CN104614353B - 基于双通道的多光谱荧光成像显微系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明适用于光学、生物医学、生命科学等领域，提出了以一种基于双通道的多光谱荧光成像显微系统和方法，其中基于双通道的多光谱荧光成像显微系统包括：皮秒脉冲激光器，荧光激发和收集光路，显微物镜，分束镜，双ICCD探测器，控制与处理模块。本发明同时还公布了一种利用所述双通道的多光谱荧光成像显微系统进行多光谱成像的方法。本发明有效的解决了现有的荧光显微镜、荧光寿命成像显微系统，一次探测只能获取单一波长荧光信息的限制，并可以针对生物医学和生命科学中相关荧光强度探测受限的动态过程，进行多光谱荧光强度和荧光寿命图像的同时获取，拓展了生物光子学的研究和应用范围。

Description

基于双通道的多光谱荧光成像显微系统和方法

技术领域

本发明涉及光学成像技术、生物医学领域，特别是一种基于双通道的多光谱荧光成像显微系统和方法。

背景技术

近年来，随着生物医学研究的进展，利用荧光寿命显微成像的方法获取生物光子学信息的手段逐渐被采用。结合荧光强度成像，荧光寿命成像方法可用于细胞微环境检测，光谱重叠的荧光团成像，具体可以完成荧光共振能力转移、细胞内物理化学环境例如氧离子浓度、钙离子、PH值的定量监测等。

目前，可对荧光寿命进行探测的荧光显微成像系统主要包括：单光子荧光计数荧光显微系统，门控荧光显微成像系统，频域荧光显微成像系统；以上几种荧光显微系统都可以同时获取荧光强度成像和荧光寿命成像。

现有的技术中，荧光显微系统多是针对单一波长的荧光团进行监测，或者是利用光谱仪结合探测器对兴趣波长进行成像融合；以上设备利用的方法在光学信息获取是针对动态过程的单一波段，或者针对兴趣波段逐一探测，例如活体细胞的动态监测、FRET过程等，现有系统无法针对整个监测过程的多个兴趣波段进行同时获取并对图像信息进行融合处理。从而，利用双通道的探测器对多波长的相同目标活动的检测可以满足动态过程中的荧光光谱信息，荧光强度信息，荧光寿命信息同时获取的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于双通道的多光谱荧光成像显微系统和方法。本发明实施例的基本思路是将利用分光镜的分束的双通道探测方法和门控荧光寿命成像显微方法结合，实现基于双通道的多光谱荧光成像显微系统。

该基于双通道的多光谱荧光成像显微系统，包括：光源模块，光斑整形光路，荧光激发收集光路，双通道光路，双ICCD、时序信号产生器和PC机，其特征在于：所述光源模块，用于激发荧光样品，使样品表面产生光致荧光信号；

所述光斑整形光路包括光纤耦合输出装置、扩束镜，用于将自由空间输出的激发光经光纤耦合输出后，采用扩束镜进行光斑扩束，用于适应激发样品大小，实现宽场激发；

所述荧光激发收集光路包括双色镜、反射镜、物镜，激发光经由右侧双色镜反射至反射镜表面，反射镜位于双色镜左侧，激发光反射至反射镜上方的物镜内；物镜将激发光会聚到样品表面完成荧光样品激发，并收集样品表面出射的荧光信号，双色镜用于分离激发光束和荧光信号，实现荧光样品的激发和收集，对于激光全部反射，荧光信号全部透射；所述反射镜用于光路中激发光和荧光的光路角度调整，方向调整90度；

所述双通道光路，包括：分光棱镜、透镜L3、透镜L4、滤光片F1、滤光片F2，其中所述分光棱镜，用于将荧光信号分成50∶50的荧光强度信号，50％透射、50％反射实现双通道探测；所述透镜L3、L4，用于调整荧光在探测器上成像的清晰度和大小；所述滤光片F1、F2，用于选择荧光信号中的兴趣波段，实现兴趣光谱成像；

所述双ICCD(增强型电荷耦合器件探测器)探测两路兴趣波段的时间分辨荧光强度图像；

所述时序信号产生器输出三路电学触发信号，用于触发短脉冲激光器、第一ICCD、第二ICCD，完成时序电路控制；

所述PC机同时连接时序信号产生器、双ICCD的图像输出端口，用于系统探测参数的输入、成像系统的控制以及荧光寿命图像计算和融合处理。

按照本发明的一方面，一种利用双相机的多光谱荧光成像显微系统，包括：

光源模块，紫光372nm、绿光440nm或者根据实际荧光样品选定近紫外至可见光波段皮秒半导体脉冲激光头可选的)皮秒脉冲激光器，用于观察样品中荧光激发；

激光器光斑整形光路，包括光纤耦合输出装置，扩束镜。用于将自由空间输出光光纤耦合输出后，利用扩束镜进行光斑扩束；

双色镜，反射镜，物镜，激发光经由右侧双色镜反射至反射镜表面，反射镜位于双色镜左侧，激发光反射至反射镜上方的物镜内，三者共同位于荧光激发收集光路上。脉冲激光经双色镜发射并经过物镜入射到观测样品表面，样品受激发的荧光经反射镜并透过双色镜至荧光探测光路。

分束镜，用于将样品荧光分束成强度50/50的两路信号；

透镜L3，透镜L4，滤光片F1，滤光片F2，经由分束镜的荧光信号经由耦合透镜，兴趣波段的滤光片滤除后耦合到ICCD探测器；

双ICCD(增强型电荷耦合器件探测器)，用于探测两路兴趣波段的时间分辨荧光强度图像；

时序信号产生器，用于输出三路电学触发信号，同步脉冲激光器、第一ICCD、第二ICCD，完成时序电路控制；

PC机，同时连接时序信号产生器，两路ICCD的图像输出端口。用于输入控制信号产生器的参数和输出控制参数，并通过相机图像控制软件实时显示并存储样品荧光强度图像，在获取全部时序控制参数和时间分辨荧光强度图像后，利用荧光寿命算法处理并显示多种荧光图像信息。

系统中光学部件位置如系统光路图图2中所示，双色镜进行不同波长的激发光和荧光信号的分离，分束镜实现荧光信号分束后的双通道探测。PC机通过以太网控制时序信号输入，时序产生器利用三路TTL信号(数字逻辑信号)触发半导体激光器和ICCD探测器，获取图像通过以太网线传入PC机设备。

系统中通过控制时序产生器的TTL信号的位置，调整激发光脉冲同探测门的位置，实现时间分辨荧光强度信号的探测，延迟精度＜10ps。

按照本发明的另一方面，一种利用上述的基于双通道的多光谱荧光成像显微系统成像的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤1，PC机输入成像系统控制参数，实现系统探测参数初始化；

步骤2，时序产生器接受到PC机设定TTL参数，驱动激光器和ICCD探测器开启，激发光传播到样品表面完成荧光激发，双ICCD(增强型电荷耦合器件)探测器在延迟信号驱动下分别获取多波长荧光信号，完成光学信号探测过程；

步骤3，PC机读取多组延迟信息，时间分辨荧光强度图像，获取全部待处理的时间和图像信息；

步骤4，荧光寿命处理软件计算寿命图像并进行融合等操作，完成多光谱荧光信号探测。

本发明基于双通道的多光谱荧光成像显微系统，针对性获取兴趣波段的荧光强度图像和荧光寿命图像，实现了多光谱的荧光显微成像，突破了原有单一波段和重复获取多波长的探测限制，极具科学意义和应用价值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以及结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明，其中：

图1是本发明实施例提供的双通道多光谱荧光成像显微系统的处理流程图；

图2是本发明实施例提供的双通道多光谱荧光成像显微系统的系统光路图。

具体实施方式

应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

图1表示了本发明实施例提供的基于双通道的多光谱荧光成像显微方法的具体实现流程，详述如下：

在步骤1中，选定观察目标为活体仓鼠的口腔癌细胞，两路的兴趣荧光波段分别为450nm、550nm，主要针对的两种生物自体荧光团为NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)，以此为例说明。

将装有待观测荧光样品的容器放置的载物台上，样品目标区域放置在显微物镜观察区域内；在PC机控制软件内，用于输入控制信号驱动信号产生器产生实际的驱动信号，用于驱动信号产生器以及ICCD，具体包括：皮秒激光器触发信号、ICCD门宽、延迟时间、MCP增益(微通道板电压)等参数。

在步骤2中，为了方便描述仅示出了与本实施例相关的部分，图2给出了本发明实施例提供的基于双通道的多光谱荧光成像显微系统的光学结构图。添加了附图标记并对其进行说明。信号发生器产生三路信号分别触发皮秒脉冲激光器、ICCD1和ICCD2，实现荧光信号的探测；针对单一门延迟时间的设置，皮秒激光器同ICCD具有相同的工作频率，在ICCD一帧内完成多组相同门延迟的荧光信号的累积，根据不同荧光寿命计算方法设置ICCD探测门的数量及延迟位置。

在荧光激发光路中，在一次探测过程中，脉冲激光器受信号发生器驱动产生一个皮秒脉冲光，经光纤输出口后，经过透镜1和透镜2，完成光斑的扩束，并经过反射镜反射至显微物镜后会聚到样品上，完成样品的荧光激发。

在样品激发出的荧光部分入射进显微物镜被收集，并经过反射镜反射，透射过双色镜；经过双色镜的荧光被50∶50的分光棱镜分成两部分，一半透射，一半反射，两束荧光分别经过450nm，550nm的窄带滤光片，L3，L4透镜将两个波长的荧光耦合至ICCD的探测光阴极上；

以上过程完成了对于单个门延迟的荧光强度图像探测，在分别完成两组至多组时间分辨荧光强度图像双通道图像探测后，整个光学探测过程完成。

在步骤3中，PC端在步骤1中根据荧光寿命算法设计的多组双通道时间分辨荧光强度图像设置参数后，在步骤2中获取了全部延迟参数以及对应两个波长的荧光强度图像。

根据受极窄脉冲激发的荧光负指数衰减模型I(t)＝I₀exp(-t/τ)，其中，t是荧光衰减的时间信息，τ代表荧光寿命，I₀为荧光最大强度值，I(t)为对应时刻t的荧光强度值；对应双通道的时间分辨荧光强度图像，两组图像分别利用基于荧光衰减模型的荧光寿命计算法进行寿命图像计算。

本方法中利用的荧光寿命算法有三种，快速荧光寿命算法、线性最小二乘法拟合，列文伯格马夸尔特法拟合算法。

快速荧光寿命算法利用的是荧光衰减过程中两个门延迟的荧光强度图像；图像处理过程中利用针对两幅图像中相同图像位置进行寿命计算，其中τ为单个像素点对应的荧光寿命值，t₁和t₂对应的是两处不同的延迟时间，I₁和I₂是针对t₁和t₂两处延迟的荧光强度值，在针对寿命图像逐像素点处理后，将所有像素整合成寿命图像。

线性最小二乘法一般针对多幅图像进行处理，处理算法利用多个门延迟以及对应的荧光强度图像，I_i是荧光在延迟处t_i的荧光强度值，该算法是将负指数衰减的模型线性化后利用线性最小二乘法拟合的结果。

列文伯格-马克夸特拟合方法是一种非线性最小二乘法拟合方法，这种方法是一种迭代算法，迭代过程由公式决定；其中是J待估计参数的雅克比矩阵，通过不断递进求解荧光寿命值。

在该步骤中，重复两组计算过程可以获取双通道的荧光寿命图像，对应不同兴趣波长的荧光寿命图像。

在步骤4中，PC机已经完成双通道的荧光寿命图像的计算，后续处理包括双光谱的图像融合是利用图像处理算法完成双通道图像的相加，一般设置强度比例为50∶50，实际融合比例通过滚动条控制，该步骤完成的是相同延迟处的双通道的荧光强度图像以及荧光寿命图像融合；

至此，通过1-4个步骤，完成了双通道的多光谱的荧光显微图像的获取，包括两个通道的荧光强度图像，荧光寿命图像，以及两个通道融合的强度和寿命图像。

以上所述的具体的实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于双通道的多光谱荧光成像显微系统，包括：光源模块，光斑整形光路，荧光激发收集光路，双通道光路，双ICCD、时序信号产生器和PC机，其特征在于：

所述光源模块，用于激发荧光样品，使样品表面产生光致荧光信号，所述光源模块包括皮秒脉冲激光器，由激光器驱动器、半导体激光头、光纤输出口组成；所述激光器驱动器用于接收时序信号产生器产生的触发信号，并触发半导体激光头产生皮秒脉冲激光；所述半导体激光头，在激光器驱动器触发下，输出自由空间光；所述光纤输出口，连接在半导体激光头上，将输出的自由空间光耦合到光纤输出口，实现光纤输出，所述半导体激光头包括紫光372nm、绿光440nm或者根据实际荧光样品选定近紫外至可见光波段皮秒半导体脉冲激光头；

所述光斑整形光路包括光纤耦合输出装置、扩束镜，用于将输出的自由空间光经光纤耦合输出后，采用扩束镜进行光斑扩束，用于适应激发样品大小，实现宽场激发；

所述荧光激发收集光路包括双色镜、反射镜、物镜，激发光经由右侧双色镜反射至反射镜表面，反射镜位于双色镜左侧，激发光反射至反射镜上方的物镜内；物镜将激发光会聚到样品表面完成荧光样品激发，并收集样品表面出射的荧光信号，双色镜用于分离激发光束和荧光信号，实现荧光样品的激发和收集，对于激发光全部反射，荧光信号全部透射；所述反射镜用于光路中激发光和荧光的光路角度调整，方向调整90度；

所述双通道光路，包括：分光棱镜、透镜L3、透镜L4、滤光片F1、滤光片F2，其中所述分光棱镜，用于将荧光信号分成50∶50的荧光强度信号，50％透射、50％反射实现双通道探测；所述透镜L3、L4，用于调整荧光在探测器上成像的清晰度和大小；所述滤光片F1、F2，用于选择荧光信号中的兴趣波段，实现兴趣光谱成像；

所述双ICCD探测器探测两路兴趣波段的时间分辨荧光强度图像；

所述时序信号产生器输出三路电学触发信号，用于触发短脉冲激光器、第一ICCD、第二ICCD，完成时序电路控制；

所述PC机同时连接时序信号产生器、双ICCD的图像输出端口，用于系统探测参数的输入、成像系统的控制以及荧光寿命图像计算和融合处理。

2.根据权利要求1所述基于双通道的多光谱荧光成像显微系统，其特征在于，所述扩束镜包括透镜L1、L2。

3.根据权利要求1所述的基于双通道的多光谱荧光成像显微系统，其特征在于双通道中的两台ICCD具有相同的性能。

4.一种利用权利要求1-3任一所述的基于双通道的多光谱荧光成像显微系统成像的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤1，将装有待观测荧光样品的容器放置在载物台上，样品目标区域放置在显微物镜观察区域内；

步骤2，PC机输入成像系统控制参数，实现系统探测参数初始化；

步骤3，时序信号产生器接收到PC机设定参数，驱动光源模块和ICCD探测器开启，激发光传播到样品表面完成荧光激发，双ICCD探测器在延迟信号驱动下分别获取多波长荧光强度信号，完成光学信号探测过程；

步骤4，PC机读取多组延迟信息，时间分辨荧光强度图像，获取全部待处理的时间和图像信息；

步骤5，对应双通道的时间分辨荧光强度图像，两组图像分别利用荧光寿命处理软件计算寿命及图像融合，完成多光谱荧光信号探测。

5.根据权利要求4中所述的基于双通道的多光谱荧光成像显微系统成像的方法，其中荧光寿命计算方法包括快速荧光寿命计算、线性最小二乘法拟合或列文伯格-马克夸特拟合方法。

6.根据权利要求4中所述的基于双通道的多光谱荧光成像显微系统成像的方法，其中图像融合是利用图像处理算法完成双通道图像的相加，设置灰度比例为50∶50，实际融合比例通过滚动条控制。