JPH06121686A - アドレナリンレセプターをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプター
を構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩
基配列を含むＤＮＡ、該ＤＮＡの遺伝情報発現形質転換
細胞、該発現細胞から得られるポリペプチド、該発現細
胞の製造法および該細胞を用いて行う薬物スクリーニン
グ方法。 【効果】 ヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプター
の遺伝子を提供し得、さらにこの遺伝子を発現せしめる
ことによりヒトでの薬理学的重要性の解明を可能ならし
めたものであり、またこのレセプターに作用刷る薬物ス
クリーニングのための受容体結合実験系をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト由来アドレナリン
α２ＣＩＩレセプターの遺伝情報を有するＤＮＡ、該Ｄ
ＮＡの遺伝情報発現形質転換細胞、該発現細胞から得ら
れるポリペプチド、該発現細胞の製造法および該細胞を
用いて行う薬物スクリーニング方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】アドレナリンレセプターは大きく２つの
サブタイプに分類されており（α、β）中枢神経系や自
律神経系および心臓、肝臓、腎臓などの重要な臓器に分
布し、精神活動、血圧調整、消化管運動、脂質や糖の代
謝などにおいて重要な働きをしていると考えられてい
る。アドレナリンαレセプターはさらに、α１、α２に
アドレナリンα２レセプターはさらにα２Ａ、α２Ｂ、
α２Ｃといったサブタイプに細分化されている（ＴｉＰ
Ｓ，１２, ６２−６７（１９９１）、ＦＡＳＥＢＪ．，
６、８３２−８３９（１９９２））。

【０００３】これらアドレナリンレセプターはそのレセ
プターに特異的に作用する薬物スクリーニングに利用さ
れている。特異的に作用する薬物をスクリーニングする
には、レセプターを多く有する組織を動物から摘出、膜
画分を調製し、ラジオアイソトープでラベルされた特異
リガンドを用いたレセプター結合阻害実験を行うのが通
常の方法である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】アドレナリンα２レセ
プターの関与する生理作用は上述のように多岐にわた
り、アドレナリンα２レセプターを介して作用する薬物
としてはクロニジン、メチルドパなどが存在する（Ｔｉ
ＰＳ，１３、２７７−２８２（１９９２））。しかし、
従来の動物組織由来膜画分を用いた薬物のスクリーニン
グ方法には問題点が存在した。

【０００５】まず前述のごとく、アドレナリンレセプタ
ーにはサブタイプが非常に多く存在するため、１組織の
膜画分を調製しても何種類ものレセプターが混在してお
り、被検薬物がどのレセプターサブタイプに対して親和
性を有しているのか解析が困難であった。また、ヒトの
各組織由来の膜画分を自由に使用できない事も問題であ
った。動物組織ではなく、遺伝子工学的にヒトの各レセ
プターの遺伝子を発現させた培養細胞あるいはその膜画
分を用いることでこの問題点を解決できる。

【０００６】これまで、ヒト由来の３種のアドレナリン
α２レセプター遺伝子、α２Ａ（ＳＣＩＥＮＣＥ，２３
８、６５０−６５６（１９８７））、α２Ｂ（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７、５０
９４−５０９８（１９９０））、α２Ｃ（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５、６３０１−
６３０５（１９８８）））がクローニングされている。

【０００７】しかし、これらの遺伝子のうちＰＣＲ法
（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ
法（Ｓｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９
８５））によりクローニングできたのはヒト由来アドレ
ナリンα２Ｂのみであった。ＰＣＲ法は既知遺伝子を取
得する目的には非常に有効な方法であるが、ヒト由来ア
ドレナリンα２Ｃレセプター遺伝子のＰＣＲ法による遺
伝子増幅は、種々の条件検討を行ったにもかかわらず成
功しなかった。

【０００８】これは、ヒト由来アドレナリンα２Ｃレセ
プター遺伝子のＧＣ含量が７１％と高率であったためで
あると推察される。また、ヒト由来アドレナリンα２Ｃ
レセプターで報告されているのは１種類のみで他のタイ
プのものは報告されていなかった。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、アドレナ
リン関連レセプターに対する親和性を指標とした効率的
な薬物スクリーニング系および評価系の開発のために、
既知ヒト由来アドレナリンα２レセプター遺伝子のクロ
ーニングと発現を行っていた。そのため、実施例で述べ
るようにショットガン法によりゲノムライブラリーを作
成し、ヒト由来アドレナリンα２Ｃレセプター遺伝子を
有するコロニーをコロニーハイブリダイゼーションによ
り選別しようとした。

【００１０】その結果、既知ヒト由来アドレナリンα２
Ｃレセプターには存在しない制限酵素切断部位（Ｈｉｎ
ｆＩサイト）を有する新しいタイプのヒト由来アドレナ
リンα２Ｃレセプター遺伝子のクローニングに成功し、
かつその一次構造を解析することができた。これより以
下、これまでに報告さたヒト由来アドレナリンα２Ｃレ
セプターをヒト由来アドレナリンα２ＣＩレセプター、
本発明者らが新たに発見したヒト由来アドレナリンα２
Ｃレセプターをヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプ
ターと命名することにした。さらに、この遺伝子を動物
細胞に移入し、得られた発現細胞を用いることにより、
優れたヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプター結合
実験系を作成し、この薬物α２ＣＩＩレセプター遺伝子
発現系を利用した薬物スクリーニングでは従来のレセプ
ター遺伝子発現系ではスクリーニングできなかった新し
い化合物を見いだせるスクリーニング系を確立した。

【００１１】即ち、本発明は、上記の知見に基づいてな
されたものであり、ヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレ
セプターを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を含むＤＮＡ、該ＤＮＡを保持する形質
転換細胞、該ＤＮＡの遺伝情報を発現させることにより
得られたポリペプチド、該ＤＮＡの遺伝情報を発現させ
たポリペプチドを含有した発現細胞の製造法、および発
現細胞そのものあるいは該細胞から調製した膜画分を用
いて行うレセプター結合性を指標とした薬物スクリーニ
ング法を提供するものである。

【００１２】本発明のＤＮＡは、例えば遺伝子組換え技
術を利用し、次のようにして得ることができる。ヒト染
色体ＤＮＡを、ヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプ
ター遺伝子を切断しないような制限酵素、例えばＥｃｏ
ＲＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩにより切断し、電気泳動及
び、サザンハイブリダイゼーションによりヒト由来アド
レナリンα２ＣＩＩレセプター遺伝子を含むＤＮＡ断片
の大きさを確認した後、その大きさのＤＮＡ断片を回収
し、適当なベクターに組み込み、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を形質転換させる。

【００１３】形質転換菌からヒト由来アドレナリンα２
ＣＩＩレセプター遺伝子を有するクローンを選別するに
は、ヒト由来アドレナリンα２Ｂレセプター遺伝子のう
ちヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプター遺伝子と
相同性を持つ部分をプローブとしたコロニーハイブリダ
イゼーション法を用いることができる。得られたポジテ
ィブクローンからヒト由来の遺伝子部分の塩基配列を調
べ、得られた遺伝子がヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩ
レセプター遺伝子であることを確認する。

【００１４】ハイブリダイゼーション用のプローブとな
るヒト由来アドレナリンα２Ｂレセプター遺伝子を得る
には、染色体ＤＮＡを鋳型としてヒト由来アドレナリン
α２Ｂレセプター遺伝子の両端に対応するプライマーを
用いたＰＣＲ法により遺伝子増幅を行い、クローニング
する。このようにして得られた本発明のヒト由来アドレ
ナリンα２ＣＩＩレセプター遺伝子を含む組換えプラス
ミドを保有するエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１ｐＵＣ１１９α２ＣＩＩを通
商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託（微工
研菌寄第１３１８９：ＦＥＲＭＰ−１３１８９）した。

【００１５】このようにして得たクローンから組換えプ
ラスミドを分離し、次いでこのプラスミドからヒト由来
アドレナリンα２ＣＩＩレセプター遺伝子をコードする
本発明のＤＮＡを切り出し、取得することができる。図
２にヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプター遺伝子
の塩基配列を、図１にヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩ
レセプターのアミノ酸配列を示す。

【００１６】図１においてＸ₁ は水素原子、Ｘ₂ −Ａｌ
ａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙまたはそれらのアセチル体を意
味し、Ｘ₂ は水素原子またはＭｅｔを意味する。図２に
おいてＸ₃ は水素原子またはＸ₄ ＧＣＧＴＣＣＣＣＧＧ
ＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣ
ＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＣを意味し、Ｘ₄ は水素原子
またはＡＴＧを意味する（但し、ＤＮＡの５’末端はリ
ン酸基があるとする）。

【００１７】また、本発明の図１に示されるポリペプチ
ドは次のようにして得ることができる。前述のようにし
て得られた図２のヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセ
プター遺伝子を含むＤＮＡ断片を動物細胞発現用ベクタ
ーに組み込み、このプラスミドＤＮＡを動物細胞に移入
する。この細胞を培養収集、破砕、膜画分を取り、界面
活性剤で溶解後遠心分離と各種のクロマト処理の組合せ
により単離精製できる。

【００１８】さらに、本発明の薬物スクリーニング法は
次のようにして行うことができる。すなわち、前述のよ
うに、ヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプター遺伝
子を組み込んだ発現プラスミドを動物細胞に移入した発
現細胞を収集し、また適宣細胞を破砕して膜画分を取る
ことができる。この細胞そのまま、または細胞膜画分を
レセプター標品とし、標識リガンド、例えば ³Ｈ−ラウ
オルシンと被験薬物との結合阻害実験を行い、標識リガ
ンドの細胞あるいは細胞膜画分への結合量を定量する事
により実施できる。

【００１９】鋳型となるＤＮＡの由来組織はヒトの胎
盤、肝臓、腎臓、心臓などが上げられるが、胎盤由来の
染色体ＤＮＡは市販されているため、これを使用するの
が簡便である。また、市販されている各種ｃＤＮＡライ
ブラリーから抽出したＤＮＡを用いても構わない。プラ
イマーの合成は、市販ＤＮＡ合成機を用いて固相法によ
り合成すればよい。ＰＣＲ法による遺伝子増幅は、種々
の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼを用いて市販サーマルサイクラーで行えばよ
い。

【００２０】ベクターとしては宿主微生物細胞内で自立
的に増殖できるプラスミドまたはファージから構築され
たものが適している。ファージ由来のベクターとして
は、エシェリヒア・コリを宿主とする場合、λｇｔ、Ｅ
ＭＢＬなどが使用できる。また、プラスミド由来のもの
としては、エシェリヒア・コリを宿主とする場合、プラ
スミドｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１８、
ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９などが使用で
きる。

【００２１】動物細胞用の発現ベクターとしてはｐＳＶ
Ｌ、ｐＭＡＭｎｅｏなどのベクターが使用でき、さらに
適宜プロモーター、例えばＳＶ４０のプロモーターを組
み換えたプラスミドｐＭＣ１ＮｅｏＰｏｌｙＡを用いて
もよい。ＤＮＡ断片とベクター断片との結合はよく知ら
れたＤＮＡリガーゼを用いる方法に従えばよい。

【００２２】また、ＤＮＡの塩基配列はダイデオキシ法
で解読し決定することができる。宿主微生物としては、
組換えＤＮＡが安定かつ自立的に増殖できるものならば
よい。例えば、エシェリヒア・コリＤＨ１、ＪＭ１０
９、ＨＢ１０１などが使用できる。宿主微生物に組換え
ＤＮＡを移入する方法としては、例えばエシェリヒア・
コリの場合、塩化カルシウム法が適している。

【００２３】宿主となる動物細胞としてはＣｏｓ−１、
Ｃｏｓ−７、ＨＥＫ−２９３などが使用でき、構成型発
現細胞としてＣｏｓ−１、Ｃｏｓ−７、Ｌ細胞などが使
用できる。動物細胞の培養は適宜変更し得るが、通常Ｃ
ｏｓ細胞の場合は、培地としては１０％ＦＣＳ添加ＤＭ
Ｅ培地を使用し、培養は３７℃で５％ＣＯ₂濃度で行う
のがよい。

【００２４】動物細胞への遺伝子移入はリン酸カルシウ
ム法またはＤＥＡＥ−デキストラン法などを用い、一過
性発現の場合の細胞回収までの培養時間は移入後６０〜
７２時間が適している。また構成型発現の場合は遺伝子
移入後、約２週間ないし１ケ月間選択培地で培養する。
このときの選択培地としては、例えば移入発現プラスミ
ドがネオマイシン耐性遺伝子を有している場合は選択薬
剤としてゲネティシンを２００−４００μｇ／ｍｌとな
るように生育可能な培地に加えておけばよい。選択培養
で生育してきた細胞を、より高濃度の選択薬剤を含んだ
培地で培養することにより遺伝子発現量の増加した構成
型発現細胞を得ることができる。このようにして得られ
た構成型発現細胞は適当な保存培地、例えば１０−５０
％ジメチルスルフォキサイド、１０％ＦＣＳを含んだＤ
ＭＥ培地を用いることにより、−８０℃で保存でき、必
要に応じ培養を再開することができる。培養日数は通常
３−９日が適している。

【００２５】培養終了後トリプシン処理などの方法によ
り細胞を剥し、低速遠心（１０００ｒｐｍ、２分）によ
り細胞を洗浄回収する。回収後直ちに、あるいは−８０
℃で凍結保存した後、通常のレセプター結合実験により
発現を確認し、その細胞そのものあるいは細胞をホモジ
ナイズ後遠心操作により得られる膜画分を用いて薬物ス
クリーニングすることができる。すなわち、このように
して得られた細胞または細胞膜画分を用いて薬物スクリ
ーニングを行うにあたっては、スクリーニング対象であ
る薬物、例えばヨヒンビンやプラゾシンを一定量含有す
る被験液を該細胞またはその膜画分の一定量と一定温
度、例えば２５℃で、一定時間、例えば６０分間、標識
リガンド、例えば ³Ｈ−ラウオルシンの存在下で反応せ
しめて標識リガンドの結合阻害率を求めればよい。

【００２６】本明細書に記載のアミノ酸、ペプチド、核
酸、核酸関連物質、その他に関する略号は、それらの当
該分野における慣用略号に基づくもので、それらの例を
以下に列記する。また全てのアミノ酸はＬ体を示すもの
とする。 ＤＮＡ：デオキシリボ核酸 Ａ：アデニン Ｔ：チミン Ｇ：グアニン Ｃ：シトシン ＡＴＰ：アデノシン３リン酸 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン３リン酸 ｄＣＴＰ：デオキシシチジン３リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン３リン酸 ｄＴＴＰ：デオキシチミジン３リン酸 Ａｌａ：アラニン Ａｒｇ：アルギニン Ａｓｎ：アスパラギン Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｃｙｓ：システイン Ｇｌｎ：グルタミン Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ｇｌｙ：グリシン Ｈｉｓ：ヒスチジン Ｉｌｅ：イソロイシン Ｌｅｕ：ロイシン Ｌｙｓ：リジン Ｍｅｔ：メチオニン Ｐｈｅ：フェニルアラニン Ｐｒｏ：プロリン Ｓｅｒ：セリン Ｔｈｒ：スレオニン Ｔｒｐ：トリプトファン Ｔｙｒ：チロシン Ｖａｌ：バリン

【００２７】

【実施例】以下に本発明に関する具体的な実施例を挙げ
るが、本発明はこれらによって何ら限定されるものでは
ない。

【００２８】

【実施例１】 １）ＰＣＲ法によるヒト由来アドレナリンα２Ｂレセプ
ター遺伝子の増幅 ヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプター遺伝子のコ
ロニーハイブリダイゼーションにおけるプローブを得る
ため、文献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８７、５０９４−５０９８（１９９０））に基
づきヒト由来アドレナリンα２Ｂレセプター遺伝子の両
端に対する配列番号２および配列番号３に示すプライマ
ーをＤＮＡ合成機（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ Ｂｉｏｓｅａｒ
ｃｈ社製、モデル８７５０）を用いて合成した。ヒト胎
盤由来染色体ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）および、
ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（宝
酒造製）を使用して遺伝子増幅を行った。

【００２９】２種類の２０μＭ合成プライマー１０μ
ｌ、鋳型ヒト染色体ＤＮＡ１０μｌ（０．１μｇ）、ｄ
ＡＴＰ溶液２μｌ、ｄＣＴＰ溶液２μｌ、ｄＧＴＰ溶液
２μｌ、ｄＴＴＰ溶液２μｌ、１０倍濃度の添付の反応
緩衝液１０μｌ、水５１μｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼ１μｌを混合し、サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社製）を用い、９５℃１分、５
７℃２分、７３℃４分の反応を３５回繰り返した。反応
終了後混合液をクロロホルム／フェノール処理（当量の
クロロホルム／フェノール溶液（ＴＥ液（１ｍＭのＥＤ
ＴＡ含有１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０））飽
和フェノールとクロロホルムの１：１の溶液）を混合
し、１５，０００ｒｐｍ３分間の遠心後、水相を回収し
た）によりＤＮＡを精製し、エタノール沈澱（１／１０
量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）と２倍量のエタ
ノール（−２０℃）を加え混合した後、１５，０００ｒ
ｐｍ３分間の遠心により沈澱物を回収した）によりＤＮ
Ａを回収し、０．７％アガロース電気泳動を行った。

【００３０】その結果、１．４ｋｂのバンドが認められ
た。このバンドを切取り１．４ｋｂＤＮＡ断片を電気抽
出し、クロロホルム／フェノール処理により精製した
後、このＤＮＡ１μｇ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
（１０Ｕ）（宝酒造製）とＡＴＰ（最終濃度５ｍＭ）を
３７℃、１時間反応させ５’末端をリン酸化した。プラ
スミドｐＵＣ１１８（０．５μｇ）（宝酒造製）をＨｉ
ｎｃＩＩ（１０Ｕ）（宝酒造製）と３７℃、１時間反応
させ、クロロホルム／フェノール処理、エタノール沈澱
を行い、エシェリヒア・コリ由来アルカリフォスファタ
ーゼ（ＢＡＰ）処理（ＤＮＡ（約１μｇ）とＢＡＰ
（１．７５Ｕ）（宝酒造製）を５０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０）中で６５℃、１時間反応させた）によ
り脱リン酸化した後、この部位に前述の１．４ｋｂＤＮ
Ａ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造製）を用
いて結合し（ＤＮＡとＤＮＡライゲーションキット中の
溶液Ａ、溶液Ｂを体積比で１：８：１の割合で混合し、
１６℃で３０分間反応させた）、０．１Ｍ塩化カルシウ
ムにより処理したエシェリヒア・コリＤＨ１を形質転換
した。

【００３１】これらの実験で得られた組換えプラスミド
をさらにエシェリヒア・コリＭＶ１１８４（宝酒造製）
に移入し、形質転換したＭＶ１１８４をＹＴ培地（×
２）で３７℃で培養し、Ｍ１３ヘルパーファージ（ＫＯ
７）をＭＶ１１８４当り１０〜２０ファージが感染する
ように加え、さらに一晩培養した。培地中に放出された
ファージを集め、クロロホルム／フェノール処理、エタ
ノール沈澱により塩基配列決定用１本鎖ＤＮＡを調製
後、ダイデオキシ法とＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ社
製、モデル３７０Ａ）を使い塩基配列を調べた。その結
果、得られたＤＮＡ断片はヒト由来アドレナリンα２Ｂ
レセプター遺伝子であることを確認した。

【００３２】２） ヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレ
セプター遺伝子のクローニング ヒト由来アドレナリンα２Ｂレセプター遺伝子を挿入し
たｐＵＣ１１８（１μｇ）をＨｉｎｃＩＩ（２０Ｕ）と
３７℃、１時間反応させ、アガロース電気泳動を行い
０．６ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、電気抽出し、フェ
ノール処理、エタノール沈澱により０．６ｋｂＤＮＡ
（５０ｎｇ）を回収した。このＤＮＡ断片をランダムプ
ライマーラベリングキット（宝酒造製）を用いてラベル
化（ＤＮＡ（３０ｎｇ）、ランダムプライマー２μｌと
水を加え全体を５μｌとし、熱変性（９５℃、５分間の
後０℃、５分間）を行い、これに水９μｌ、１０倍濃度
の添付の反応緩衝液２．５μｌ、ｄＡＴＰとｄＧＴＰと
ｄＴＴＰの混合液２．５μｌ、ｋｌｅｎｏｗフラグメン
ト１μｌ、［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ（５μｌ）（ＮＥＮ社
製）を加え３７℃、３時間反応させた）し、エタノール
沈澱によりＤＮＡを回収し、１００μｌのＴＥ液に溶解
しプローブとした。プローブは使用する直前に熱変性を
行った。

【００３３】ヒト染色体ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社
製）１００μｇをＰｓｔＩ（４００Ｕ）（宝酒造製）、
ＨｉｎｆＩ（４００Ｕ）（宝酒造製）と３７℃、２時間
反応させ、クロロホルム／フェノール処理、エタノール
沈澱を行った後、ＤＮＡブランティングキット（宝酒造
製）を用いて平滑末端化（ＤＮＡ８μｌ、１０倍濃度の
添付の反応緩衝液１μｌ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ１
μｌを混合し、３７℃、５分間反応させた）し、クロロ
ホルム／フェノール処理、エタノール沈澱を行い、Ｎｃ
ｏＩ（４００Ｕ）（宝酒造製）と３７℃、２時間反応さ
せた後、アガロース電気泳動により約１．４ｋｂ断片を
切り出し、ＤＮＡを電気抽出し、クロロホルム／フェノ
ール処理により精製し、エタノール沈澱を行い、沈澱を
２０μｌのＴＥ液に溶解した。

【００３４】これとは別に、ｐＵＣ１１９（宝酒造製）
のＸｂａＩサイトにＮｃｏＩリンカー（宝酒造製）を組
み込んだベクター１．５μｇをＮｃｏＩ（１００Ｕ）、
ＳｍａＩ（１００Ｕ）（宝酒造製）と３７℃、２時間反
応させ、クロロホルム／フェノール処理、エタノール沈
澱を行った後、ＢＡＰ処理を行い、クロロホルム／フェ
ノール処理、エタノール沈澱を行い、沈澱を２０μｌの
ＴＥ液に溶解し、脱リン酸化したベクター断片を調製し
た。この部位に、前述の１．４ｋｂヒト染色体断片をＤ
ＮＡライゲーションキットを用いて結合し、塩化カルシ
ウムで処理したエシェリヒア・コリＤＨ１を形質転換し
た。前述のプローブを用いてコロニーハイブリダイゼー
ション法によりポジティブクローンを検索した。

【００３５】約２０万個の形質転換体を調べた結果、１
個のハイブリダイズするクローンを得、このエシェリヒ
ア・コリの保有するプラスミドのヒト由来ＤＮＡ部分の
塩基配列を前述の方法で調べ、ヒト由来アドレナリンα
２ＣＩＩレセプター遺伝子を有することを確認した。こ
の株をエシェリヒア・コリＤＨ１ｐＵＣ１１９α２ＣＩ
Ｉ（ＦＥＲＭＰ−１３１８９）と、また保有するプラス
ミドをｐＵＣ１１９α２ＣＩＩと命名し、寄託した。

【００３６】上記のようにして得られたヒト由来アドレ
ナリンα２ＣＩＩレセプター遺伝子を分析した結果、ヒ
ト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプター遺伝子はヒト
由来アドレナリンα２ＣＩレセプター遺伝子とヌクレオ
チドレベルで９８％の相同性があった。ヒト由来アドレ
ナリンα２ＣＩＩレセプター遺伝子には遺伝子中に、ヒ
ト由来アドレナリンα２ＣＩレセプター遺伝子には存在
しない制限酵素切断部位（ＨｉｎｆＩサイト）が存在し
ていた。これは今回行った実験では、染色体ＤＮＡが制
限酵素により部分的にしか切断されなかったため完全な
ヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプター遺伝子がク
ローニングできたと考えられる。

【００３７】また、本発明のヒト由来アドレナリンα２
ＣＩＩレセプター遺伝子は、ヒト由来アドレナリンα２
ＣＩレセプターより３個のアミノ酸が少ない４５８アミ
ノ酸をコードしているオープンリーディングフレームを
有していた。ヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプタ
ー遺伝子とヒト由来アドレナリンα２ＣＩレセプターの
オープンリーディングフレームから予想されるアミノ酸
の間には９２％の相同性があった。

【００３８】図１において最初のプロリンを１番目とし
たとき、ヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプターは
ヒト由来アドレナリンα２ＣＩレセプターと比較して、
２２２番目がＡｒｇからＬｅｕに、２５３番目がＧｌｕ
からＡｌａに、２５４番目がＡｌａからＧｌｙに、２５
５番目がＡｒｇからＧｌｕに、２５６番目がＴｈｒから
Ａｓｎに、２５８番目がＴｈｒからＨｉｓに、２５９番
目がＡｌａからＣｙｓに、２６０番目がＡｒｇからＡｌ
ａに、２６２番目がＡｒｇからＰｒｏに、２６４番目が
ＰｒｏからＡｌａに、２６５番目がＴｈｒからＡｓｐ
に、２６６番目がＴｒｐからＶａｌに、２６７番目がＳ
ｅｒからＧｌｕに、２６８番目がＡｒｇからＰｒｏに、
２６９番目がＴｈｒからＡｓｐに、２７０番目がＡｒｇ
からＧｌｕに、２７１番目がＡｌａからＳｅｒに、２７
２番目がＡｌａからＳｅｒに、２７３番目がＧｌｎから
Ａｌａに、２７４番目がＡｒｇからＡｌａに、２７５番
目がＰｒｏからＡｌａに、２７６番目がＡｒｇからＧｌ
ｕに、２７７番目がＧｌｙからＡｒｇに、２７８番目が
ＧｌｙからＡｒｇに、２７９番目がＡｌａからＡｒｇ
に、２８０番目がＰｒｏからＡｒｇに、２８３番目がＰ
ｒｏからＡｌａに、３０８番目がＧｌｎからＧｌｕに、
３８０番目がＩｌｅからＳｅｒに、４２５番目がＰｒｏ
からＡｒｇに置換しており、２８１番目のＡｒｇが挿入
されていた。また、ヒト由来アドレナリンα２ＣＩレセ
プターの最初のメチオニンを１番目としたとき、３２１
番目から３２４番目までのＧｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏの部分がヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプタ
ーにおいて欠失していた。このことから、本発明ヒト由
来アドレナリンα２ＣＩＩレセプターは新規なものと認
められる。

【００３９】

【実施例２】 Ｃｏｓ細胞でのヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプ
ター遺伝子の一過性発現 プラスミドｐＵＣ１１９α２ＣＩＩ（１μｇ）をＫｐｎ
Ｉ（５０Ｕ）（宝酒造製）と３７℃、１時間反応させ、
クロロホルム／フェノール処理、エタノール沈澱を行
い、ＤＮＡブランティングキットを用いて平滑末端化
し、クロロホルム／フェノール処理、エタノール沈澱を
行い、ＸｂａＩ（５０Ｕ）（宝酒造製）と３７℃、１時
間反応させた後、アガロース電気泳動により１．４ｋｂ
断片を分離、電気抽出しクロロホルム／フェノール処
理、エタノール沈澱を行い、１０μｌのＴＥに溶解し
た。

【００４０】一方、発現ベクターｐＳＶＬ（ファルマシ
ア製）０．５μｇをＸｂａＩ（２０Ｕ）、ＳｍａＩ（２
０Ｕ）と３７℃、１時間反応させ、クロロホルム／フェ
ノール処理、エタノール沈澱を行い、ＢＡＰ処理により
脱リン酸化し、クロロホルム／フェノール処理を行い、
１０μｌのＴＥ液に溶解した。このベクターにヒト由来
アドレナリンα２ＣＩＩレセプター遺伝子を含む断片を
ＤＮＡライゲーションキットを用い結合し、クローニン
グした。

【００４１】このプラスミドをｐＳＶＬα２ＣＩＩと命
名し、Ｃｏｓ−７細胞にトランスフェクトした。即ち、
Ｃｏｓ−７細胞の約１０⁶ 個を５ｍｌのＤＭＥ培地（１
０％ＦＣＳ含有）を入れた培養器に移植し５％ＣＯ₂ イ
ンキュベーターにて３７℃で２４時間培養した。培地を
吸引することにより除去し、５ｍｌの無血清ＤＭＥ培地
で１回洗浄後、１０μｇの発現プラスミドｐＳＶＬα２
ＣＩＩと４３８μｇのＤＥＡＥ−デキストランを含んだ
２．５ｍｌの無血清ＤＭＥ培地で２時間トランスフェク
トするために培養した。培地を吸引除去後、５ｍｌの無
血清ＭＤＥ培地で１回洗浄し、５ｍｌのＤＭＥ培地（１
０％ＦＣＳ含有）を加えて３７℃で７２時間培養した。
培養終了後０．２５％トリプシン液で細胞を剥し、ＰＢ
Ｓで洗浄後−８０℃で凍結保存した。

【００４２】

【実施例３】 Ｃｏｓ細胞でのヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプ
ター遺伝子の構成型発現 実施例２で得られたプラスミドｐＳＶＬα２ＣＩＩ（１
μｇ）を制限酵素ＳａｌＩ（５０Ｕ）（宝酒造製）と３
７℃、１時間反応させ、クロロホルム／フェノール処
理、エタノール沈澱を行い、ＢＡＰ処理を行い、クロロ
ホルム／フェノール処理、エタノール沈澱を行い、２０
μｌのＴＥに溶解した。また、動物細胞中で発現可能な
ネオマイシン耐性遺伝子を保有するプラスミドｐＭＣ１
ＮｅｏＰｏｌｙＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）２μｇ
を制限酵素ＸｈｏＩ（１００Ｕ）（宝酒造製）、Ｓａｌ
Ｉ（１００Ｕ）（宝酒造製）と３７℃、１時間反応させ
た後、アガロース電気泳動により約１．０ｋｂのネオマ
イシン耐性遺伝子を有するＤＮＡ断片を分離、ＤＮＡを
電気抽出し、クロロホルム／フェノール処理、エタノー
ル沈澱を行い、２０μｌのＴＥ液に溶解した。

【００４３】この断片をさきにＳａｌＩで切断したプラ
スミドｐＳＶＬα２ＣＩＩにＤＮＡライゲーションキッ
トを用いて組み込み、構成型発現用プラスミドｐＳＶＬ
α２ＣＩＩ−Ｎｅｏと命名した組換えプラスミドを得
た。このプラスミドを、リン酸カルシュウムトランスフ
ェクションキット（５プライム３プライム製）を用いて
Ｃｏｓ−７細胞にトランスフェクトした。即ち、培地は
ＤＭＥ（１０％ＦＣＳ添加）を用い５％ＣＯ₂ インキュ
ベーターで培養した。

【００４４】トランスフェクション４８時間後にゲネテ
ィシン（Ｇ−４１８、ＳＩＧＭＡ製）を３００μｇ／ｍ
ｌとなるように加え、３〜４日おきにゲネティシン含有
ＤＭＥ培地で培地交換を行った。約３週間後生育してき
た細胞を０．２５％トリプシン液で剥し、種々の濃度
（３００、４５０、６００、７５０、９００、１０５０
μｇ／ｍｌ）のゲネティシンを含んだＤＭＥ培地に継代
培養した。生育した細胞を実施例２と同様の方法で回収
し凍結保存した。

【００４５】

【実施例４】 レセプター結合実験 実施例２または実施例３で得られた細胞に０．５ｍＭの
ＥＤＴＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）
を加え約１ｍｇタンパク質／ｍｌなるように細胞分散液
を調製した。細胞分散液０．１ｍｌを含む反応液（５ｎ
Ｍ ³Ｈ−ラウオルシン、０．１％アスコルビン酸、０．
５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．４））０．５ｍｌを２５℃、１時間反応させること
により総結合量を定量した。非特異的結合量はフェント
ラミンを最終濃度１０μＭになるように上記反応液に加
え、反応させることにより定量した。反応液はガラス繊
維ろ紙（ＧＦ／Ｃ）で吸引ろ過した後、０．５ｍＭのＥ
ＤＴＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）３
ｍｌで３回洗浄後ろ紙をバイアル瓶に移し、その放射活
性を液体シンチレーションカウンターで測定した。

【００４６】正常Ｃｏｓ−７細胞およびヒト由来アドレ
ナリンα２ＣＩＩレセプター遺伝子を一過性または構成
型にトランスフェクトしたＣｏｓ−７細胞での ³Ｈ−ラ
ウオルシン結合を表１に示した。

【００４７】

【表１】

【００４８】正常Ｃｏｓ細胞には ³Ｈーラウオルシン結
合能をほとんど検出できないのに対して、一過性または
構成型に遺伝子をトランスフェクトしたＣｏｓ細胞では
明らかに ³Ｈーラウオルシン特異的結合が認められた。
このことから、本発明のヒト由来アドレナリンα２ＣＩ
Ｉレセプター遺伝子が発現し、ヒト由来アドレナリンα
２ＣＩＩレセプターが産生されたと判定される。

【００４９】

【実施例５】 レセプター結合阻害実験 実施例２より得られた一過性発現Ｃｏｓ−７細胞を実施
例４と同様の方法で調製し細胞分散液を得た。細胞分散
液０．１ｍｌを含む反応液（１ｎＭ ³Ｈ−ラウオルシ
ン、０．１％アスコルビン酸、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、
５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４））０．５ｍ
ｌを２５℃、１時間反応させることにより総結合量（Ｔ
Ｂ）を定量した。非特異的結合量（ＮＢ）はフェントラ
ミンを最終濃度１０μＭになるように上記反応液に加
え、反応させることにより定量した。アドレナリンリガ
ンドの結合力を調べるためには、フェントラミンのかわ
りに種々の濃度のリガンドを加えて反応させた（ＤＴ
Ｂ）。これらの反応液はガラス繊維ろ紙（ＧＦ／Ｃ）で
吸引ろ過した後、０．５ｍＭのＥＤＴＡ含有５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）３ｍｌで３回洗浄後ろ紙
をバイアル瓶に移し、その放射活性を液体シンチレーシ
ョンカウンターで測定した。

【００５０】リガンドの結合能を下記式より求めた。

【００５１】

【数１】

【００５２】リガンドが ³Ｈ−ラウオルシンの結合を５
０％阻害する濃度（ＩＣ５０値）を算出し、その結果を
表２に示した。

【００５３】

【表２】

【００５４】ヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプタ
ーはラウオルシンに対して最も親和性が強く以下、ヨヒ
ンビン、ＷＢ４１０１、フェントラミン、プラゾシン、
オキシメタゾリンの順に親和性が弱くなっていった。ま
た、オキシメタゾリンに対するプラゾシンのＩＣ５０の
比は０．１９であった。これらの性質は、ヒト由来アド
レナリンα２ＣＩレセプター（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｌ．，４２、１−５（１９９２））やラット由来アド
レナリンα２Ｃレセプター（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６６、１０４７０−１０４７８（１９９１））
の性質と類似していた。このことから、本発明で得られ
た細胞はヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプターに
対する薬物を効率的にスクリーニングし得ると判定され
る。

【００５５】

【発明の効果】本発明により、これまで知られていなか
ったヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプターが存在
することが判明し、その遺伝子特性が明白となり、かつ
本発明は、ヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプター
の遺伝子を提供し得るもので、さらにこの遺伝子を発現
せしめることによりヒトでの薬理学的重要性の解明を可
能ならしめたものであり、またこのレセプターに作用す
る薬物スクリーニングのための受容体結合実験系をも提
供するものである。

【００５６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１３８２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 1-2 ５’非翻訳領域 3-1376 翻訳領域 1377-1382 ３’非翻訳領域 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CC ATG GCG TCC CCG GCG CTG GCG GCG GCG CTG GCG GTG GCG GCA GCG 47 Met Ala Ser Pro Ala Leu Ala Ala Ala Leu Ala Val Ala Ala Ala 1 5 10 15 GCG GGC CCC AAT GCG AGC GGC GCG GGC GAG AGG GGC AGC GGC GGG GTT 95 Ala Gly Pro Asn Ala Ser Gly Ala Gly Glu Arg Gly Ser Gly Gly Val 20 25 30 GCC AAT GCC TCG GGG GCT TCC TGG GGG CCG CCG CGC GGC CAG TAC TCG 143 Ala Asn Ala Ser Gly Ala Ser Trp Gly Pro Pro Arg Gly Gln Tyr Ser 35 40 45 GCG GGC GCG GTG GCA GGG CTG GCT GCC GTG GTG GGC TTC CTC ATC GTC 191 Ala Gly Ala Val Ala Gly Leu Ala Ala Val Val Gly Phe Leu Ile Val 50 55 60 TTC ACC GTG GTG GGC AAC GTG CTG GTG GTG ATC GCC GTG CTG ACC AGC 239 Phe Thr Val Val Gly Asn Val Leu Val Val Ile Ala Val Leu Thr Ser 65 70 75 CGG GCG CTG CGC GCG CCA CAG AAC CTC TTC CTG GTG TCG CTG GCC TCG 287 Arg Ala Leu Arg Ala Pro Gln Asn Leu Phe Leu Val Ser Leu Ala Ser 80 85 90 95 GCC GAC ATC CTG GTG GCC ACG CTG GTC ATG CCC TTC TCG TTG GCC AAC 335 Ala Asp Ile Leu Val Ala Thr Leu Val Met Pro Phe Ser Leu Ala Asn 100 105 110 GAG CTC ATG GCC TAC TGG TAC TTC GGG CAG GTG TGG TGC GGC GTG TAC 383 Glu Leu Met Ala Tyr Trp Tyr Phe Gly Gln Val Trp Cys Gly Val Tyr 115 120 125 CTG GCG CTC GAT GTG CTG TTT TGC ACC TCG TCG ATC GTG CAT CTG TGT 431 Leu Ala Leu Asp Val Leu Phe Cys Thr Ser Ser Ile Val His Leu Cys 130 135 140 GCC ATC AGC CTG GAC CGC TAC TGG TCG GTG ACG CAG GCC GTC GAG TAC 479 Ala Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Trp Ser Val Thr Gln Ala Val Glu Tyr 145 150 155 AAC CTG AAG CGC ACA CCA CGC CGC GTC AAG GCC ACC ATC GTG GCC GTG 527 Asn Leu Lys Arg Thr Pro Arg Arg Val Lys Ala Thr Ile Val Ala Val 160 165 170 175 TGG CTC ATC TCG GCC GTC ATC TCC TTC CCG CCG CTG GTC TCG CTC TAC 575 Trp Leu Ile Ser Ala Val Ile Ser Phe Pro Pro Leu Val Ser Leu Tyr 180 185 190 CGC CAG CCC GAC GGC GCC GCC TAC CCG CAG TGC GGC CTC AAC GAC GAG 623 Arg Gln Pro Asp Gly Ala Ala Tyr Pro Gln Cys Gly Leu Asn Asp Glu 195 200 205 ACC TGG TAC ATC CTG TCC TCC TGC ATC GGC TCC TTC TTC GCG CCC TGC 671 Thr Trp Tyr Ile Leu Ser Ser Cys Ile Gly Ser Phe Phe Ala Pro Cys 210 215 220 CTC ATC ATG GGC CTG GTC TAC GCG CGC ATC TAC CGA GTG GCC AAG CTG 719 Leu Ile Met Gly Leu Val Tyr Ala Arg Ile Tyr Arg Val Ala Lys Leu 225 230 235 CGC ACG CGC ACG CTC AGC GAG AAG CGC GCC CCC GTG GGC CCC GAC GGT 767 Arg Thr Arg Thr Leu Ser Glu Lys Arg Ala Pro Val Gly Pro Asp Gly 240 245 250 255 GCG TCC CCG ACT ACC GAA AAC GGG CTG GGC GCG GCG GCA GGC GCA GGC 815 Ala Ser Pro Thr Thr Glu Asn Gly Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly 260 265 270 GAG AAC GGG CAC TGC GCG CCC CCG CCC GCC GAC GTG GAG CCG GAC GAG 863 Glu Asn Gly His Cys Ala Pro Pro Pro Ala Asp Val Glu Pro Asp Glu 275 280 285 AGC AGC GCA GCG GCC GAG AGG CGG CGG CGC CGG GGC GCG TTG CGG CGG 911 Ser Ser Ala Ala Ala Glu Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ala Leu Arg Arg 290 295 300 GGC GGG CGG CGG CGA GCG GGC GCC GAG GGG GGC GCG GGC GGT GCG GAC 959 Gly Gly Arg Arg Arg Ala Gly Ala Glu Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asp 305 310 315 GGG CAG GGG GCG GCT GAG TCG GGG GCG CTG ACC GCC TCC AGG TCC CCG 1007 Gly Gln Gly Ala Ala Glu Ser Gly Ala Leu Thr Ala Ser Arg Ser Pro 320 325 330 335 GGG CCC GGT GGC CGC CTG TCG CGC GCC AGC TCG CGC TCC GTC GAG TTC 1055 Gly Pro Gly Gly Arg Leu Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ser Val Glu Phe 340 345 350 TTC CTG TCG CGC CGG CGC CGG GCG CGC AGC AGC GTG TGC CGC CGC AAG 1103 Phe Leu Ser Arg Arg Arg Arg Ala Arg Ser Ser Val Cys Arg Arg Lys 355 360 365 GTG GCC CAG GCG CGC GAG AAG CGC TTC ACC TTT GTG CTG GCT GTG GTC 1151 Val Ala Gln Ala Arg Glu Lys Arg Phe Thr Phe Val Leu Ala Val Val 370 375 380 ATG GGT GTG TTC GTG CTC TGC TGG TTC CCC TTC TTC TTC AGC TAC AGC 1199 Met Gly Val Phe Val Leu Cys Trp Phe Pro Phe Phe Phe Ser Tyr Ser 385 390 395 CTG TAC GGC ATC TGC CGC GAG GCC TGC CAG GTG CCC GGC CCG CTC TTC 1247 Leu Tyr Gly Ile Cys Arg Glu Ala Cys Gln Val Pro Gly Pro Leu Phe 400 405 410 415 AAG TTC TTC TTC TGG ATC GGC TAC TGC AAC AGC TCG CTC AAC CCG GTC 1295 Lys Phe Phe Phe Trp Ile Gly Tyr Cys Asn Ser Ser Leu Asn Pro Val 420 425 430 ATC TAC ACG GTC TTC AAC CAG GAT TTC CGG CGA TCC TTT AAG CAC ATC 1343 Ile Tyr Thr Val Phe Asn Gln Asp Phe Arg Arg Ser Phe Lys His Ile 435 440 445 CTC TTC CGA CGG AGG AGA AGG GGC TTC AGG CAG TGACTC 1382 Leu Phe Arg Arg Arg Arg Arg Gly Phe Arg Gln 450 455

【００５７】

【配列表】

配列番号：２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プライマー 起源：合成ＤＮＡ 配列 ACCTCCCGCC CCGTCATGGA CCACCAGGAC 30

【００５８】

【配列表】

配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プライマー 起源：合成ＤＮＡ 配列 GCGCAGGCGG GCTCACCAGG CCGTCTGGGT 30

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はヒト由来アドレナリンα２ＩＩレセプタ
ーを構成するポリペプチドのアミノ酸配列を示す図であ
る。

【図２】図２はヒト由来アドレナリンα２ＩＩレセプタ
ーを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7823−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 7906−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプ
   ターを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードす
   る塩基配列を含むＤＮＡ。
2. 【請求項２】 ヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプ
   ターを構成するポリペプチドのアミノ酸配列が、Ｎ末端
   側より図１（但し、Ｘ₁ は水素原子、Ｘ₂ −Ａｌａ−Ｓ
   ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌ
   ａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ
   −Ａｌａ−Ｇｌｙまたはそれらのアセチル体を意味し、
   Ｘ₂ は水素原子またはＭｅｔを意味する）で表される請
   求項第１項記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 塩基配列が、５’末端側より図２（但
   し、Ｘ₃ は水素原子またはＸ₄ ＧＣＧＴＣＣＣＣＧＧＣ
   ＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧ
   ＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＣを意味し、Ｘ₄ は水素原子ま
   たはＡＴＧを意味する）で表される請求項第１項記載の
   ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 宿主にとって外来性であるヒト由来アド
   レナリンα２ＣＩＩレセプターを構成するポリペプチド
   のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを保
   持することを特徴とする形質転換細胞。
5. 【請求項５】 ヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプ
   ターを構成するポリペプチドのアミノ酸配列が、Ｎ末端
   側より図１（但し、Ｘ₁ 、Ｘ₂ は上記と同じ意味を有す
   る）で表されるものである請求項第４項記載の形質転換
   細胞。
6. 【請求項６】 塩基配列が５’末端側より図２（Ｘ₃ 、
   Ｘ₄ は上記と同じ意味を有する）で表されるものである
   請求項第４項記載の形質転換細胞。
7. 【請求項７】 形質転換細胞が、動物細胞である請求項
   第４項記載の形質転換細胞。
8. 【請求項８】 動物細胞がＣｏｓ−１、Ｃｏｓ−７また
   は、Ｌである請求項第７項記載の形質転換細胞。
9. 【請求項９】 Ｎ末端側より図１（但し、Ｘ₁ 、Ｘ₂ は
   上記と同じ意味を有する）で表されるアミノ酸配列を有
   するヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプターを構成
   するポリペプチド。
10. 【請求項１０】 該ヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレ
    セプターを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコー
    ドする塩基配列を含むＤＮＡを保持した形質転換細胞を
    培地にて培養し、次いで該ＤＮＡの遺伝情報を発現させ
    た該ヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプターを構成
    するポリペプチドを保持した該細胞を採取することを特
    徴とする該細胞の製造法。
11. 【請求項１１】 組換え操作によって該ヒト由来アドレ
    ナリンα２ＣＩＩレセプターを構成するポリペプチドを
    発現した細胞あるいは該細胞から調製した膜画分に標識
    リガンドと被験薬物を一定量含有する被験液を作用さ
    せ、次いでその標識量の変化を定量することにより行う
    ヒト由来アドレナリンα２ＣＩＩレセプターに作動性の
    薬物スクリーニング法。