CN104583192A - 适合于线粒体复合体-1检出的化合物 - Google Patents

适合于线粒体复合体-1检出的化合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供以式(1-0)表示的化合物。(式(1-0)中，R表示-O(CH2)n-、-O(CH2)nOC2H4-、-CH2O(CH2)n-或-CH2O(CH2)nOC2H4-，n表示1～5的整数，Q1表示F或-OCH3)。

Description

适合于线粒体复合体-1检出的化合物
技术领域
本发明涉及适合于线粒体复合体-1(mitochondrial Complex-1)检出的化合物。
背景技术
由于阳电子(正电子)发射型计算机断层成像(PET法)比单光子发射计算机断层成像(SPECT法)，从灵敏度、分辨率和定量性方面更优异，近年特别受到关注。
以认知症为首的各种神经精神疾病的诊断，由PET法进行的神经细胞的葡萄糖代谢评价，现在正在进行。作为此时PET用探针，可以使用18F-氟脱氧葡萄糖([18F]FDG)。
现有技术
专利文献
专利文献1：特表2011-513306号公报
非专利文献
非专利文献1：Yalamanchili P et al.,J Nucl Cardiol 14(2007)782-788；Huisman et al.,J Nucl Med,49:630-636
发明内容
但是，如果由使用[18F]FDG的PET法评价脑梗塞模型的大鼠，由脑梗塞的发病，在预想[18F]FDG蓄积下降的脑缺血损伤部位中，可知与预想相反、[18F]FDG的蓄积增加。这表示[18F]FDG作为神经障碍后的评价用PET探针不适用。如果掌管脑内免疫的线粒体细胞被活性化，就在引起炎症反应的缺血损伤部位蓄积。因为该蓄积的线粒体细胞摄入[18F]FDG，所以，在脑的缺血损伤部位中，确认[18F]FDG的异常蓄积增加。
另一方面，作为识别线粒体的复合体1(以下有称为“MC-1”的情况)的PET探针，报告了[18F]BMS-747158-02(2-叔丁基-4-氯-5-[4-(2-氟-乙氧基甲基)-苄氧基]-2H-哒嗪-3-酮、[18F]BMS)，可以在脑或心脏的功能评价中使用(专利文献1、非专利文献1)。在由使用大鼠脑切片的放射自显影法进行的体外评价、和由使用活大鼠脑的PET法进行的体内评价中，可知因为[18F]BMS脂溶性比较高(logP＝1.42)，所以，血脑屏障的透过性高、脑内移动性良好。[18F]BMS因为其高的脂溶性，所以非特异性的结合能高，判断在作为对复合体1的特异性抑制药的鱼藤酮(rotenone)引起的抑制实验中不能充分确认抑制效果。
本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于提供一种作为PET法的标记化合物也能够利用的、适合于线粒体复合体-1检出的化合物。
本发明提供以式(1-0)表示的化合物。
(式(1-0)中，R表示-O(CH2)n-、-O(CH2)nOC2H4-、-CH2O(CH2)n-或-CH2O(CH2)nOC2H4-，n表示1～5的整数，Q1表示F或-OCH3。)
以式(1-0)表示的化合物是适合于线粒体复合体-1检出的化合物。
在上述化合物(1-0)中，Q1可以是18F或-O11CH3。由此，上述化合物变得能够发出正电子。从上述化合物发出的正电子，立即与电子结合、发出γ射线(湮没辐射(annihilation radiation))。通过在PET法可以使用的装置中测定该γ射线，可以定量且经时地将上述化合物的体内分布成像。即，作为PET法的标记化合物也能够利用。
本发明提供以式(2-0)表示的化合物。
(式(2-0)中，R表示-O(CH2)n-、-O(CH2)nOC2H4-、-CH2O(CH2)n-或-CH2O(CH2)nOC2H4-，n表示1～5的整数，Q2表示能够脱离的取代基(取代磺酰氧基、卤素原子或羟基等))
通过使用以式(2-0)表示的化合物，能够高效率地合成以式(1-0)表示的化合物。
根据本发明，能够提供作为PET法的标记化合物能够利用的、适合于线粒体复合体-1检出的化合物。
附图说明
图1是BMS-P的中间体的NMR光谱图。
图2是表示对线粒体复合体-1的结合亲和性的图表。
图3是表示在大鼠的脑切片中的、由线粒体复合体-1的特异性抑制药引起的PET探针的结合抑制效果的图像的图。
图4是表示在大鼠的脑切片中的、由线粒体复合体-1的特异性抑制药引起的PET探针的结合抑制效果的图表。
图5是表示在活的大鼠的脑和心脏中的、由线粒体复合体-1的特异性抑制药引起的PET探针的结合抑制效果的PET图像的图。
图6是表示在活的大鼠的脑和心脏中的、由线粒体复合体-1的特异性抑制药引起的PET探针的结合抑制效果的图表。
图7是表示在大鼠的脑梗塞模型的损伤部位中的、葡萄糖代谢和线粒体复合体-1的活性的经时变化的PET图像的图。
图8是表示在活的猴脑中的、由线粒体复合体-1的特异性抑制药引起的PET探针的结合抑制效果的PET图像的图。
图9是表示在活的猴脑中的、由线粒体复合体-1的特异性抑制药引起的PET探针的结合抑制效果的图表。
图10是表示在活的猴脑中的、[18F]BCPP-EF的结合与老化相关的PET图像的图及图表。
图11是表示在正常的猴和帕金森病模型猴的脑内的、[18F]BCPP-EF的结合的PET图像的图及图表。
具体实施方式
以下，详细说明本发明的适合的实施方式。但是，本发明限于以下的实施方式。
适合于本实施方式相关的线粒体复合体-1检出的化合物，是以(1-0)表示的化合物(以下有称为“化合物(1-0)”的情况)。
R是-O(CH2)n-、-O(CH2)nOC2H4-、-CH2O(CH2)n-或-CH2O(CH2)nOC2H4-。n是1～5的整数，优选是2～4。Q1是F或-OCH3、优选是18F或-O11CH3。通过将Q1设为-O11CH3或18F，化合物(1-0)能够发出正电子。在Q1是-O11CH3的情况下，因为半衰期短为20分钟，所以还能够在1日内进行多次测量。在Q1是18F的情况下，因为半衰期为110分钟并且比-O11CH3长，所以能够延长1次的测量时间。
在吡啶环中的与吡啶环结合的-OCH2-的结合位置及R的结合位置不被特别限制，但与吡啶环结合的-OCH2-的结合位置是吡啶环的5位、R的结合位置优选是吡啶环的2位。将与吡啶环结合的-OCH2-的结合位置是吡啶环的5位、R的结合位置是吡啶环的2位时的结构式作为式(1-0’)在以下表示。
从对线粒体复合体-1的结合特异性的观点出发，适合于线粒体复合体-1检出的化合物，优选是以式(1)表示的化合物(以下有称为“化合物(1)”的情况)。与[18F]BMS比较，化合物(1)的脂溶性低。因此，化合物(1)的非特异性结合被抑制，和[18F]BMS比较，对线粒体复合体-1结合特异性有变高的倾向。
从对线粒体复合体-1的结合亲和性的观点出发，适合于线粒体复合体-1检出的化合物，优选是以式(1-2)表示的化合物(以下有称为“化合物(1-2)”的情况)。
以(2-0)表示的化合物(以下有称为“化合物(2-0)”的情况)是上述化合物(1-0)的前体。
Q2是能够脱离的取代基(取代磺酰氧基、卤素原子或羟基)。
作为上述取代磺酰氧基，例如，可以列举甲苯磺酰氧基(-OTs)、甲烷磺酰氧基(-OMs)、三氟甲烷磺酰氧基(-OTf)、硝基苯磺酰氧基(-ONs)，优选使用-OTs。
作为卤素原子，可以列举氟、氯、溴、碘。
以式(2-0’)表示的化合物(以下有称为“化合物(2-0’)”的情况)是上述化合物(1-0’)的前体。
以式(2)表示的化合物(以下有称为“化合物(2)”的情况)是上述化合物(1)的前体。
以式(2-2)表示的化合物是上述化合物(1-2)的前体。
(前体的合成方法)
R是-CH2O(CH2)n-、n是2、Q2是羟基的化合物(2-0)，可以从公知的化合物来合成。例如，可以经由在后述的实施例的实验2中记载的合成流程图(工序1～10)来合成。R是-CH2O(CH2)nOC2H4-、Q2是羟基的化合物(2-0)，可以参照在后述实施例的实验2中记载的合成流程图(工序1～10)和后述的合成流程图(c)来合成。
Q2是羟基的化合物(2)，可以从公知的化合物来合成。例如，可以经由在后述实施例的实验1中记载的合成流程图(a)～(h)来合成。
Q2是甲苯磺酰氧基的化合物(2)，可以从公知的化合物来合成。例如，可以从上述Q2是羟基的化合物(2)经由在后述的实施例中记载的合成流程图(i)来合成。
从化合物(2)来制造Q1是F的化合物(1)的方法，可以通过将化合物(2)氟化的方法来进行。例如，在Q2是-OTs的情况下，将化合物(2)氟化的方法以以下的合成流程图(A)表示。在Q2是其它取代磺酰氧基或卤素原子的情况下，也能够以同样的合成流程图来合成对应的化合物(1)。
从化合物(2)来制造Q1是18F的化合物(1)的方法，可以通过将化合物(2)[18F]氟化的方法来进行。例如，在Q2是-OTs的情况下，将化合物(2)[18F]氟化的方法以以下的合成流程图(B)表示。在Q2是其它取代磺酰氧基或卤素原子的情况下，也能够以同样的合成流程图来合成对应的化合物(1)。
作为将化合物(2)[18F]氟化的方法，通过在溶剂中，使化合物(2)与、大环配体和[18F]KF的复合体反应，从而能够进行[18F]氟化。
作为[18F]氟化时的溶剂，只要能够以某种程度溶解起始物质，就没有特别限定，例如，可以列举乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)等，优选使用乙腈。
作为大环配体，例如，可以列举4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮双环[8.8.8]二十六烷(K[2.2.2])、1,4,7,10,13,16-六氧杂环十八烷(18-冠醚-6)等，优选使用K[2.2.2]。
从Q2是羟基的化合物(2)来制造Q1是-OCH3的化合物(1)的方法，例如，以以下的合成流程图(C)表示。
从Q2是羟基的化合物(2)来制造Q1是-O11CH3的化合物(1)的方法，例如，以以下的合成流程图(D)表示。
在上述合成流程图(D)中，11CH3OTf能够通过公知的方法来合成。例如，可以经由反应式(E)来合成。
在对生物体给药的情况下，化合物(1)具有与线粒体复合体-1特异性结合的倾向。在对生物体给药的情况下，化合物(1-2)具有与线粒体复合体-1以高亲和性结合的倾向。因此，化合物(1-0)适合于线粒体复合体-1的检出。例如，如果使荧光色素等与化合物(1-0)结合，或对化合物(1-0)进行正电子标记，就可以作为线粒体复合体-1的标记化合物使用。特别是在化合物(1-0)的Q1是-O11CH3或18F的情况下，化合物(1-0)能够发出正电子。从上述化合物(1-0)发出的正电子立即与电子结合、发出γ射线。通过在PET法中使用的装置来测定该γ射线，可以将化合物(1-0)的体内分布定量且经时地成像。因此，通过使用化合物(1-0)，检出被检验者的生物体内的线粒体复合体-1存在的部位，可以将其变化经时地可视化。
化合物(1-0)作为线粒体复合体-1检出试剂是有用的。上述检出试剂包含化合物(1-0)，如果对生物体给药，通过以PET法测量从体内的化合物(1-0)发出的γ射线，从而可以高效率地检出线粒体复合体-1存在的部位。上述检出试剂特别适合于脑内的线粒体复合体-1的检出。
化合物(1-0)作为帕金森病的诊断药也是有用的。根据上述诊断药，通过高效率地检出生物体中的线粒体复合体-1存在部位，就能够诊断帕金森病。
上述线粒体复合体-1检出试剂和帕金森病的诊断药，例如，可以通过在任意的缓冲液中溶解化合物(1-0)来制造。此时，上述检出试剂和诊断药可以作为溶液来提供，并且在上述缓冲成分以外，还可以含有表面活性剂、防腐剂、稳定剂等其它成分。给药方法通常是静脉内给药。
作为上述线粒体复合体-1检出试剂和帕金森病的诊断药的对象，例如，可以列举人类、猴、小鼠和大鼠，但不限于这些。在使用本实施方式相关的化合物(1-0)、进行PET测定时，其测定方法没有特别限制，可以按照公知的方法实施。
实施例
以下，列举实施例来更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
另外，在以下的实施例中，除非另有说明，在硅胶柱色谱法中使用的硅胶是使用关东化学公司生产的硅胶60N(Silica Gel 60N)(快速色谱法用)40～50μm。
＜实验1＞
BCPP-EF的合成
按照下述工序1～工序10，合成BCPP-EF。以下，说明各工序。
工序1
按照合成流程图(a)，合成化合物3。
在水(440mL)中溶解糠氯酸1(50g、0.29mol)，加入碳酸钠(15.3g、0.14mol)。向该溶液中，0℃下加入叔丁基肼盐酸盐(36.9g、0.29mol)。搅拌得到的反应液2.5小时。过滤析出的固体，以冷水洗净后，干燥在减压下析出的固体，得到中间体2。
向中间体2中加入醋酸(500mL)，将反应液回流30分钟。在减压下蒸馏出反应液中的醋酸后，用二氯甲烷和碳酸氢钠水溶液进行分液。水洗有机层后，以无水硫酸镁干燥，减压下浓缩有机层。用硅胶色谱(庚烷:氯仿＝7:3～0:10)精制浓缩的残渣，得到作为淡黄色固体的化合物3(52.9g、收率80％)。
工序2
按照合成流程图(b)，合成化合物4。
向化合物3(2g、9mmol)的1,4-二恶烷溶液中，加入氢氧化钾(1.5g、27mmol)水溶液(15mL)，将混合液回流5小时。向冰水中注入得到的混合液，加入浓盐酸，滤取析出的固体(粗体)。以水、庚烷的顺序洗净粗体，得到化合物4(1.6g、收率91％)。
工序3
按照合成流程图(c)，合成化合物6。
向二乙二醇(22.8mL、0.24mol)和3,4-二氢-2H-吡喃(21.7mL、0.24mol)的、THF(40mL)和二氯甲烷(400mL)的混合溶液中，在-10℃下加入对甲苯磺酸一水合物(4.57g、24mmol)，搅拌反应液1小时。向反应液中加水，用醚进行分液。用饱和食盐水洗净有机层，用无水硫酸钠干燥。此后，在减压下浓缩有机层。用硅胶色谱(庚烷:醋酸乙酯＝50:50～0:100)精制浓缩的残渣，得到作为无色液体的化合物6(14g、收率31％)。
工序4
按照合成流程图(d)，合成化合物9。
在氩气氛围下，0℃下向氢化钠(1.51g、37.8mmol(60％、在油中))中，慢慢加入6-氯-3-吡啶甲醇7(5g、34.8mmol)的DMF溶液(30ml)。此后，向反应液中进一步加入1-氯-3-甲基-2-丁烯8(4.11mL、36.5mmol)，在25℃下搅拌反应液1小时。对残留的原料，进一步加入1-氯-3-甲基-2-丁烯(2.0mL、17.7mmol)，在50℃下搅拌反应液1小时。
对残留的原料，加入氢化钠(1.51g、37.8mmol(60％、在油中))和1-氯-3-甲基-2-丁烯(8.0mL、71.1mmol)，在50℃下搅拌反应液30分钟。向反应液中加水，用醋酸乙酯进行分液。以饱和食盐水洗净有机层，以无水硫酸钠干燥。此后，在减压下浓缩有机层。用硅胶色谱(庚烷:醋酸乙酯＝95:5～85:15)精制浓缩的残渣，得到作为无色液体的化合物9(7.0g、收率96％)。
工序5
按照合成流程图(e)，合成化合物10。
在氩气氛围下，0℃下向氢化钠(320mg、8mmol(60％、在油中))中，慢慢加入化合物6(1.90g、10mmol)的1,4-二恶烷溶液(8ml)，在60℃下搅拌反应液30分钟。此后，向反应液中加入化合物9(0.84g、4mmol)的1,4-二恶烷溶液(4ml)，以微波在170℃下搅拌反应液30分钟。将反应液冷却后，向反应液中加入饱和氯化铵水溶液，用氯仿进行分液。以水和饱和食盐水洗净有机层，以无水硫酸镁干燥。此后，减压下浓缩有机层。用硅胶色谱(庚烷:醋酸乙酯＝95:5～85:15)精制浓缩的残渣，得到化合物10(4.9g、收率96％)。
工序6
按照合成流程图(f)，合成化合物11。
在氩气氛围下，向叔丁醇钾(15.3g、0.13mol)的DMSO溶液(130mL)中，慢慢加入化合物10(5g、13.6mmol)，在60℃下搅拌反应液40分钟。将反应液冷却后，向反应液中加入饱和氯化铵水溶液，用醋酸乙酯进行分液。以水和饱和食盐水洗净有机层，以无水硫酸镁干燥。此后，减压下浓缩有机层。用硅胶色谱(庚烷:醋酸乙酯＝80:20)精制浓缩的残渣，得到作为淡黄色液体的化合物11(2.7g、收率68％)。
工序7
按照合成流程图(g)，合成化合物12。
在氩气氛围下，向化合物4(1.43g、7.04mmol)、化合物11(2.3g、7.74mmol)和三苯基膦(2.77g、10.6mmol)的THF溶液(100mL)中，加入偶氮二甲酸二异丙酯(2.09mL、10.6mmol)，25℃下搅拌反应液16小时。向反应液中加水，用醋酸乙酯进行分液。以饱和食盐水洗净有机层，以无水硫酸镁干燥。此后，减压下浓缩有机层。用硅胶色谱(第1次，庚烷:醋酸乙酯＝90:10～60:40；第2次，氯仿:甲醇＝99:1)精制浓缩的残渣，得到化合物12(2.7g、收率80％)。
工序8
按照合成流程图(h)，合成化合物13。
向化合物12(96mg、7.2mmol)的甲醇溶液(1mL)中，加入对甲苯磺酸一水合物(2mg、0.01mmol)，在25℃下搅拌反应液16小时。在减压下浓缩反应液后，用硅胶色谱(庚烷:醋酸乙酯＝70:30～20:80)精制浓缩的残渣，得到作为无色固体的化合物13(96.9mg、收率99％)。
工序9
按照合成流程图(i)，合成化合物14。
向化合物13(450mg、1.13mmol)、三乙胺(1.58mL、11.3mmol)和4-二甲氨基吡啶(13.8mg、0.11mmol)的二氯甲烷溶液(10mL)中，-10℃以下加入对甲苯磺酰氯(0.32g、1.69mmol)，搅拌反应液16小时。向反应液中加水，用二氯甲烷提取2次目的化合物。以饱和食盐水洗净有机层，以无水硫酸镁干燥。此后，减压下浓缩有机层。用硅胶色谱(庚烷:醋酸乙酯＝90:10～40:60)精制浓缩的残渣，得到化合物14(610mg、收率97％)。
工序10
按照合成流程图(j)，合成化合物15(BCPP-EF)。
在氩气氛围下，在25℃下搅拌化合物14(110mg、0.2mmol)和四丁基氟化铵(0.6mL、0.6mmol(THF中、1.0mol/L))的混合溶液16小时。在减压下浓缩反应液后，用硅胶色谱(庚烷:醋酸乙酯＝90:10～50:50)精制浓缩的残渣，得到作为BCPP-EF的化合物15(70mg、收率88％)。
BCPP-EM的合成
按照上述工序1～工序8和下述工序11，合成BCPP-EM。以下，说明工序11。
工序11
按照合成流程图(k)，合成化合物16。
在氩气氛围下，0℃下向氢化钠(12mg、0.3mmol(60％、在油中))中，加入化合物13(80mg、0.2mmol)的1,4-二恶烷溶液(2mL)。此后，向反应液中加入甲基碘(125μL、2mmol)，在密封管容器内，25℃下搅拌反应液1小时。将反应液冷却后，向反应液中加水，用醋酸乙酯进行分液。以饱和食盐水洗净有机层，以无水硫酸镁干燥。此后，在减压下浓缩有机层。用硅胶色谱(庚烷:醋酸乙酯＝70:30～30:70)精制浓缩的残渣，得到化合物16(62mg、收率75％)。
[18F]BCPP-EF的合成
按照上述工序1～工序9和下述合成流程图(l)，合成[18F]BCPP-EF(化合物17)。
标记合成使用[18F]标记化合物自动合成装置(F-110、F-120、住友重机械工业、东京)进行。从靶子回收，将在阴离子交换树脂AG1-X8(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,USA)中截留的[18F]F-以40mMK2CO3水溶液(0.5mL、20μmol)进行脱附。在得到的溶液中加入K[2,2,2](Merck、Darmstadt、Germany)(15mg、20μmol)的CH3CN(Aldrich、St.Louis、MO、USA)溶液(2mL)，在He气流下，将反应液共沸脱水。在残渣中加入CH3CN(1mL)共沸脱水2次，配制除去水分的[18F]KF/K[2,2,2]。在[18F]KF/K[2,2,2]中，加入前体(化合物14、6.29mg、11.3μmol)的CH3CN(Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,MO,USA)溶液(1.5mL)，在80℃进行氟化10分钟。在得到的反应混合物中加入CH3CN和H2O的混合液(CH3CN:H2O＝3:7、1.5mL)，使反应停止。此后，将反应液移送到HPLC注射器。再以CH3CN和H2O的混合液(CH3CN:H2O＝3:7、1.5mL)共同洗涤反应容器，同样地将上述混合液移送到HPLC注射器。由HPLC[柱、Inertsil ODS-3(5μ、10.0×250mm、GLSciences、东京)、流动相CH3CN:H2O＝500:500、流速6mL/min、波长254nm]精制粗产物。将保持时间为17.4分钟的放射性峰值分馏，并将分馏得到的溶液以蒸发器浓缩干燥。此后，在0.1％Tween80/生理盐水(5mL)中再溶解浓缩干燥过的产物，回收[18F]BCPP-EF(2.36GBq)。
采集一部分产物，由HPLC[柱、Finepak SIL C18S(5μ、4.6×150mm、日本分光、东京)、流动相CH3CN:30mMCH3ONH4:CH3COOH＝500:500:2、流速2mL/min、波长254nm]分析。放射化学收率、比放射能(specific radioactivity)和放射化学纯度分别是16.98％(decay corrected)、84.3GBq/μmol、100％。全合成时间从照射结束时(End of bombardment、EOB)起大约是63分钟。
关于[18F]BCPP-EF，在以3.54mg前体(化合物14)进行合成的情况下，放射化学收率是4.02％。通过将上述前体增加到6.29g，放射化学收率上升到16.98％。得到的最终产物的放射化学纯度是100％、比放射能是84.3GBq/μmol，在PET实验中可以得到充分的纯度和收获量。
[11C]BCPP-EM的合成
按照上述工序1～工序8和下述合成流程图(m)，合成[11C]BCPP-EM。
用回旋加速器(HM-18、住友重机械工业、东京)，将质子加速到18MeV。另一方面，准备以大致17kg/cm2的压力封有纯氮气体(G等级，Japan Fine Products Corp.,神奈川)的靶气。向上述靶气，以大致20μA的电流值照射上述质子，通过14N(p,α)11C核反应制造[11C]。在靶气内，[11C]以[11C]CO2的化学形式存在。以自动合成装置(住友重机械工业、东京)，将包含上述[11C]CO2的靶气导入至冷却的0.1MLiAlH4/四氢呋喃(THF)溶液(500μL)(ABX Advanced BiochemicalCompounds GmbH,Germany)。此时的上述靶气的流量是400mL/min。导入上述靶气后，在得到的反应液中将氮气(气体流量200mL/min)鼓泡，加热到200℃，蒸馏出THF。蒸馏出THF后，将反应器一旦冷却，向反应溶液中加入氢碘酸(Nacalai Tesque、京都、0.5ml)，加热到150℃。将生成的[11C]甲基碘进行蒸馏，通过使其通过加热到200℃的AgOTf(Sigma-Aldrich Co.,美国)柱，从而制成[11C]三氟甲磺酸甲酯。立即将通过柱的[11C]三氟甲磺酸甲酯导入前体(化合物13)的溶液。
在2-丁酮(和光纯药工业、东京、0.3mL)中溶解前体(化合物13、2mg)。向得到的前体溶液中加入NaH(约2mg)来配制。向得到的前体溶液中，导入蒸馏过的上述[11C]三氟甲磺酸甲酯，在放射能达到平衡的时点停止上述[11C]三氟甲磺酸甲酯的导入。此后，在40℃下以5分钟的条件进行前体的甲基化反应。
用高效液相色谱(固定相Megapak SIL C18-107.6×250mm(日本分光、东京)、流动相乙腈(和光纯药工业、大阪):30mM醋酸铵水溶液(和光纯药工业、大阪)＝450:550、流速6mL/min、波长254nm)，分馏[11C]BCPP-EM的溶液。将分馏过的溶液用蒸发器(住友重机械工业、东京)蒸馏出洗脱液，在残渣中加入生理食盐溶液(大塚制药、东京)，制成最终制剂。
测定最终制剂的放射能(Hitachi Aloka Medical、东京)。将最终制剂的一部分用高效液相色谱(固定相Finepack C18-S 4.6×150mm(日本分光、东京)、流动相乙腈(和光纯药工业、大阪):30mM醋酸铵(NacalaiTesque Inc.,京都):醋酸(和光纯药工业、大阪)＝500:550:2、流速2mL/min、波长254nm)进行分析。
在向上述靶气照射上述质子大致60分钟的情况下，[11C]BCPP-EM的生产量为，0.26-2.01GBq、放射化学纯度是93.6％以上。
在分离HPLC中的[11C]BCPP-EM的前体(化合物13)的保持时间是5.2分钟、[11C]BCPP-EM的保持时间是10分钟。在分析HPLC中的[11C]BCPP-EM的保持时间是4.0分钟。
＜实验2＞
BMS-P的合成
按照下述工序1～工序12，合成BMS-P(化合物15”)。以下，说明各工序。
工序1
向化合物5a(10.00g、68.41mmol)、三乙胺(10.38g、102.6mmol)和4-二甲氨基吡啶(836mg、6.841mmol)的二氯甲烷溶液(100mL)中，在冰冷下，分批添加对甲苯磺酰氯(13.69g、71.83mmol)。添加后，在冰冷下搅拌反应液16小时。向反应液中注入冰水(200mL)、以二氯甲烷(100mL)提取目的化合物。以饱和食盐水(100mL)洗净有机层，以硫酸镁干燥。此后，减压蒸馏出有机层的溶剂。以中压分馏(硅胶120g、己烷/醋酸乙酯＝5/1～1/1)精制得到的残渣，得到作为无色液体的化合物5b(18.38g、收率89.4％)。
工序2
在氩气氛围下，向反应器中加入氯化钙(29.92g、269.6mmol)、乙醇(390ml)和THF(390ml)，继续在冰冷下将硼氢化钠(20.40g、539.2mmol)分批投入反应器中。投入硼氢化钠后，在冰冷下搅拌反应液2.5小时。在冰冷下，向反应液中分批投入化合物7’(30.09g、134.8mmol)，在冰冷下，搅拌反应液30分钟。向冰水(1.5L)中注入反应液后，边搅拌氯化铵(300g)边加入至反应液中。以醋酸乙酯(1L×2)提取目的化合物。以水(1L)、饱和食盐水(1L)依次洗净有机层。以硫酸镁干燥有机层后，减压蒸馏出有机层的溶剂，得到作为淡黄褐色固体的化合物9’(16.12g、收率66.0％)。
工序3
向化合物9’(17.07g、94.21mmol)和对甲苯磺酸一水合物(18.11g、94.21mmol)的二氯甲烷溶液(500mL)中，在冰冷下，加入3,4-二氢-2H-吡喃(23.55mL、259.2mmol)，室温下搅拌反应液18小时。以饱和碳酸氢钠水(500mL)、饱和食盐水(500mL)依次洗净有机层。以硫酸镁干燥有机层后，减压蒸馏出有机层的溶剂，得到作为淡黄褐色液体的化合物10”’(42.72g、粗收率170.9％)。将化合物10”’未加工地直接供给下工序。
工序4
在氩气氛围下，在氢化铝锂(7.988g、210.5mmol)的THF悬浊液(100mL)中，冰冷下滴加未加工的化合物10”’(42.72g、Net＝24.99g、94.21mmol)的THF溶液(200ml)。此后，室温下搅拌反应液1小时。冰冷下，向反应液中依次滴加水(8mL)、15％氢氧化钠水溶液(8mL)、水(24mL)，停止反应。过滤得到的混合物，以醋酸乙酯(600mL)洗净浆液。以饱和食盐水(300mL)洗净得到的滤液，以硫酸钠干燥。此后，减压蒸馏出滤液的溶剂。以中压分馏(硅胶200g、己烷/醋酸乙酯＝1/1～仅醋酸乙酯)精制得到的残渣，得到作为淡黄褐色液体的化合物16’(14.98g、从化合物9’的收率71.2％)。
工序5
在氩气氛围下，在化合物16’(14.98g、67.09mmol)的DMF溶液(60mL)中，冰冷下分批添加氢化钠(3.489g、作为60％换算是87.22mmol)，室温下搅拌反应液1小时。接着，向反应液中加入化合物8(10.53g、100.7mmol)，在50℃下搅拌3小时。向反应液中加入冰水(300mL)，以醋酸乙酯(300mL)提取目的化合物。以水(300mL)、饱和食盐水(300mL)依次洗净有机层。以硫酸镁干燥有机层后，减压蒸馏出有机层的溶剂。以中压分馏(硅胶200g、己烷/醋酸乙酯＝10/1～1/1)精制得到的残渣，得到作为淡黄褐色液体的化合物17’(15.40g、收率78.8％)。
工序6
向化合物17’(15.40g、52.85mmol)的甲醇溶液(154mL)中，加入对甲苯磺酸一水合物(502.7mg、2.643mmol)，室温下搅拌反应液18小时。此后，加热回流反应液8小时。浓缩反应液，以中压分馏(硅胶200g、己烷/醋酸乙酯＝1/1～仅醋酸乙酯)精制得到的残渣，得到作为淡黄褐色液体的化合物18’(10.78g、收率98.4％)。
工序7
在氩气氛围下，向化合物18’(10.76g、51.91mmol)的二恶烷溶液(100mL)中，冰冷下分批添加氢化钠(2.430g、作为60％换算是60.74mmol)，室温下搅拌反应液15分钟。接着，加入化合物5b(18.24g、60.74mmol)的二恶烷溶液(60mL)，50℃下搅拌反应液2小时。向反应液中加入冰水(300mL)，以醋酸乙酯(200mL×2)提取目的化合物。以饱和食盐水(200mL)洗净有机层。以硫酸钠干燥有机层后，减压蒸馏出有机层的溶剂。以中压分馏(硅胶200g、己烷/醋酸乙酯＝4/1～仅醋酸乙酯)精制得到的残渣，得到作为淡黄褐色液体的化合物19(14.21g、收率81.6％)。
工序8
在氩气氛围下，向化合物19(14.21g、43.67mmol)的DMSO溶液(375mL)中，添加叔丁醇钾(49.00g、436.7mmol)，60℃下搅拌反应液30分钟。将反应液注入冰水(1L)中，以醋酸乙酯(500mL×4)提取目的化合物。将有机层以饱和食盐水(500mL)洗净，并以硫酸钠干燥。此后，减压蒸馏出有机层的溶剂。以中压分馏(硅胶200g、己烷/醋酸乙酯＝1/1～仅醋酸乙酯)精制得到的残渣，得到作为淡黄色液体的化合物11”(4.201g、收率37.1％)。
工序9
在氩气氛围下，向化合物4(3.185g、15.72mmol)、化合物11”(4.201g、15.72mmol)和三苯基膦(6.185g、23.58mmol)的THF溶液(200mL)中，冰冷下，滴加偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD、4.768g、23.58mmol)的THF溶液(23mL)，室温下搅拌反应液16小时。浓缩反应液，以中压分馏(硅胶200g、己烷/醋酸乙酯＝4/1～1/1、2次)精制得到的残渣，得到作为微黄色液体的化合物12”(431g、收率6.1％)。
工序10
向化合物12”(430mg、0.9515mmol)的甲醇溶液(4.3mL)中，加入对甲苯磺酸一水合物(9.05mg、0.0457mmol)，室温下搅拌反应液18小时。进一步在60℃下搅拌反应液4小时。浓缩反应液，以中压分馏(硅胶60g、己烷/醋酸乙酯＝3/1～仅醋酸乙酯)精制得到的残渣，得到作为无色液体的化合物13”(242mg、收率69.2％)。在图1中表示化合物13”的NMR图谱。
工序11
向化合物13”(140.6mg、0.3822mmol)、三乙胺(386.7mg、3.822mmol)和4-二甲氨基吡啶(4.67mg、0.03822mmol)的二氯甲烷溶液(3mL)中，在-10℃下添加对甲苯磺酰氯(109.3mg、0.5734mmol)。添加对甲苯磺酰氯后，在-10℃下搅拌反应液16小时。向反应液中注入冰水(20mL)、以二氯甲烷(20mL)提取目的化合物。以饱和食盐水(10mL)洗净有机层，以硫酸镁干燥。此后，减压蒸馏出有机层的溶剂，得到作为红褐色且粘稠的液体的化合物14”(201.2mg、粗收率100.8％)。化合物14”未加工地直接供给下工序。
工序12
在THF(2mL)中溶解未加工的化合物14”(195mg、Net＝193.5mg、0.3706mmol)，加入1M的TBAF/THF(2mL)、TBAF·xH2O(500mL)，室温下搅拌反应液2小时。向反应液中注入冰水(50mL)、以醋酸乙酯(50mL)提取目的化合物。以饱和食盐水(20mL)洗净有机层，以硫酸镁干燥。此后，减压蒸馏出有机层的溶剂。以中压分馏(硅胶60g、己烷/醋酸乙酯＝4/1～1/1)精制得到的残渣，与从化合物13”(50mg)另外配置和精制的批次合并，得到作为红褐色液体的化合物15”(BMS-P)(47.6mg、收率25.4％)。
对线粒体复合体-1的结合亲和性的评价
作成被检验物质和阳性物质的剂量-反应曲线，算出被检验物质与阳性物质对示踪剂与线粒体复合体-1(受体)的结合抑制50％的浓度(IC50值)和绝对抑制常数(Ki)。作为被检验物质，使用BMS、BCPP-EF、BCPP-BF、BCPP-PF、BCPP-EM和BMS-P。在以下表示详细情况。
线粒体组分原液的配制
称量(湿重量)动物组织，加入2倍量的匀浆缓冲液(250mmol/L的蔗糖、1mmol/L的琥珀酸和0.2mmol/L的EDTA的10mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.40))，在冰冷下进行均质。此后，离心分离(1200×g、4℃、20分钟)均质过的悬浊液。采集上清液，离心分离(26000×g、4℃、15分钟)。采集沉淀的残渣，加入匀浆缓冲液并均质化为100mg tissue eq./mL。得到的线粒体组分原液在-80℃保存到使用时。线粒体组分的蛋白质浓度使用BCA蛋白浓度测定试剂(BCAProtein Assay Reagent)(PIERCE公司生产)测定。动物组织使用大鼠的脑和牛的心脏。
线粒体组分溶液的配制
以缓冲液稀释上述线粒体组分原液，配制最终浓度的2倍浓度的线粒体组分溶液(使用时配制)。线粒体组分溶液的最终浓度制成45μg蛋白质/mL。
被检验物质溶液的配制
以DMSO逐步稀释被检验物质，配制最终浓度的100倍浓度的溶液。进一步将配制的各浓度溶液以Milli-Q水稀释10倍，由此配制最终浓度的10倍浓度的被检验物质溶液(使用时配制)。
被检验物质溶液的最终浓度成为以下的浓度范围：
BMS：3×10-11～3×10-8mol/L
BCPP-EF：1×10-10～1×10-7mol/L
BCPP-BF：3×10-11～3×10-8mol/L
BCPP-PF：1×10-10～1×10-7mol/L
BCPP-EM：3×10-10～3×10-7mol/L
BMS-P：1×10-7～1×10-4mol/L
阳性物质溶液的配制
称量阳性物质，以DMSO溶解。以DMSO逐步稀释得到的溶液，由此配制最终浓度的100倍浓度的溶液。进一步将配制的各浓度溶液以Milli-Q水稀释10倍，由此配制最终浓度的10倍浓度的阳性物质溶液(使用时配制)。阳性物质使用鱼藤酮。阳性物质的最终浓度成为3×10-11～3×10-8mol/L。
取代物质溶液的配制
称量取代物质，以DMSO溶解，由此配制最终浓度的100倍浓度的溶液。进一步将配制的溶液以Milli-Q水稀释10倍，由此配制最终浓度的10倍浓度的取代物质溶液(使用时配制)。取代物质使用鱼藤酮。取代物质的最终浓度成为1×10-5mol/L。
示踪剂溶液的配制
以缓冲液稀释示踪剂原液，由此配制最终浓度的10倍浓度的示踪剂溶液(使用时配制)。示踪剂使用二氢鱼藤酮(Dihydrorotenone)[2-异丙基-H(N)(2-isopropyl-H(N))]。示踪剂的最终浓度为，第1次是4.5nmol/L、第2次是4.4nmol/L、第3次是4.5nmol/L。
测定程序
按照以下的顺序实施测定。在各浓度中，配制2例样品，分别测定3次。
1：向用于算出非特异性结合的管中，添加100μL取代物质溶液(DMSO的最终浓度：1％)。向用于算出总结合的管中，添加100μL的10％DMSO(DMSO的最终浓度：1％)。向用于算出被检验物质或阳性物质的抑制率的管中，分别添加100μL的被检验物质溶液或阳性物质溶液(DMSO的最终浓度：1％)。
2：向各管中添加缓冲液(300μL)。
3：向各管中添加示踪剂溶液(100μL)。
4：向各管中添加线粒体组分溶液(500μL)。
5：将各管包含的反应液在22℃下培育30分钟。
6：由细胞收集器过滤反应液(GF/C、Whatman)，以50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.40、3mL)洗净过滤过的滤纸3次。
7：向用于测定的多剂量容器中移入滤纸，添加液体闪烁体(PICO-FLUORTM PLUS、5mL)，以液体闪烁计数器测定放射量(测定时间2分钟)。
抑制率的算出
抑制率由“100-结合率”式算出。
结合率：[(B-N)/(B0-N)]×100(％)
B：在被检验物质存在下的结合放射量(个别值)
B0：在被检验物质不存在下的总结合放射量(平均值)
N：非特异性结合放射量(平均值)
将抑制率在0％以下的情况作为0％，将大于100％的情况作为100％，算出抑制率。
关于阳性物质，也与被检验物质同样算出抑制率。
剂量-反应曲线的制成(IC50值的算出)
剂量-反应曲线是通过将在被检验物质存在下的特异性结合放射能(B-N)和不存在下的总结合放射能(B0-N)之比((B-N)/(B0-N))进行Logit变换后，相对于被检验物质的最终浓度的常用对数值作图的按照Logit-Log模型而制成。
剂量-反应曲线的回归使用下述回归式。
Y＝aX+b
(Y＝logit、y＝ln(y/(1-y))、y＝(B-N)/(B0-N))
(X＝log x、x表示被检验物质的最终浓度。)
(a＝常数、b＝常数)
从得到的回归式算出IC50值。回归时，对于被检验物质的最终浓度的抑制率平均值超出5～95％范围的值，不予以采用，使用范围内的连续增加的抑制率，算出IC50值。
Ki值的算出
使用在IC50值的算出的试验中使用过的示踪剂浓度(L)、得到的IC50值、和相对于通过Scatchard解析的试验求出的示踪剂的线粒体复合体-1的Kd值，由下式算出被检验物质和阳性物质的Ki值。
Ki = IC 50 1 + L Kd
在图2中表示剂量-反应曲线。可知在任意的被检验物质中，均浓度依赖性地与线粒体复合体-1结合。BCPP-BF显示最低的IC50，暗示相对线粒体复合体-1的亲和性高。另一方面，BMS-P显示比其它被检验物质更高的IC50，暗示以弱亲和性与线粒体复合体-1结合。
使用大鼠活性切片(living slices)的评价
将大鼠用水合氯醛(400mg/kg；I.P.)麻醉、断头。此后，立即将脑取样、充分冷却，浸在冰冻果子露状(sherbet state)的ACSF(人工脑脊髓液)中。切出所得到的脑的必要块，并粘附在振动切片机HM650V(Thermo Fisher Scientific,Inc.,Waltham,USA)的固定台上。此后，制作300μm厚的脑切片。将切出的脑切片在以O2鼓泡的24ml的ACSF中浸30分钟，使细胞的活动平静。此后，向ACSF中加入20μL介质(Vehicle)或鱼藤酮(Rotenone、各烧杯中调整成为2nM、20nM、200nM、20000nM的浓度)，鼓泡30分钟。进一步向ACSF中加入1MBq/ml的[18F]BMS或[18F]BCPP-EF，继续鼓泡30分钟。鼓泡结束后，取出脑切片，移入100ml的新的ACSF。此后，进一步将ACSF鼓泡30分钟，洗净剩余的RI。此后，在OHP片上排列上述脑切片，以扫描仪(EPSON：GT-600)将图像摄影。此后，将排列有上述脑切片的OHP片放置在对射线具有灵敏度的图像板(imaging plate)(ST-VI、Fujifilm、东京)上，在暗处放置(接触)1小时左右。上述图像板以Typhoon图像分析仪FLA-7000(Typhoon Image Analyzer FLA-7000)(Fujifilm、东京)进行检出。在图3和图4中表示结果。可知[18F]BCPP-EF比[18F]BMS更容易受到由鱼藤酮引起的结合抑制效果的影响。这暗示[18F]BCPP-EF与[18F]BMS相比，线粒体复合体-1的特异性高。关于[18F]BCPP-BF、[18F]BCPP-PF和[18F]BCPP-EM，也进行同样的实验，确认受到由鱼藤酮引起的结合抑制效果的影响。
鱼藤酮给药大鼠的PET测量
将大鼠以水合氯醛(400mg/kg；I.P.)麻醉，在测量用台上固定。此后，立即从上述大鼠的尾静脉将鱼藤酮(0.1mg/kg/h)或介质进行给药。为了识别给药中脑的位置，实施由Clairvivo-CT(岛津制作所)进行的测量。此后，将测量用台移向Clairvivo PET。在鱼藤酮(0.1mg/kg/h)或介质的给药结束后，立即从上述大鼠的尾静脉将[18F]BMS或[18F]BCPP-EF以约8MBq/只、大丸药进行给药，进行60分钟测量。测量中，通过从上述大鼠的尾静脉将水合氯醛(100mg/kg/hr)持续给药，使大鼠失活。在上述大鼠的小脑、大脑皮层、纹状体和心脏中，观察由鱼藤酮引起的结合抑制效果。在图5和图6中表示其结果。可知在任意的组织中，[18F]BCPP-EF与[18F]BMS相比，通过鱼藤酮的给药，取入量减少。
将大脑中动脉堵塞的大鼠的脑梗塞模型的制作和PET测量
利用光敏反应，使用与人同样地在实际中以血栓堵塞大脑中动脉(middle cerebral artery：MCA)而成的大鼠的脑梗塞(Photochemicallyinduced thrombosis：PIT)模型，进行实验。将大鼠用4％三氟溴氯乙烷(30％O2、70％室内空气)进行麻醉诱导，手术中以1.5～2％的三氟溴氯乙烷浓度进行维持。在手术用显微镜下，沿着左眼窝边缘切开皮肤，以牙钻将头盖骨底部削开约3mm的椭圆形窗(穴)以使得左侧大脑中动脉在硬膜下可见。从上述大鼠的尾静脉将作为光敏剂的玫瑰红(Rose Bengal)(20mg/kg)进行给药，对上述大脑中动脉照射540nm波长的绿光10分钟，使大鼠脑梗塞发病。
在脑梗塞发病前(Normal)、脑梗塞发病后1日(Day-1)和脑梗塞发病后7日(Day-7)的大鼠中，分别以PET法监控脑的缺血损伤部位中的葡萄糖代谢(作为探针，使用[18F]FDG)和线粒体复合体-1的活性(作为探针，使用[18F]BMS或[18F]BCPP-EF)。具体地，从上述大鼠的尾静脉将上述探针以6～8MBq/只进行大丸药(bolus)给药，进行60分钟测量。测量中，从上述大鼠的尾静脉进行水合氯醛(100mg/kg/hr)持续给药，由此使大鼠失活。在图7中表示其结果。在作为探针使用[18F]FDG的情况下，可知在缺血损伤部位中，[18F]FDG的蓄积增加。这暗示[18F]FDG作为神经损伤后的评价用PET探针不适合。另一方面，在作为探针使用[18F]BMS或[18F]BCPP-EF的情况下，可知在缺血损伤部位中，没有探针的蓄积，可以正确地评价线粒体复合体-1的活性。特别在作为探针使用[18F]BCPP-EF的情况下，可知与[18F]BMS相比，在缺血损伤部位和正常部位之间，探针的蓄积程度更清晰地区分。这暗示[18F]BCPP-EF作为评价脑内功能的探针是适合的。
使用猴的PET测量
进行在猴脑内的由鱼藤酮给药引起的PET探针的结合抑制实验、伴随老化的脑内的线粒体复合体-1的活性变化和帕金森病模型的猴脑内的线粒体复合体-1的活性评价。在所有的实验中，PET测量都由以下的方法进行。
分别作为被检验动物的静脉内给药路径，确保头静脉或下肢大隐静脉，作为动脉血采血用路径，确保股动脉或胫后动脉。首先，测量[18F]BMS、[18F]BCPP-EF或[11C]BCPP-EM的放射量。从在被检验动物中留置的留置针，作为放射性药剂，[18F]BMS和[18F]BCPP-EF以300～500MBq的给药量、[11C]BCPP-EM以800～1200MBq的给药量在静脉内以30秒钟将全部量进行给药。与上述放射性药剂的给药开始同时，开始辐射(emission)测量(10秒6帧、30秒6帧、1分钟12帧、3分钟25帧、5分钟6帧，共计121分钟、55帧)。
由鱼藤酮给药引起的向线粒体复合体-1的结合抑制实验
在由猴脑内的鱼藤酮给药引起的PET探针的结合抑制实验中，将鱼藤酮以成为0.1mg/kg/hr的方式通过静脉内注射对被检验动物进行给药。此后，作为探针，将[18F]BMS、[18F]BCPP-EF或[11C]BCPP-EM进行给药，进行PET测量。在图8和图9中表示结果。可知[18F]BCPP-EF和[11C]BCPP-EM，比[18F]BMS更容易受到由探针引起的结合抑制效果的影响。即使在猴的情况下，也可知[18F]BCPP-EF和[11C]BCPP-EM，与[18F]BMS相比，线粒体复合体-1的特异性高。
伴随老化的脑内的线粒体复合物-1的活性变化
在图10中显示幼龄猴(5岁)和老龄猴(22岁)的PET测量结果。作为PET探针，使用[18F]BCPP-EF。可知，幼龄猴与老龄猴相比，PET探针在脑内大量蓄积。这暗示由于老化造成脑内的线粒体复合物-1的活性减少。
在帕金森病模型的猴脑内的线粒体复合体-1的活性评价
通过PET测量比较在正常猴和帕金森病模型的猴的脑内的线粒体复合体-1的活性。作为PET探针，使用[18F]BCPP-EF。帕金森病模型的猴如以下方式准备。在雄性幼龄食蟹猴(体重3～6kg)中，将选择性损伤多巴胺神经的MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)，以每周1次的进度、在6个月期间内，作为MPTP的总量为15～20mg进行给药。在MPTP的给药时，边确认上述食蟹猴的健康状态边进行。通过观察上述食蟹猴抓举诱饵的样子，评价四肢运动功能损伤的程度，同时使用PET测量，通过测量多巴胺再吸收部位的降低，最终确认作为帕金森病状态的情况。在图11中表示结果。可知在帕金森病模型的猴中，与正常的猴相比，在脑内蓄积的PET探针的量少。这暗示帕金森病的发病和线粒体复合体-1的活性具有相关关系。29 -->

Claims (3)

1.一种以式(1-0)表示的化合物，
式(1-0)中，R表示-O(CH2)n-、-O(CH2)nOC2H4-、-CH2O(CH2)n-或-CH2O(CH2)nOC2H4-，n表示1～5的整数，Q1表示F或-OCH3。
2.如权利要求1所述的化合物，其中，
Q1为18F或-O11CH3。
3.一种以式(2-0)表示的化合物，
式(2-0)中，R表示-O(CH2)n-、-O(CH2)nOC2H4-、-CH2O(CH2)n-或-CH2O(CH2)nOC2H4-，n表示1～5的整数，Q2表示取代磺酰氧基、卤素原子或羟基。
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