反应。此外，β1受体在心肌病和其它疾病路径的进程中具有中心作用。这种受体的活化增强及其相关的肌病和心率不齐途径在心力衰竭的自然病史中起重要作用。一旦心肌病进程已经开始，慢性β1-肾上腺素能活化加速疾病进程，因为衰竭的心脏试图通过释放更多去甲肾上腺素和增加β1-受体信号来补偿它受损的功能。β-受体阻断的理论部分基于通过阻断β1-受体和减少去甲肾上腺素信号来抵销这种心肌病途径。
β1-肾上腺素能受体已经被克隆和测序(Frielle et al.，1987)。该基因已经被定位于10号染色体的q24-q26上(Yang-Feng et al.，1990)。人β1AR具有推导的477个氨基酸的氨基酸序列。
在β1AR基因的1165位编码核苷酸上，在人群中可以发现或者是胞嘧啶或者是鸟嘌呤，这导致在所编码的389位氨基酸上或者是Arg或者是Gly(Mason et al.，1999)。这个位置在受体的细胞内结构域内，所述受体涉及与刺激性G-蛋白(GS)的偶联。在经转染而表达相等水平的两种受体的成纤维细胞中，β1-Arg389受体与β1-Gly389受体相比，显示出对腺苷酰环化酶更大的刺激作用(Mason et al.，1999)。较少见的β1AR多态性Gly49也已经被鉴定，但是有一些有关它功能性作用不一致的报导(Rathz et al.，2002；和Levin et al.，2002)。
β1-AR 389Arg/Arg多态性实际上是β1肾上腺素能受体最普遍的形式并且在美国人群中大约占50％(在非洲裔美国人中稍少)。这种受体的另一种变体在389位上具有甘氨酸(Gly)并且被认为是野生型，这只是因为它是最先被克隆的。在所有其它已知非人动物物种中，在密码子389上存在精氨酸(Arg)是这种受体优选(并且是唯一)的结构，并且389区域位于重要的功能性结构域中。389Arg/Arg也是这种受体的最高功能性变体(Masonet al.，1999)；它的信号转导功效比在389位上的Gly杂合体或Gly/Gly大3-4倍(见实施例和Mason et al.，1999)。β1-AR 389Arg/Arg信号转导能力的增加可应用于cAMP生成(Mason et al.，1999)、分离人心肌的收缩(Mason et al.，1999)、和转基因小鼠中产生心肌病(Mialet Perez et al.，2003)。
已经在特定遗传性变异背景下评估了某些β～阻断剂并具有不同结果。Sofowora et al.报导，基于血液动力学的反应，Gly389纯合的患者对阿替洛尔作用的敏感性较低，这是一种选择性β-肾上腺素能受体，提示作者所述变异可能尤其与静止血压反应相关。Johnson et al.(1993)报导，通过测量血压，Arg389纯合体更可能对选择性β-阻断剂美托洛尔产生反应。Perez et al.(2003)在完整心脏功能背景下利用靶向转基因小鼠评估了β1AR的389位变异体。在这些在389位上或者过表达纯合Arg或者过表达纯合Gly的转基因小鼠中，Arg/Arg小鼠更大程度地丧失了用于增加心肌功能的isoproterenol反应性，并且根据心肌功能障碍、腔重建程度和组织学测量，具有更严重程度的心肌病。他们也报导了用非选择性β-阻断剂carvelilol治疗导致患者左心室功能较大改善，它与纯合或杂合状态中的Arg389多态性有关。
Liu et al.(2003)报导了他们发现，与Gly389相比，Arg389与对美托洛尔的更大反应(根据心率变化)相关。作者也警告了扩大结果到超过他们的患者库以外，他们的患者库是健康、青年、男性中国人志愿者。他们明确地说研究没有发现美托洛尔关于所述多态性的任何长期影响。
2004年公开的评论文章(Lohse，2004)指出，尽管Arg389多态性也许与β-阻断剂治疗的益处相关，但是仍然没有关于β1-肾上腺素能受体多态性对于心力衰竭对β-阻断剂反应的影响的研究。另一个评论文章指出，尽管一些研究显示肾上腺素能受体的多态性或许改变对β-阻断剂治疗的反应，因为在不同研究中很低的患者数量，所以不能得出对于患者处置的确定结论或推荐。
此外，几个报导没有在β1-AR的389位多态性与对β-阻断剂治疗的反应之间检测到任何相关性。因此，本发明公开内容具有显著意义，尽管说明书提到了参考文献White et al.(见下面的讨论#1)，该文献宣称通过对死亡率或死亡率+心力衰竭住院治疗联合终点的评估检查了美托洛尔-治疗心力衰竭患者，并且没有发现相关性。O’Shaughnessy et al.(2000)报导没有发现血压或心率对β阻断(阿替洛尔或比索洛尔-两种拮抗剂)的反应与389多态性相关的差异。另一篇文章(Joseph et al.(2004))也没有观察到受体对β-阻断剂的亲和性随389多态性有差异。此外，最近的研究报导没能发现任何证据表明Arg389多态性对于美托洛尔治疗的“药物遗传学作用”。White et al.，Eur.J.Heart Fail.5：463-8，2003.
因此，β-阻断剂作为一类治疗剂的有效性与β1-AR中389位多态性之间的相关性仍然没有确立。此外，尤其没有获得关于布新洛尔的相关性，布新洛尔在几个重要方面不同于其它β-阻断剂。因为这些β-阻断剂间的差异是明显的，β1AR-389变体对β-阻断剂反应的影响可能依赖于特定的药剂。
本公开内容提供这种数据，当在个体基因型、尤其是在Arg389多态性的背景下评估BEST数据时，布新洛尔具有明确的治疗功效。这种数据是令人惊奇的，因为在BEST研究中在全部研究群体中所观察的死亡率作用低于用其它β-阻断剂比如卡维地洛、美托洛尔CR/XL和比索洛尔所观察到的结果。此外，本文所提供的科学数据第一次证明了布新洛尔治疗功效和两种遗传变异体之间的相关性。
详细地，本发明提供确定是否应该将布新洛尔处方给患者的方法，其中β1AR和α2C-AR的多态性核苷酸或氨基酸位置的身份被确定，并基于该诊断检验的结果开或不开布新洛尔的处方。相似地，基于基因型，可以给具有不利β1AR基因型的患者开另一种药物，从而尝试获得提高的临床反应。在两种情形中，药物治疗的决定是基于患者的β1AR基因型。
因此，本发明涉及，基于个体是否在β1AR基因中是纯合的Arg389、是否在氨基酸位置322-325上是野生型形式的α2CAR、或者是否两者都是，来评估患者尤其是心力衰竭患者的布新洛尔治疗的方法。作为替代，本发明涉及有关β1AR389Gly携带者和α2cARDel322-325携带者双基因型的方法。
B.α2c肾上腺素能受体
α2C-AR位于心脏交感神经末梢，并调节突触前(prejunctional)神经元释放去甲肾上腺素到突触间隙区域。去甲肾上腺素与α2C-AR的结合引起负反馈交感神经阻滞反应，这减弱进一步的神经元去甲肾上腺素释放。鼠基因部分切除模型暗示α2c-AR主要负责控制去甲肾上腺素释放的长期稳定速率。(Hein et al.，1999)。以此方式α2c-AR在心脏中具有“保护性”作用，缓冲抵抗衰竭人心脏中遇到的去甲肾上腺素水平的持续升高。
已经报导α2c-AR基因ADRA2C的人遗传多态性(Small et al.，2000)。失去12个核苷酸的ADRA2C翻译成在受体第三细胞内环中缺失4个连续氨基酸(α2cDel322-325)。(Small et al.，2000)。这种缺失多态性在非洲裔美国人中更加普遍，非洲裔美国人的等位基因频率为0.4，而非非洲裔美国人具有0.04等位基因频率。总体上，这种多态性存在于约15％的美国人口中。
与Arg389多态性相比，α2C肾上腺素能受体的322-325Del多态性并不常见，并且是这种受体的低功能性变体(Small et al.，2000)。丧失这4个残基预示着受体功能的降低，这可以通过细胞转染试验来支持，其中受体功能被降低了50-85％。(Small et al.，2000)。A2C受体通常在肾上腺素能神经末梢中强烈地抑制去甲肾上腺素的突触前释放(Hein et al.，1999)。
322-325缺失基本上破坏了受体功能(Small et al.，2000)，导致更高水平的去甲肾上腺素和肾上腺素能动力(Neumister et al.，2005)。抑制性控制减退的结果是去甲肾上腺素的基础释放被根本性增加，导致更高状态的交感神经活性。(Hein et al.，1999)。在心力衰竭中这特别有意义，因为α2cDel322-325受体缺乏抵抗交感神经动力增加的“保护性”刹车作用。
在一项研究中，α2cDel322-325受体多态性作为纯合基因型在仅7.4％的慢性心力衰竭高加索人中存在，但是在52.6％的慢性心力衰竭黑人中存在，导致通过对抑制腺苷酰环化酶刺激进行评估的功能丧失(Small et al.，2002)。这种缺陷对α2c-AR功能具有功能影响，并且已经被可互换地称为“多态性”和“突变”，分别反映人群中的相对普遍性及其深远的结构/功能作用的特征。在本申请中，所述变体主要被称为“多态性”，以反映这是存在于许多心力衰竭对象中的普遍变体。然而，它的重要性源自它的功能影响，其大大降低了受体活性。基于遗传切除小鼠中的作用，野生型、全功能的α2c受体对去甲肾上腺素释放具有突触前抑制作用；因为所述基因敲除小鼠显示丧失了这种抑制，这导致去甲肾上腺素水平升高和病理性过度生长。(Hein et al.，1999)。通过鉴定α2cDel322-325基因型作为心力衰竭的风险因子的研究举例说明了这种多态性对于人的临床重要性；与杂合体和非携带者相比，其在具有这种基因型的纯合体黑人中对于心力衰竭具有5.54的未调整比数比(odds ratio)(95％CI 2.68，11.45；p＜0.001)。(Small et al.，2002)。与β1Arg389变体联合，这种作用更强，具有12.67的未调整比数比(95％CI 2.70，59.42；p＝0.001)。然而，与本公开内容相比，仍然没有指明这些多态性与治疗远景相关。
C.β-阻断剂
尽管β1激动剂比如多巴酚丁胺被用于治疗心室功能衰竭患者的急性恶化，心脏与所施用激动剂的延长接触、或提高身体产生的内源性儿茶酚胺激动剂导致更加恶化的心力衰竭。事实上，β1AR和β2AR在心力衰竭中变得不敏感，其被认为是抵抗心力衰竭中存在的高水平儿茶酚胺的一种自我保护机制。施用β拮抗剂能够改善心室功能和临床效果，这推测是由于阻断儿茶酚胺的这些有害影响。并且实际上，在以β阻断治疗心力衰竭期间，心脏βAR的表达和功能得到改善。儿茶酚胺的大部分有害作用、以及β阻断剂治疗的成功是由于β1AR亚型的变体。(Zhu et al.，2001；和Bristow et al.，2003)
β-肾上腺素能受体拮抗剂(也称作β-阻断剂)已经表现出作为一种治疗慢性心力衰竭的主要治疗模式。最初认为这些药剂不能用于心力衰竭中，因为认为肾上腺素能动力增加在支持衰竭心脏中是非常关键的。事实上，在早期关于第一代化合物普萘洛尔的经验中，施用标准剂量经常与心力衰竭的恶化相关联(Stephen，1968)。然而，使用低起始剂量并缓慢向上滴定，第二代(选择性β1-阻断剂)或第三代(非选择性β-阻断剂-血管扩张剂)化合物已经显示出可以逆转收缩功能障碍以及结构和分子重建，并且可以改善心力衰竭发病率和死亡率(Bristow，2000)；CIBIS-II研究者和委员会(CIBIS-II Investigators and Committees)。心脏机能不全比索洛尔研究II：(CIBIS-II，1999)；MERIT-HF研究组。美托洛尔CR/XL在慢性心力衰竭中的作用：美托洛尔CR/XL在充血性心力衰竭中的随机介入试验(MERIT-HF，1999)。Packer et al.(2001)；BEST试验研究者，(2001)；Loweset al.，2002)。部分地认为这些有益作用是由于保护衰竭心脏免于在综合征中发现的由去甲肾上腺素水平升高介导的持续性不利生物作用，这种保护作用具有有限的代谢和生理性逆转作用(Bristow，2000；Cohn et al.，1984；和Liggett，2001)。此外，β-阻断剂已经显示出可以部分地逆转心力衰竭的分子表型(Lowes et al.，2002)，因此这些药剂既能预防又能逆转进行性心肌衰竭和重建(Eichhorn和Bristow，Circulation 1996)。
令人感兴趣的是，最近的研究已经显示，与Gly389个体相比，心率和/或血压对β-阻断剂美托洛尔和阿替洛尔的反应在正常血压的Arg389个体中更强(Liu et al.，2003；和Sofowora et al.，2003)。并且在高血压患者中，在Arg389患者中血压对美托洛尔的反应大于在Gly389患者中的反应(Johnson et al.，2003)。一项公开的心力衰竭研究已经发现，在β1AR多态性与住院治疗和死亡对美托洛尔治疗的联合反应之间没有明显的关联或趋势(White et al.，2003)。在此研究中，尽管用美托洛尔治疗的患者没有与用安慰剂的患者直接进行基因型的比较，接近45％的患者具有轻度的心力衰竭(NYHA Class II)，平均随访期只有12个月。这些差异可以说明这种潜在的矛盾。然而，布新洛尔和美托洛尔在它们的药理特性方面具有一些显著差异(Bristow，2000；和Bristow et al.，1997)。特别地，布新洛尔降低去甲肾上腺素、扩张外周脉管系统、并且更有效地阻断人β1-肾上腺素能受体。
尽管所有已被用来治疗HF(心力衰竭)的β-阻断剂的共同药理特性是它们阻断β1AR，据估计在衰竭的人心脏中转导高达约90％的病理性肾上腺素能刺激(Zhu et al.，2001；和Bristow et al.，2003)，可获得的β-阻断剂具有大量不同的特性，包括βAR亚型选择性、对α1AR的亲和性、部分激动剂活性、交感神经阻滞(Bristow et al.，2004)和血管舒张(Bristow，2000；和Bristow et al.，1997)。
在图1中提供了一些β-阻断剂的化学结构，其显示这些药剂具有明显的结构差异。此外，它们具有不同的药理学特性。正如在图2中所显示的，研发中或II或III期临床试验中的不同抗肾上腺素能剂的比较描绘了这些差异。例如卡维地洛是一种高效的β1-AR和β2-AR阻断剂、以及α1-AR阻断剂。相比较，布新洛尔是一种弱α1-AR阻断剂，并且美托洛尔和比索洛尔根本不能阻断α1-AR。值得注意的，由于阻滞交感神经的特性布新洛尔在β-阻断剂中是独特的，与其形成对比的是卡维地洛、美托洛尔和比索洛尔没有这种特性。与其它β阻断剂相比，布新洛尔独特地降低全身中去甲肾上腺素水平(Lowes et al.，2000；Bristow et al.，1997；BEST NEJM，Bristow，2004)，并且是β3-肾上腺素受体的完全激动剂(Strosberg，1997)。
布新洛尔是第三代β-阻断剂-血管扩张剂，其化学名称和结构是(2-{2-羟基-3{{2-(3-吲哚基)-1，1-二甲基乙基}氨基}丙氧基}-苄腈盐酸盐)。它首先被用于高血压，随后用于心力衰竭。因为它的低逆激动和血管扩张性质，布新洛尔的非选择性β-阻断可以很好地被心力衰竭患者所耐受，并且部分因为这个原因，在1994年NIH和VA协作临床试验组(VA Cooperative ClinicalTrials Group)选择布新洛尔来检验β-阻断剂可以降低晚期心力衰竭死亡率的假设。这个假设的检验是BEST试验，其在1995年5月31日到1999年7月29日之间实施。
β-阻断剂生存评估试验(“BEST”)因为数据和安全监督委员会(theData and Safety Monitoring Committee)的建议被提前停止，在此时对于全原因死亡率的主要(primary)终点而言风险比是0.90(C.I.s 0.78-1.02)(BEST Investigators，2001；Domanski et al.，2003)。然而，整个BEST组的结果对于死亡率或心力衰竭住院治疗的高阶二级终点而言是正面的，其被布新洛尔降低了19％(p值＜0.0001)(Domanski et al.，2003)。实际上这个终点被看作是HF决定性试验的优选主要终点。
停止BEST的原因是1)III级、非黑人患者中产生的BEST试验数据确认了在最近公开的来自CIBIS-II(CIBIS Investigators，1999)和MERIT-HF(MERIT-HF Study Group，1999)试验的信息，这些类型的心力衰竭患者的实质生存率都从β-阻断治疗中受益，2)研究人员中间平衡的丧失不断增加，他们相信β-阻断在心力衰竭中的功效已经被证明，和3)在先前没有在β-阻断剂心力衰竭试验中研究过的亚组(IV级和黑人)中对于不良事件的无效性和趋势。随后对布新洛尔的进一步研发被放弃，因为即使布新洛尔被批准，但是不清楚布新洛尔是否能够成功的被推向市场。
因此，在这个以总体生存率作为评估终点的大型生存率试验中，BEST临床试验被过早地中止，因为确认了最近在其它试验中已经显示的利益，并且布新洛尔的功效不能扩展到先前没有在大型临床试验中评估过的患者亚组(BEST Investigators，2001)。在那时，没有观察到在用布新洛尔或安慰剂治疗的那些患者之间具有明显的死亡率差异。与BEST的结果比较明显不同，用β-肾上腺素能拮抗剂比索洛尔(称作“CIBIS-II”试验)、美托洛尔(称作“MERIT-HF”试验)、和卡维地洛(称作“COPERNICUS”试验)的相似研究报导了在用拮抗剂和用安慰剂治疗的那些患者之间具有非常有利的差异(死亡率降低34-35％)。BEST研究人员推测对于结果中差异的一个可能解释是“可能来源于布新洛尔的独特药理学性质”。
在CIBIS-II试验中，研究也被过早停止，但是是因为在用比索洛尔治疗的那些患者中死亡率显著更低。CIBIS-II Investigators，1999。相似地，在用美托洛尔的MERIT-HF研究中，该研究被过早终止，因为预定标准已经被满足并且被超出。MERIT-HF Study Group，1999。涉及卡维地洛的COPERNICUS研究也被过早停止，因为在治疗中观察到明显的益处。Packer et al.，2001。BEST研究人员指出他们的结果提出了有关β-阻断剂等效性的问题。
此外，在先前涉及卡维地洛的非死亡率研究中(Yancy et al.，2001)，在黑人和非黑人对象之间没有观察到反应差异，这是关于布新洛尔的另一个具体而又相关的差别。在BEST试验中，患有晚期心力衰竭的黑人患者显示出比非黑人患者更差的结果。Bristow，1997。
不同试验的一个评论阐述“对BEST研究中使用布新洛尔所获得的益处减少不能提出明确的解释。”Bouzamondo et al.，2001(发现如果将BEST试验排除，证据表明用β-阻断剂治疗实现了风险降低)。尽管作者说他们的研究提示不同心力衰竭人群亚组对β-阻断剂治疗具有不同的反应，他们没有排除不同β-阻断剂具有不同特性的可能性，他们也没有说多态性是其原因。也见Sallach et al.，2003.(“尽管一些作者已经提出[BEST试验的差异]是由于所检查的患者群体，其它人觉得缺少死亡率降低是由于布新洛尔自身。”)
因此，在布新洛尔和其它β-阻断剂之间具有治疗差异，并且具有关于布新洛尔总体治疗功效的明显问题。因此，布新洛尔和特定遗传变体之间的任何关系都不是显而易见的。
基于本文中所公开遗传数据的回顾性分析的好处是强调布新洛尔有助于它在治疗心力衰竭患者中有效性的独特药理学性质。这些特征中的两个对药物和肾上腺素能受体基因变体之间的相互作用也是有帮助的。
这些特征中的第一个是交感神经阻滞作用、或药物直接降低肾上腺素能动力的能力(降低血液和组织中去甲肾上腺素水平)。正如上面指出的，在已经被用来治疗心力衰竭的β-阻断剂中，在这点上布新洛尔是独特的(BEST Trial Investigators，2001；Lowes et al.，2000；Bristow et al.，2004)。布新洛尔的交感神经阻滞作用可能是由于β2-受体阻断加上不充分的α1-阻断使肾上腺素能动力活化，以及对β1-和β2-受体的低反向激动活性使得基于心肌抑制的肾上腺素能活化降到最低。布新洛尔能够有助于交感神经阻滞作用的其它特性是生成一氧化氮和β3受体激动性(Strosberg，1997)。这后两种性质加上或减去弱α1-受体阻断作用可能解释布新洛尔的轻度血管扩张性质(Gilbert et al.，1990)，与卡维地洛不同，这不足以引发反射性肾上腺素能活化。
当以适量存在时，(去甲肾上腺素更少降低)交感神经阻滞作用是一种有利性质，有助于布新洛尔的治疗性抗肾上腺素能作用。这是优于简单β-阻断的潜在作用机制，因为从系统中去除了过量的去甲肾上腺素。去甲肾上腺素对心肌有毒性并且过量的话会引发各种心脏病途径。然而，当过分扩大其作用时，交感神经阻滞作用能造成损害，并且能增加死亡率(Bristow et a1.2004)。正如以下讨论的，布新洛尔的遗传靶向允许这种特性只以有利的方式发挥其功能。
与药物遗传学靶标相互作用的布新洛尔的第二药理学特性是高亲和性的β1-受体阻断作用(Hershberger et al.，1990；Asano et al.，2001)。布新洛尔对人β1-受体、以及β2-受体具有高亲和性(Hershberger et al.，1990)。此外，通过对翻译或蛋白质转换的非激动作用，布新洛尔降低β1-受体的密度(Asano et al.，2001)。因为它如此良好的耐受性，布新洛尔可以以非常高的β-阻断剂量施用，并且这些性质中每一种都有助于它对高功能性人β1-受体389Arg/Arg基因变体的有益作用(实施例，Mason et al.，1999)。尽管布新洛尔在大鼠心肌中具有内在的类交感神经活性(ISA)，但是在功能性人心脏组织中布新洛尔缺乏ISA(Bristow et al.，1994；Sederberg et al.，2000；Bristow et al.，1998，实施例7)。这能在图13的板块A和B中清楚看到，其中在β1AR Arg/Arg或Gly携带者基因型中，即使存在用二萜di化合物福斯高林(forskolin)增强信号转导的条件下，在分离的衰竭的人右心室小梁中在产生力上没有明显增加。相比之下，正如在图13板块C中所示，扎莫特罗作为阳性对照ISA化合物在β1ARArg/Arg基因型中在低和高信号转导活化中都显示出增加了力，但是在Gly携带者中只有经福斯高林预处理提供的高活化状态下才表现出来。最后，正如在图13中所见的，在制备分离的人心脏中，布新洛尔对β1ARArg/Arg对比Gly携带者受体具有独特作用。在衰竭心脏中的低水平信号转导(低受体活化)条件下(板块A)，布新洛尔作为人心肌β1Arg/Arg受体的中性拮抗剂(无激动剂或逆向激动剂活性)起作用，但是当信号转导就像腺苷酰环化酶被福斯高林直接活化一样高(板块B)时，布新洛尔作为逆向激动剂发挥作用而使受体失活，正如通过统计学显著的斜率因子所指出，直到通过治疗剂量可达到的血浆中最高浓度10-6M。在Gly携带者受体中没有出现这种作用，其中布新洛尔在低活化状态中作为逆向激动剂发挥作用，而在福斯高林存在时作为中性拮抗剂。这些数据提示布新洛尔在拮抗高活化状态的β1389Arg/Arg受体中具有独特作用，其中受体的形式被推测是最心肌病的形式。
这些性质可能就是在布新洛尔治疗背景下在β1AR的Arg389遗传变体和在α2cAR的Del322-325遗传变体中所观察到的令人惊奇和未预料到的结果的原因。
II.多态性分析
因为所述遗传变体是在β1-AR和α-AR基因的编码区并且影响所编码的蛋白质，所以能够从核酸序列或蛋白质序列确定Arg389或Del322-325多态性的存在。因此，为此目的可以使用各种不同的方法。
A.核酸
本发明的某些实施方案涉及多种核酸，包括扩增引物、寡核苷酸探针、和基因组DNA分析涉及的其它核酸元件。在某些方面，核酸包括野生型、突变体、或多态性核酸。
因此，术语“β1-肾上腺素能受体”多态性或“β1AR”多态性是本领域的术语，表示β1-肾上腺素能受体基因或基因产物的核酸或氨基酸序列中的多态性。只为参考的目的，GenBank登记号J03019(Gly389)和AF169007(Arg389)(这两个序列以参考被并入本文中)的序列分别是β1-肾上腺素能受体基因序列的Gly-和Arg-389形式的实例。
同样，术语“α2c-肾上腺素能受体”多态性或“α2cAR”多态性因此是本领域的术语，表示α2c-肾上腺素能受体基因或基因产物中的多态性。只为参考的目的，GenBank登记号NM00683序列对应野生型(非缺失)而AF280400序列对应缺失型(这两个序列以参考被并入本文中)。
为了鉴定多态性位点，β1AR或α2c-AR基因编码区起始密码子的第一个核苷酸(在DNA分子中ATG的腺嘌呤和在RNA分子中AUG的腺嘌呤)被设定为核苷酸“1”并且沿着编码序列增加数目。相似地，所翻译蛋白质产物的第一个氨基酸(甲硫氨酸)被设定为氨基酸“1”。
术语“核酸”在本领域中是众所周知的。在本文中应用的“核酸”通常表示包含核碱基的DNA或RNA的分子(即，链)。例如，核碱基包括DNA(例如，腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”或胞嘧啶“C”)或RNA(例如，A、G、尿嘧啶“U”或C)中发现的天然嘌呤或嘧啶碱基。术语“核酸”包括术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”，各自都作为术语“核酸”的亚类。术语“寡核苷酸”表示长度约3-约100个核碱基的分子。术语“多核苷酸”表示长度大于约100个核碱基的至少一个分子。“基因”表示基因产物的编码序列、以及基因产物的内含子和启动子。
在一些实施方案中，本发明的核酸包含在cDNA序列中1165位具有胞嘧啶或鸟嘌呤的人β1AR cDNA序列或者存在或缺失964-975位核苷酸的α2CAR cDNA序列中的全部或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1165、1200、1300、1400、1500个或更多个连续核苷酸、或其间可导出的任何范围，或者是与以上核苷酸序列互补。本领域的技术人员知道如何设计并使用用于杂交和扩增的引物和探针，包括施用引物和探针所需的对同源性的限制。
这些定义通常涉及单链分子，但是在具体实施方案中也将包括部分、基本或完全与所述单链分子互补的额外链。因此，核酸可以包括包含分子的特定序列的一个或多个互补链或“互补物”的双链分子或三链分子。正如在本文中使用的，单链核酸可以以前缀“ss”表示，双链分子可以以前缀“ds”表示，三链核酸可以以前缀“ts”表示。
在具体方面，核酸编码蛋白质、多肽、或肽。在某些实施方案中，本发明涉及包含至少一个蛋白质性分子的新组合物。正如在本文中使用的，“蛋白质性分子”、“蛋白质性组合物”、“蛋白质性化合物”、“蛋白质性链”、或“蛋白质性物质”通常表示，但不限于，大于约200个氨基酸或者从基因翻译的内源性全长序列的蛋白质；大于约100个氨基酸的多肽；和/或约3-约100个氨基酸的肽。所有上述的有关“蛋白质性”的术语可以在本文中相互替换使用。
1.核酸的制备
可以通过本领域普通技术人员已知的任何技术制备核酸，比如，化学合成、酶促生产或生物生产。合成核酸(例如，合成寡核苷酸)的非限制性实例包括经体外化学合成制备的核酸，这是通过利用磷酸三酯、亚磷酸酯或氨基磷酸酯化学和固相技术，这种技术例如描述于欧洲专利266,032中，其通过参考并入本文；或者经过脱氧核苷H-膦酸酯中间体，这描述于Froehler et al.，1986和美国专利5,705,629中，每一篇文献经参考并入本文中。在本发明的方法中，可以使用一个或多个寡核苷酸。寡核苷酸合成的多种不同机制已经被公开，例如见，美国专利4,659,774、4,816,571、5,141,813、5,264,566、4,959,463、5,428,148、5,554,744、5,574,146、5,602,244，每篇均经参考并入本文中。
酶促生产核酸的非限制性实例包括通过酶在扩增反应如PCRTM(见例如，美国专利4,683,202和美国专利4,682,195，每一篇经参考并入本文中)中生产的核酸，或通过描述于美国专利5,645,897的寡核苷酸合成法生成的核酸，其通过参考并入本文中。生物生产核酸的非限制性实例包括在活细胞中生产(即复制)的重组核酸，比如在细菌中复制的重组DNA载体(见例如，Sambrook et al.2001，其通过参考并入本文中)。
2.核酸纯化
可以在聚丙烯酰胺凝胶、氯化铯离心梯度、色谱柱上或通过本领域普通技术人员已知的任何其它方式(见例如，Sambrook et al.2001，其通过参考并入本文中)纯化核酸。在某些方面，核酸是药学可接受核酸。药学可接受的组合物对于本领域技术人员是已知的，并且描述于本文中。
在某些方面，本发明涉及的核酸是分离的核酸。正如在本文中使用的，术语“分离的核酸”表示已经被分离而游离于、或以其它方式游离于一个或多个细胞的总基因组和转录核酸体系的核酸分子(例如，RNA和DNA分子)。在某些实施方案中，“分离的核酸”表示已经被分离而游离于、或以其它方式游离于细胞成分或体外反应成分例如大分子比如脂质或蛋白质、小生物分子等体系的核酸。
3.核酸片段
在某些实施方案中，所述核酸是核酸片段。正如在本文中使用的，术语“核酸片段”是核酸的片段，比如，作为非限制性实例，那些只编码部分β1AR基因座或β1AR基因序列、或部分α2cAR基因座或基因序列的核酸片段。因此，“核酸片段”可以包含基因序列的任何部分，包括从约2个核苷酸至包括启动子区至多聚腺苷酸信号的全长基因以及包括全部编码区的任意长度。
可以基于特定核酸序列设计多种核酸片段，并且可以是任意长度。通过给序列赋值，例如，第一个残基是1，第二个残基是2等，就可以建立定义所有核酸片段的算法：
n至n+y
其中n是从1到序列最后编号的整数而y是核酸片段长度减去1，其中n+y不超过序列的最后编号。因此，对于10聚体，核酸片段对应碱基1至10、2至11、3至12...等等。对于15聚体，核酸片段对应碱基1至15、2至16、3至17...等等。对于20聚体，核酸片段对应碱基1至20、2至21、3至22...等等。在某些实施方案中，核酸片段可以是探针或引物。正如在本文中使用的，“探针”通常表示用于检测方法或组合物中的核酸。正如在本文中使用的，“引物”通常表示用于延伸或扩增方法或组合物中的核酸。
4.核酸互补物
本发明也包括与核酸互补的核酸。当核酸能够根据标准Watson-Crick、Hoogsteen或反Hoogsteen互补配对原则与另一个核酸进行碱基配对时，所述核酸就是“互补物”或“互补于”另一个核酸。正如本文中使用的，“另一个核酸”可以表示分开的核酸或在同一分子中在空间上分开的序列。在优选实施方案中，互补物是用于检测核酸多态性的杂交探针或扩增引物。
正如本文中所用，术语“互补”或“互补物”也表示包含能与另一核酸链或双链杂交的连续核碱基或半连续核碱基(即一或更多核碱基结构不存在于该分子中)序列的核酸，即使少于所有核苷酸碱基不与对应核碱基形成碱基配对。然而，在一些诊断或检测实施方案中，完全互补的核酸是优选的。
5.核酸检测和评估
准确地根据先前描述于Small et al.，(2002)的方法实施基因型测定，该文献经参考并入本文。本领域技术人员应该理解，可用其它标准技术进行基因型测定并且任何技术可以用于本发明中。核酸检测方法的常规方法提供于下，后面是鉴定多态性包括单核苷酸多态性(SNP)的具体实施例。
确定需要β-阻断剂治疗的个体基因型的具体基因型测定方法不是本发明的一部分，但是简而言之涉及从个体中分离核酸混合物，其中包含个体中存在的两个拷贝的β1AR基因、或其片段，并且确定β1AR中在1165位置上核苷酸对的身份或者确定在α2cAR基因中在核苷酸964-975位置上是否有缺失。在β1AR和α2cAR基因中优选的多态性和多态位点包括下面表1中的内容：
表1
这些多态性在先前都已被报导过。野生型β1AR核苷酸序列通常包含核苷酸1165位的鸟嘌呤。野生型β1AR蛋白质序列通常包含氨基酸389位的甘氨酸。通常认为野生型α2cAR核苷酸序列表示没有核苷酸964-975位的缺失并且因此没有氨基酸322-325的缺失。
本领域的技术人员将很容易知道核酸分子可以是双链分子并且在一条链上参考的具体位置也涉及互补链上的相应位置。因此，在确定多态性位点时，当提到核酸分子正(正义或编码)链具体位点上的腺嘌呤、胸腺嘧啶(尿嘧啶)、胞嘧啶、或鸟嘌呤时，意思也分别包括核酸分子互补链的负(反义或非编码)链上相应位点的胸腺嘧啶(尿嘧啶)、腺嘌呤、鸟嘌呤、或胞嘧啶。因此，可以参考任一链并且仍包含同样的多态性位点，并且可以设计寡核苷酸与任一链杂交。贯穿本文的是，在鉴别多态性位点时，参考正义链，这只是为了便利的目的。
典型的是，使用比如公开于Jones(1963)等中的标准技术，该文献经引用并入本文，从采自个体的生物样本，比如血液样本或组织样本中分离核酸混合物。合适的组织样本包括全血、精液、唾液、泪液、尿、粪便物、汗、口腔物(buccal)、皮肤和毛发。所述核酸混合物可以包含基因组DNA、mRNA、或cDNA，并且在后两种情形中，生物样本必须从表达β1AR基因的器官中获得。此外，本领域技术人员应该理解的是mRNA或cDNA制备物不用来检测位于内含子或5’和3’非转录区的多态性。如果分离β1AR基因片段，它必须含有待测定基因型的多态性位点。
预测患者对β-激动剂反应的能力对于医生确定如何治疗心力衰竭患者是有用的。如果患者的基因型指示该患者可能对激动剂具有良好反应，那么与可能表现中等反应或没有反应的患者相比，此患者对于β-阻断剂治疗是更好的候选者，并且医生能够以更少的试验和错误确定哪些个体应接受替代形式的治疗。
在本发明中所使用的基因型测定方法中，可以通过从存在于个体中的一个或全部两拷贝的β1AR基因和/或α2cAR基因中直接扩增包含多态性位点的靶区域并通过常规方法确定所扩增区域的序列来确定在多态性位点处的核苷酸(核苷酸对)身份。本领域的技术人员将很容易理解在该位点纯合的个体中在所述多态性位点上将只检测到一种核苷酸，然而如果个体对于该位点是杂合的，那么将检测到两种不同核苷酸。多态性可以被直接鉴定，被称作正类型鉴定，或通过推导而得，被称为负类型鉴定。例如，在参考人群中已知SNP是鸟嘌呤和胞嘧啶的情形下，对于该位点为纯合的个体可以正性确定该位点是鸟嘌呤或胞嘧啶；或如果个体在该位点是杂合的，那么该位点是鸟嘌呤和胞嘧啶。作为替代，可以负性确定该位点不是鸟嘌呤(并且因此是胞嘧啶/胞嘧啶)或不是胞嘧啶(并且因此是鸟嘌呤/鸟嘌呤)。
靶区域可以使用任何寡核苷酸指导的扩增方法进行扩增，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)(美国专利No.4,965,188)、连接酶链式反应(LCR)(Barany et al.，1991；WO90/01069)、和寡核苷酸连接分析(OLA)(Landegren et al.，1988)。在这些方法中可用作引物或探针的寡核苷酸将特异地杂交到含有或邻近多态性位点的核酸区域。典型的是，寡核苷酸是10-35个核苷酸长并且优选15-30个核苷酸长。最优选的是，寡核苷酸是20-25个核苷酸长。寡核苷酸的准确长度将取决于技术人员常规所考虑和实践的许多因素。
可以用其它已知的核酸扩增方法扩增靶区域，包括基于转录的扩增系统(美国专利No.5,130,238；EP 329,822；美国专利No.5,169,766，WO89/06700)和等温方法(Walker et al.，1992)。
也可以在扩增之前或之后使用本领域中已知的几种基于杂交的方法之一分析靶区域中的多态性。通常在实施这样的方法时，应用等位基因特异性的寡核苷酸。等位基因特异性寡核苷酸可以用作不同标记的探针对，其中探针对的一个成员显示出对靶序列的一种变体完全匹配并且另一个成员显示出对不同变体完全匹配。在一些实施方案中，可以使用一组等位基因特异性寡核苷酸或寡核苷酸对一次检测超过一个多态性位点。
可以两种实体都在溶液中实施等位基因特异性寡核苷酸与靶多核苷酸的杂交，或者当寡核苷酸或靶多核苷酸以共价或非共价方式附着到固体支持物上时实施这样的杂交。例如，可以通过抗体-抗原相互作用、聚-L-赖氨酸、链亲合素或亲合素-生物素、盐桥、疏水相互作用、化学连接、紫外交联烘烤等介导附着。可以直接在固体支持物上合成等位基因特异性寡核苷酸或者在合成以后再附着到固体支持物上。适用于本发明检测方法中的固体支持物包括由硅、玻璃、塑胶、纸等制备的基底，例如，其可以被做成孔(如作为96孔板)、条(slide)、薄片(sheet)、膜、纤维、基片(chip)、盘、和珠。可以处理、包被或衍生化固体支持物从而辅助等位基因特异性寡核苷酸或靶核酸的固定。
也可以通过将一个或全部两拷贝的基因或其片段与比如描述于WO95/11995的核酸阵列和亚阵列杂交来确定个体的β1AR基因中一或多种多态性位点的基因型。所述阵列包含一组等位基因特异性寡核苷酸，其代表包含于基因型或单体型中的各种多态性位点。
也可以使用错配检测技术确定多态性的身份，错配检测技术包括但不限于应用核糖核酸探针(riboprobes)(Winter et al.，1985；Meyers et al.，1985)和识别核苷酸错配的蛋白质比如大肠杆菌mutS蛋白质(Modrich，1991)的RNA酶保护方法。作为替代，可以通过单链构象多态性(SSCP)分析(Orita et al.，1989；Humphries，et al.，1996)或变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Wartell et al.，1990；Sheffield et al.，1989)鉴定变体等位基因。
也可以使用聚合酶介导的引物延伸方法鉴定多态性。几种这样的方法已经在专利和科学文献中描述过。可以通过描述于美国专利5,605,798的质谱方法检测含有多态性的延伸引物。另一种引物延伸方法是等位基因特异性PCR(Ruano et al.，1989；Ruano et al.，1991；WO 93/22456；Turki et al.，1995)。
也可以使用某些限制酶的DNA差异消化方法(Small et al.，2002)或通过鉴定β1AR基因1165位核苷酸的任何其它方法检测人β1AR基因核苷酸1165位的多态性变异。
a.杂交
使用长度在7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、50、60、70、80、90或100个核苷酸之间的、优选17-100个核苷酸的、或在本发明的某些方面中长达1-2千碱基或更长的探针和引物，允许形成既稳定又具有选择性的双链分子。一般优选在超过20个碱基长的连续片段上具有互补序列的分子，以增加所获得杂交分子的稳定性和/或选择性。技术人员通常优选设计具有一或多个20-30核苷酸或期望时甚至更长的互补序列的核酸分子用于杂交。这样的片段可以很容易的被制备，例如，通过化学方法直接合成或通过将所选择序列引入重组载体中进行重组生产。
因此，对于本发明的核苷酸序列，可以利用它们与DNA和/或RNA的互补区段选择性形成双链分子的能力，或者利用它们提供引物从样本中扩增DNA或RNA的能力。根据预期应用，期望利用不同的杂交条件以实现探针或引物对靶序列的不同程度的选择性。
对于需要高选择性的应用，通常期望使用相对高严谨度的条件以形成杂交物。例如，相对低盐和/或高温条件，比如约50℃到约70℃温度下约0.02M到约0.10M NaCl所提供的条件。这种高严谨度条件很少允许在探针或引物与模板或靶链之间任何可能的错配并且特别适合于分离特异性基因或检测特异性多态性。通常知道通过加入逐渐增加量的甲酰胺能够提供更加严谨的条件。例如，在高严谨度条件下，可以在如下条件下进行滤膜结合DNA的杂交：在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mMEDTA、65℃，并且在68℃、0.1×SSC/0.1％SDS中清洗(Ausubel et al.，1989)。
可以通过增加盐浓度和/或降低温度提供较低严谨度的条件。例如，可以通过约37℃到约55℃下约0.1到0.25M NaCl提供中等严谨度条件，可以通过约20℃到约55℃下约0.15M到约0.9M盐提供低严谨度条件。在低严谨度条件下，比如适当严谨度条件下，清洗可以在例如42℃下0.2×SSC/0.1％SDS中进行(Ausubel et al.，1989)。根据期望结果可以很容易地操控杂交条件。
在另一些实施方案中，杂交可以在例如以下条件下实现：50mMTris-HCl(pH 8.3)，75mM KCl，3mM MgCl2，1.0mM二硫苏糖醇，温度约20℃到约37℃。其它所利用的杂交条件可以包括约10mMTris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，温度约40℃到约72℃。
在某些实施方案中，应用本发明定义序列的核酸并联合适于确定杂交手段比如标记将是有利的。在本领域中已知广泛的适当指示手段，包括荧光、放射性、酶或其它配体，比如亲合素/生物素，它们可以被检测。在优选实施方案中，技术人员可以期望应用荧光标记或酶标签比如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶替代放射性或其它对环境有害的试剂。在酶标签的情形中，比色指示底物是已知的并能够用来提供可见的或分光光度计可检测的检测手段，从而鉴定与包含互补核酸的样品特异性杂交。在另一些方面，可能存在特定的核酸酶切割位点，并可以通过存在或缺少核酸切割而确定特定核苷酸序列的检测。
一般来说，可以预见到本文中所描述的探针或引物可以用作溶液杂交比如PCR中的试剂，用于检测相应基因的表达或基因型，以及用在应用固相的实施方案中。在涉及固相的实施方案中，测试DNA(或RNA)被吸附或以另外方式附着到所选的表面或基质。随后将这种固定的、单链核酸与选定探针在期望条件下进行杂交。所选条件将取决于特定环境(例如，取决于G+C含量、靶核酸类型、核酸来源、杂交探针的大小等)。本领域技术人员根据特定应用目的优化杂交条件的方法是众所周知的。在清洗杂交分子从而去除非特异性结合的探针分子之后，通过确定结合标记物的量对杂交进行检测和/或定量。典型的固相杂交方法公开于美国专利5,843,663、5,900,481和5,919,626。可以用于实施本发明的另一些杂交方法公开于美国专利5,849,481、5,849,486和5,851,772。在本说明书本部分中指出的这些以及其他参考的相关部分通过引用并入本文中。
b.核酸扩增
用作扩增模板的核酸可以根据标准方法(Sambrook et al.，2001)从细胞、组织或其它样本中分离。在某些实施方案中，对模板核酸进行或不进行实质性纯化对全细胞或组织匀浆或生物流体样本实施分析。核酸可以是基因组DNA或经分离的或全细胞RNA。当使用RNA时，可以期望首先将RNA转化成互补DNA。
在本文中使用的术语“引物”的意思包括能够在模板依赖的过程中引发新生核酸合成的任何核酸。通常，引物是10-20和/或30个碱基对长的寡核苷酸，但是也可使用更长的序列。可以以双链和/或单链形式提供引物，尽管单链形式是优选的。
设计用来选择性杂交与β1AR基因座或其变体、及其片段所对应核酸的引物对与模板核酸在允许选择性杂交的条件下相接触。根据期望的应用，可以选择只允许完全互补的序列与引物杂交的高严谨度杂交条件。在另一些实施方案中，可以在较低严谨度下进行杂交，从而允许扩增与引物序列包含一个或多个错配的核酸。一旦形成杂交，模板引物复合物与一或多种促进模板依赖性核酸合成的酶接触。进行多轮扩增，也称“循环”，直到产生足量的扩增产物。
可以检测、分析或定量扩增产物。在某些应用中，可通过可视手段实施检测。在某些应用中，检测可以涉及经由所掺入放射性标记或荧光标记的化学发光、放射性闪烁分析或甚至经由使用电子和/或热脉冲信号的系统(Affymax technology；Bellus，1994)来进行产物的间接鉴定。
很多模板依赖性方法可用于扩增存在给定模板样本中存在的寡核苷酸序列。了解最多的扩增方法之一是聚合酶链式反应(被称作PCRTM)，其详细内容公开于美国专利4,683,195、4,683,202和4,800,159和Innis etal.，1988，其中的每一篇以整体方式通过参考并入本文中。
另一种扩增方法是连接酶链式反应(“LCR”)，其公开于欧洲专利申请No.320 308，其以整体方式通过参考并入本文中。美国专利4,883,750描述了与LCR相似的方法，用于使探针对与靶序列结合。一种公开于美国专利5,912,148的基于PCRTM和寡核苷酸连接酶分析(OLA)的方法(下面将有进一步详细的描述)也可以使用。
用于扩增可用来实施本发明的靶核酸序列的替代方法公开于美国专利5,843,650、5,846,709、5,846,783、5,849,546、5,849,497、5,849,547、5,858,652、5,866,366、5,916,776、5,922,574、5,928,905、5,928,906、5,932,451、5,935,825、5,939,291和5,942,391，英国申请2 202 328，和PCT申请PCT/US89/01025，其中的每一篇以整体方式通过参考并入本文中。在PCT申请PCT/US87/00880中描述的Qbeta复制酶也可以用在本发明的扩增方法中。
一种等温扩增方法，其中使用限制性内切酶和连接酶实现扩增在限制性位点的一条链中含有核苷酸5′-[α-硫代]-三磷酸的靶分子，这种方法也可以在本发明中用于扩增核酸(Walker et al.，1992)。公开于美国专利5,916,779的链置换扩增(SDA)是另一种实施核酸等温扩增的方法，该方法涉及多轮的链置换和合成，即，缺口翻译。
另外的核酸扩增方法包括基于转录的扩增系统(TAS)，包括基于核酸序列的扩增(NASBA)和3SR(Kwoh et al.，1989；PCT申请WO 88/10315，其以整体方式通过参考并入本文中)。欧洲申请329 822公开了一种核酸扩增方法，涉及循环合成单链RNA(“ssRNA”)、ssDNA、和双链DNA(dsDNA)，其可以根据本发明来使用。
PCT申请WO 89/06700(它以整体方式通过参考并入本文中)公开了一种核酸序列扩增方案，其基于启动子区/引物序列与靶单链DNA杂交以及随后转录所述序列的许多RNA序列拷贝。这个方案不是循环的，即，从新模板不是从所得RNA转录物中产生的。其它的扩增方法包括“RACE”和“单边PCR”(Frohman，1990；Ohara et al.，1989)。
c.核酸检测
任何扩增之后，可以期望从模板和/或过量引物中分离扩增产物。在一个实施方案中，使用标准方法通过琼脂糖、琼脂糖-丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物(Sambrook et al.，2001)。所分离的扩增产物可以从凝胶中切出并从凝胶中洗脱用于进一步处理。使用低熔点琼脂糖凝胶，可以通过加热凝胶随后提取核酸来回收所分离的带。
也可以使用本领域已知的旋转离心柱和/或色谱技术实现核酸分离。有许多种可用于本发明实施的色谱法，包括吸附、分配、离子交换、羟基磷灰石、分子筛、反相、柱、纸、薄层和气相色谱法以及HPLC。
在某些实施方案中，对分离或没有分离的扩增产物进行显示。典型的显示方法涉及用溴化乙锭染色凝胶并在UV光下使条带可视。作为替代，如果用放射性-或荧光标记的核苷酸以整合方式标记扩增产物，分离的扩增产物可以对X-射线胶片曝光或者在适当的激发光谱下使其可视。
在一个实施方案中，在分离扩增产物之后，使标记的核酸探针与扩增的标记序列接触。探针优选与发色团缀合，但也可以放射性标记。在另一个实施方案中，探针与结合伴侣比如抗体或生物素、或携带可检测部分的另一种结合伴侣缀合。
在具体实施方案中，通过Southern印迹和与标记探针的杂交来实施所述检测。Southern印迹的技术对本领域技术人员是众所周知的(见Sambrook et al.，2001)。前述的一个实例在美国专利5,279,721中有描述，其通过参考并入本文中，其公开了用于核酸的自动电泳和转移的装置和方法。所述装置允许无需外部操作凝胶而进行电泳和印迹并且非常适于实施根据本发明的方法。
可用于实施本发明的另一些核酸检测方法公开于美国专利5,840,873、5,843,640、5,843,651、5,846,708、5,846,717、5,846,726、5,846,729、5,849,487、5,853,990、5,853,992、5,853,993、5,856,092、5,861,244、5,863,732、5,863,753、5,866,331、5,905,024、5,910,407、5,912,124、5,912,145、5,919,630、5,925,517、5,928,862、5,928,869、5,929,227、5,932,413和5,935,791，其中每一个通过参考并入本文中。
d.其他检测
可以在本发明的范围内使用另外的遗传筛选方法，例如，用来检测基因组DNA、cDNA和/或RNA样本中的突变。用来检测点突变的方法包括变性梯度凝胶电泳(“DGGE”)、限制性片段长度多态性分析(“RFLP”)、化学或酶促切割方法、直接测序经PCRTM(见上述)扩增的靶区域、单链构象多态性分析(“SSCP”)和本领域已知的其他方法。
一种筛选点突变的方法是基于RNA/DNA或RNA/RNA异源双链核酸分子中错配碱基对的RNase切割。正如在本文中使用的，将术语“错配”定义为在双链RNA/RNA、RNA/DNA或DNA/DNA分子中一个或多个未配对或错配对核苷酸的区域。因此这个定义包括由于插入/缺失突变、以及单或多碱基点突变引起的错配。
美国专利4,946,773描述了一种RNaseA错配切割检测方法，其涉及将单链DNA或RNA检测样本与RNA探针一起退火，并随后用RNase A处理核酸双链体。为检测错配，用RNase A处理的、根据大小进行电泳分离的单链产物与相似处理的对照双链体进行比较。包含不能在对照双链体中看见的较小片段(切割产物)的样本作为阳性被记录。
其他研究者已经描述了RNase I在错配检测中的应用。在PromegaBiotech的文献中描述了RNase I用于错配检测的应用。Promega销售含有RNase I的试剂盒，据报道RNase I切割4个已知错配中的3个。另外还有描述使用MutS蛋白质或其它DNA-修复酶检测单碱基错配。
可用于实施本发明的检测缺失、插入或替换突变的替代方法公开于美国专利5,849,483、5,851,770、5,866,337、5,925,525和5,928,870，其中每一个以其整体通过参考被并入本文中。
e.多态性核酸筛选方法的具体实施例
在生物的基因组进化过程中发生的自发突变经常不立即传遍该物种的所有成员，从而产生共存于该物种群体中的多态性等位基因。多态性经常是遗传性疾病的病因。几类多态性已经被鉴定。例如，可变核苷酸类型多态性(VNTR)是由核苷酸的二或三核苷酸重复基序的自发性串联复制产生的。如果这样的变异改变由限制性内切酶切割产生的DNA片段的长度，所述变异被称为限制性片段长度多态性(RFLP)。RFLP已被广泛地用于人和动物的遗传分析。
另一类多态性是由单核苷酸的替换产生的。这种单核苷酸多态性(SNP)很少导致限制性内切酶位点的变化。因此，SNP几乎不能用限制性片段长度分析来检测。SNP是最常见的遗传性变异并且每100-300个碱基出现一次，并且已经发现了几种SNP突变，它们以足够在实际上引起遗传疾病的方式影响蛋白质编码基因中的单核苷酸。SNP疾病的例子有血友病、镰状细胞性贫血、遗传性血色沉着病、迟发型阿尔茨海默病等。
已经开发出几种筛选多态性的方法并且在下面列举了一些实例。参考文献Kwok and Chen(2003)和Kwok(2001)提供了一些这些方法的综述；这两个参考文献特别地通过参考并入本文中。
涉及ABCC2的SNP的特征可以通过应用这些方法中的任何方法或其合适修改来确定。这些方法包括所述位点的直接或间接测序、使用限制性位点被所述位点处各等位基因产生或破坏的限制酶、使用等位基因特异性杂交探针、使用针对多态性的不同等位基因所编码蛋白质的特异性抗体、或任何其他生物化学解释方法。
i.DNA测序
表征多态性最普遍使用的方法是对包括多态性及其旁侧的基因座直接进行DNA测序。可以使用双脱氧链终止法(也称作“Sanger法”(Sangeret al.，1975))或者“化学降解法”(也称作“Maxam-Gilbert法”(Maxamet al.，1977))完成这样的分析。可以使用测序方法联合基因组序列特异性扩增技术比如聚合酶链式反应促进所期望基因的回收(Mullis et al.，1986；欧洲专利申请50,424；欧洲专利申请84,796、欧洲专利申请258,017、欧洲专利申请237,362；欧洲专利申请201,184；美国专利4,683,202；4,582,788；和4,683,194)，以上全部参考文献通过参考并入本文中。
ii.核酸外切酶抗性
能用来确定多态性位点处所存在核苷酸身份的另一些方法利用专门的核酸外切酶抗性核苷酸衍生物(美国专利4,656,127)。与多态性位点立即3’区等位基因序列互补的引物在研究条件下与所述DNA杂交。如果在该DNA上多态性位点包含与所存在的具有特定核苷酸外切抗性衍生物互补的核苷酸，那么该衍生物将通过聚合酶掺入杂交引物的末端。这样的掺入使得引物对核酸外切酶切割具有抗性并且由此允许其检测。因为核苷酸外切抗性衍生物的身份是已知的，可以确定在DNA多态性位点中存在的特定核苷酸。
iii.微量测序方法
另外几种用于检测DNA中多态性位点的引物指导的核苷酸掺入方法已有描述(Komher et al.，1989；Sokolov，1990；Syvanen 1990；Kuppuswamy et al.，1991；Prezant et al.，1992；Ugozzoll et al.，1992；Nyrenet al.，1993)。这些方法依赖于掺入标记脱氧核苷酸以区分多态性位点处的碱基。因为信号与掺入的脱氧核苷酸的量成比例，所以在相同核苷酸的循环中出现的多态性产生与该循环的长度成比例的信号(Syvanen etal.，1990)。
iv.在溶液中延伸
法国专利2,650,840和PCT申请WO91/02087讨论了确定多态性位点的核苷酸身份的基于溶液的方法。根据这些方法，使用与多态性位点立即3’的等位基因序列互补的引物。如果与多态性位点处核苷酸互补，标记的双脱氧核苷酸衍生物将掺入引物的末端处，使用所述标记双脱氧核苷酸衍生物来确定该位点处核苷酸的身份。
v.遗传比特(Bit)分析或固相延伸
PCT申请WO92/15712描述了使用标记终止剂以及与多态性位点3’序列互补的引物的混合物的方法。所掺入的标记终止剂与待评价靶分子多态性位点中所存在的核苷酸互补并因此得以鉴定。在此引物或靶分子被固定到固相上。
vi.寡核苷酸连接分析(OLA)
这是使用不同方法学的另一种固相方法(Landegren et al.，1988)。使用能杂交到靶DNA单链的邻接序列的两种寡核苷酸。这些寡核苷酸中的一种是生物素化的，而另一种被可检测地标记。如果在靶分子中发现了精确的互补序列，寡核苷酸将杂交，于是与它们的末端邻接，并产生连接底物。所述连接允许应用亲合素回收标记的寡核苷酸。基于这种方法并联合PCR的另外的核酸检测法也已经描述(Nickerson et al.，1990)。在此使用PCR实现靶DNA的指数扩增，随后应用OLA检测靶DNA。
vii.连接酶/聚合酶介导的遗传比特分析
美国专利5,952,174描述了一种也涉及能与靶分子的邻接序列杂交的两种引物的方法。在固定有靶标的固体支持物上形成杂交产物。杂交在此发生，于是引物被分离开而互相间隔单个核苷酸。在聚合酶、连接酶、和含有至少一种脱氧核苷三磷酸的核苷三磷酸混合物存在的条件下，孵育这种杂交产物，以允许任何成对的邻接的杂交寡核苷酸相连接。加入连接酶导致发生信号、延伸和连接所需的两种事件。这与只单独使用延伸或连接的方法相比，提供了更高的特异性和更低的“噪音”，并且与基于聚合酶的检测不一样，这种方法通过使聚合酶步骤与二次杂交和连接步骤相联合用于将信号附着至固相，从而增强了聚合酶步骤的特异性。
viii.侵入性切割反应
侵入性切割反应可以用来评估细胞DNA的特定多态性。被称作的技术利用了这种反应(例如，de Arruda et al.，2002；Stevens etal.，2003，它们通过参考并入本文中)。一般来说，有三种核酸分子：1)靶位点上游的寡核苷酸(“上游寡核苷酸”)，2)覆盖靶位点的探针寡核苷酸(“探针”)，和3)具有靶位点的单链DNA(“靶标”)。上游寡核苷酸和探针不重叠但是它们含有邻接序列。探针含有供体荧光团比如荧光素，和受体染料比如Dabcyl。上游寡核苷酸3’末端的核苷酸重叠(“侵入”)探针-靶双链的第一碱基对。随后结构特异性5’核酸酶切割探针，引起荧光团/猝灭剂对分离，这增加了可检测荧光的量。见Lu et al.，2004。
在一些情况中，在固体表面上或以阵列形式实施检测。
ix.检测SNP的其他方法
在下面列举了几种用于多态性检测和鉴定的另一些特异性方法，并且可以原样或者结合结合本发明中鉴定β1AR基因多态性进行适当修改来使用。在万维网上NCBI的SNP网址www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP中上也描述了几种其他方法，它们通过参考并入本文中。
在具体的实施方案中，扩展的单倍型可以在群体中任意给定基因座上确定，这允许人们明确鉴定哪些SNP将是冗余而哪些是在关联研究中必需的。后者被称为‘单倍型标签SNP(htSNP)’、它是捕获连锁不平衡的基因或区域的单倍型的标记物。见Johnson et al.(2001)和Ke and Cardon(2003)，其中每一篇通过参考并入本文中，用作示例性方法。
通过使用TaKaRa LA Taq试剂和其它标准反应条件的长距离PCR方法，VDA分析利用基因组片段的PCR扩增。长距离扩增方法能够扩增约2,000-12,000bp大小的DNA。可以通过Affymetrix高通量筛选中心(HighThroughput Screening Center)和计算机软件分析实施产物与变异检测阵列(VDA)的杂交。
一种称作芯片分析(Chip Assay)的方法通过标准或长距离PCR方案使用基因组片段的PCR扩增。通过VDA分析杂交产物(Halushka et al.(1999)，其经参考并入本文)。SNPs通常基于杂交模式的计算机分析被分类为“确定”或“可能”。通过与替代检测方法比如核苷酸测序进行比较，通过这种方法已经证实了100％的“确定”SNP；并且已经证实了73％的“可能”SNP。
另一些方法仅涉及PCR扩增随后用相应限制性酶消化。还有另一些涉及对来自已知基因组区的纯化PCR产物进行测序。
还在另一些方法中，PCR扩增个别外显子或大外显子的重叠片段。从公开或数据库序列来设计引物并使用以下条件实施基因组DNA的PCR扩增：200ng DNA模板，每种引物0.5μM，dCTP、dATP、dTTP和dGTP各80μM，5％甲酰胺，1.5mM MgCl2，0.5U Taq聚合酶和0.1体积Taq缓冲液。实施热循环并且通过PCR单链构象多态性(PCR-SSCP)分析在各种条件下分析所得PCR产物，所述条件例如含或不含5％甘油、具有15％尿素的5或10％聚丙烯酰胺凝胶。实施过夜电泳。重新扩增显示出迁移率变动的PCR产物并对其进行测序从而鉴定核苷酸变异。
在称作CGAP-GAI(DEMIGLACE)的方法中，将序列和比对数据(来自PHRAP.ace文件)、用于序列碱基判定(call)的质量分值(来自PHRED质量文件)、距离信息(来自PHYLIP dnadist和neighbour程序)和碱基判定数据(来自PHRED‘-d’swith)加载到存储器中。比对序列并对所得组块的每个垂直区块(‘条slice’)的不一致性进行检查。任何这样的条被认为候选SNP(EDMIGLACE)。通过DEMIGLACE使用多种滤器以排除不可能代表真正多态性的条。这些滤器包括：(i)如果相邻序列质量评分下降40％或更多，从SNP考虑中排除任何给定条中的序列；(ii)排除碱基判定中峰值幅度低于那种核苷酸类型的所有碱基判定百分之十五的判定；(iii)排除与参与SNP计算的共有序列具有高量不一致性的序列的区域；(iv)从考虑中去除具有某种替代判定的任何碱基判定，在所述替代判定中峰值占所判定峰面积的25％或更多；(v)排除只在一个读取方向上出现的变异。PHRED质量评分被转换成针对所述条中每个核苷酸的误差概率值。使用标准Baysian方法计算在给定位置上具有核苷酸异质性证据的后验概率。
在称作CU-RDF(RESEQ)的方法中，使用针对每种SNP的特异性引物用从血液分离的DNA实施PCR扩增，并且在进行典型的清洁(cleanup)方案以去除未用引物和游离核苷酸之后，使用同样的或巢式引物直接测序。
在称作DEBNICK(METHOD-B)的方法中，进行成簇EST序列的比较分析并通过基于荧光的DNA测序来确认。在一种称作DEBNICK(METHOD-C)的相关方法中，成簇EST序列的比较分析条件如下：在错配位点处phred质量＞20，在SNP的5’FLANK和3’的5个碱基上平均phred质量＞＝20、在SNP的5’和3’5个碱基中没有错配，每个等位基因实施至少两次并通过检查轨迹来确认。
在称为ERO(RESEQ)的方法中，根据电子公开的STS设计新引物组并且用来扩增来自10个不同小鼠品系的DNA。来自每个品系的扩增产物随后进行凝胶纯化并使用应用33P-标记终止剂的标准双脱氧、循环测序技术对其进行测序。全部ddATP终止的反应随后被加载到测序凝胶的相邻泳道中，随后是全部ddGTP反应等。通过可视检查放射性照片鉴定SNP。
在另一个称作ERO(RESEQ-HT)的鉴定方法中，根据电子公开的鼠DNA序列设计新引物组并且用于扩增来自10种不同小鼠品系的DNA。通过应用核酸外切酶I和虾碱性磷酸酶，制备来自每个品系的扩增产物用于测序。使用ABI Prism Big Dye Terminator Ready Reaction试剂盒(Perkin-Elmer)实施测序并在3700DNA分析仪(96毛细管测序仪)上处理序列样品。
FGU-CBT(SCA2-SNP)是一种方法，其中使用引物SCA2-FP3和SCA2-RP3PCR扩增含SNP的区域。在50ml反应体积中扩增约100ng基因组DNA，反应体系含有终浓度5mM Tris、25mM KCl、0.75mMMgCl2、0.05％明胶、每种引物各20pmol和0.5U Taq DNA聚合酶。样品被变性、退火和延伸，并且使用，例如，QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化从琼脂糖凝胶切下条带中的PCR产物，并且用PCR引物在ABI Prism377自动DNA测序仪上使用染料终止化学法对其进行测序。
在称作JBLACK(SEQ/RESTRICT)的方法中，对基因组DNA实施两个独立PCR反应。通过测序分析来自第一反应的产物，指示独特的FspI限制性位点。通过用Fsp I消化确定在第二PCR反应产物中的突变。
在描述为KWOK(1)的方法中，通过比较来自4个随机选择个体的应用染料-终止化学法对PCR产物直接DNA测序获得的高质量基因组序列数据来鉴定SNP(见Kwok et al.，1996)。在一个称为KWOK(2)的相关方法中，通过比较来自重叠大片段插入克隆比如细菌人工染色体(BAC)或基于P1的人工染色体(PAC)的高质量基因组序列数据来鉴定SNP。随后发展含有这种SNP的STS，并通过合并DNA(pooled DNA)测序确定在各种群体中SNP的存在(见Taillon-Miller et al.，1998)。在另一个称为KWOK(3)的相似方法中，通过比较来自重叠大片段插入克隆BAC或PAC的高质量基因组序列数据来鉴定SNP。通过这种方法发现的SNP代表两种供体染色体之间的DNA序列变异，但是在一般群体中的等位基因频率仍然没有确定。在KWOK(5)方法中，通过比较来自纯合体DNA样品和一种或多种合并DNA样品应用染料终止化学法对PCR产物直接DNA测序获得的高质量基因组序列数据来鉴定SNP。从公共数据库发现的序列数据发展所用的STS。具体来说，对完全葡萄胎(CHM)通过PCR扩增这些STS，所述完全葡萄胎已经显示在所有基因座上都是纯合的并且DNA样品来自80名CEPH父母(见Kwok et al.，1994)。
在另一个这样的方法KWOK(OverlapSnpDetectionWithPolyBayes)中，通过计算机分析大片段插入人基因组克隆序列的重叠区发现SNP。为了获取数据，直接从大规模测序中心获得克隆序列。这是必要的，因为碱基质量序列不存在于GenBank/不能通过GenBank获得。原始数据处理涉及分析克隆序列和关于一致性的附加碱基质量信息。给没有相关碱基质量序列的完成(‘完美碱基’，误差率为每10,000bp中少于1个)序列指定一个统一的碱基质量值40(误差率为10,000bp中1个)。抛弃没有碱基质量值的草图序列。将处理后序列输入到本地数据库。也保存每一序列的掩蔽已知人重复序列的版本。用程序“MASKERAID”实施重复序列掩蔽。重叠检测：用程序“WUBLAST”检测假想重叠。接下来是几个过滤步骤，它们是为了排除假重叠检测结果，即由于序列复制而非真正重叠产生的成对克隆序列之间的相似性。总重叠长度、整体百分相似性、具有高碱基质量值“高质量错配”的核苷酸之间的序列差异数。结果也与在华盛顿大学基因组测序中心的基因组克隆的限制性片段图谱的结果、完成者的重叠结果报告、以及NCBI种序列连锁群建设项目的结果进行比较。SNP检测：用‘POLYBAYES’SNP检测软件针对候选SNP位点来分析克隆序列的重叠对。针对代表真正序列变异而非测序错误的概率对成对序列的序列差异进行评分。这种处理需要两个序列的碱基质量值都存在。抽出高分值的候选者。搜索被限于替换型单碱基对变异。通过POLYBAYES软件计算候选SNP的置信度评分。
在称为KWOK(TaqMan分析)的方法中，使用TaqMan分析来确定90个随机个体的基因型。在称为KYUGEN(Q1)的方法中，合并指定群体的DNA样本并通过PLACE-SSCP进行分析。通过杂合体中的那些来校正合并分析中每个等位基因的峰高度，随后用于计算等位基因频率。通过这种方法可靠地定量高于10％的等位基因频率。等位基因＝0(零)表示在个体中发现了等位基因，但是在检查合并库中没有见到相应的峰。等位基因频率＝0-0.1指示在合并库中检测到少量等位基因，但是因为峰太低而不能可靠定量。
在另一个称为KYUGEN(Method1)的方法中，用荧光染料对PCR产物进行后标记并且通过自动毛细管电泳系统在SSCP条件(PLACE-SSCP)下对其进行分析。在一系列试验中，应用或不应用两种合并库DNA(日本人库和CEPH父母库)对四个或更多个体DNA进行分析。通过可视检查鉴定等位基因。对具有不同基因型的个体DNA进行测序并鉴定其SNP。在用杂合体中的峰高校正信号偏差之后，从合并库样本的峰高来估计等位基因频率。对于PCR，引物被加标签而在其末端具有5′-ATT或5′-GTT用于两条链的后标记。在反应混合物中对DNA样本(10ng/ul)进行扩增，所述反应混合物含有缓冲液(10mM Tris-HCl、pH 8.3或9.3、50mM KCl、2.0mM MgCl2)、每种引物各0.25μM、每种dNTP各200μM、和0.025U/μl预先混有抗-Taq抗体的Taq DNA聚合酶。通过DNA聚合酶I的Klenow片段的交换反应用具有R110和R6G修饰的核苷酸差异化标记PCR产物的两条链。通过加入EDTA停止反应，并且通过加入牛小肠碱性磷酸酶使未掺入的核苷酸去磷酸化。对于SSCP，将小份荧光标记PCR产物和TAMRA标记的内部标记物加到去离子甲酰胺中，并变性。使用ABI Prism 310基因分析仪在毛细管中进行电泳。应用Genescan软件(P-E Biosystems)收集数据和处理数据。使用big-dye终止化学在ABI Prism 310测序仪上对个体(2到11个)的DNA(包括在SSCP上显示出不同基因型的个体的DNA)进行直接测序。通过Phred/Phrap对从ABI Prism 310获得的多重序列轨迹轨迹文件进行处理和比对，并且使用Consed阅读器观察。
在另一个称为KYUGEN(Method2)的方法中，通过变性HPLC(DHPLC)或PLACE-SSCP(Inazuka et al.，1997)搜索具有不同基因型的个体并且确定它们的序列以鉴定SNP。为了两条链的后标记，用在末端带5′-ATT或5′-GTT标签的引物实施PCR。应用WAVE DNA片段分析系统(Transgenomic)实施DHPLC分析。PCR产物被注入DNASep柱中，并在用WAVEMaker程序(Transgenomic)确定的条件下对其进行分离。通过DNA聚合酶I的Klenow片段交换反应用具有R110和R6G修饰的核苷酸差异标记PCR产物的两条链。通过加入EDTA停止所述反应，并且通过加入牛小肠碱性磷酸酶使未掺入的核苷酸去磷酸化。用ABI Prism 310基因分析仪在毛细管中实施SSCP随后电泳。Genescan软件(P-E Biosystems)。在ABI Prism 310测序仪上，应用big-dye终止化学对个体DNA(包括在DHPLC或SSCP上显示出不同基因型的那些)进行测序。通过Phred/Phrap对从ABI Prism 310获得的多重序列轨迹轨迹文件进行处理和比对，并且使用Consed阅读器观察。通过PolyPhred软件和可视检查鉴定SNP。应用PHRED处理Unigene中EST序列的轨迹色谱数据。为了鉴定可能的SNP，从通过程序PHRAP、BRO和POA产生的针对每个Unigene簇的多重序列比对结果中报告单碱基错配。BRO校正可能误报的EST定向，然而POA鉴定并分析指示可能产生假SNP的基因混合/嵌合体的非线性比对结构。用Bayesian推论来权衡关于以下的证据：真实多态性比测序错误、错误比对或不明确性、错误聚类或嵌合EST序列、评估数据比如原始色谱高度、尖锐性、重叠和间隔；测序误差率；背景敏感性；cDNA文库来源等。
在称为MARSHFIELD(Method-B)的方法中，通过检索公共数据库鉴定包含假想插入/缺失多态性的重叠人DNA序列。从共有序列中选择每个多态性位点两侧的PCR引物。用所述引物扩增个体的或合并的人基因组DNA。所得PCR产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中分离并用PhosphorImager从DNA合并库中评估等位基因频率。
f.连锁不平衡
与另一种多态性连锁不平衡的多态性，其中鉴定一种多态性预示着所连锁多态性的身份。“连锁不平衡”(在本文中用作“LD”，在本领域中也称作“LED”)表示等位基因(即，指定基因的变体形式)或多态性在两个基因座上的特定组合显示出比根据偶然性预期更高的频率的情形。正如本领域技术人员所确定的，在有关连锁不平衡中使用的“显著”，表示统计学上的p值或α值可以是0.25或0.1并且可以是0.1、0.05、0.001、0.00001或更小。可以通过评估与389多态性处于连锁不平衡中的多态性的核酸序列来确定在β1AR蛋白中389位多态性。可以对一或多种多态性以这种方式来实施本发明，以允许单倍型分析。根据对于本领域技术人员而言是平常和普通的意思来使用“单倍型”。它表示沿着同源染色体之一的两个或多个等位基因或多态性的集合基因型。
B.评估蛋白质
作为替代，可以通过检测β1AR蛋白质389位氨基酸变异的任何方法来确定多态性变异。本发明不限于任何具体方法来实现此目的。例如，可以从个体获得流体或组织的样本并且确定β1AR蛋白质389位氨基酸。这样的检测方法可以是各种方法，包括可以使用基于抗体的检测、(Western印迹、ELISA)或氨基酸分析(高压液相色谱法或质谱分析法)，来检测蛋白质是否具有Arg或Gly。
因此，在某些实施方案中，本发明涉及包含至少一种蛋白质分子的组合物，比如β1AR蛋白质或结合β1AR蛋白质的蛋白质比如抗体。正如在本文中所用的，“蛋白质分子”、“蛋白质组合物”、“蛋白质化合物”、“蛋白质链”或“蛋白质物质”通常表示但不限于大于约200个氨基酸的或翻译自基因的全长内源序列的蛋白质；大于约100个氨基酸的多肽；和/或从约3个到约100个氨基酸的肽。所有上述有关“蛋白质”的术语可以在本文中替换使用。
可以根据本领域技术人员已知的任何技术，包括通过标准生物学技术表达蛋白质、多肽或肽，从天然资源分离蛋白质化合物、或者化学合成蛋白质物质来制备蛋白质组合物。在此前已经公开了多种基因的核苷酸和蛋白质、多肽和肽序列，并且可以在对于本领域普通技术人员已知的计算机数据库中发现。一个这样的数据库是国家生物技术信息中心的Genbank和GenPept数据库(the National Center for Biotechnology Information′sGenbank and GenPept databases)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。可以使用本文中已经公开的技术或本领域一般技术人员已知的技术来扩增和/或表达这些已知基因的编码区。作为替代，本领域技术人员已知蛋白质、多肽和肽的多种商业制备物。
1.蛋白质纯化
可以期望从样本中纯化β1AR或纯化结合β1AR的蛋白质，比如抗体。这样的技术被广泛的使用并且本发明没有限制有关蛋白质纯化的意图。蛋白质纯化技术对本领域技术人员是众所周知的。在一定水平上，这些技术涉及将细胞物质粗分级成多肽和非多肽组分。如果已经从其它蛋白质中分离出所述多肽，可以使用色谱和电泳技术对感兴趣多肽进行进一步的纯化从而实现部分的或完全的纯化(或纯化至均一性)。特别适用于制备纯肽的分析方法是离子交换色谱法、排阻色谱法；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚焦法。一种纯化肽的特别有效的方法是快速蛋白质液相色谱或甚至是HPLC。
本发明的某些方面可以涉及编码蛋白质或肽的纯化，和在具体实施方案中的实质性纯化。在本文中使用的术语“纯化的蛋白质或肽”的意思表示可从其它组分分离的组合物，其中蛋白质或肽可以被纯化到相对于其天然可获得状态的任何程度。因此纯化的蛋白质或肽也表示游离于其天然环境的蛋白质或肽。
通常，“纯化的”将表示已经进行过分级从而去除了多种其它组分的蛋白质或肽组合物，并且该蛋白质或肽组合物基本上保留了它所表达的生物活性。在使用术语“基本纯化的”时，该表述将表示蛋白质或肽构成组合物主要组分的组合物，比如在组合物中蛋白质占约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多。
基于本公开内容，对本领域技术人员而言定量蛋白质或肽纯化程度的各种方法是已知的。这些包括，例如，确定活性组分的比活性，或通过SDS/PAGE分析评估组分内的多肽量。用于评估组分纯度的一种优选方法是计算组分的比活性，与初始提取物的比活性进行比较，并且由此计算纯度，在本文中用“纯化倍数”来评估。当然，用于表示活性量的实际单位将依赖于纯化后所选择的特定检测技术和所表达的蛋白质或肽是否表现出可检测活性。
多种适合用于蛋白质纯化的技术对本领域的技术人员是众所周知的。这些包括，例如，利用硫酸铵、PEG、抗体等或通过加热变性进行沉淀，接着离心；色谱步骤比如离子交换、凝胶过滤、反相、羟磷灰石和亲和色谱；等电聚焦；凝胶电泳；和这些技术和其它技术的联合。正如本领域中众所周知的，相信实施各种纯化步骤的顺序是可以改变的，或者某些步骤可以被省略，并且仍然导致制备基本纯化的蛋白质或肽的合适方法。
通常不必要求总是以它们的最纯化状态提供蛋白质或肽。实际上，可以考虑在某些实施方案中较少基本纯化的产物将具有效用。通过使用较少的联合纯化步骤，或者通过利用相同一般纯化方案的不同形式，可以实现部分纯化。例如，应该理解的是利用HPLC设备实施的阳离子交换柱色谱通常上将比利用低压色谱系统的同样技术导致更多“倍”的纯化。表现出较低相对纯化程度的方法可以在蛋白质产物总回收量、或在维持所表达蛋白质活性方面有优势。
已知多肽在SDS/PAGE不同条件下的迁移能够改变，有时还很显著(Capaldi et al.，1977)。因此应该理解的是在不同的电泳条件下，纯化的或部分纯化的表达产物的表观分子量可以改变。
高效液相色谱(HPLC)的特征在于具有极高峰分辨率的快速分离。这是通过利用非常细的颗粒和高压以维持足够的流速来实现的。分离可以在几分钟、或多至小时的时间内完成。此外，只需要非常小体积的样本，因为颗粒是非常小并紧密填充以致于外体积只占床体积非常小的部分。同样，不需要非常大的样本浓度，因为带是如此的窄以致于样本基本上没有稀释。
凝胶色谱，或分子筛色谱是特殊类型的分离色谱，其是基于分子的大小。凝胶色谱背后的理论是当较大分子或较小分子绕过或穿过小孔时，用含有小孔的惰性物质的微小颗粒制备的柱将根据分子大小将它们分离。只要制备颗粒的材料不吸附所述分子，确定流速的唯一因素是大小。因此，只要分子形状相对恒定，分子将按逐渐降低大小的顺序从柱中被洗脱。对于分离不同大小的分子，凝胶色谱是无法比拟的，因为分离不依赖于所有其它因素比如pH、离子强度、温度等。也几乎没有吸附、较小区带展宽，并且洗脱体积仅简单的与分子量相关。
亲和色谱是一种依赖于待分离物质和与其特异性结合的分子之间的特异亲和性的色谱方法。这是一种受体-配体类型的相互作用。通过使一种结合伴侣与不溶性基质共价偶联来合成柱材料。柱材料随后能从溶液中特异性吸附所述物质。通过将条件改变为不发生结合的条件来实现洗脱(例如，改变pH、离子强度、和温度)。
一种可用于纯化含有碳水化合物的化合物的特定类型亲和色谱是凝集素亲和色谱。凝集素是结合多种多糖和糖蛋白的一类物质。凝集素通常经过溴化氰与琼脂糖偶联。偶联至Sepharose的Conconavalin A是待用的首选这类材料，并且其已经被广泛地应用于分离多糖和糖蛋白，其它的凝集素包括扁豆(lentil)凝集素、已经用于纯化N-乙酰葡糖胺残基的麦胚凝集素和蜗牛(Helix pomatia)凝集素。凝集素自身用应用碳水化合物配体的亲和色谱进行纯化。已经用乳糖从蓖麻子和花生中纯化凝集素；已经用麦芽糖从扁豆(lentil)和刀豆中提取凝集素；用N-乙酰基-D-半乳糖胺从大豆纯化凝集素；N-乙酰基葡糖胺结合来自麦胚的凝集素；D-半乳糖胺已经用于从蛤中获取凝集素并且L-岩藻糖将与来自莲的凝集素结合。
基质应该是在任何明显程度上自身不吸附分子的物质并且其具有广泛的化学、物理和热稳定性。配体应该以不影响它结合特性的方式被偶联。配体也应该提供相对紧密的结合。并且它应该能够在不破坏样本或配体的情况下洗脱所述物质。一种最常见形式的亲和色谱是免疫亲和色谱。适用于本发明的抗体的产生在以下讨论。
2.抗体
本发明的另一个实施方案是抗体，在某些情况下是与人β1AR多肽序列发生免疫反应的人单克隆抗体。应该理解的是抗体能用于检测β1AR，尤其是特定多态性导致的β1AR。本发明的意图是，尤其用于本发明背景下的抗体是和具有Arg389的β1AR蛋白质相比，可区别地结合具有Gly389的β1AR蛋白质的抗体，从而在两种群体间进行区分。
如本文中所用的，术语“抗体”意在广泛的表示任何免疫结合剂，比如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，优选IgG和/或IgM，因为它们是生理情形下最常见的抗体并且因为它们是在试验装置中最容易制备的抗体。
术语“抗体”被用来表示任何具有抗原结合区的抗体样分子，并且包括抗体片段比如Fab′、Fab、F(ab′)2、单结构域抗体(DABs)、Fv、scFv(单链Fv)等。用于制备和使用各种基于抗体的构建物和片段的技术在本领域中是众所周知的。用于制备并表征抗体的手段在本领域中也是众所周知的(见，例如，Harlow et al.，1988；通过参考并入本文)。
a.抗体的产生
在某些实施方案中，本发明涉及抗体。例如，所有或部分的单克隆抗体可被用于确定389位的氨基酸。如上所述，除了产生抗全长蛋白质的抗体之外，也可以产生对包括表位核心区的更小构建物发生反应的抗体，其中表位核心区包括野生型和突变型表位。用于制备和使用各种基于抗体的构建物和片段的技术在本领域中是众所周知的。制备和表征抗体的手段在本领域中也是众所周知的(见例如，Harlow和Lane，1988；通过参考并入本文)。
单克隆抗体(mAbs)被认识到具有某些优势，例如，重复性和可大规模生产，通常优选应用它们。因此本发明提供人、鼠、猴、大鼠、仓鼠、兔和甚至小鸡来源的单克隆抗体。
产生单克隆抗体(mAbs)的方法通常沿着制备多克隆抗体的相同路线开始。简单地说，可以用根据本发明的免疫原多肽组合物免疫动物并通过收集来自被免疫动物的抗血清来制备多克隆抗体。可替代地，在本发明的一些实施方案中，从可能已经暴露于特定抗原的人中收集血清。暴露于特定的抗原可以发生在工作环境中，于是那些人职业性的暴露于特定的抗原并发展出针对肽、多肽、或蛋白质的多克隆抗体。在本发明的一些实施方案中，通过使用免疫检测方法，用来自职业性暴露的人的多克隆血清来鉴定多花白树毒蛋白毒素中的抗原区。
大范围的动物物种能够用于生产抗血清。典型的用来生产抗血清的动物是兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或山羊。因为兔的血液体积相对大，优先选择兔用于生产多克隆抗体。
正如本领域众所周知的，给定组合物的免疫原性可以改变。因此经常不可避免地强化宿主的免疫系统，比如可以通过将肽或多肽免疫原偶联到载体上来实现。典型的或优选的载体是匙孔帽贝血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。另外的白蛋白比如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也能够用作载体。使多肽与载体蛋白结合的手段在本领域中是众所周知的并且包括戊二醛、m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和双-二氮化对二氨基联苯(bis-biazotized benzidine)。
在本领域中也众所周知的是，能通过应用被认作是佐剂的非特异性免疫反应刺激剂来增强特定免疫原组合物的免疫原性。合适的分子佐剂包括所有可接受的免疫刺激化合物，比如细胞因子、毒素或合成的组合物。
可应用的佐剂包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ-干扰素、GMCSP、BCG、氢氧化铝、MDP化合物，比如thur-MDP和nor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂质A、和单磷酰脂质A(MPL)。RIBI也包括在本发明之内，其包含提取自细菌的三种组分(2％鲨烯/Tween 80乳液中的MPL、海藻糖二霉酚酸(TDM)和细胞壁骨架(CWS))。甚至可以使用MHC抗原。典型的，经常优选的佐剂包括弗氏完全佐剂(一种非特异性的免疫反应刺激剂，其包含灭活的结核分支杆菌)、弗氏非完全佐剂和氢氧化铝佐剂。
除了佐剂之外，可以期望共同施用生物反应修饰剂(BRM)，其已经表现出可上调T细胞的免疫性或下调抑制细胞的活性。这样的BRMs包括，但不限于，甲腈咪胺(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline，PA)；低剂量环磷酰胺(CYP；300mg/m2)(Johnson/Mead，NJ)、细胞因子比如γ-干扰素、IL-2、或IL-12或涉及免疫辅助功能的基因编码的蛋白质，比如B-7。
用于产生多克隆抗体的免疫原组合物的量依免疫原的特性以及所免疫动物而改变。各种途径可用于施用免疫原(皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内)。可以通过在免疫后的各个时间点采集免疫动物的血样来监测多克隆抗体的产生。
也可以进行第二次、强化注射。重复强化和滴定的过程，直至达到合适的效价为止。当获得理想水平的免疫原性时，可以对免疫动物实施放血并且分离并保存血清，和/或动物能被用来产生mAbs。
可以通过使用众所周知的技术，比如通过参考并入本文的美国专利4，196,265中举例说明的技术，很容易的制备mAbs。典型的，这种技术涉及用所选的免疫原组合物无论是野生型还是突变型的组合物，例如，纯化或部分纯化的多肽、肽或结构域，来免疫合适的动物。以有效刺激抗体产生细胞的方式施用免疫组合物。
如果希望的话，可以应用过滤、离心和各种色谱法比如HPLC或亲和色谱进一步纯化mAbs。可以通过包括酶，比如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的消化和/或通过化学还原切割二硫键的方法从单克隆抗体获得本发明的单克隆抗体的片段。作为替代，本发明包括的单克隆抗体片段能够应用自动式肽合成仪来合成。
本发明也意图应用分子克隆方法产生mAbs。为此，从分离自被免疫动物脾的RNA制备组合的免疫球蛋白噬菌粒(phagemid)文库，并且通过淘选表达抗原的细胞和对照细胞来选择表达适宜抗体的噬菌粒。这种方法优于常规杂交瘤细胞技术之处在于一次能够产生和筛选约104倍的抗体，并且通过H和L链组合产生新的特异性，所述特异性进一步增加了发现适宜抗体的机会。
b.免疫检测方法
正如某些实施方案中所讨论的，本发明涉及的免疫检测方法用于结合、纯化、去除、确定、和/或另外地检测生物组分比如多肽和肽的抗原区。本发明的免疫检测方法能够用来鉴定有治疗性应用的肽、多肽、或蛋白质的抗原性区，尤其是降低靶对象中肽、多肽、或蛋白质的免疫原性或抗原性。
免疫检测方法包括酶联免疫吸附检测(ELISA)，放射性免疫检测(RIA)、免疫放射分析、荧光免疫分析、化学发光分析、生物发光分析、和Western印迹、还有其他多种本领域普通技术人员已知的方法。各种可应用的免疫检测方法的步骤已经在科学文献中有描述，比如，例如，Doolittleet al.，1999；Gulbis et al.，1993；De Jager et al.，1993；和Nakamura et al.，1987，每一篇通过参考并入本文。
通常，免疫结合方法包括获取推测包含蛋白质、多肽和/或肽的样本，包括，根据情况，在有效允许形成免疫复合物的条件下，使样品具有根据本发明的第一抗体，单克隆或多克隆抗体。
这些方法包括用于从细胞器、细胞、组织或机体样本中纯化的蛋白质、多肽和/或肽的方法。在这些实例中，抗体从样本中去除抗原性蛋白质、多肽和/或肽组分。抗体将优选连接至比如柱基质形式的固体支持物，并且推测包含蛋白质、多肽和/或肽抗原性组分的样本将用于固定化抗体。从柱中洗掉不期望的组分，留下与固定化抗体形成免疫复合物的待洗脱的抗原。
免疫结合方法还包括用于检测和定量样本中抗原组分的量的方法，以及检测和定量结合过程中形成的任何免疫复合物。因此，人们将获得推测包含抗原或抗原性结构域的样本，用抗抗原或抗原性结构域的抗体接触样本，随后检测并定量在特定条件下形成的免疫复合物的量。
根据抗原检测，所分析的生物样本可以是任何推测包含抗原或抗原性结构域的样本，比如，例如，组织切片或标本、匀浆化的组织提取物、细胞、细胞器、分离和/或纯化形式的任何上述包含抗原的组合物、或者甚至任何与细胞或组织接触的生物流体，包括血液和/或血清。
在足以允许免疫复合物形成的有效条件和一段时间内用抗体接触所选生物样本，通常只是简单的将抗体组合物加到样本中并且孵育混合物一段时间，使抗体足以与存在的抗原，即结合，形成免疫复合物。此后，通常清洗样本-抗体组合物，比如组织切片、ELISA板、点印迹(dot blot)或western印迹，从而去除任何非特异性结合的抗体种类，只允许检测和初级免疫复合物内特异性结合的抗体。
通常，检测免疫复合物的形成在本领域中是众所周知的并且可以通过应用多种方法来实现。这些方法通常基于检测标签或标记物，比如任何放射性、荧光、生物的和酶的标签。涉及应用这样标记物的美国专利包括3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241，其中每一篇通过参考并入本文中。当然，正如在本领域中已知的，可以通过应用第二结合配体比如二抗和/或生物素/亲合素配体结合安排发现其他优势。
用于检测的抗体自身可以连接至可检测的标签，其中人们随后仅简单地检测此标签即可，由此允许确定组合物中初级免疫复合物的量。作为替代，结合至初级免疫复合物中的第一抗体可以通过有抗体结合亲和性的第二结合配体来检测。在这些情况中，第二结合配体可以与可检测标签连接。第二结合配体自身通常是抗体，因此被命名为“第二”抗体。在足以允许第二免疫复合物形成的有效条件和时间内，用标记的、第二结合配体、或抗体接触初级免疫复合物。通常随后清洗第二免疫复合物以去除任何非特异性结合的标记的二抗或配体，并随后检测第二免疫复合物中保留的标签。
其他方法包括通过两步法检测初级免疫复合物。如上所述，有抗体结合亲和性的第二结合配体，比如抗体，用于形成第二免疫复合物。清洗后，再次在足以允许免疫复合物(第三免疫复合物)形成的有效条件和时间内，使第二免疫复合物接触对有二抗结合亲和性的第三结合配体或抗体。第三配体或抗体连接至可检测的标签，允许检测由此形成的第三免疫复合物。如果期望的话，这样的系统可以提供信号放大。
Charles Cantor设计的免疫检测方法使用两种不同的抗体。第一步生物素化的、单克隆或多克隆抗体用于检测靶抗原，随后第二步抗体用于检测附着到复合生物素中的生物素。方法中，待检测的样本首先在含有第一步抗体的溶液中孵育。如果靶抗原存在，一些抗体与抗原结合从而形成生物素化的抗体/抗原复合物。随后通过在连续的链霉亲和素(或亲合素)、生物素化DNA、和/或互补的生物素化DNA溶液中孵育抗体/抗原复合物，每一步中向抗体/抗原复合物加入额外的生物素位点，从而放大了抗体/抗原复合物。重复放大步骤直至合适的放大水平，此水平下将样本在含有抗生物素的第二步抗体的溶液中进行孵育。该第二步抗体被标记，例如用酶标记，所述酶可用于通过组织酶学利用发色底物来检测抗原/抗体复合物。通过适当放大，能够产生宏观上可见的结合体。
另一已知免疫检测方法利用免疫-PCR(聚合酶链式反应)方法。到生物素化DNA的孵育步骤为止，PCR方法与Cantor方法都相似，然而，代替多轮链霉亲和素和生物素化DNA孵育，用释放抗体的低pH或高盐缓清洗DNA/生物素/链霉亲和素/抗体复合物。所得的清洗溶液随后用来实施具有合适引物的适宜控制的PCR反应。至少在理论上，能利用PCR巨大的放大能力和特异性来检测单抗原分子。
i.ELISA
如上详述，按照最简单和/或直接的意义，免疫分析是结合分析。某些优选的免疫分析是本领域公知的各种类型的酶联免疫吸附检测(ELISAs)和/或放射性免疫检测(RIA)。使用组织切片的免疫组织化学检测也是非常有用的。然而，容易理解的是所述检测并不限于这些技术，和/或western印迹、点印迹(dot blot)、FACS分析、和/或类似的方法也可以应用。
在一个ELISA实例中，抗体被固定到展示出蛋白质亲和性的所选表面上，比如聚苯乙烯微量滴定板上的孔。随后，将推测含有抗原的受试组合物，比如临床样本，加到孔中。在结合和/或清洗以去除非特异性结合的免疫复合物之后，可以检测结合的抗原。通常通过加入连接至可检测标签的另一抗体来实现检测。这种类型的ELISA是简单的“夹心ELISA”。也可以通过加入第二抗体，接着加入有第二抗体亲和性的连接有可检测标签的第三抗体来实现检测。ELISA可以基于抗体对具有Arg389的蛋白质相对具有Gly389的蛋白质的结合性差异。
在另一个ELISA实例中，推测含有抗原的样本被固定到孔表面上和/或随后与抗体接触。结合和/或清洗以去除非特异性结合免疫复合物之后，检测结合的抗-抗体。初始抗体连接至可检测的标签时，可以直接检测免疫复合物。此外，可以使用有第一抗体亲和性的连接有可检测标签的第二抗体检测免疫复合物。
另一种抗原被固定的ELISA涉及在检测中应用抗体竞争。在这样的ELISA中，将标记的抗抗原的抗体加到孔中，让其结合，和/或通过它们的标签进行检测。随后在与包被孔孵育期间，通过样本与标记的抗抗原抗体混合来确定在未知样品中抗原的量。在样本中抗原的存在引起可结合孔的抗抗原抗体的量的降低并且因此降低了最终的信号。这也适用于在未知样本中检测抗抗原抗体，其中未标记的抗体与包被有抗原的孔结合并且也降低了可用于结合标记的抗体的抗原的量。
不考虑所用的形式，ELISAs具有某些共同的特征，比如包被、孵育和结合、清洗以去除非特异性结合的种类、以及检测结合的免疫复合物。这些在下面进行描述。
用抗原或抗体包被板时，通常用抗原或抗体溶液与孔板一起孵育过夜或指定几个小时。随后将清洗孔板以去除未完全吸附的物质。对于检测抗血清，然后用抗原性中性的非特异性蛋白质“包被”任何余下可用的孔表面。这些包括小牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液。包被允许封闭固定化表面上的非特异性吸附位点因此降低由表面上抗血清非特异性结合引起的背景。
在ELISAs中，可能更习惯应用第二或第三检测手段，而不是直接方法。因此，在蛋白质或抗体与孔结合、用非反应性物质包被以降低背景、清洗以去除未结合的物质之后，在有效允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下使固定表面与待检测生物样本接触。随后免疫复合物的检测需要标记的第二结合配体或抗体，并且第二结合配体或抗体连接有标记的第三抗体或第三结合配体。
“在有效允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下”表示优选包括用溶液比如BSA、小牛γ球蛋白(BGG)或磷酸缓冲盐(PBS)/Tween溶液稀释抗原和/或抗体。加入这些试剂的目的也在于帮助减少非特异性背景。
“合适的”条件也表示在允许有效结合的温度或足够的时间下孵育。孵育步骤通常约1至2至4小时左右，温度优选按照25℃至27℃的顺序，或者可以在4℃左右过夜。
ELISA所有的孵育步骤之后，清洗接触的表面从而去除非复合的物质。清洗步骤的实例包括用溶液比如PBS/Tween、或硼酸盐缓冲液清洗。在检测样本和初始结合物质之间形成特异性复合物、并进行随后的清洗之后，即使产生了微小量的免疫复合物也可以确定。
为了提供检测的手段，第二或第三抗体将具有允许检测的相关标签。这可以与合适的发色底物一起孵育就能产生颜色的酶。因此，例如，人们将期望在有利于进一步形成免疫复合物的条件下用脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或过氧化氢酶偶联的抗体接触并孵育第一和第二免疫复合物一段时间(例如，在室温下在含PBS溶液比如PBS-Tween中孵育2小时)。
在用标记的抗体进行孵育、和随后进行清洗以去除未结合的物质之后，定量标签的量，例如，在过氧化物酶作为酶标签的情况通过与发色底物比如尿素、或溴甲酚紫、或2，2′-连氮基-双-(3-乙基-苯基噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、或H2O2一起孵育来实现。随后定量通过测量颜色发生的程度，例如，使用可见光分光光度计来实现。
ii.免疫组织化学
本发明的抗体也可以与通过免疫组织化学法(IHC)制备的用于研究的新鲜冷冻的和/或甲醛溶液固定的、石蜡包埋的组织块联合应用。例如，免疫组织化学可以用于辨别Fortilin或评估Fortilin在细胞中的量。从这些特定样本中制备组织块的方法已经成功应用于先前的各种预测因素的IHC研究中，和/或对本领域技术人员是众所周知的(Brown et al.，1990；Abbondanzo et al.，1990；Allred et al.，1990)。
简单地说，可通过在室温下在小塑料胶囊中的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中使50mg冷冻“粉末化的”组织再水化；通过离心使颗粒成为球形；将它们重悬浮在粘性包埋介质(OCT)中；颠倒塑料胶囊和/或再次通过离心使其沉淀；在-70℃异戊烷中进行速冻；切割塑料胶囊和/或移去组织冷冻的柱体；在恒冷显微薄样切片机架上固定组织柱体；和/或25-50个连续切片，来制备冷冻切片。
可以通过涉及在塑料微离心管中使50mg样本再水化；沉淀；在10％甲醛溶液中重悬浮4小时进行固定；清洗/沉淀；重悬浮在温的2.5％琼脂中；沉淀；在冰水中使其冷却以使琼脂变硬；从管中移去组织/琼脂块；过滤和/或在石蜡中包埋块；和/或连续切割高达50个永久切片的相似方法来制备永久切片。
III.治疗
一旦确定个体的β1-AR的基因型或蛋白质序列，可以使治疗的疗程个性化。在所述方法的优选实施方案中，感兴趣的特征是患者对某些治疗处理所展示出的临床反应，例如对药物比如但不限于β-阻断剂，比如布新洛尔、靶向β1AR的药物或对医疗病症的治疗处理的反应。正如本文中使用的，“医学病况”包括但不限于任何被证明具有一种或多种期望治疗的身体和/或心理症状的病况或疾病，并且包括以前和新近鉴定的疾病和其它具有相似病理生理状态的疾病，比如但不限于，心力衰竭、嗜铬细胞瘤、偏头痛、心率不齐、高血压、扩张性心肌病、缺血性心脏病(心肌病、缺血性心脏病(心肌病、心绞痛、心急梗塞)、和各种焦虑症。正如在本文中使用的，术语“临床反应”表示以下的任何或所有的定量测量：对治疗功效和效能和不良事件(即，副作用)的定量测量。
因此能够对具有医学病况的纯合的β1Arg389个体实施包括β-阻断剂比如但不限于布新洛尔的治疗。β-阻断剂可以单独施用或与至少一种另外的试剂，比如稳定化合物联合施用。β-阻断剂也可以与先前已经由需要所述装置的疾病状态显示出处置不当的医疗设备装置联合施用。例如，通常具有心搏徐缓的心力衰竭患者将不能接受β-阻断剂。但是如果个体的基因型是Arg389(有利的基因型)，可以植入起搏器，并开布新洛尔处方。
A.施用途径
可以通过许多的途径施用β-阻断剂，所述的途径包括，但不限于口服、静脉内、肌肉内动脉内、髓内、.鞘内、心室内、真皮内、气管内、膀胱内、眼内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部的、舍下、或直肠施用。关于制剂和施用的技术进一步详细的说明可以在最新版的Remington′sPharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co.，Easton，Pa.)中找到。在某些实施方案中，配制布新洛尔用于口服施用。
B.剂型
考虑临床应用时，将以适于目的应用的形式制备药物组合物。通常，这将必需使制备的组合物实质上没有致热源、以及其它可能对人或动物有害的杂质。
人们通常期望应用适宜的盐和缓冲剂来提供稳定的递送载体并允许被靶细胞所摄取。当重组细胞引入患者时，也将使用缓冲剂。本发明的水性组合物包括有效量的载体或水性介质。短语“药物的或药理学上可接受的”表示当施用给动物或人时不产生副作用、过敏反应、或其他不利反应的分子实体和组合物。正如在本文中使用的，“药用可接受的载体”包括溶剂、缓冲剂、溶液、分散介质、包衣剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等可接受的用于配制药物，比如适合给人施用的药物。对于药物活性物质而言这些介质和试剂的应用在本领域中是众所周知的。除了在此范围内任何不适合本发明活性成分的常规介质或试剂之外，它们在治疗组合物中的应用在本发明的意图内。补充的活性成分也能被整合到组合物中，只要它们不使组合物的载体或细胞失活。
本发明的活性组合物可以包括典型的药物制备物。这些根据本发明的组合物的施用可以经由任何通常的途径，只要靶组织通过那种途径可用到所述组合物。这包括经口、鼻、或颊的施用。作为替代，施用可以通过皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射、或直接注射到心脏组织。如上所述，这样的组合物通常作为药物可接受的组合物正常施用。
活性化合物也可以经腹膜或腹膜内施用。作为举例说明，作为游离碱或药理学上可接受盐的活性化合物的溶液可以在适当的混有表面活性剂，比如羟丙基纤维素的水中进行制备。分散系也能够在甘油、液体聚乙二醇、和其混合物中以及在油中制备。在平常的保存和应用条件下，这些制备物通常包含防腐剂以防止微生物的生长。
适合用于注射使用的药物形式包括，例如，灭菌水性溶液或分散系和用于即时制备灭菌注射液或分散系的灭菌粉末。通常，这些制备物是灭菌的并且在某种程度上是以易于注射的流体形式存在。制备物在制造和保存的条件下应该是稳定的并应该以抵抗微生物，比如细菌和真菌污染作用的方式被保存。适宜的溶剂或分散介质可以包含，例如，水、乙醇、多羟基化合物(例如，甘油、聚乙二醇、和液体聚乙二醇等)、它们合适的混合物、和植物油。能够，例如，通过使用包衣，比如卵磷脂、在分散系情况中通过维持必需的颗粒大小和通过应用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸脂类、氯丁醇、酚、山梨酸、硫汞撒等来防止微生物的作用。在许多的情况中，将优选包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。能够通过在组合物中应用延迟吸收剂，例如，单硬脂酸铝和明胶延长可注射组合物的吸收。
为了口服施用，本发明的多肽通常可以掺有赋形剂并以非可吸收的漱口剂和洁齿剂形式应用。可以通过以必需的量将活性成分掺入适宜的溶剂，比如硼酸钠溶液(Dobell′s Solution)中来制备漱口剂。可选择的，可以将活性成分掺入包含硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的防腐洗液中。活性成分也可以分散于洁齿剂，包括：凝胶、糊、粉末和浆。活性成分可以以治疗有效量加到paste洁齿剂中，所述洁齿剂可以包括水、粘合剂、研磨剂、调味剂、泡沫剂、和湿润剂。
通常可以以中性或盐形式配制本发明的组合物。药物可接受盐包括，例如，衍生自无机酸(例如，盐酸或磷酸)或有机酸(例如，乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)。也能够从无机碱(例如，氢氧化钠、钾、铵、钙、或铁)或有机碱(例如，异丙胺，三甲胺，组氨酸，普鲁卡因等)衍生与蛋白质的游离羧基形成的盐。
依赖于制剂，优选以能与剂型相容的形式并以治疗有效量施用溶液。制剂可以很容易的以各种剂型比如注射溶液、药物释放胶囊等施用。为了胃肠道外施用水性溶液，例如，溶液通常合适地被缓冲处理并且液体稀释剂首先提供等渗条件例如应用足够的盐或葡萄糖。可以将这样的水性溶液用于，例如，静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。优选的是，应用本领域技术人员已知的，尤其是根据本发明公开的灭菌的水性介质。作为举例说明，单剂量可以溶解于1ml的等渗NaCl溶液中并且或者加到1000ml的皮下输液流体中或者在所推荐的输注位置进行注射(见例如，“Remington′s Pharmaceutical Sciences”第15版，1035-1038和1570-1580页)。将依赖于治疗对象的条件必要地在剂量上发生某些变化。无论如何，负责施用的人将确定个体对象的适宜剂量。此外，为了人的施用，制备物应该满足FDA生物制品标准局(Office of Biologics standards)所要求的灭菌、热原、一般安全和纯度的标准。
1.控制/扩展/持续/延长释放的施用
本发明的另一方面提供通过向具有纯合β1Arg389基因型的患者递送作为控制释放制剂的β-阻断剂治疗心力衰竭的方法。正如本文中使用的，术语“控制地”、“扩展地”、“持续地”或“延长地”释放本发明的组合物将共同的在本文中被表示为“控制地释放”，并且包括持续或不连续的、和线性的或非线性的释放本发明的组合物。控制地释放β-阻断剂制剂具有许多优势。
a.片剂
控制地释放适合本发明目的的片剂被公开于美国专利5，126,145，其经参考并入本文。这样的片剂包括在混合物(admixture)中的大约5-30％的高粘性羟丙基甲基纤维素、大约2-15％的水可溶性药用粘合剂、大约2-20％的疏水性组分比如蜡质物质，例如，脂肪酸、和大约30-90％的活性成分。
b.膜
本发明还提供在侵入性心脏手术之后预防或治疗具有纯合β1Arg389基因型患者的方法，包括施用生物可降解的、生物相容性的聚合膜，其中包含β-阻断剂比如布新洛尔给患者。与它们自己的长度和宽度相比，聚合膜是非常薄的。所述的膜通常具有相同的所选厚度，大约60微米到大约5mm。厚度为大约600微米到1mm和大约1mm到大约5mm的膜，以及厚度为大约60微米到大约1000微米、和大约60到大约300微米的膜都可用在制备用于插入患者体内的治疗移植物中。所述膜能够以粘附外科所用方法的相似方式施用给患者。例如，β-阻断剂，比如布新洛尔，的膜制剂可以在外科处置期间喷洒在或滴在心脏组织位置或动脉上，或所形成的膜能够被置于所选的组织位置上。在替代性实施方案中，所述膜可以被用作控制释放的包衣覆在医疗装置上，比如支架，其将在下面进一步详细讨论。
可以用生物可降解或非生物可降解的聚合物构造植入物，其中β-阻断剂被均匀的分布于整个聚合物基质。许多用于制备本发明生物可降解膜的合适的生物可降解聚合物在本领域中是已知的，包括聚酸酐和脂肪族聚酯，优选聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)和它们的混合物和共聚物，更优选50∶50的PLA∶PGA共聚物并且最优选75∶25的PLA∶PGA共聚物。也可以使用PLA的单对映异构体，优选L-PLA，其可以单独使用或联合PGA使用。也可以应用聚碳酸酯、聚延胡索酸酯和己内酯制备本发明的植入物。
掺入本发明聚合物膜的β-阻断剂，比如布新洛尔，的量是显示出可测量的治疗疾病作用的有效量，所述疾病具有相似的病理生理状态，比如但不限于，心力衰竭、嗜铬细胞瘤、偏头痛、心率不齐、高血压、缺血(aschemia)、心肌病、和各种焦虑症。可以通过各种技术比如通过溶液法、悬浮法、或熔融压制法将本发明的组合物整合在膜中。
c.透皮贴装置
透皮递送涉及透过皮肤递送治疗剂以使其通过血液循环在体内分布。透皮递送相当于用皮肤代替了静脉内的针头作为进入口来持续地、控制地递送药物。治疗剂穿过皮肤的外层，在皮肤中扩散进入毛细血管或微小的血管并且随后被运输到主要的循环系统。
提供通过皮肤控制地、持续地施用治疗剂的透皮贴剂装置在本领域中是众所周知的。这样的装置，例如，被公开于美国专利4,627,429；4,784,857；5,662,925；5,788,983；和6,113,940，它们通过参考被并入本文中。特有的是，这些装置包括限定装置外表面的药物不能渗透的背衬层和可渗透的皮肤贴附膜，比如粘性层、密封的内衬层，以这样的方式在它们之间产生贮库用来放置治疗剂。在本发明的一个实施方案中，β-阻断剂的制剂被引入透皮贴剂的贮库并由β1AR基因纯合的Arg389患者使用。
d.医疗装置
另一个实施方案的意图在于将β-阻断剂，比如布新洛尔掺入医疗装置，随后该装置被置于体内期望的靶位置，于是β-阻断剂在此流出医疗装置。正如在本文中使用的，“医疗装置”表示为了预防或治疗医学病症暂时地或永久地引入哺乳动物的装置。这些装置包括以皮下、透皮或外科手术的方式被引入从而置于器官、组织或腔内的任何装置。医疗装置包括，但不限于，支架、人造移植物、人造心脏瓣膜、人造心脏和连接修复器官和脉管循环的装置(fixture)、静脉瓣膜、腹主动脉瘤(AAA)移植物、下腔静脉滤器(inferior venal caval filters)、导管包括永久药物输注导管、弹簧圈栓塞(embolic coils)、用于血管栓塞的栓塞材料(例如，PVA发泡材料)、网状物修复材料、Dracon血管颗粒整形金属板、杆和螺钉和血管缝合材料。
在一个实施方案中，医疗装置比如支架或移植物用基质进行包被。可以从各种材料制备用于包被根据本发明的支架或移植物的基质。对于基质的基本要求是它具有足够的弹性和柔性，从而维持支架或合成移植物所暴露的表面不破裂。
C.剂量
给患者施用的或开处方的布新洛尔的量能够是大约、至少大约、或至多大约0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500mg，或者可从其中引出的任何范围。可替代地，施用或处方量可以是关于患者体重的大约、至少大约、或至多大约0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7.3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0mg/kg，或者可从其中引出的任何范围。
当以不连续的量提供时，每次摄取的布新洛尔可以被认为是一个“剂量”。医学工作者可以开处方或施用对于特定或不确定时间进程的多剂量布新洛尔。
可以施用布新洛尔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、或更多次或者可从其中引出的任何次。本发明的目的还打算可以在不确定的时间周期内给患者服用所述药物或者只要患者表现出处方或施用布新洛尔所针对的医学病症的症状就给患者服用药物。同样，可以每2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时、或1、2、3、4、5、6、7天、或1、2、3、4、5周、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月或更长时间、或者可从其中引出的任何范围，来施用药物。作为替代，药物可以在任何的这些时间周期中以全身性方式施用并且时间可以延长超过一年。
D.另外的治疗选择
在本发明的某些实施方案中，所述方法可以涉及施用的β-阻断剂不是布新洛尔或者它是肌力剂(ionotrope)、利尿剂、ACE-I、AII拮抗剂、BNP、Ca++-阻断剂、或HDAC抑制剂。在评估β1-AR和/或α2c-AR之后，这些药剂可以代替布新洛尔或除了布新洛尔之外开处方或施用给患者。
作为第二治疗方案，所述药剂可以与布新洛尔同时、或者在布新洛尔之前或之后施用或服用。所述治疗可以改善病理性心脏肥大或心力衰竭的一种或多种症状比如提供增加的运动能力、增加的心脏射血体积、降低的左心室舒张终末压、降低的肺毛细血管楔压、增加的心输出量或心指数、降低的肺动脉压、降低的左心室终末收缩和舒张程度、降低的左和右心室壁应力、降低的壁张力和壁厚度、增加的生活质量、和降低的疾病相关发病率和死亡率。
在另一个实施方案中，期望布新洛尔与其它治疗模式联合应用。因此，除了上述的疗法之外，也可以给患者提供更多“标准的”药物心脏疗法。另外的疗法实例包括，但不限于，另外的β-阻断剂、抗-高血压剂、强心剂、抗-血栓剂、血管扩张剂、激素拮抗剂、变力剂(iontropes)、利尿剂、内皮素拮抗剂、钙通道阻断剂、磷酸二酯酶抑制剂、ACE抑制剂、血管紧张素2型拮抗剂和细胞因子阻断剂/抑制剂、和HDAC抑制剂。
可以通过使心脏细胞与单一组合物或包含两种药剂的药物制剂接触、或通过使细胞同时与两种不同的组合物或制剂接触实现所述的组合，其中两种组合物中的一种包含表达构建物和另一种包含所述药剂。作为替代，应用布新洛尔的疗法可以在施用其它药剂之前或随后间隔几分钟到几周的时间内施用。在不同的药剂和表达构建物分别地应用于细胞的实施方案中，通常要确保重要的时间周期没有超过每次递送之间的时间，比如药剂和表达构建物仍然将能够发挥对细胞有益的组合作用。在这样的实例中，本发明的意图在于通常使细胞与两种药征(modalities)在它们彼此的大约12-24小时内接触，更优选的是在彼此的大约6-12小时内，并且具有仅大约12小时的延时是最优选的。在某些情况中，可以期望显著地延长治疗时间周期，比如在各自施用间的间隔为几天(2、3、4、5、6或7)到几周(1、2、3、4、5、6、7或8)的时间。
还可以想得到的是，或者布新洛尔、或者另外药剂超过一次的施用将是期望的。在这点上，可以使用各种组合。作为举例说明，在布新洛尔是“A”和另外的药剂是“B”的情况，基于总共3和4次的施用，以下的排列组合作为实例列举：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/BA/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/AA/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B其他组合也同样包括在本发明内。
1.药物治疗剂
药物治疗剂和施用方法、剂量等对本领域的技术人员是众所周知的(见例如，“Physicians Desk Reference”，Klaassen’s“The Pharmacological Basisof Therapeutics”，“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，和“The MerckIndex，Eleventh Edition”，它们中的相关部分通过参考并入本文中)，并且可以根据本文中公开的内容与本发明进行组合。将依赖于所治疗对象的条件对剂量作出一些必要的变化。无论如何，负责施用的人将确定针对个体对象的适宜剂量，并且这种个体化的确定在本领域普通技术人员所掌握的范围内。
可用于本发明的药物治疗剂的非限制性实例包括抗高脂蛋白剂、抗动脉硬化剂、抗凝血/溶栓剂、凝血剂、抗心率失常剂、抗高血压剂、血管收缩剂、充血性心力衰竭治疗剂、抗心绞痛剂、抗菌剂或它们的组合。
此外，应该注意的是可以用以下任何所述的内容发展出新一套的心脏病治疗靶基因，其与在本实施例(见下)中使用的β-阻断剂一样。尽管预计到一些这样的基因可能有部分重叠，但是可能发展出新的靶基因。
a.抗高脂蛋白血剂
在某些实施方案中，施用降低较高血脂和/或脂蛋白浓度的药剂，在本文中被称为“抗高脂蛋白血剂”，可以与根据本发明的心血管疗法组合，尤其是在治疗动脉粥样硬化和脉管组织增厚或阻塞中。在某些方面，抗高脂蛋白血剂可以包括芳氧基烷酸/苯氧酸衍生物、树脂/胆汁酸螯合剂、HMGCoA还原酶抑制剂、烟酸衍生物、甲状腺激素或甲状腺激素类似物、其他类药剂(miscellaneous agent)或其组合。
i.芳氧基烷酸/苯氧酸衍生物
芳氧基烷酸/苯氧酸衍生物的非限制性实例包括苄氯贝特、enzafibrate、比尼贝特、环丙贝特、克利贝特、氯贝特(安妥明-S)、氯贝酸、依托贝特、非诺贝特、吉非贝齐(lobid)、尼可贝特、吡贝特、氯烟贝特、双贝特和羟乙茶碱氯贝特。
ii.树脂/胆汁酸螯合剂
树脂/胆汁酸螯合剂的非限制性实例包括考来烯胺(cholybar、questran)、考来替泊(降胆葡胺)和多聚糖胺。
iii.HMG CoA还原酶抑制剂
HMG CoA还原酶抑制剂的非限制性实例包括洛伐他汀(mevacor)，普伐他汀(pravochol)或辛伐他汀(zocor)。
iv.烟酸衍生物
烟酸衍生物的非限制性实例烟酸酯、阿西莫司、戊四烟酯、尼可氯酯、尼可莫尔和氧烟酸。
v.甲状腺激素和类似物
甲状腺激素和其类似物的非限制性实例包括etoroxate、甲状丙酸和甲状腺素。
vi.其他抗高脂蛋白血剂
其他抗高脂蛋白血剂的非限制性实例包括阿昔呋喃、阿扎胆醇、苯氟雷司、β-苯亚甲基丁酰胺、卡尼汀、硫酸软骨素、氧甾醚、detaxtran、葡聚糖硫酸钠、5，8，11，14，17-二十碳五烯酸、香菇嘌呤、夫拉扎勃、美格鲁托、甲亚油酰胺、双甲雌三烯二醇、鸟氨酸、γ-谷维素、泛硫乙胺、季戊四醇四乙酸酯、α-苯丁酰胺、吡扎地尔、普罗布考(lorelco)、β-谷甾醇、磺托酸-哌嗪盐、硫地醇、曲帕拉醇和联苯丁酸。
b.抗动脉硬化剂
抗动脉硬化剂的非限制性实例包括吡醇氨酯(pyridinol carbamate)。
c.抗凝血/纤维蛋白溶解剂
在某些实施方案中，施用有助于去除或预防血栓的药剂可以与施用调节剂组合，尤其是在治疗动脉硬化和脉管系统(例如，动脉)阻塞中。抗凝血和/或纤维蛋白溶解剂的非限制性实例包括抗凝血剂、抗凝血剂拮抗剂、抗血小板剂、溶解血栓剂拮抗剂或它们的组合。
在某些方面，能口服施用的抗血栓剂，比如，例如，阿司匹林和华法林(可脉丁)是优选的。
i.抗凝血剂
抗凝血剂的非限制性实例包括醋硝香豆素、安克洛酶、菌茚二酮、溴茚二酮、氯茚二酮、库美香豆素、环香豆素、葡聚糖硫酸钠、双香豆素、二苯茚酮、二羟香豆素乙酸乙酯、亚乙基双香豆素、氟茚二酮、肝素、水蛭素、阿朴酸钠、奥沙二酮、多硫酸聚戊糖、苯茚满二酮、苯丙香豆素、卵黄高磷蛋白、吡考他胺、噻氯香豆素和华法林。
ii.抗血小板剂
抗血小板剂的非限制性实例包括阿司匹林、葡聚糖、双嘧达莫(潘生丁)、肝素、苯磺唑酮(磺吡酮)和噻氯匹定(抵克利得)。
iii.溶解血栓剂
溶解血栓剂的非限制性实例包括组织纤溶酶原激活物(activase)、纤溶酶、尿激酶原、尿激酶(abbokinase)、链激酶(streptase)、阿尼普酶/APSAC(依米内斯)。
d.血液凝结剂
在某些实施方案中，其中患者具有出血或增加出血的可能性，可以应用可增强血液凝结的制剂。血液凝结促进剂的非限制性实例包括溶解血栓剂拮抗剂和抗凝剂拮抗剂。
i.抗凝血剂拮抗剂
抗凝血剂拮抗剂的非限制性实例包括鱼精蛋白和维生素K1。
ii.溶解血栓剂拮抗剂和抗凝剂
溶解血栓剂拮抗剂的非限制性实例包括氨基己酸(amicar)和氨甲环酸(amstat)。抗凝剂的非限制性实例包括阿那格雷、阿戈托班、西洛他唑(cilstazol)、达曲班、去纤苷、依诺肝素、弗希肝素、吲哚布芬、lamoparan，奥泽格瑞、吡考他胺、泼来妥明、替地肝素、噻氯匹定和三氟散。
e.抗心律失常剂
抗心律失常剂的非限制性实例包括I类抗心律失常剂(钠通道阻断剂)、II类抗心律失常剂(β-肾上腺素能阻断剂)、II类抗心律失常剂(再极化延长药物)、IV类抗心律失常剂(钙通道阻断剂)和其他类抗心律失常剂。
i.钠通道阻断剂
钠通道阻断剂的非限制性实例包括IA类、IB类和IC类抗心律失常剂。IA类抗心律失常剂的非限制性实例包括丙吡胺(双异丙吡胺)、普鲁卡因胺(pronestyl)和奎尼丁(quinidex)。IB类抗心律失常剂的非限制性实例包括利多卡因(xylocaine)、妥卡尼(tonocard)和美西律(mexitil)。IC类抗心律失常剂的非限制性实例包括英卡胺(enkaid)和氟卡尼(tambocor)。
ii.β-阻断剂
β-阻断剂，也被称为β-肾上腺素能阻断剂、β-肾上腺素能拮抗剂或II类抗心律失常剂，的非限制性实例包括醋丁洛尔(sectral)、阿普洛尔、氨磺洛尔、阿罗洛尔、阿替洛尔、苯呋洛尔、倍他洛尔、贝凡洛尔、比索洛尔、波吲洛尔、布库洛尔、布非洛尔、丁呋洛尔、布尼洛尔、布拉洛尔、丁氢萘心定、丁非洛尔、卡拉洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、西利洛尔、西他洛尔、二氯苯心安、地来洛尔、益派洛尔、艾司洛尔(brevibloc)、茚旦醇、拉贝洛尔、左布诺洛尔、甲吲哚心安、美替洛尔、美托洛尔、莫普洛尔、纳多洛尔、萘肟洛尔、硝苯洛尔、尼普地洛、氧烯洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普拉洛尔、丙萘洛尔、普萘洛尔(inderal)、索他洛尔(betapace)、硫氧洛尔、他林洛尔、特他洛尔、噻吗洛尔、托利洛尔和xibinolol。在某些方面，β-阻断剂包括芳氧基丙醇胺衍生物。芳氧基丙醇胺衍生物的非限制性实例包括醋丁洛尔、阿普洛尔、阿罗洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、贝凡洛尔、比索洛尔、波吲洛尔、布尼洛尔、丁非洛尔、卡拉洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、西利洛尔、西他洛尔、益派洛尔、茚旦醇、甲吲哚心安、美替洛尔、美托洛尔、莫普洛尔、纳多洛尔、尼普地洛、氧烯洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、他林洛尔、特他洛尔、噻吗洛尔和托利洛尔。
iii.再极化延长剂
延长再极化的药剂，也被称为III类抗心律失常剂，的非限制性实例包括胺碘酮(cordarone)和索他洛尔(betapace)。
iv.钙通道阻断剂/拮抗剂
钙通道阻断剂，另外也被称为IV类抗心律失常剂，的非限制性实例包括芳烷基胺(例如，苄普地尔、地尔硫卓、芬地林、加洛帕米、普尼拉明、特罗地林、维拉帕米)、二氢吡啶衍生物(非洛地平、伊拉地平、尼卡地平、硝苯地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平)、哌嗪衍生物(例如，桂利嗪、氟桂利嗪、利多氟嗪)或混合钙通道阻断剂比如苄环烷、依他苯酮、镁、米非地尔或派克昔林。在某些实施方案中，钙通道阻断剂包括长效二氢吡啶(硝苯地平型)钙拮抗剂。
v.其他类抗心律失常剂
其他类抗心律失常剂的非限制性实例包括阿糖腺苷(adenocard)、地高平(lanoxin)、乙酰卡尼、西萝芙木碱、克冠吗啉、茚丙胺、溴苯乙胺、丁萘酰胺、克冠异丁胺、卡波酸、西苯唑啉、丙吡胺、二氢奎尼丁、英地卡胺、异丙托溴胺、利多卡因、芬拉明、氯卡尼、美澳冰定、莫雷西嗪、吡美诺、普拉马林、普罗帕酮、必利诺宁、奎尼丁聚半乳糖醛酸盐、硫酸奎尼丁和奎尼辛。
f.抗高血压剂
抗高血压剂的非限制性实例包括抗交感神经剂、α/β阻断剂、α阻断剂、抗II型血管紧张素剂、β阻断剂、钙通道阻断剂、血管扩张剂混和抗高血压剂。
i.α-阻断剂
α-阻断剂，也被称为α-肾上腺素能阻断剂或α-肾上腺素能拮抗剂，的非限制性实例包括阿膜索罗、阿罗洛尔、达哌拉唑、多沙唑嗪、氢麦角碱、芬司必利、吲哚拉明、拉贝洛尔、麦角溴烟酯、哌唑嗪、特拉唑嗪、妥拉苏林、曲马唑嗪和育亨宾。在某些实施方案中，α-阻断剂可以包括喹唑啉衍生物。喹唑啉衍生物的非限制性实例包括阿夫唑嗪、布那唑嗪、多沙唑嗪、哌唑嗪、特拉唑嗪和曲马唑嗪。
ii.α/β阻断剂
在某些实施方案中，抗高血压剂既是α-又是β-肾上腺素能拮抗剂。α/β阻断剂的非限制性实例包括拉贝洛尔(normodyne，trandate)。
iii.抗II型血管紧张素剂
抗II型血管紧张素剂的非限制性实例包括血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素II受体拮抗剂。血管紧张素转换酶抑制剂(ACE抑制剂)的非限制性实例包括阿拉普利、依那普利(vasotec)、卡托普利、西拉普利、地拉普利、依那普利拉、福辛普利、赖诺普利、莫替普利、培哚普利、喹那普利和雷米普利。血管紧张素II受体阻断剂，也被称为血管紧张素II受体拮抗剂、ANG受体阻断剂或ANG-I型-1受体阻断剂(ARBS)，的非限制性实例包括血管康德沙坦、依普沙坦、依贝沙坦、氯沙坦和缬沙坦。
iv.抗交感神经剂
抗交感神经剂的非限制性实例包括中枢作用抗交感神经剂或外周作用抗交感神经剂。中枢作用抗交感神经剂，也被称为中枢神经系统(CNS)抗交感神经剂，的非限制性实例包括可乐定(catapres)、胍那苄(wytensin)、胍法辛(tenex)和甲基多巴(aldomet)。外周作用抗交感神经剂的非限制性实例包括神经节阻断剂、肾上腺素能神经元阻断剂、β-肾上腺素能阻断剂或α1-肾上腺素能阻断剂。神经节阻断剂的非限制性实例包括美加明(inversine)和咪噻吩(arfonad)。肾上腺素能神经元阻断剂的非限制性实例包括胍乙啶(ismelin)和利血平(serpasil)。β-肾上腺素能阻断剂的非限制性实例包括心施德(sectral)、阿替洛尔(tenormin)、倍他洛尔(kerlone)、卡替洛尔(cartrol)、拉贝洛尔(normodyne、trandate)、美托洛尔(lopressor)、纳多洛尔(corgard)、喷布洛尔(levatol)、吲哚洛尔(visken)、普萘洛尔(inderal)和噻吗洛尔(blocadren)。α1-肾上腺素能阻断剂的非限制性实例包括哌唑嗪(minipress)、多沙唑嗪(cardura)和特拉唑嗪(hytrin)。
v.血管扩张剂
在某些实施方案中，心血管治疗剂可以包括血管扩张剂(例如，脑血管扩张剂、冠状血管扩张剂或外周血管扩张剂)。在某些优选实施方案中，血管扩张剂包括冠状血管扩张剂。冠状血管扩张剂的非限制性实例包括阿蒙追芬、地巴唑、苯呋地尔琥珀酸酯、苯碘达隆、氯吩嗪、乙氧香豆素、氯达罗、氯硝甘油、地拉齐普、双嘧达莫、氢普尼拉明、乙氧黄酮、丁四硝酯、依他苯酮、芬地林、夫洛地尔、更利芬、herestrol双(β-二乙基氨基乙基醚)、海索苯定、硝乙醇胺对甲苯磺酸盐、凯林索、立得安(lidoflanine)、甘露六硝酯、美地巴嗪、nicorglycerin、季戊四醇四硝酸酯、三硝季戊醇、派克昔林、吡胺乙茶碱、曲匹地尔、甲克罗酮、曲美他嗪、磷酸三乙硝胺和维司那定。
在某些方面，血管扩张剂可以包括慢性治疗血管扩张剂或高血压急症血管扩张剂。慢性治疗血管扩张剂的非限制性实例包括肼苯哒嗪(apresoline)和米诺地尔(loniten)。高血压急症血管扩张剂的非限制性实例包括硝普钠(nipride)、二氮嗪(hyperstat IV)、肼苯哒嗪(apresoline)、米诺地尔(loniten)和维拉帕米。
vi.其他类抗高血压剂
其他类抗高血压剂的非限制性实例包括西萝芙木碱、γ-氨丁酸、丁苯碘胺、西氯他宁、环西多明、鞣酸绿藜安、芬洛多潘、氟司喹南、酮舍林、美布氨酯、美加明、甲基多巴、甲基-4-吡啶基酮缩胺基硫脲(methyl4-pyridyl ketone thiosemicarbazone)、氯苄唑胺、帕吉林、潘必定、吡那地尔、哌氧环烷、氟苯马隆、原藜芦碱、萝巴辛、瑞西美托、利美尼定、沙拉新、sodium nitrorusside、氯噻苯氧酸、阿芳那特、酪氨酸酶和乌拉地尔。
在某些方面，抗高血压剂可以包括芳基乙醇胺衍生物、苯并噻二嗪衍生物、N-羧基烷基(肽/内酰胺)衍生物、二氢吡啶衍生物、胍衍生物、肼/酞嗪、咪唑衍生物、季铵化合物、利血平衍生物或磺酰胺衍生物。
芳基乙醇胺衍生物.芳基乙醇胺衍生物的非限制性实例包括阿膜索罗、丁呋洛尔、地来洛尔、拉贝洛尔、丙萘洛尔、索他洛尔和硫氧洛尔。
苯并噻二嗪衍生物.苯并噻二嗪衍生物的非特异性实例包括阿尔噻嗪(althizide)、苄氟噻嗪、苄噻嗪、氢氯噻嗪苄酯、丁氢氯噻嗪、氯噻嗪、氯噻酮、环戊噻嗪、环噻嗪、二氮嗪、氟硫噻嗪、乙噻嗪、芬喹唑、氢氯噻嗪、氢氟噻嗪、甲氯噻嗪、美替克仑、美托拉宗、对氟噻嗪、泊利噻嗪(polythizide)、四氯噻嗪和三氯噻嗪。
N-羧基烷基(肽/内酰胺)衍生物.N-羧基烷基(肽/内酰胺)衍生物的非限制性实例包括阿拉普利、卡托普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利特、福辛普利、赖诺普利、莫替普利、培哚普利、喹那普利和雷米普利。
二氢吡啶衍生物.二氢吡啶衍生物的非限制性实例包括氨氯地平、非洛地平、伊拉地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼索地平和尼群地平。
胍衍生物.胍衍生物的非限制性实例包括倍他尼定、异喹胍、氯压胍、胍那克林、胍那决尔、胍那佐定、胍乙啶、胍法辛、胍氯酚、胍诺沙苄和胍生。
肼/酞嗪.肼/酞嗪的非限制性实例包括布屈嗪、卡屈嗪、双肼酞嗪、恩屈嗪、肼卡巴嗪、肼苯达嗪、苯异丙肼、匹尔屈嗪和托屈嗪。
咪唑衍生物.咪唑衍生物的非限制性实例包括可乐定、洛非西定、酚妥拉明、噻美尼定和托洛尼定。
季铵化合物.季铵化合物的非限制性实例包括阿扎溴铵、松达氯铵、六烃季铵、甲硫酸氰戊吗啉、五甲溴铵、酒石酸戊双吡铵、芬托氯铵和甲硫曲美替定。
利血平衍生物.利血平衍生物的非限制性实例包括比他舍平、地舍平、利血胺、利血平和昔洛舍平。
磺酰胺衍生物.磺酰胺衍生物的非限制性实例包括安布赛特、氯帕胺、呋噻米、吲哒帕胺、喹乙宗、曲帕胺和希帕胺。
vii.血管加压剂
通常使用血管加压剂来提升休克期间的血压，休克可以出现在外科手术期间。血管加压剂，也被称为抗低血压剂，的非限制性实例包括甲硫阿美铵、血管紧缩素氨基化合物、二甲福林、多巴胺、依替非明、依替福林、吉培福林、间羟胺、米多君、去甲肾上腺素、福来君和辛弗林。
g.充血性心力衰竭治疗剂
充血性心力衰竭治疗剂的非限制性实例包括抗-血管紧张素II剂、后负荷-前负荷降低治疗剂、利尿剂和肌力剂(inotropic agnet)。
i.后负荷-前负荷降低
在某些实施方案中，不能接受血管紧张素拮抗剂的动物患者可以用组合疗法进行治疗。这样的疗法可以组合施用肼屈嗪(apresoline)和硝酸异山梨酯(isordil、sorbitrate)。
ii.利尿剂
利尿剂的非限制性实例包括噻嗪或苯并噻二嗪衍生物(例如，阿尔噻嗪、苄氟噻嗪、苄噻嗪、氢氯噻嗪苄酯、丁氢氯噻嗪、氯噻嗪、克尿塞、氯噻酮、环戊噻嗪、氟硫噻嗪、乙噻嗪、乙噻嗪、芬喹唑、氢氯噻嗪、氢氟噻嗪、甲氯噻嗪、美替克仑、美托拉宗、对氟噻嗪、泊利噻嗪、四氯噻嗪、三氯噻嗪)、有机汞制剂(例如，氯汞君、美拉鲁利、mercamphamide、硫汞林钠、汞香豆酸、汞香豆林钠、氯化亚汞、汞撒利)、蝶啶(例如，呋氨蝶啶、氨苯蝶啶)、嘌呤(例如，醋茶碱、7-吗啉甲茶碱、pamobrom、丙可可碱、可可豆碱)、含有醛固酮拮抗剂的类固醇(例如，坎利酮、欧夹竹桃苷、螺内酯)、磺酰胺衍生物(例如，乙酰唑胺、安布赛特、阿佐塞米、布美他尼、布他唑胺、氯米非那胺、氯非那胺、氯帕胺、氯索隆、二苯甲烷-4，4’-苯二磺酰胺、甲磺酰胺、依索唑胺、呋塞米、吲哒帕胺、美夫西特、醋甲唑胺、吡咯他尼、喹乙宗、托拉塞米、曲帕胺、希帕胺)、尿嘧啶(例如，氨美啶、阿米美啶)、保钾拮抗剂(例如，阿米洛利、氨苯蝶啶)或混合利尿剂比如aminozine、熊果苷、氯拉扎尼、依他尼酸、乙氧唑啉、肼卡巴嗪、异山梨醇、甘露醇、美托查酮、氯苄唑胺、派克昔林、替尼酸(ticrnafen)和脲。
iii.肌力剂
肌力剂，也被称为强心剂，的非限制性实例包括acefylline、乙酰洋地黄毒苷、2-氨基-4-甲基吡啶、氨力农、苯呋地尔琥珀酸酯、布拉地辛、cerberosine、樟脑吡酰胺、铃兰毒苷、罗布麻苷、异波帕胺、去乙酰毛花苷、地吉妥辛、洋地黄、洋地黄毒苷、地高辛、多巴酚丁胺、多巴胺、多巴克胺、甲硫咪唑、格木碱、苯醇胺、吉他林、吉妥辛、胍基乙酸、庚胺醇、白毛莨分碱、异波帕明、毛花苷、甲氧酚胺、米力农、黄夹次苷B、夹竹桃苷、毒毛花苷G、奥昔非君、丙胺酚醇、海葱次苷甲、布福吉宁、海葱苷、海葱苷元、毒毛花苷K、磺苯咪啶、可可碱和扎莫特罗。
在具体的方面，肌力剂是强心苷、β-肾上腺素能激动剂或磷酸二酯酶抑制剂。强心苷的非限制性实例包括地高辛(lanoxin)和洋地黄毒苷(crystodigin)。β-肾上腺素能激动剂的非限制性实例包括沙丁胺醇、班布特罗、比托特罗、卡布特罗、克伦特罗、氯丙那林、异波帕胺、双羟乙麻黄碱、多巴酚丁胺(dobutrex)、多巴胺(intropin)、多巴克胺、麻黄碱、乙基麻黄碱、乙诺那林、非诺特罗、福莫特罗、海索那林、异波帕明、乙基异丙肾上腺素、异丙肾上腺素、马布特罗、硫酸奥西那林、甲氧那明、奥昔非君、吡布特罗、丙卡特罗、普罗托醇、瑞普特罗、利米特罗、利托君、索特瑞醇、特布他林、曲托喹吩、妥洛特罗和扎莫特罗。磷酸二酯酶抑制剂的非限制性实例包括氨力农(inocor)。
iv.抗心绞痛剂
抗心绞痛剂可以包括有机硝酸酯、钙通道阻断剂、β-阻断剂和它们的组合。
有机硝酸酯，也被称为硝基血管扩张剂，的非限制性实例包括硝酸甘油(nitro-bid、nitrostat)、硝酸异山梨酯(isordil、sorbitrate)和亚硝酸异戊酯(aspirol、vaporole)。
2.外科治疗手段
在某些方面，第二治疗剂可以包括某些类型的外科手术，其包括，例如，预防性的、诊断性的或阶段性的、治疗性的和姑息的外科处置。外科，并且尤其是治疗外科可以与另外的疗法联合，比如本发明的和一种或多种其他药剂。
对于血管和心血管疾病和病况的这样的外科治疗剂对本领域的技术人员是众所周知的，并且可以包括，但不限于，对器官实施外科手术、提供心血管机械假体、血管重建术、冠状动脉再灌注、导管切除术(catheterablation)、向对象提供植入型心律恢复除颤器、机械循环支持或它们的组合。可用于本发明的机械循环支持的非限制性实例包括主动脉内球囊反搏(intra-aortic balloon counterpulsation)、左心室辅助装置或它们的组合。
IV.实施例
包括以下实施例用来证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，在以下实施例中公开的技术代表在本发明实践中本发明人发现的功能良好的技术，并且因此可以被认为构成本发明实践的优选模式。然而，根据本发明的内容，本领域的技术人员应该理解能够在具体实施方案中做出许多变化，并且仍然获得同样或相似的结果，它们并不脱离本发明的精神和范围。
实施例1
转染的细胞
A.方法
根据以前所述(Mason et al.，1999)用人Arg389和Gly389cDNA稳定转染中国仓鼠成纤维细胞(CHW细胞)。根据放射性结合配体确定具有相等表达水平的细胞系，研究这些细胞系以确定布新洛尔对去甲肾上腺素刺激的cAMP积聚的拮抗作用。在缺少和存在各种浓度的布新洛尔和在37℃下用10μM去甲肾上腺素处理单层细胞20分钟，并且由柱色谱分离[3H]cAMP(Salomon，1991)。
B.结果：转染细胞中对布新洛尔的反应
对于功能性拮抗作用研究，受体在CHW细胞中的表达水平对于Arg389和Gly389细胞系分别是123±19和137±16fmol/mg。在缺少或存在各种浓度的布新洛尔的条件下，细胞暴露于10μM激动剂去甲肾上腺素，并确定cAMP水平。如图3所示，在缺少布新洛尔的条件下，与Gly389相比，Arg389显示对去甲肾上腺素的更大cAMP刺激，它们代表两种受体的主要表型(Mason et al.，1999)。尽管Arg389受体具有实质上更大程度的去甲肾上腺素介导的刺激，布新洛尔仍有效地拮抗这种反应。对于表达β1-Arg389的细胞，由布新洛尔引起的cAMP生成的绝对降低方面的差异更大：在Arg389细胞中由布新洛尔引起cAMP的最大降低435±80fmol/ml，相比之下，在Gly389细胞中115±23fmol/ml cAMP(P＜0.008，N＝4)。对于反应而言，没有发现布新洛尔效能上的差异(分别为ED50＝46±4.5和35±11nM，P＝0.94，N＝4)。在另外的试验中，在表达任一受体变异的细胞中，浓度高达10μM的单独布新洛尔没有引起对cAMP的刺激(数据未显示)。因此这些结果表明在心力衰竭治疗中Arg389受体可以提供对布新洛尔更大的临床反应。
实施例2
转基因小鼠中对β-阻断的反应
应用α-肌球蛋白重链启动子，利用具有定向心室表达人β1AR(Arg389或Gly389形式)的转基因小鼠来确定对长期施用β-阻断剂普萘洛尔的等位基因特异性反应。两种受体的表达水平是等同的。最近已经将产生这种小鼠和它们的部分表征在别处详细报道(Perez et al.，2003)。对于当前研究，用存在于饮用水中的普萘洛尔(0.5mg/ml)、或不含普萘洛尔的水(对照)连续处理3月龄的两种基因型小鼠、以及非转基因小鼠6个月。随后切除心脏并制备心室蛋白质提取物。对这些提取物进行Western印迹以应用先前描述的方法(Perez et al.，2003)确定以下蛋白质的表达：Gαs、Gαi2、G-蛋白偶联受体激酶-2(GRK2)、5型腺苷酰环化酶(AC5)、总受磷蛋白(phospholamban)(T-PLN)、磷酸化受磷蛋白(P-PLN)和肌浆内质网钙ATPase-2A(SERCA)。通过用ANOVA在基因型内比较未处理小鼠和普萘洛尔处理小鼠中蛋白质的表达来评估治疗作用。该研究由辛辛那提大学动物实验管理委员会(the University of Cincinnati Animal Use and CareCommittee)批准。
根据最近的报道(Perez et al.，2003)，具有心脏定向表达β1-Gly389或β1-Arg389的转基因小鼠显示出在表达某些心脏信号和Ca++操作蛋白(handling protein)方面随时间(早在6月龄时观察)有多种改变。为评估对长期β-阻断的基因型特异性反应的潜能，用安慰剂或β-阻断剂普萘洛尔处理表达每种β1AR基因型的3月龄小鼠六个月，移除心室并制备蛋白质提取物。利用Western印迹定量指定蛋白质的表达，比较β1AR基因型组内由处理引起的表达变化。如图4显示，普萘洛尔处理对来自Gly389小鼠的心脏中指定蛋白质的表达没有影响(P＝0.67)。相反，在来自普萘洛尔处理的Arg389小鼠的心脏中观察到总体治疗反应(在表达上或者增加或者降低)(P＜0.002)。由β-阻断引起的这些趋势的方向，包括增加Gαs、P-PLN和T-PLN和降低Gαi和GRK2，都被认为是在心脏肥大/心力衰竭背景下的恢复性生化反应(Liggett，2001)。随后，结合起来看，在这种转基因小鼠模型中与长期β-阻断相关的蛋白质表达谱提示，与具有β1-Gly389基因型的心力衰竭患者相比，可以预期在β1-Arg389心力衰竭患者中对β-阻断剂布新洛尔更有利的反应。
实施例3
布新洛尔对安慰剂的临床研究
A.材料和方法
1.患者群体
对参与β-阻断剂生存试验评估(BEST)(Lowes et al.，2002)并同意进行DNA亚组研究的患者在编码β1AR多态性位点进行基因型分析。BEST的入组从1995年5月31日到1998年12月31日；研究设计已经在别处详细描述(BEST Trial Investigators，2001；和Lowes et al.，2002)。简单地说，该研究是在2708名III/IV级心力衰竭患者中对第三代、非选择性β-阻断剂-血管扩张剂布新洛尔(Bristow，2000)进行的随机、多中心、安慰剂对照试验(BEST Trial Investigators，2001)。在第一周，对接受活性药物的患者每天两次施用3mg布新洛尔，并且如果耐受则以一周为基础向上滴定到50mg每天两次(或如果患者体重＞75kg为100mg每天两次)。在2708名患者中，1040名患者同意进行亚组研究并且具有足够的从血样中制备的DNA。该研究经BEST DNA监督委员会和辛辛那提大学机构审查委员会(the University of Cincinnati Institutional Review Board)批准。
2.基因型分析
使用标准技术(Jones，1963)从全血中提取DNA。准确地使用根据以前详细描述过的方法(Small et al.，2002)实施基因型分析。对于β1AR，描述在编码核苷酸145和1165处的变异，其对应氨基酸49和389。这些等位基因被命名为β1-Ser49、β1-Gly49和β1-Arg389和β1-Gly389。对所有的DNA样本都成功地进行了β1AR-389基因座的基因型分析并且对1030份样本成功地进行了β1AR-49的基因型分析。
3.统计学分析
主要终点是全原因死亡、由于心力衰竭引起的由终点委员会(BESTTrial Investigators，2001)判定的住院治疗、以及死亡或心力衰竭住院治疗的联合终点。β1AR上389位氨基酸变体被认为是假定影响β-阻断剂功效的主要基因型。以平均值±SD的形式记录连续的临床变量，并且通过t-检验或Wilcoxon秩和检验进行比较。根据比例形式记录分类变量并且通过卡平方或Fisher’s准确检验法实施比较。通过Kaplan-Meier法(Kaplan et al.，1958)和SAS(r)专有软件(版本6.12.Cary，NC：SAS Institute，1996)构建累积生存曲线。使用Cox比例风险回归模型来检查根据指定基因型分级的治疗作用。根据年龄、性别、种族和依指定的β1-Gly49多态性调整结果。因为比较的数目受限、以及在先假设是基于细胞、转基因、和另外的对人研究(Kaplan et al.，1958)和SAS(r)专有软件(版本6.12.Cary，NC：SAS Institute，1996；Perez et al.，2003)；和Wagoner et al.，2002)，认为P值＜0.05具有显著性，不针对多重比较进行调整。
B.结果
来自转染细胞和转基因小鼠的结果促进对来自BEST的患者进行基因型分析，BEST是一个β-阻断剂布新洛尔治疗III-IV级心力衰竭患者的试验，其包括安慰剂部分(BEST Trial Investigators，2001)。大部分人口统计学和基线临床特征在参加DNA亚组研究的患者和没有参加的患者之间没有统计学差异。尤其值得注意的是，在年龄、性别、NYHA分类和心力衰竭病因方面没有差异。在基线心率(-1.3bpm)、心脏收缩压(+1.7mmHg)、体重(+1.9kg)、LVEF(+0.9％)和非白种人百分率(-5％)方面注意到在DNA亚组参加者对非参加者之间的微小的和临床不显著的差异。Arg389的总体等位基因频率是67％，这与在普通人群中(Mason et al.，1999)和在心力衰竭试验组中(Smal et al.，2002)所报道有关这种多态性的等位基因频率相似。
在表2中提供根据主要假设基因型(β1AR-389)和处理进行分组的患者的特征。对于年龄、性别、种族、心力衰竭病因、NYHA分级、或基线LVEF，在由安慰剂、布新洛尔治疗、或基因型分类的组之间没有差异。正如所见，纯合Gly389个体的数目是相对小的(安慰剂组52名、布新洛尔组42名)。由此，将Arg纯合体与Gly携带者(具有一个或两个Gly等位基因)进行比较。随后根据治疗和基因型分成4组，每一组都由＞200名对象组成(表2)。
根据β1AR-389基因型分级的用安慰剂和布新洛尔治疗的患者的生存率显示在图5和6中。根据年龄、性别和种族调整的个体比较显示，与用安慰剂治疗的Arg389患者相比，用布新洛尔治疗的纯合Arg389患者具有增加的生存率(风险比＝0.62，95％CI＝0.40-0.96，P＝0.03)。因此，在Arg389患者中由布新洛尔引起的生存率提高总计超过安慰剂组38％。在Gly携带者中进行的这种同样的比较显示，生存曲线中没有差异(风险比＝0.90，95％CI＝0.62-1.30，P＝0.57)，这指示对布新洛尔没有治疗反应。β1AR基因型对针对布新洛尔的心力衰竭住院治疗反应也有明显影响(图5)。与用安慰剂治疗的纯合Arg389患者相比，在用布新洛尔治疗的相同基因型患者中观察到在住院治疗方面的降低(风险比＝0.64，95％CI＝0.46-0.88，P＝0.006)。在住院治疗方面，与安慰剂相比，Gly389携带者没有显示从药物中获得益处(风险比＝0.86，95％CI＝0.64-1.15，P＝0.298)。对于心力衰竭住院治疗或死亡的联合结果，与安慰剂相比，布新洛尔相关的有利治疗作用(图5和7)对Arg389患者是显而易见的(风险比＝0.66，95％CI＝0.50-0.88，P＝0.004)，但是在Gly389携带者中布新洛尔治疗与安慰剂比较没有明显差异(风险比＝0.87，95％CI＝0.67-1.11，P＝0.250)。针对49位变体(β1-Ser49，β1-Gly49)的调整对上面任何结果没有明显影响。根据如此的调整(包括年龄、性别和种族)，对β1-Arg389纯合体的生存率的风险比是0.62，95％CI＝0.40-0.97，P＝0.035；对β1-Gly389携带者没有明显治疗作用(风险比＝0.89，95％CI＝0.61-1.30，P＝0.56)。相似地，针对49位的调整对住院治疗的风险比没有可观察的影响：对于Arg389纯合体而言，风险比＝0.63，95％CI＝0.45-0.86，P＝0.007；对于Gly389携带者而言，风险比＝0.85，95％CI＝0.63-1.14，P＝0.54。对于根据β1-389分级的死亡和住院治疗的联合结果也没有根据β1-49基因型进行修改。
实施例4
在一些BEST患者中与抗交感神经作用相关的死亡风险
作为BEST试验核心方案的一部分，系统性静脉去甲肾上腺素测量是死亡率的最强基线预测之一，通过单变量和多变量分析显示Ln去甲肾上腺素分别与死亡率风险的1.8和1.6倍增加相关。令人惊奇地，如以下显示，去甲肾上腺素3个月时的变化与依赖于治疗组的死亡率有复杂关系。在布新洛尔组中，但不在安慰剂治疗组中，相当数量的患者(受试群体的18％)显示出去甲肾上腺素水平降低，这与1.7倍更高的随后死亡率风险相关。
大部分但不是所有研究表明肾上腺素能活性是慢性心力衰竭(CHF)结局的主要决定因素(Cohn et al.，1984；Kaye et al.，1995；Isnard et al.，2000；Rockman et al.，1989)。此外，心脏肾上腺素能活性是第一个神经激素标志物，随着左心室机能障碍它在对象中的水平变高(Runquist et al.，1997)。这些观察结果构成了β-阻断剂治疗心力衰竭的基础要素(Bristow，2000)。
在另一方面，肾上腺素能支持在衰竭心脏中是一种重要的补偿机制，用于维持静止心肌功能在相对正常的范围内(Port et al.，2001)。当肾上腺素能动力在慢性心力衰竭对象中快速降低时，心肌功能可以变差(Gaffneyet al.，1963)，并且在肾上腺素能动力显著降低时治疗可以增加严重的不良反应，包括死亡率(Cohn et al.，2003；Swedberg et al.，2002)。基于这些观察结果显示，肾上腺素能活性的“抗交感神经性”药理学降低可以显著不同于β-阻断的方式影响心力衰竭的自然病史。
尽管在许多CHF结果研究以及临床试验中已经调查了基线肾上腺素能活性(Benedict et al.，1996；Swedberg et al.，1996；Francis et al.，1993；Anand et al.，2003)，直到最近只有相对少数(通常几百个)的对象在这些研究(Anand et al.，2003)中被调查过。此外，只在两个另外的试验(Swedberg et al.，1990；Anand et al.，2003)中调查过作为自然病史潜在决定因素的去甲肾上腺素的时间行为的关系并且从来没有在使用过强效抗肾上腺素能剂的大规模CHF组、安慰剂对照的研究中调查过。因此，在BEST中调查了肾上腺素能活性的基线水平和变化对临床结果的影响、以及布新洛尔(一种具有抗交感神经特性的β-阻断剂)与临床结果的相互作用。
A.方法
1.临床方案
先前已经描述了BEST方案和主要结果(Mason et al.，1999；Small et al.，2002)。因为起始时在确定程序上的延迟，所以在试验启动后6个月开始在所有随机患者中为了去甲肾上腺素采集血样。作为结果，在BEST的2708名随机对象中的2126名至少有基线去甲肾上腺素样本被收集并测量。
2.去甲肾上腺素样本的收集和测量
在基线、3和12个月时通过插入21号蝶形针到臂静脉中并且使对象仰卧在安静室内30分钟来抽取外周静脉NE样本。抛弃最开始3ml血液，抽取随后5ml血液并马上转移到含有EDTA的预冷5ml管中。在30分钟内，分离血浆并在-70℃冷冻。每3个月将置于干冰上的样本运到中心实验室(LabCorp，Raritan，NJ)，在此样本被保存在-85℃并且在3周内进行检测。通过应用Bio-Rad HPLC方法(Bio-Rad Laboratories Hercules，CA)的HPLC-电化学检测法测量NE。质量控制包括从第二保存管中对具有＜200pg/ml或＞2000pg/ml起始值的所有样本进行再测量；并以常规程序(每20个样本)测量已知的量。
3.统计学方法
对于连续数据以平均值和标准偏差(SD)表示，对于分类数据以比例或百分比表示。对连续数据应用T-检验或Wilcoxon秩和检验，对分类数据应用卡平方或Fisher准确检验(Fisher’s exact test)。使用0.05的α水平(双尾，未调整)用于指示统计学显著性。
应用在基线时去甲肾上腺素的水平、或在3个月时的变化来预测生存率以及死亡率+CHF住院治疗的联合终点。对绝对数据和log转换数据进行初始分析。因为去甲肾上腺素水平的非对称性，在多变量Cox比例风险回归模型中使用自然对数(Ln)转换的数据。
使用基于最大可能性的方法(Kalbfleisch et al.，1980)将去甲肾上腺素的变化分成3组用来预测死亡率或死亡率+CHF住院治疗。这样的划分方法发现了去甲肾上腺素值的最佳分割，其使所得的Cox比例风险模型的可能性最大化。此外，使用柔性三次样条分析(flexible cubic spline analysis)(Green et al.，1994)以确定去甲肾上腺素在3个月时的变化对生存率的关系的形状和显著性水平。
B.结果
1.研究群体
在至少获得了基线去甲肾上腺素数据的对象中基线人口统计和群体描述符数据与全部研究群体没有不同(BEST Trial Investigators，2001)。
2.去甲肾上腺素数据
基线肾上腺素平均值在安慰剂组(n＝1061)中是501±316pg/ml，在布新洛尔组(n＝1065)中是529±370pg/ml(p＝0.061对安慰剂)。通过在3个月时(p＝0.0085)和12个月时(p＝0.0002)的成对t分析，在安慰剂组中去甲肾上腺素显示出统计学显著的增加，然而在布新洛尔组中在3个月时显示明显降低(p＝0.0001)并且在12个月时表现出降低的趋势(p＝0.067)(图8)。去甲肾上腺素的组间变化在3个月时(p＜0.0001)和在12个月时(p＜0.0001)在统计学上具有非常高的显著性。相对于安慰剂组中的变化，在布新洛尔组的去甲肾上腺素在3个月时和12个月时分别降低19％和13％。
3.基线去甲肾上腺素作为死亡率或死亡率+CHF住院治疗的联合终点的预测
图9描述了根据基线去甲肾上腺素值的对于总死亡率的风险比，其中通过划分为四部分，并且相对而言第一四分之一部分被指定风险比(HR)为1.0。对于整组(全部参加者)和对于每一处理组而言，随着四分之一部分的增加，死亡风险有进行性增加。对于死亡率+CHF住院治疗的联合终点获得了相似结果(图10)。
表3给出了基线去甲肾上腺素的单变量和多变量分析并且其他方案预先规定了死亡率的潜在修饰。Ln去甲肾上腺素产生的单变量HR(95％置信限)为1.82(1.58-2.09)，p＜0.001。在多变量分析中，Ln去甲肾上腺素是最强的死亡率预测器之一。
4.去甲肾上腺素的变化作为死亡率或死亡率+CHF住院治疗联合终点的预测器
去甲肾上腺素在3个月时的四分之一部分的变化与随后的死亡率或死亡率+CHF住院治疗的关系显示在表4中，其中HR是相对于第一四分之一部分变化的计算值。为了保持去甲肾上腺素变化/四分位在安慰剂组和布新洛尔组中是相同的，从来源于整组的分割点来实施四分位分析。这产生两个去甲肾上腺素降低的四分之一部分(第一和第二)，和两个去甲肾上腺素增加的四分之一部分(第三和第四)。去甲肾上腺素以pg/ml计的绝对变化和自基线值的％变化列于表4中。因为布新洛尔的抗交感神经作用，有较多的布新洛尔患者在第一四分之一部分和较多的安慰剂患者在第四四分之一部分。
正如在表4中所能看到的，对于去甲肾上腺素绝对变化对比死亡率而言，安慰剂组显示出在第四/第一四分之一部分中风险增加的趋势(HR为1.38，p＝0.099)，并且相对于第一四分之一部分在第二或第三四分之一部分中死亡率没有产生差异的趋势。对于死亡率+CHF住院治疗，在安慰剂组中第四：第一四分之一部分具有1.46的显著HR(p＝0.011)。相比较而言，对于任一临床结果，布新洛尔组没有显示出在第四：第一四分之一部分中风险增加的趋势，但是相对于第一四分之一部分在第三四分之一部分中死亡率的风险降低(HR 0.66，p＝0.046)并且在第三：第一四分之一部分中死亡率+CHF住院治疗有风险降低的趋势(p＝0.22)。
对死亡率以及死亡率+CHF住院治疗两者而言，对于去甲肾上腺素的％变化，在安慰剂组的第三：第一和第四：第一四分之一部分中有风险增加或有风险增加的趋势。相比较而言，在布新洛尔组，在第三或第四相对于第一四分之一部分中对于任一临床终点而言没有HR增加的这种趋势，并且与去甲肾上腺素绝对变化相似，在第三：第一四分之一部分中HR(0.77)有降低的趋势(p＝0.21)。
表4也给出了以布新洛尔：安慰剂表示的治疗组HR，这是对于根据绝对或％变化的每个去甲肾上腺素四分之一部分。对于死亡率，在第三四分之一部分对于去甲肾上腺素的绝对变化(HR＝0.63)或％变化(HR＝0.56)，布新洛尔：安慰剂的HR明显＜整体(布新洛尔与安慰剂相比死亡率降低)。对于死亡率+住院治疗，除了第四四分之一部分中HR也明显降低之外，观察到相似的模式。与死亡率相比，对于死亡率+CHF住院治疗，第二四分之一部分在布新洛尔：安慰剂HR中关于绝对变化产生几乎显著(p＝0.067)的增加，并且关于％变化产生显著(p＝0.021)的增加(HR＝1.39)。
为了进一步探索与去甲肾上腺素变化有关的治疗相关差异死亡率风险，使用基于可能性的方法(Bristow，1984)。正如图11中显示，在每一治疗组内分开的可能性分析鉴定了11名安慰剂组的对象和153名布新洛尔组的对象，这些对象分别具有随后死亡率的较高风险(HR 3.31，p＝0.004；HR 1.69，p＝0.002)并且在3个月时去甲肾上腺素降低。在这些风险组中去甲肾上腺素在安慰剂组中降低≥783pg/ml，在布新洛尔组中降低≥244.5pg/ml。图11也举例说明在两个治疗组中在3个月时去甲肾上腺素增加的亚组被鉴定具有较高的死亡率风险。
因为基于可能性的方法提供预测死亡率增加的去甲肾上腺素变化的切割点的最大优化，我们利用使用柔性三次样条逆合的较少区分性拟合(Fowler and Bristow，1985)。这种方法的最佳拟合是具有5个节点和3自由度的U形、非线性曲线，对于布新洛尔治疗组、安慰剂治疗组和整组(全部参与者)的卡平方值分别为13.2(p＝0.0042)、和11.1(p＝0.011)和32.5(p＜0.0001)。
5.与死亡率风险增加相关的去甲肾上腺素增加或降低的对象的特征
与作为对照的各自的中间变化组相比，通过基于可能性的分析法在去甲肾上腺素变化范围两端鉴定的死亡率高风险亚组的特征在表5中列出。经鉴定具有较高死亡率风险并且去甲肾上腺素降低的布新洛尔亚组的153名对象具有高基线去甲肾上腺素水平并且在3个月时去甲肾上腺素平均降低529pg/ml。与很少或没有去甲肾上腺素变化(-44pg/ml)的中间变化对照组相比，这些对象也具有较低的LVEFs和RVEFs，和较高的心率。具有明显去甲肾上腺素降低的153名布新洛尔治疗对象也具有较高比例的IV级对象，并且与中间变化组相比具有向着更多黑种人对比非黑种人的趋势。在这些153名对象中发生的52例死亡中有79％被归类为心脏原因，并且其中63％、27％和2％被分别归因于突发性心脏死亡、泵衰竭和心肌梗塞。相比之下，用布新洛尔治疗的具有与去甲肾上腺素增加相关的较高死亡率风险的亚组(n＝137)具有较低的基线RVEF、相似的基线LVEF，但是与中间变化组相比在3个月时有明显较少的LVEF增加。在这个亚组中，IV级％和非黑种人/黑种人分布与中间组没有差异。在这个亚组中，43例死亡中的35例是由于心血管，但是少数是突发性的(34％对51％泵衰竭和6％是由于心肌梗塞)。
C.讨论
来自BEST试验的基线去甲肾上腺素数据确认并扩展以前关于肾上腺素能活化水平和不良临床结果之间正向关系的报告。基线去甲肾上腺素的数据表明这个参数是临床结果的强效预测器，正如其已经在CHF群体中被鉴定。令人惊奇地是，在BEST中，由较高基线去甲肾上腺素水平引起的风险增加没有被抗肾上腺素能治疗而显著降低，因为在布新洛尔和安慰剂治疗组中，随着去甲肾上腺素四分之一部分值的增加，死亡率或死亡率+CHF住院治疗的风险比也逐渐增加。对于在所述较高基线去甲肾上腺素四分之一部分中这种缺乏布新洛尔保护作用的一种可能性是，在具有最晚期CHF和最大程度心肌功能障碍的对象中发生的抗交感神经作用。
另一方面，在3个月时显示出肾上腺素能活性增加的患者的四分之一部分中布新洛尔显示出临床保护作用。在去甲肾上腺素降低的四分之一部分中没有观察到临床终点的这种降低。实际上，对于死亡率+CHF住院治疗，去甲肾上腺素降低的第二四分之一部分显示出在布新洛尔治疗患者中风险增加的证据。而且，当去甲肾上腺素3个月变化的四分之一部分与第一四分之一部分(其具有最大程度的降低)相比时，第三：第一四分之一部分的关系表现出，对于布新洛尔组而非对于安慰剂组在第一四分之一部分中死亡率增加的证据。在3个月时表现出去甲肾上腺素降低的患者中布新洛尔副作用的这些提示促使对这种独特β-阻断剂的抗交感神经作用进行另外的分析。
与安慰剂相比，布新洛尔在3个月时使去甲肾上腺素降低19％。这与在MOXCON试验(Cohn et al.，2003)中由中枢抗交感神经剂莫索尼啶在3个月时引起去甲肾上腺素相对降低24％可以相比。与在MOXCON中一样，布新洛尔的抗交感神经作用似乎与不利临床结果的风险增加相关，尤其是对于突然死亡。除了上面所讨论的去甲肾上腺素降低的四分之一部分内的证据，基于可能性的分析鉴定了布新洛尔组中有18％具有明显的去甲肾上腺素降低(＞224pg/ml)，他们的死亡风险有1.65倍增加，然而在安慰剂治疗组中只有1％被鉴定为具有增加的死亡率风险并有去甲肾上腺素的显著降低。这个分析也揭示了在去甲肾上腺素增加的患者中死亡风险增加，但是布新洛尔和安慰剂治疗患者在数量上相似。通过柔性三次样条拟合法证实了在3个月时去甲肾上腺素变化范围的两端具有增加的死亡风险，这对于布新洛尔和安慰剂处理组产生了统计学显著的U形曲线。
根据可能性分析处于死亡率风险增加而鉴定的具有去甲肾上腺素降低的布新洛尔治疗对象的亚组，包括较晚期(IV对III级)心力衰竭、较高基线去甲肾上腺素水平、较低的LV和RV功能、和黑种人比非黑种人的较大比例趋势的患者。因此布新洛尔的抗交感神经作用在可能依赖肾上腺素能活性支持心脏功能的严重心肌机能障碍的对象亚类中可能导致不良后果，但是这种机制没有被我们的数据证实，并且其它解释是可能的。
仅有的以前公开的关于系统性肾上腺素能活性变化与后果的关系的临床试验数据来自CONSENSUS(Swedberg et al.，1990)，其中神经激素在6周时的变化与239名对象中的后果无关，以及Val-HeFT(Ahand et al.，2003)，其中在4301名患者中去甲肾上腺素在4个月时的绝对变化不能、但是％变化预测了在安慰剂-和缬沙坦-治疗组中随后死亡率的差异。然而，与Val-HeFT中不同，在去甲肾上腺素绝对水平增加和死亡率或死亡率+CHF住院治疗风险增加之间发现了正向关系。本研究的主要新发现是肾上腺素能活性的降低和增加都能够与慢性心力衰竭群体中的不利临床后果相关。布新洛尔对这些风险的减轻作用表明，与由治疗开始之前所测量的基线去甲肾上腺素造成的风险相反，去甲肾上腺素增加的不良作用能够通过共同施用抗肾上腺素能治疗而被去除。
总之，从BEST试验中所测量的外周静脉去甲肾上腺素水平来评估，对系统性肾上腺素能活性的全面研究表明，在晚期CHF中，1)基线去甲肾上腺素是不利临床后果但不是治疗反应的预测器，2)去甲肾上腺素在3个月时的增加和降低都预示不利后果，和3)布新洛尔减轻去甲肾上腺素增加的风险，但是通过它的抗交感神经特性使某些类型的患者置于去甲肾上腺素降低的临床风险中。
表3.多变量分析基线NE
表4
在安慰剂和布新洛尔组中，去甲肾上腺素(NE)在3个月时的变化对随后死亡率(M)或死亡率+CHF住院治疗(M+H)的作用；以及布新洛尔与安慰剂相比的治疗作用，根据去甲肾上腺素变化四分之一部分、风险比和(95％置信区间)
四分之一部分是：NE变化的绝对值pg/ml，第一部分＜-144(安慰剂n＝155，布新洛尔n＝268)；第二部分-144至＜-9(安慰剂n＝206，布新洛尔n＝214)，第三部分-9至111(安慰剂n＝236，布新洛尔n＝186)，第四部分＞111(安慰剂n＝248，布新洛尔n＝173)；％NE变化，第一部分＜-30.2(安慰剂n＝160，布新洛尔n＝262)，第二部分-30.2至＜-2.5(安慰剂n＝198，布新洛尔n＝223)，第三部分-2.5至31.1(安慰剂n＝240，布新洛尔n＝181)，第四部分＞31.1(安慰剂n＝247，布新洛尔n＝175)。＊，p＜0.05对第一四分之一部分，Fisher准确检验
表5
具有增加风险的经可能性确定的亚组对比中间(Inter)NE变化亚组的人口统计学特征，其中所述增加风险与去甲肾上腺素(NE，pg/ml)降低(Redxn)或增加(Incr)的变化(Δ)相关。NE以pg/ml表示；数据以平均值±SD表示；＊，p＜0.05对Inter；#，p＜0.10对Inter
实施例5
A2C-肾上腺素能受体遗传变体在BEST中的流行性
下表给出与最初由Liggett小组(Small et al.，2002)所报导的结果相比，在BEST中α2c-肾上腺素能受体遗传变体(WT/WT＝纯合野生型，WT/DEL＝杂合体，DEL/DEL＝纯合α2cDel322-325)的流行性(％)。通过应用引物经PCR扩增覆盖所述缺失的α2cAR序列的区域并随后在能分辨有或无该缺失的产物之间12个碱基对长度差异的凝胶上运行扩增反应来评估来自BEST的样本。
表6
正如在上表中所见的，α2cDel322-325等位基因在黑种人群体中的频率远大于非黑种人群体中的频率，在BEST中为0.423比0.043(p＜0.0001)。其次，在黑种人中，α2cDel322-325等位基因在BEST中的频率与在Small etal中的黑种人CHF患者中的频率不一样高(0.615，p＜0.0001)，但是与在Small et al中的黑种人对照的频率相似(0.411，p＝.85)。这些差异可能反映了在Small et al.(n＝78名黑人CHF患者，84名黑人对照)和BEST试验(在DNA亚组研究中n＝207名黑人)中所用的相对小的样本量。
仅已经假定在人中α2cDel322-325多态性与增加的肾上腺素能动力相关，并且还没有直接调查过。
对于在本建议中直接阐述的在α2cDel322-325纯合体和α2c野生型对照之间基线去甲肾上腺素的小差异的一个可能原因是，系统性静脉去甲肾上腺素不是心脏肾上腺素能动力的良好替代指标，并且在慢性心力衰竭中，心脏肾上腺素能动力的变化能够在缺少系统性去甲肾上腺素变化的情况下发生。
根据α2c受体类型的去甲肾上腺素在基线和3个月时变化的结果显示在表7中：
表7.去甲肾上腺素(NE)，平均值±SD，和BEST试验的(n)，根据α2c受体类型；*p＜0.05对安慰剂变化
正如在表7中所见，在BEST中系统性静脉NE的基线水平或变化强烈支持上述关于α2cDel322-325受体变体对基线肾上腺素能动力作用的假设；对于3个月时较高的基线去甲肾上腺素只有非显著性的趋势有利于α2cDel322-325纯合体。另一方面，在表7中能够很容易地看出，由布新洛尔引起的去甲肾上腺素降低在α2cDel322-325纯合体中要远大于在α2c野生型纯合体或杂合体中。
实施例6
实施例3和4的扩展
A.材料和方法
1.离体人心室研究
从由于物理或ABO血型不相容而不能被移植心脏的当地潜在供体获得非衰竭的心脏。从经历心脏移植的由缺血性或非缺血性扩张型心肌病引起的晚期心力衰竭患者中获得衰竭的心脏。在结果中提供所述心脏的人口统计学特征。如前所述评估分离的、场刺激的人小梁的收缩反应{1755；a-c}。大小一致的小梁(1-2×6-8mm)在36℃、用95％O2-5％CO2鼓气的pH7.45泰罗德溶液(Tyrode solution)中被固定在80ml肌肉浴腔室中。平衡后，L最大75％的张力被施加于每个单独小梁。随后通过阈上10％的5-ms脉冲施加场刺激，并且在平衡之后使用指定浓度和每5分钟增加的施加剂量绘制对异丙肾上腺素、布新洛尔或扎莫特罗的全剂量-效应曲线。在用福斯高林增强信号转导的试验中{e，f}，在实施剂量-效应曲线之前15-20分钟，将10-6M的这种腺苷酰环化酶活化剂施加于组织浴，并且使之实现张力反应的稳定性。以刺激张力(mN/mm2)减去基线张力来计算每种剂量的心脏收缩张力。通过非线性重复测量协方差分析计算最大张力、产生50％最大活动张力(EC50)的异丙肾上腺素浓度和曲线斜率。使用关于分组数据的统计学显著的负或正曲线斜率分别鉴定负或正的变力(inotropic)作用，并且通过相互作用检验来检测各基因型组之间的曲线斜率差异。按照在实施例3和4中所述使用统计学方法。
2.转染细胞、放射性配体结合、cAMP检测
用以前描述的构建体稳定转染中国仓鼠成纤维细胞，从而使其分别表达人β1-Arg389或β1-Gly389受体。如所述使用1μM普萘洛尔确定非特异性结合，通过应用125I-cyanopindolol(125I-CYP)的放射性配体结合研究确定β1AR表达、和对布新洛尔的亲和性。根据[3H]-腺嘌呤方法使用如所示的两种受体具有相等表达水平的两种细胞系实施全细胞cAMP积累研究。在37℃，将附着细胞暴露于载体(基础)，10μM去甲肾上腺素或10μM去甲肾上腺素与指定浓度的布新洛尔维持15分钟。
B.结果
1.人心室离体收缩反应与β1AR基因型相关
在这些研究中，在内源性表达、缺少和存在心室衰竭的条件下，利用分离自人心脏的右心室小梁使用相应组织来确定基因型对收缩的作用。预外植(pre-explant)的LVEF在非衰竭组中对于Arg是0.61+0.13和对于Gly是0.53+0.15，并且在衰竭组中对于Arg是0.21+0.11和对于Gly是0.17+0.07。11名衰竭Arg患者中的5名和11名衰竭Gly患者中的6名具有缺血性扩张型心肌病，所有另外的衰竭心脏患者是非缺血性扩张型心肌病。非衰竭心脏的年龄是：Arg 39±16岁、Gly 43±20岁(p＝0.64)。对于衰竭心脏的年龄是Arg 48±15岁、Gly 54±8岁(p＝0.26)。在非衰竭心脏组中性别分布是在Arg中3名男性和8名女性，和在Gly中5名男性和6名女性。在衰竭心脏中性别分布是在Arg中8名男性和3名女性，和在Gly中2名男性和9名女性。图12显示的是在从非衰竭和衰竭的人心脏中取下的并根据β1AR-389基因型分级的右心室小梁中对异丙肾上腺素的心脏收缩张力反应。在非衰竭心脏中，基因型之间具有反应差异，其中β1-Arg389纯合体的最大张力较高(13±2.5对5.2±1.4mN/mm2β1-Gly389携带者，P＝0.01)。重要的是，在来自衰竭心脏的小梁中观察到这种相同表型具有甚至更大的等位基因特异性相对差异：最大异丙肾上腺素刺激的张力对于β1-Arg389是9.4±1.9mN/mm2和对于β1-Gly389是2.4±0.60mN/mm2(P＝0.008)。
23个衰竭心脏的第二组被用于评估布新洛尔、β1-AR选择性部分激动剂扎莫特罗{d}、和异丙肾上腺素在分离的右心室小梁中的变力作用。该组的LVEF平均为0.18±0.09，其具有10个非缺血性和13个缺血性扩张型心肌病。平均年龄是52±11岁，有20名男性和3名女性。23个心脏中的13个是Arg389纯合体，10名是Gly携带者(全部杂合体)。在Arg纯合体和Gly携带者之间对于LVEF、年龄、心肌病病因、和性别方面没有差异。在23个心脏的8个中实施布新洛尔和扎莫特罗试验；另外15个心脏或者实施了扎莫特罗或者实施了布新洛尔剂量-效应曲线，而未用其它药剂。所有23个心脏都实施了全异丙肾上腺素剂量-效应曲线。
在两种基因型组之间异丙肾上腺素剂量-效应的结果与图12中显示的结果非常相似。在未示出的数据中，在有利于Arg/Arg基因型的剂量-效应中有明显差异，其中通过对相互作用的检验表明曲线斜率具有高度显著(p＜0.001)的差异和最大值具有差异(Arg，xxxx；Gly，yyyy，p＜0.05)。正如在图3中所见的，单独布新洛尔在两个基因型组中都产生负变力作用(在两组中为负斜率，p值都＜0.01，对曲线斜率之间非显著的相互作用检验)。在存在福斯高林预处理时，Arg心脏保持负曲线斜率(P＜0.05)，但是Gly剂量-效应曲线的斜率与0没有差异(p＝0.25)。在缺少福斯高林时(图13C)，扎莫特罗在Arg心脏中产生正变力作用，但是在Gly小梁中产生负变力作用(两个斜率p值都＜0.05)。当用福斯高林进行预处理时，扎莫特罗在两种基因型组中都产生正变力作用(在两种基因型中是正曲线斜率，p＝＜0.05)，其中Arg/Arg心脏具有较大的变力作用，这与在扎莫特罗剂量为3×10-8M和10-7M的基线比较时具有显著性。
2.在转染细胞中NE刺激cAMP的功能性拮抗作用
在这些研究中利用Arg389(123±19)和Gly389(137±16)人β1AR表达水平相等(fmol/mg，n＝4)的细胞。cAMP的基础水平是72±8.5和59±9.1fmol/孔。存在直到10μM的布新洛尔时的初始cAMP积累试验没有显示出布新洛尔在任一受体上具有内源性拟交感活性(ISA)的证据。为了检查功能性拮抗作用，在缺少或存在不同浓度的布新洛尔的情况下使细胞暴露于10μM的激动剂去甲肾上腺素，并确定cAMP水平。如图13所示，与Gly389相比，在缺少布新洛尔时Arg389表现出对于激动剂的更大cAMP刺激作用，这代表如前所述两种受体的主要表型{998}。尽管Arg389受体有显著更大程度的NE-介导刺激作用，布新洛尔有效地拮抗了这种效应。由布新洛尔造成的cAMP生成绝对降低的差异对于表达β1-Arg389的细胞是更大的：与在Gly389细胞中的115±23fmol/ml相比，布新洛尔在Arg389细胞中引起435±80fmol/ml cAMP的最大降低(P＝0.008，n＝4)。对于所述效应而言没有发现布新洛尔的效能有不同(分别为EC50＝46±4.5和35±11nM，P＝0.94，n＝4)。此外，在125I-CYP竞争结合研究中，对布新洛尔的亲和性在β1-Arg389(pKi＝9.6±0.04)和β1-Gly389受体(pKi＝9.6±0.11，n＝3)之间没有差异。这些发现表明布新洛尔能拮抗β1-Arg389增强的反应。
3.对Arg389基因型有利的治疗的机制
典型地通过升高系统性静脉去甲肾上腺素水平而鉴定的肾上腺素能活性增加在心力衰竭患者中支持受损的心力衰竭功能，但是有助于心力衰竭的发展{h}。在BEST中观察到在肾上腺素能活性和结果之间的这种复杂关系，其中基线去甲肾上腺素的增加与不良后果独立地相关，但是肾上腺素能活化的显著降低与死亡率增加相关{i}。不象其他已用来治疗心力衰竭的β-阻断剂，布新洛尔具有强效的抗交感神经特性，并且在BEST中18％用布新洛尔治疗的患者表现出在3个月时去甲肾上腺素的过度降低并伴随有随后死亡率风险的1.7倍增加{i}，这使人回想到在MOXCON试验中用纯抗交感神经剂莫索尼啶治疗的患者的死亡率增加{j}。尽管抗交感神经作用增加死亡率风险的原因没有被完全了解，但是它可能与丧失肾上腺素能介导的对衰竭心脏的收缩能力支持有关。因此Arg纯合体患者可能比Gly携带者更好地潜在耐受去甲肾上腺素信号丧失，因为正如在图12和13中所示，在Arg纯合体中即使低水平的儿茶酚胺激动剂也引起力的增加。Arg纯合体能够获得对布新洛尔治疗的治疗优势的另一种机制可能是对不利的β1-AR信号的更大程度的拮抗作用，正如在图3中所提示的。为了确定哪一种机制可以解释相对于Gly携带者在Arg纯合体中可以获得更有利的布新洛尔治疗效果，发明人比较了基线去甲肾上腺素和3个月时去甲肾上腺素变化对死亡率的影响(表8)。正如在表8中所能见到的，Arg纯合体对比Gly携带者关于死亡率的风险比随基线去甲肾上腺素增加而降低，这提示随着肾上腺素能动力的增加对于布新洛尔治疗的Arg纯合体有着逐渐发展的优势。对于去甲肾上腺素分析中的变化，在先前被鉴定为相对于去甲肾上腺素明显降低(在治疗三个月时降低＞244pg/ml)而死亡率风险增加的组、具有很小或没有去甲肾上腺素变化(-244至145pg/ml)而没有死亡率风险增加的参照组、和由于去甲肾上腺素增加(＞145pg/ml)而使死亡率风险增加的组中，发明人比较了Arg纯合体对比Gly携带者的死亡率。正如在表8中所见，在由于过度抗交感神经作用引起死亡率风险增加的亚组中对Arg纯合体没有优势(组1)；1.07的风险比表明在该组中对于Gly携带者的优势可以忽略。在另一方面，对于基线去甲肾上腺素，随着在3个月时逐渐增加的去甲肾上腺素上升到一定的位置，风险比随之降低，所述的位置是在去甲肾上腺素逐渐增加的组中对于Arg纯合体的益处是由于死亡率有64％的相对较好的降低(p＝0.08)。这些去甲肾上腺素变化和基线数据表明，对于β1AR的Arg纯合状态，布新洛尔治疗优势是直接相关于肾上腺素能活性的程度，并且不与避免抗交感神经作用的保护作用直接相关。
表8
在测量去甲肾上腺素(NE)(pg/ml，n＝439)的BEST DNA子研究中布新洛尔治疗的患者
BSL＝基线。＊，在布新洛尔组中3个月(mos)时的NE变化与随后生存率结果相关；分割点是根据先前公开的可能性分析从整组中获得的。根据与组2的比较分析，组的死亡率有1.69倍(p＜.05)增加，并且组3的死亡率有1.65倍(p＜0.05)增加。
实施例7
来自BEST试验的附加分析
在慢性心力衰竭中，肾上腺素能神经系统的活化具有双重的、表面上对立的结果(图14)。在一方面，持续的肾上腺素能活化给衰竭的心脏提供重要支持，通过抗交感神经剂来药理学消除这种支持增加了死亡率(Bristow et al.，2004；Cohn et al.，2003)。在另一方面，慢性β-肾上腺素能刺激是心肌病性的，并且β-肾上腺素能受体的阻断能改善扩张性心肌病的表型和临床结果。抗肾上腺素能疗法的挑战是基本上不干扰肾上腺素能支持，然而却抑制了不利作用。以低剂量的可逆、质量作用/竞争性β-阻断剂起始的策略已经在处理这种脆弱的平衡中获得了很大的成功，在不太晚期的心力衰竭患者中尤其如此。
清楚的是在BEST中布新洛尔在平衡抗肾上腺素能疗法作用的过程中遭遇了由于过度地降低了在IV级患者中的支持而面临的困难(Anderson etal.，2003)。用布新洛尔治疗的IV级患者在最开始治疗的6个月，在死亡或心力衰竭住院治疗的联合终点上具有统计学显著的、1.7倍增加，然而III级患者没有这种早期不利作用并且总体具有高度显著的(p＝0.0001)、22％的发生率降低。对布新洛尔有大的抗交感神经反应的亚组患者在IV级患者中超出了比例，与所预料的一样，因为这个亚组具有非常高的基线去甲肾上腺素水平(图15)。对布新洛尔具有大的抗交感神经反应的亚组患者也具有恶化的LV和RV功能，与所预料的一样(图16)。
在BEST中经历深度抗交感神经作用(去甲肾上腺素降低≥244.5pg/ml)的亚组(治疗组中的18％)中的死亡率有1.7倍的增加。这个亚组结果与在MOXCON试验中接受“纯”抗交感神经剂莫索尼啶的患者中的结果(Cohn et al.，2003)相似。看起来有两种遗传药理学方式可以用来保护患者免受这样的不利作用：1)他们具有野生型的α2c受体，其是去甲肾上腺素释放的限定因素之一(Bristow 2000)；2)他们具有β1受体的高机能变体，推测这种变体能允许他们抵抗去甲肾上腺素信号的丧失。因此，对于野生型α2cAR或β1AR-389Arg/Arg存在的预筛选鉴别了死亡率分别降低29％(p＝0.031)或38％(p＝0.030)的患者群体。
在黑种人亚组中显示出在相当大数量的患者中存在特异性药物基因组谱，所述患者对布新洛尔治疗没有效果并且有获得不利结果的趋势。黑种人对于α2c受体的功能丧失变体具有高得多(接近10倍)的等位基因频率，其涉及受体蛋白质的第三个胞质内环中322-325位氨基酸的缺失(Small etal.，2000)。预期α2cAR中的这种功能丧失将增加肾上腺素能动力，因为α2受体的正常突触前肾上腺素能抑制作用受到了损害(Brum et al.2002)。BEST中的对象并且尤其是对这种基因变体为杂合或纯合(α2cAR-Del322-325携带者)的黑种人具有在基线时全身性去甲肾上腺素增加的趋势，并且对布新洛尔具有非常大的抗交感神经反应(图17)。事实上，在BEST中接近61％的黑种人对象是α2cAR-Del322-325携带者，相比之下非黑种人为8％(图18)。在α2cAR-Del322-325携带者对象中，在布新洛尔治疗组中死亡率有10％的增加，相比之下在野生型α2cAR对象中死亡率降低29％(p＝0.031)(图19)。
另一种避免布新洛尔抗交感神经作用的方式是具有β1AR的高功能性的389Arg/Arg变体(图15)(Mason et al.，1999)，其在BEST群体中占47％。正如在图20和实施例4中所示的，对于β1AR而言个体是389Arg/Arg(Arg纯合体)还是389Gly携带者可能是对β-激动剂反应的主要决定因素，甚至比心力衰竭的存在与否更重要。预料β1AR-389Arg/Arg个体对抗交感神经的不利作用具有相对的抗性，因为即使较低水平的去甲肾上腺素将产生相对强烈的变力反应(图20)。如图19所示，实际上似乎正是如此。图21表明在α2cAR-Del322-325携带者患者中，β1AR-389Arg/Arg受体的存在使β1AR-389Gly携带者死亡率增加36％转变为死亡率降低18％。
除了避免由抗交感神经作用产生的心肌抑制，β1AR-389Arg/Arg基因型赋予了对布新洛尔更大的、“超反应”(图5-7)。这可能是因为高功能性的β1AR-389Arg/Arg变体赋予了更大程度的心肌病。因为它较高的功能性，抑制布新洛尔信号转导的绝对程度是较大的，这解释为更潜在地有益于β1AR-389Arg/Arg基因型患者。
正如在图21和图20中所显示的，具有389Arg/Arg受体变体的患者在整组中(死亡率38％的降低(p＝0.030)对比在Gly携带者中死亡率非显著性降低10％)和在α2cAR野生型患者中(死亡率降低40％(p＝0.037)对比在Gly携带者中死亡率非显著性降低22％)对布新洛尔具有更大的死亡率降低反应。因此，是否存在超反应标记物β1AR-389Arg/Arg基因型是晚期心力衰竭患者中布新洛尔反应的主要决定因素。图22举例说明了在BEST中使用基因变体来定义亚群对于死亡率降低具有增加疗效的进展。作为对比，仅有的另一个入组了相对大量(＞500)的美国患者的β-阻断剂心力衰竭死亡率试验(MERIT-HF)也被标示在图7中。正如所能看到的，BEST中死亡率降低从在整组中不显著的10％增加到80％的α2cAR野生型患者中的29％、增加到47％的β1AR-389Arg/Arg患者中的38％、增加到40％的既是α2cAR野生型又是β1AR-389Arg/Arg患者中的40％。相比之下，对于在MERIT-HF入组的美国患者中美托洛尔CR/XL的风险比是1.05(Wedel et al.，2001)。
尽管可能从BEST产生的β1AR-389基因型特异性数据对于所有的β-阻断剂是一般有效的，但是有很好的理由认为这些结果可能只应用于布新洛尔。首先，如上所讨论，β1AR-389Arg/Arg基因型避免了抗交感神经的不利作用，并且在用来治疗心力衰竭的β-阻断剂中布新洛尔对于抗交感神经作用是独特的。其次，为了最大化抑制经由高功能性的β1AR-389Arg/Arg受体的信号，事实上布新洛尔可以用来降低去甲肾上腺素并阻断受体，只有布新洛尔具有这种特性组合。最后，可以认为在BEST中由布新洛尔产生的基因变体数据只在晚期、III-IV级心力衰竭中是有效的。有充分的理由可以相信在不太晚期(NYHA级I-II)的心力衰竭中，布新洛尔将是具有α2cAR-Del322-325携带者加上β1AR-389Arg/Arg组合的对象的药物选择，因为抗交感神经作用和心肌功能支持丧失在此类患者群体中不太是问题，并且具有α2cAR-Del/Del+β1AR-389Arg/Arg单倍型的个体发生心力衰竭的风险具有10倍的增加(Small et al.，2002)。布新洛尔对这些患者可能是最后的治疗方法，因为它降低去甲肾上腺素(由此应对α2cAR-Del322-325等位基因的影响)并且阻断β1AR。
在文献中已经有关于布新洛尔在人心脏中是否具有内在拟交感神经活性(ISA)的争论，这种特性已经被用来解释布新洛尔BEST试验的结果。尽管布新洛尔在啮齿动物心肌中明确地具有ISA，发明人的广泛研究表明布新洛尔在功能性人心室心肌中具有极低的反向激动剂活性同时没有任何ISA。正如在Bristow et al.，1998中所示的，在动态心电图(Holtermonitoring)上布新洛尔没有增加夜间心率，这被认为是人心脏中ISA的最敏感指示并且是一种能很容易鉴定扎莫特罗或双胺心安的ISA的检验(Xameterol Study Group，1990；Silke et al.，1997)。此外，发明人在分离的人心脏制备物中实施了广泛的研究，布新洛尔在非衰竭的(图23和24)或衰竭的人心脏(图25和26)中没有显示出ISA的证据。实际上，当用福斯高林预处理的制备物时，在衰竭的心脏中，卡维地洛比布新洛尔提供更多的正变力信号(为检测弱ISA需要增加信号转导)(图26)。在BEST中，在高功能性β1AR-389Arg/Arg变体中布新洛尔的更有利反应进一步证明反对布新洛尔在人心室心肌中的ISA。
实施例8
BEST试验重访
在1040名患者中实施的、BEST的DNA亚研究检验了关于两种肾上腺素能受体多态性的预期假说，基于在模式系统中(Mialet et al.，2003)或在心力衰竭流行病学研究中(Small et al.，2002)的工作成果，所述受体多态性与布新洛尔的治疗作用具有潜在的相互作用。这两种肾上腺素能受体基因变体在黑种人对非黑种群体中显示出差异性的等位基因频率，并且发现它们在BEST中明显地影响了治疗结果。首先是α2cDEL 322-325多态性，一种功能损失的基因变体，其增加肾上腺素能动力并且其易受布新洛尔的过度抗交感神经作用的影响。作为α2cDEL 322-325携带者并用布新洛尔治疗的患者在3个月时去甲肾上腺素的平均降低为153±57(SEM)pg/ml，相比之下在用布新洛尔治疗的α2cWT/WT患者中去甲肾上腺素的降低为50±13pg/ml(p＝0.008)。在BEST中这种过度抗交感神经反应与统计学显著的、死亡率1.7倍的增加有关(Bristow et al.，2004)。有两个易受显著的抗交感神经作用影响的临床或人口统计学亚组，IV级患者和黑种人，在BEST中只有这两个亚组的死亡率风险比＞1.0(BEST Writing Committee，2001)。α2cDEL 322-325等位基因的频率在黑种人是0.42，在非黑种人中是0.04(p＜0.0001)。正如在表9的栏3中所示的，在BEST中对于α2c-肾上腺素能受体为纯合野生型(WT/WT)的患者的全原因死亡率有30％的降低(p＝0.031)并且在心血管死亡率上有41％的降低(p＝0.004)，然而作为DEL322-325多态性携带者的患者在全原因死亡率上有9％的增加(p＝NS)，并且在心血管死亡率上有3％的增加(p＝NS)。大体上，BEST试验中80％的人，包括24％的黑种人，是α2cWT/WT，其中包括34％的黑种人。因此对DEL 322-325多态性存在的简单筛选并且只治疗美国人口中85％的对于α2c-肾上腺素能受体为纯合野生型的美国人，将去除布新洛尔的抗交感神经作用/死亡率风险增加，并且增强它的治疗效果。正如以下所展开的，作为α2cDEL 322-325携带者的患者如果他们具有β1389Arg/Arg基因型(该基因型在BEST中的流行率在黑种人中为0.32和在非黑种人中为0.51)就可以用布新洛尔治疗，因此基于12％的黑种人和88％的非黑种人的种族百分比，对于布新洛尔适合的群体是总美国心力衰竭群体的85％+6％＝91％。此外，超过50％的黑种人(34％+21％＝55％)能够根据基因型筛选用布新洛尔进行治疗。
发现在BEST中可影响布新洛尔治疗效果的另外的肾上腺素能受体多态性是β1389Arg/Gly SNP，其中与存在Gly等位基因(“Gly携带者”栏6，表9)相比，Arg/Arg更高功能性的变体赋予了对布新洛尔的“超反应”(表9，栏5)。在05年3月28日会议的资料包中提供了证据，389Arg/Arg变体比Gly携带者变体显示出更高的信号转导功能，并且Liggett博士的小组已经公开了证据，389Arg等位基因比389Gly对心肌病有更大影响(Mialetet al.，2003)。正如在表9中所能见到的，在BEST中作为389Arg/Arg患者的全原因死亡率有38％的降低(p＝0.030)，并且由于布新洛尔的心血管死亡率有46％的降低，相比之下在作为389Gly携带者的患者中各自的死亡率分别为10％和22％(两个p＝NS)。因为没有证据表明卡维地洛(Smallet al.，2002)或美托洛尔CR/XL(White et al.，2003)在β1389Arg/Arg和β1389Gly携带者之间具有显著的差异化治疗反应，因此布新洛尔在具有β1389Arg/Arg受体基因变体的患者中的有利作用可能是由于降低去甲肾上腺素信号和受体竞争性拮抗作用的联合。在此点上，Bristow博士的小组已经基于生理的和分子/生物标志物数据提供证据，表明用全治疗剂量的β-阻断剂治疗的心力衰竭患者显示出持续的心肌肾上腺素能信号的证据(Lowes etal.，2001)，并且因此在具有β1389Arg/Arg高功能性受体变体的患者中去甲肾上腺素的降低可以提供额外的益处。
此外，既是β1389Arg/Arg又是α2c-WT/WT(列8，表9)的患者的全原因死亡率具有40％的降低(p＝0.037)，心血管性死亡率具有47％的降低(p＝0.020)，并且在死亡率+心力衰竭住院治疗上具有39％的降低(p＝0.002)，或者比在整个BEST组中或在同源相反二倍型中具有更大的治疗反应。在此点上，表9中栏11表明在BEST中既是α2cDEL 322-325又是β1389Gly携带者的患者的全原因死亡率具有35％的增加，并且在CV死亡率上具有36％的增加。对于这些不利反应的显然解释是具有低功能性389Gly携带者β1-肾上腺素能受体的晚期心力衰竭患者不能忍受与α2cDEL携带者状态有关的过度抗交感神经反应。相比之下，特征在于对低浓度的儿茶酚胺具有强烈反应的具有高功能性(389Arg/Arg)β1-受体的患者对总体或心血管性死亡率没有这种不利作用(表9，栏9)。尽管相对小量的患者和事件排除了对于在{α2cDEL 322-325和β1389Gly携带者}亚组中任一死亡率终点的统计学显著性，当问题是患者安全性时，这些发现与抗交感神经数据和肾上腺素能受体多态性的分子药理学的一致性支持它们在科学上和临床上的重要性。
在BEST中，β1389Arg/Arg等位基因频率在非黑种人是0.72，但是在黑种人中只有0.57(p＜0.0001)。因此，在BEST中黑种人具有较高频率的易受死亡率增加影响的等位基因(α2cDEL 322-325)，和较低频率的“超反应”β1389Arg/Arg等位基因。在美国黑种人中这两种遗传差异可能在该人口统计学组中有助于朝向不利结果的趋势(BEST Writing Committee，2001)。
BEST的药物基因组学亚组研究基于布新洛尔与特异性肾上腺素能受体多态性的预期药理学相互作用使用前瞻性假设，所述的多态性已经于先前在模型和人系统中被广泛地调查过。因此，相信这些药物基因组学假设比标准的、追溯既往衍生的亚组分析更加有效。
从BEST试验分析的遗传药理学数据被包括于下。同意DNA亚组研究和遗传药理学分析的群体与整组的基线特征没有差异。此外，没有证据表明对于任一多态性的基因剂量作用；杂合体的作用与纯合体的相同或者更大。因此，假设α2cDEL 322-325和β1389Gly等位基因作为显性负性。
表9
在来自在美国心力衰竭患者中实施的意向治疗死亡率试验的唯一可用/公开的数据中比较β-阻断剂与安慰剂的作用
Ev＝事件；NA，不可用
实施例9
附加研究：设计I
因为伦理的原因，不可能在由原发性或继发性扩张性心肌病引起的心力衰竭患者中实施有关β-阻断剂的安慰剂对照试验。这让非劣效性(non-inferiority)或优越性(superiority)研究作为设计选项来抵抗活性β-阻断剂对照，或者作为替代来比较基因变体之间的布新洛尔反应。非劣效性设计选择看起来将由于缺少对于任何其它药剂的受体基因变体数据而被排除(在另外的III期试验中只有MERIT-HF具有药物基因组学亚组研究(Small et al.，2002)，并且因为太小而不能获得任何有意义的结论)。在图27中显示的研究设计I是一种可能的研究方案，其应用到死亡或心力衰竭住院治疗的时间作为主要终点，对基因型靶向和布新洛尔的联合与美托洛尔CR/XL的非靶向疗法进行比较。在设计I中，对于布新洛尔如果随机挑选的患者是β1AR-389Gly携带者，他们将不进入研究，因为基于BEST数据，针对布新洛尔的反应将不能充分保证进一步的评估。这些患者将改为登记进入获取可能限定为生命状态的最低程度信息的组，无论他们以其治疗医生所选择的何种治疗方式进行治疗。设计I的主要比较将在用布新洛尔治疗的β1AR-389Arg/Arg患者和用美托洛尔CR/XL(TOPROL XL)非靶向疗法治疗的所有基因型患者之间进行。对于设计I的总随机样本大小将是900，有662名对象参与了主要结果比较。
实施例10
附加研究：设计II
在附加研究设计的研究设计II(图28)中，对具有症状的和晚期心力衰竭(在前一年中被心力衰竭住院治疗史加强；因此，允许在筛选时的II级患者进入试验)和LVEFs≤0.35(BEST试验群体的一般说明)的患者进行在携带者状态(或者是杂合体或者是纯合体)下是否缺少α2c322-325DEL多态性的初步筛选。这种限制性排除了由布新洛尔引起的大部分抗交感神经不利作用，这主要表现为在BEST(风险比1.09，栏4，表9)和在MOXCON中死亡率增加的趋势，并且预期在纯α2c纯合野生型(WT/WT)肾上腺素能受体背景下在正在治疗的余下基因型中布新洛尔与美托洛尔CR/XL相比将具有稍微的优势。
该试验的主要终点是相对美托洛尔CR/XL(TOPROL-XL)的非劣效性，其中使用在MERIT-HF试验(Hjalmarson et al.2000)中测量的至死亡率加心力衰竭住院治疗终点风险比的时间的95％上置信限(UCL)。尽管MERIT-HF试验包括所有的基因型，但是在3991名入组的患者中只有208名(5.2％)是黑种人。α2c322-325DEL携带者在黑种人对象中占相当多的人数(在BEST试验中，α2c322-325DEL等位基因频率在黑种人中是0.423，在非黑种人中是0.043，而DEL携带者在黑种人中的流行度是66％，在非黑种人中是8％)。因此，MERIT-HF试验可能有接近90％的α2c野生型，或具有能与设计II中所计划研究群体相当的基因型。此外，因为美托洛尔CR/XL没有抗交感神经作用，所以没有理由预期在α2c野生型对DEL携带者之间对美托洛尔CR/XL产生差异性反应。对于布新洛尔：美托洛尔CR/CL的风险比的95％上置信限(“边际非劣效性”)已经根据公式确定(Hasselblad et al.，2001){(UCL布新洛尔：美托洛尔CR/XL)＊(UCL美托洛尔CR/XL：安慰剂)≤1.0}；对于美托洛尔：安慰剂使用MERIT-HF整组的UCL 0.80产生x＊0.80≤1.0，或边际非劣效性x≤1.25。随后值1.25被减小到1.16，从而对非劣效性提供更大的确定性。1.16的靶UCL也是当从0.69/0.80的观察值到1.0风险比放大MERIT-HF风险比/UCL时所获得的值。随后从0.90的预期风险比确定对于双侧α＝≤0.05的几率估计(powerestimate)为85％(通过布新洛尔对β1-389Arg/Arg较好的抑制作用和/或它的心肌β2-受体阻断作用，获得布新洛尔在α2cWT/WT群体中轻微的优势)。
MERIT-HF的美国入组患者提供了布新洛尔超过美托洛尔CR/XL的优势的支持(表9)，当所述患者用美托洛尔CR/XL治疗时他们的死亡率有5％的增加并且死亡率+HF住院治疗有16％的降低。相比之下，在BEST中整组的死亡率有10％的降低(p＝0.10)并且死亡率+HF住院治疗有19％的降低(p＜0.0001)，然而α2c野生型患者的死亡率有30％的降低(p＝0.031)并且死亡率加HF住院治疗有28％的降低(p＝0.003)。风险比相除(0.72/0.84)产生0.86的预期风险比，并且布新洛尔对美托洛尔CR/XL的作用大小(effect size)是1.00-0.86、或0.14。因此不能不合理地预期在α2cWT/WT型美国群体中有利于布新洛尔对美托洛尔CR/XL的10％差异。通过图28中所提议的标准，不管布新洛尔/美托洛尔的风险比，如果UCL＜1.16，那么结论将是在100％为α2c-肾上腺素能受体纯合野生型的晚期HF群体中对于到达死亡率或HF住院治疗的时间的作用而言布新洛尔不劣于美托洛尔CR/XL。
试验设计第二部分的目的在于提供另外的证据证明，作为次要终点，药物基因组学靶向的布新洛尔优于非靶向的美托洛尔CR/XL。在此，用布新洛尔治疗的群体是β1-389Arg/Arg患者，同时他们也是α2c野生型。在BEST中整组(全部对象)的47％是β1-389Arg/Arg，同样50％是α2c野生型患者。正如在表9中所示，β1-389Arg/Arg+α2c野生型的双基因型表现出在死亡率上有40％的降低(p＝0.037)，在死亡率+HF住院治疗上有39％的降低(p＝0.002)，和在HF住院治疗上有41％的降低(p＝0.004)。对于布新洛尔：美托洛尔CR/XL(MERIT美国数据)的死亡率+HF住院治疗的预期风险比将是0.61/0.84、或0.73。在与美托洛尔CR/XL相比较的布新洛尔治疗的β1-389Arg/Arg+α2c野生型双基因型患者中使用27％的作用大小，产生81％的几率计算结果。因此在图28显示的建议试验中，对于主要终点的边际非劣效性是保守地基于MERIT-HF的整组结果，然而对于主要和次要终点的几率计算结果而言在美国群体有关布新洛尔和美托洛尔CR/XL实际数据的基础上包括了布新洛尔在所选基因型中的预期优势。对于这种比较的正确性的支持是在BEST试验的DNA亚组研究中，用安慰剂治疗的β1-389Arg/Arg患者与用安慰剂治疗的β1-389Gly携带者患者具有相等的事件率(发生率)(图6和7)。换句话说，如图7所示，在用布新洛尔治疗的β1-389Arg/Arg患者中较有利的事件率完全是由于治疗作用，与β1-389Arg/Arg患者较佳的自然病史无关。该一级次要终点将给医生提供进一步的证据，表明布新洛尔的基因型靶向疗法比用批准的心力衰竭β-阻断剂的非靶向疗法产生更好的临床结果。
在图28所示的试验设计中，用布新洛尔治疗的群体是同样也为α2c野生型的β1-389Arg/Arg患者。在BEST中整组中的47％是β1-389Arg/Arg，50％是α2c野生型患者。如表9所示，β1-389Arg/Arg+α2c野生型的双基因型表现出在死亡率上40％的降低(p＝0.037)，在死亡率加HF住院治疗上有39％的降低(p＝0.002)，并且在HF住院治疗上有41％的降低(p＝0.004)。对于布新洛尔：美托洛尔CR/XL(MERIT U.S.data)的死亡率加HF住院治疗的预期风险比将是0.61/0.84、或0.73。相对于美托洛尔CR/XL在布新洛尔治疗的β1-389Arg/Arg加α2c野生型的双基因型患者中应用27％的作用大小产生81％的几率计算结果。因此在图28所示的建议试验中，对于主要终点的边际非劣效性是保守地基于MERIT-HF的整组结果，然而对于主要和次要终点的几率计算结果而言在美国群体中有关布新洛尔和美托洛尔CR/XL实际数据的基础上包括了布新洛尔在所选基因型中的预期优势。
实施例11
附加研究：设计III
在边际非劣效性为1.16的情况下，这提供美托洛尔CR/XL超过安慰剂的治疗作用有36％保留，被认为对于证明功效来说是不够充分的，于是提出另一种设计。1.14的UCL将以90％的几率保留美托洛尔CR/XL超过安慰剂的治疗作用的50％，这被认为是可以接受的。因此，图28所示的设计已经被调整从而以90％几率实现该目标(图29)。已经通过将样本大小从1300增加到1600、并且在较小程度上通过使布新洛尔和美托洛尔CR/XL之间的随机化从2∶1转变为1∶1的方式实现了需要降低UCL的统计学几率增加。同样，在对因素反馈(agency feedback)的反应中，我们已经加入了另一个次要终点，在β1-389Arg/Arg患者中布新洛尔对美托洛尔CR/XL。基于25％的预期作用大小，对于该次要终点的几率估计是71％，然而基于27％的预期作用大小，对另一个次要终点的几率估计是88％。因为在β1-389Arg/Arg群体中关于美托洛尔CR/XL的数据有限，所以25％的前者作用大小是很难估计的；仅有的可用数据显示与安慰剂相比美托洛尔CR/XL的治疗作用有很小或没有增强(White et al.，2003)。对于另一个次要终点的27％的作用大小是基于上述讨论的美国MERIT-HF数据。
应认为前述说明书只是对本发明原理的例证性说明。另外，因为对于本领域的技术人员将很容易对本发明作出许多的修饰和变化，因此不能要求将本发明完全地限制于上述的解释和过程。因此，所有合适的修饰和等同物可以被要求落在所附权利要求限定的本发明范围内。当在本说明书和随后的权利要求中使用词语“包括”、“包含”、“含有”时，其意思是在于说明所陈述特征、整体(integers)、组分、或步骤的存在，但是并不排除存在或添加一种或多种其他特征、整体、组分、步骤、或其集合。
以下内容对应于母案申请中的权利要求书，现作为说明书的一部分并入此处：
1.一种评估布新洛尔治疗患者的方法，其包括：
获得关于患者肾上腺素能受体基因中至少一种多态性的序列信息，其中所述信息是对布新洛尔在患者中疗效的预测。
2.根据项1的方法，其中肾上腺素能受体基因是β1AR或α2cAR。
3.根据项2的方法，其中肾上腺素能受体基因是β1AR。
4.根据项2的方法，其中肾上腺素能受体基因是α2cAR。
5.根据项2的方法，其中所述序列信息包含或者(i)在患者的一个或两个β1AR等位基因中编码序列中1165位核苷酸处的序列或者(ii)在患者β1AR蛋白质的389位氨基酸，其中所述个体正考虑用布新洛尔治疗。
6.根据项5的方法，其中在一个或两个β1AR等位基因的编码序列中1165位核苷酸处的患者基因型是已知的。
7.根据项5的方法，其中在两个β1AR等位基因的编码序列中的患者基因型是已知的。
8.根据项5的方法，其中在患者的β1AR蛋白质中389位氨基酸是已知的。
9.根据项5的方法，还包括从患者获得生物样本。
10.根据项9的方法，其中所述生物样本是血液样本。
11.根据项5的方法，还包括获得有关(i)或(ii)的患者病史。
12.根据项5的方法，其中了解(i)或(ii)涉及确定(i)或(ii)。
13.根据项12的方法，其中在患者的一个或两个β1AR等位基因的编码序列中1165位核苷酸处的序列被确定。
14.根据项13的方法，其中确定序列包括链终止测序、限制性消化、等位基因特异性聚合酶反应、单链构象多态性分析、遗传比特分析、温度梯度凝胶电泳、或连接酶链式反应。
15.根据项13的方法，其中患者被确定在一个或两个β1AR等位基因的编码序列中1165位处具有胞嘧啶。
16.根据项15的方法，其中患者被确定在一个β1AR等位基因的编码序列中1165位处具有胞嘧啶并且在另一个β1AR等位基因的编码序列中1165位处具有鸟嘌呤。
17.根据项12的方法，其中患者β1AR蛋白质的389位氨基酸被确定。
18.根据项17的方法，其中确定氨基酸包括应用抗体、高压液相色谱、或质谱分析。
19.根据项17的方法，其中患者被确定在β1AR蛋白质中389位处具有精氨酸。
20.根据项17的方法，其中患者被确定在β1AR蛋白质中389位处具有甘氨酸。
21.根据项17的方法，其中患者被确定在一些β1AR蛋白质中389位处具有精氨酸和在另一些β1AR蛋白质中为甘氨酸。
22.根据项12的方法，还包括准备包含确定(i)或(ii)的结果的报告。
23.根据项5的方法，其中患者具有医学病症的症状或已经被诊断患有医学病症，所述医学病症包括心力衰竭、扩张型心肌病、缺血性心脏病、嗜铬细胞瘤、偏头痛、心律失常、高血压或焦虑症。
24.根据项23的方法，其中患者具有缺血性心脏病的症状或已经被诊断为缺血性心脏病。
25.根据项24的方法，其中缺血性心脏病是心绞痛和/或心肌梗塞。
26.根据项23的方法，其中患者具有心力衰竭的症状或已被诊断为心力衰竭。
27.根据项26的方法，其中心力衰竭是晚期心力衰竭。
28.根据项27的方法，其中晚期心力衰竭是NYHA III或IV级心力衰竭。
29.根据项5的方法，还包括在了解(i)或(ii)之后开处方或施用布新洛尔给患者，其中患者具有Arg389/Arg389基因型。
30.根据项5的方法，还包括在了解(i)或(ii)之后将不是布新洛尔的β-阻断剂开处方或施用给患者，其中患者不具有Arg389/Arg389基因型。
31.根据项5的方法，还包括了解在(iii)患者的一个或两个α2cAR等位基因的编码序列中964-975位处核苷酸序列中或(iv)患者的α2cAR蛋白质的322-325位氨基酸序列中是否有缺失。
32.根据项31的方法，还包括在了解(iii)或(iv)之后将布新洛尔开处方或施用给患者，其中患者是α2cAR 322-325缺失的纯合野生型。
33.根据项31的方法，还包括在了解(iii)或(iv)之后将不是布新洛尔的β-阻断剂开处方或施用给患者，其中患者是α2cAR 322-325缺失的携带者。
34.根据项3的方法，其中所述序列信息包括是否(i)在患者的一个或两个α2cAR等位基因中964-975位核苷酸序列已经缺失或(ii)在患者的α2cAR蛋白质中322-325位氨基酸序列已经缺失。
35.根据项34的方法，其中已知患者在其一个或两个α2cAR等位基因中964-975位核苷酸序列具有缺失。
36.根据项34的方法，其中已知患者在两个α2cAR等位基因中具有缺失。
37.根据项34的方法，其中已知患者在α2cAR蛋白质的322-325位处具有缺失。
38.根据项34的方法，还包括从患者获得生物样本。
39.根据项38的方法，其中所述生物样本是血液样本。
40.根据项34的方法，还包括获取有关(i)或(ii)的患者病史。
41.根据项34的方法，其中了解(i)或(ii)涉及确定(i)或(ii)。
42.根据项41的方法，其中在患者的一个或两个α2cAR等位基因的编码序列中所述核苷酸序列经确定被缺失。
43.根据项42的方法，其中确定序列包括链终止测序、限制性消化、等位基因特异性聚合酶反应、单链构象多态性分析、遗传比特分析、温度梯度凝胶电泳、或连接酶链式反应。
44.根据项42的方法，其中患者被确定在一个或两个α2cAR等位基因的编码序列中具有964-975位核苷酸的缺失。
45.根据项44的方法，其中患者被确定在一个α2cAR等位基因的编码序列中具有964-975核苷酸位的缺失和在另一个α2cAR等位基因的编码序列中不具有964-975核苷酸位的缺失。
46.根据项41的方法，其中在α2cAR蛋白质中322-325位氨基酸的缺失被确定。
47.根据项46的方法，其中确定氨基酸包括应用抗体、高压液相色谱、或质谱分析。
48.根据项46的方法，其中患者被确定在α2cAR蛋白质中具有322-325位氨基酸的缺失。
49.根据项46的方法，其中患者被确定在任何α2cAR蛋白质中不具有322-325位氨基酸的缺失。
50.根据项46的方法，其中患者被确定既有具有322-325位氨基酸缺失的α2cAR蛋白质又有不具有322-325位氨基酸缺失的α2cAR蛋白质。
51.根据项41的方法，还包括准备包含确定(i)或(ii)的结果的报告。
52.根据项34的方法，其中患者具有医学病症的症状或已经被诊断患有医学病症，所述医学病症包括心力衰竭、扩张型心肌病、缺血性心脏病、嗜铬细胞瘤、偏头痛、心律失常、高血压或焦虑症。
53.根据项52的方法，其中患者具有缺血性心脏病的症状或已经被诊断为缺血性心脏病。
54.根据项53的方法，其中缺血性心脏病是心绞痛和/或心肌梗塞。
55.根据项52的方法，其中患者具有心力衰竭的症状或已被诊断为心力衰竭。
56.根据项55的方法，其中所述心力衰竭是晚期心力衰竭。
57.根据项56的方法，其中晚期心力衰竭是NYHA III或IV级心力衰竭。
58.根据项34的方法，还包括在了解(i)或(ii)之后开处方或施用布新洛尔给患者，其中患者是Del322-325多态性的纯合野生型。
59.根据项34的方法，还包括在了解(i)或(ii)之后开处方或施用不是布新洛尔的β-阻断剂给患者，其中患者是Del322-325携带者。
60.根据项34的方法，还包括了解或者(i)在患者的一个或两个β1AR等位基因的编码序列中1165位核苷酸处的序列或者(ii)患者的β1AR蛋白质的389位氨基酸，其中所述个体正考虑用布新洛尔治疗。
61.根据项60的方法，还包括在了解(iii)或(iv)之后开处方或施用布新洛尔给患者，其中患者在其β1AR蛋白质中389位不具有甘氨酸。
62.根据项60的方法，还包括在了解(iii)或(iv)之后开处方或施用不是布新洛尔的β-阻断剂给患者，其中患者不是Arg389多态性的纯合体。
63.一种治疗具有心脏病况的患者的方法，其包括将有效量的布新洛尔施用或开处方给患者，其中患者不具有可检测水平的在389位为甘氨酸的β1AR蛋白质。
64.一种具有心脏病况的患者的方法，其包括将有效量的布新洛尔施用或开处方给患者，其中患者对于在两个β1AR等位基因核苷酸编码序列中的1165位胞嘧啶是纯合体。
65.一种评估心力衰竭患者是否将对布新洛尔积极反应的方法，其包括：
a)获取指示i)患者的一个或两个β1AR等位基因的编码序列中1165位编码位置上多态性的存在或ii)在β1AR蛋白质的389位氨基酸多态性的存在的信息；和
b)开处方或施用布新洛尔。
66.一种用布新洛尔治疗患者的方法，其包括：
a)获取指示i)患者的一个或两个β1AR等位基因的编码序列中1165位编码位置上多态性的存在或ii)在β1AR蛋白质的389位氨基酸多态性的存在的信息；和
b)或者给所述个体开布新洛尔治疗处方，其中患者的基因型是β1AR蛋白质的Arg389纯合体；或者不给所述个体开布新洛尔处方，其中患者的基因型不是β1AR蛋白质的Arg389纯合体。
67.一种治疗具有心脏病况的患者的方法，其包括将有效量的布新洛尔施用或开处方给患者，其中患者没有可检测水平的具有322-325位缺失的α2cAR蛋白质。
68.一种治疗具有心脏病况的患者的方法，其包括将有效量的不是布新洛尔的β-阻断剂施用或开处方给患者，其中患者在α2cAR中是Del322-325携带者。
69.一种评估心力衰竭患者是否将对布新洛尔积极反应的方法，其包括：
a)获取指示i)在一个或两个α2cAR等位基因中对应964-975位残基的缺失或ii)在α2cAR蛋白质中对应322-325位残基的缺失的信息；和
b)如果所述患者是Del322-325多态性的携带者，那么就不开处方或施用布新洛尔。
70.一种用布新洛尔治疗患者的方法，其包括：
a)获取指示i)在一个或两个α2cAR等位基因中964-975位核酸的缺失或ii)在α2cAR蛋白质中对应322-325位残基的缺失的信息；和
b)或者给所述个体开布新洛尔治疗处方，其中患者基因型对于α2cAR蛋白质Del322-325是纯合野生型；或者不给所述个体开布新洛尔处方，其中患者基因型对于α2cAR蛋白质是Del322-325携带者。
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Claims (11)

1.布新洛尔在制备用于治疗患者中之心律失常的药物中的用途，其中患者不具有可检测水平的在389位为甘氨酸的β1AR蛋白质。
2.根据权利要求1的用途，其中患者在β1AR蛋白质中389位处具有精氨酸。
3.根据权利要求1的用途，其中患者在其β1AR蛋白质中389位不具有甘氨酸。
4.布新洛尔在制备用于治疗患者中之心律失常的药物中的用途，其中患者对于在两个β1AR等位基因核苷酸编码序列中的1165位胞嘧啶是纯合体。
5.布新洛尔在制备用于治疗患者中之心律失常的药物中的用途，其中所述患者的基因型是β1AR蛋白质的Arg389纯和体。
6.不是布新洛尔的β-阻断剂在制备用于治疗患者中之心律失常的药物中的用途，其中患者不具有Arg389/Arg389基因型。
7.根据权利要求6的用途，其中患者不是Arg389多态性的纯合体。
8.布新洛尔在制备用于治疗患者中之心律失常的药物中的用途，其中患者没有可检测水平的具有322-325位缺失的α2cAR蛋白质。
9.根据权利要求8的用途，其中患者在任何α2cAR蛋白质中不具有322-325位氨基酸的缺失。
10.布新洛尔在制备用于治疗患者中之心律失常的药物中的用途，其中所述患者的基因型对于α2cAR蛋白质Del322-325是纯合野生型。
11.不是布新洛尔的β-阻断剂在制备用于治疗患者中之心律失常的药物中的用途，其中患者在α2cAR中是Del322-325携带者。
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