CN104522206A - 一种黑茶酵素及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于酵素技术领域，具体涉及一种黑茶酵素及其制备方法和在制备治疗便秘药物中的用途。本发明提供一种黑茶酵素的制备方法包括杀青、揉捻、渥堆、二次发酵、酶解、喷雾干燥，最终得到球形颗粒的黑茶酵素。本发明黑茶酵素的制备方法工艺稳定，产率高，制得的黑茶酵素可有效治疗便秘，具有通便润肠、排毒美容等功效。

Description

一种黑茶酵素及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于酵素技术领域，具体涉及一种黑茶酵素及其制备方法和在治疗便秘药物中的用途。

背景技术

黑茶，是中国六大茶类之一，是中国特有的一大茶类，属于后发酵茶，主要利用微生物发酵以及湿热作用的方式制成的一种茶叶，因制造过程中往往要堆积发酵较长时间，所以叶片大多呈现暗褐色，因此被人们称为黑茶。黑茶在中国的云南、湖南、广西、四川、湖北等地有加工生产。黑茶类产品普遍能够长期保存，而且有越陈越香的品质。黑茶按地域分布，主要分类为湖南黑茶（茯茶）、四川黑茶（边茶）、藏茶、云南黑茶（普洱茶）、广西六堡茶、湖北老黑茶及陕西黑茶（茯茶）（俗称黑五类）。

湖南黑茶是以在特定区域内生长的安化云台山种等适制安化黑茶的茶树品种鲜叶为原料，按照特定加工工艺生产的黑毛茶，以及用此黑毛茶为原料，按照特定加工工艺生产的具有独特品质特征的各类黑茶成品。茶树有性群体品种之一。原产湖南省安化县云台山，现分布在湘中、湘东、湘北等主要茶区。属灌木型，中叶类，一般叶长8-10cm，叶宽3-4.5cm，叶片有长椭圆、椭圆或卵圆等多种形状，其中椭圆型居多，叶脉8对左右，大多数叶片平展，叶肉肥厚，叶面隆起，叶质较柔软，色绿富光泽。其中有部分大叶类型，以原产地云台山居多，因此也有云台山大叶种之称。

黑茶制茶工艺一般包括杀青、揉捻、渥堆和干燥四道工序。

黑茶有各种保健效果：黑茶中的咖啡碱、维生素、氨基酸、磷脂等有助于人体消化，调节脂肪代谢，咖啡碱的刺激作用更能提高胃液的分泌量，从而增进食欲，帮助消化。日本学者通过科学检验已证明，黑茶具有很强的解油腻、消食等功能。黑茶还具有良好的降解脂肪、抗血凝、促纤维蛋白原溶解作用和显著抑制血小板聚集，还能使血管壁松弛，增加血管有效直径，从而抑制主动脉及冠状动脉内壁粥样硬化斑块的形成。同时黑茶还具有抗氧化、抗癌、降血压、降血糖、杀菌消炎等作用。

酵素又称为“酶”是各种生物化学反应的催化剂，酵素存在于所有活细胞内，是它激活了细胞之活力，使细胞展现出种种生命迹象。因此，酵素是人体不可缺少的重要物质。酵素分为两大类，体外酵素和体内酵素，人体内的酵素是有限的，随着年龄的增长，酵素会慢慢减少，当体内酵素作用衰弱或减少，疾病就会随之而来，因此人体应该合理的从体外补充酵素来满足新陈代谢的需要，抵抗疾病的侵扰。获得体外酵素的两大途径：一是生食果蔬，二是摄取酵素补充物。生食果蔬可能存在农药污染的问题，这间接影响了酵素的功能。

目前茶酵素的制取通常需要接种菌种，中国专利CN 102613329 B公开了一种生茶酵素的制备方法，该方法需接种灵芝菌种、枯草杆菌菌种、双歧杆菌菌种和醋酸杆菌菌种，其操作繁琐，生产成本高。中国专利CN 102038046 B公开了一种普洱茶酵素粉的制备方法，同样需要接种纳豆菌益生菌。

因此针对目前传统杀青、干燥等加工工艺使茶叶中酵素失活，简单地通过喝冲泡的黑茶显然无法充分地吸收其中的营养成分，容易造成资源的浪费。而目前针对黑茶开发的各类附属产品以及它们的生产工艺又无法达到充分利用黑茶的目的，研发一种黑茶酵素的制备方法以克服现有技术的不足显得尤其重要。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个在于提供一种黑茶酵素的制备方法，该制备方法工艺稳定，产率高。

本发明是通过以下技术方案实现的，一种黑茶酵素的制备方法，包括以下步骤：

（1）杀青：剔除新鲜茶叶中的黄叶、枝梗和杂草，采用热风杀青，控制锅内温度在215~285℃，杀青时间5~10分钟。

（2）揉捻：对步骤（1）杀青后的茶叶进行揉捻，揉捻机转速40~60转/分钟，揉捻时间5~10分钟。

（3）渥堆：将步骤（2）揉捻后茶叶堆放，使用纯水进行喷雾，用水量（kg）为茶叶重量（kg）的20~30%，进行第一次渥堆，第一次渥堆用时25~30天；第一次渥堆后里外翻拌均匀，使用纯水进行喷雾，用水量（kg）为茶叶重量（kg）的15~20%，进行第二次渥堆，第二次渥堆用时20~25天。

（4）二次发酵：对步骤（3）渥堆发酵后的茶叶进行榨汁，所得汁液在4℃下保存；所得茶叶渣与玉米胚芽、白扁豆粕、黑豆粕均匀混合后发酵5~8天，过滤，得到发酵液；将发酵液与汁液进行合并，得到混合液。

（5）酶解：调节步骤（4）混合液的pH值，控制温度60~70℃，加入酶，搅拌下进行酶解3.0~4.0h，得到酶解液；酶解液进行15~20min的煮沸灭酶处理，冷却后调节pH值至中性，然后离心除去沉淀，取上清液。

（6）喷雾干燥：采用喷雾干燥机对步骤（5）得到的上清液进行喷雾干燥，得到的球形颗粒即为黑茶酵素。

进一步的，所述步骤（4）中茶叶渣与玉米胚芽、白扁豆粕、黑豆粕按照重量比（3~5）:2:1:1混合。

进一步的，所述步骤（4）中发酵液与汁液按照体积比（1~2）:1进行合并。

进一步的，所述步骤（5）中调节混合液的pH值为6.0~7.0。

进一步的，所述步骤（5）中加入酶底比为3.0~4.0%的酶。

进一步的，所述步骤（5）中酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和果胶酶中的至少一种。再进一步的，所述酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和果胶酶以重量比1:1:2混合的混合物。

进一步的，所述步骤（6）中上清液以2.5 mL/min的加料速率通过喷嘴进行喷雾干燥，入口温度为135~160℃，出口温度为60~85℃，进风量为320~400NL/h。

本发明所述的新鲜茶叶（例如安化云台山种）是任意单个类型或多个类型混合的采摘后未经处理的新鲜茶叶。其中步骤（1）要求温度迅速达到215~285℃，杀青是利用高温使酶活性降低，以保证茶叶的色泽和风味。杀青适度的特征是手手握彻夜质柔软略带粘性，紧握成团，稍有弹性，嫩茎折而不断，老叶熟而不焦，表面失去光泽，略带清香即可，鲜叶失重30~40%，并且迅速吹凉，使其水分散发，避免叶色变黄。步骤（2）揉捻的开始阶段必须用轻柔，力量逐渐加强，做到卷曲成条，均一。

本发明的第二个目的在于提供由上述制备方法获得的黑茶酵素。

本发明还请求保护由上述制备方法获得的黑茶酵素在制备治疗便秘药物中的用途。本发明实施例4考察了本发明制得的黑茶酵素对慢传输型便秘小鼠模型的影响，结果显示，与模型组小鼠相比，黑茶酵素组小鼠日均排便量、首粒黑便排出时间以及c-kit 阳性细胞面积均具有极显著性差异（p<0.01），这表明黑茶酵素能够明显改善小鼠排便量，增强小鼠肠道推进力并增加肠道ICC 数量，缓解慢传输型小鼠便秘的症状。

因此，与现有技术相比，本发明的优点在于：

（1）本发明利用渥堆发酵产生的益生菌进行二次发酵，使得二次发酵的过程中带有放线菌、黄曲菌等进行发酵，这些微生物能分泌出淀粉酶、氧化酶、蛋白酶等以分解茶叶渣、玉米胚芽和豆粕中的蛋白质等，进一步提高产品保健价值，其中氧化酶可有效降低茶中酚类物质的氧化，减少茶叶中酚类物质对胃肠道的刺激。

（2）本发明黑茶酵素的制备方法工艺稳定，产率高，成本低，大大提高了黑茶资源的利用价值。

（3）本发明制得的黑茶酵素具有通便润肠、排毒美容等功效，且绿色安全，可推广应用。

具体实施方式

以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明所述的黑茶酵素的制备方法进行适当改进、替换功效相同的组分，对于本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明的范围之内。

实施例1、本发明黑茶酵素的制备方法

（1）杀青：剔除新鲜茶叶中的黄叶、枝梗和杂草，称取100kg新鲜黑茶叶，采用热风杀青，控制锅内温度在215℃，杀青时间10分钟。

（2）揉捻：对步骤（1）杀青后的茶叶进行揉捻，揉捻机转速40转/分钟，揉捻时间10分钟；揉捻的开始阶段用轻柔，力量逐渐加强，做到卷曲成条，均一。

（3）渥堆：将步骤（2）揉捻后茶叶堆放，使用纯水进行喷雾，用水量为20kg，进行第一次渥堆，第一次渥堆用时25天；第一次渥堆后里外翻拌均匀，使用纯水进行喷雾，用水量为15kg，进行第二次渥堆，第二次渥堆用时20天。

（4）二次发酵：对步骤（3）渥堆发酵后的茶叶进行榨汁，所得汁液在4℃下保存；所得茶叶渣与玉米胚芽、白扁豆粕、黑豆粕照重量比3:2:1:1均匀混合后发酵5天，过滤，得到发酵液；将发酵液与汁液按照体积比1:1进行合并，得到混合液。

（5）酶解：调节步骤（4）混合液的pH值为6.0，控制温度60℃，加入酶底比为3.0%的木瓜蛋白酶，搅拌下进行酶解3.0h，得到酶解液；酶解液进行15min的煮沸灭酶处理，冷却后调节pH值至中性，然后离心除去沉淀，取上清液。

（6）喷雾干燥：采用喷雾干燥机对步骤（5）得到的上清液进行喷雾干燥，步骤（6）中上清液以2.5 mL/min的加料速率通过喷嘴进行喷雾干燥，入口温度为135℃，出口温度为60℃，进风量为320NL/h，得到的球形颗粒即为黑茶酵素。

实施例2、本发明黑茶酵素的制备方法

（1）杀青：剔除新鲜茶叶中的黄叶、枝梗和杂草，称取100kg新鲜黑茶叶，采用热风杀青，控制锅内温度在285℃，杀青时间6分钟。

（2）揉捻：对步骤（1）杀青后的茶叶进行揉捻，揉捻机转速60转/分钟，揉捻时间5分钟；揉捻的开始阶段用轻柔，力量逐渐加强，做到卷曲成条，均一。

（3）渥堆：将步骤（2）揉捻后茶叶堆放，使用纯水进行喷雾，用水量为30kg，进行第一次渥堆，第一次渥堆用时30天；第一次渥堆后里外翻拌均匀，使用纯水进行喷雾，用水量为的20kg，进行第二次渥堆，第二次渥堆用时25天。

（4）二次发酵：对步骤（3）渥堆发酵后的茶叶进行榨汁，所得汁液在4℃下保存；所得茶叶渣与玉米胚芽、白扁豆粕、黑豆粕照重量比5:2:1:1均匀混合后发酵8天，过滤，得到发酵液；将发酵液与汁液按照体积比2:1进行合并，得到混合液。

（5）酶解：调节步骤（4）混合液的pH值为7.0，控制温度70℃，加入酶底比为4.0%的木瓜蛋白酶和中性蛋白酶以重量比1:1混合的混合物，搅拌下进行酶解4.0h，得到酶解液；酶解液进行15min的煮沸灭酶处理，冷却后调节pH值至中性，然后离心除去沉淀，取上清液。

（6）喷雾干燥：采用喷雾干燥机对步骤（5）得到的上清液进行喷雾干燥，步骤（6）中上清液以2.5 mL/min的加料速率通过喷嘴进行喷雾干燥，入口温度为160℃，出口温度为85℃，进风量为400NL/h，得到的球形颗粒即为黑茶酵素。

实施例3、本发明黑茶酵素的制备方法

（1）杀青：剔除新鲜茶叶中的黄叶、枝梗和杂草，称取100kg新鲜黑茶叶，采用热风杀青，控制锅内温度在250℃，杀青时间8分钟。

（2）揉捻：对步骤（1）杀青后的茶叶进行揉捻，揉捻机转速50转/分钟，揉捻时间9分钟；揉捻的开始阶段用轻柔，力量逐渐加强，做到卷曲成条，均一。

（3）渥堆：将步骤（2）揉捻后茶叶堆放，使用纯水进行喷雾，用水量为25kg，进行第一次渥堆，第一次渥堆用时28天；第一次渥堆后里外翻拌均匀，使用纯水进行喷雾，用水量为18kg，进行第二次渥堆，第二次渥堆用时22天。

（4）二次发酵：对步骤（3）渥堆发酵后的茶叶进行榨汁，所得汁液在-2℃下保存；所得茶叶渣与玉米胚芽、白扁豆粕、黑豆粕照重量比4:2:1:1均匀混合后发酵6天，过滤，得到发酵液；将发酵液与汁液按照体积比1.5:1进行合并，得到混合液。

（5）酶解：调节步骤（4）混合液的pH值为6.5，控制温度65℃，加入酶底比为3.5%的木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和果胶酶以重量比1:1:2混合的混合物，搅拌下进行酶解3.5h，得到酶解液；酶解液进行15min的煮沸灭酶处理，冷却后调节pH值至中性，然后离心除去沉淀，取上清液。

（6）喷雾干燥：采用喷雾干燥机对步骤（5）得到的上清液进行喷雾干燥，步骤（6）中上清液以2.5 mL/min的加料速率通过喷嘴进行喷雾干燥，入口温度为150℃，出口温度为70℃，进风量为350NL/h，得到的球形颗粒即为黑茶酵素。

经称量、计算，实施例1-3的产率如下：

表1

项目	实施例1	实施例2	实施例3
				原料（茶叶）重量	100kg	100kg	100kg
产品（黑茶酵素）重量	18.5kg	19.9kg	22.8kg
				产率	18.5%	19.9%	22.8%

由上表1可知，本发明黑茶酵素的制备方法工艺稳定，产率高，尤其以实施例3的工艺最佳，产率最高。

实施例4、本发明制得的黑茶酵素对慢传输型便秘小鼠模型的影响

1.试验目的

实验组小鼠皮下注射吗啡诱导建立慢传输型便秘小鼠模型，记录小鼠粪便重量，利用活性炭灌胃法试验比较实验组与对照组小鼠结肠传输功能。

材料

无特殊病原体SPF级ICR鼠80只，雌雄各半，体重22-26克；小鼠代谢笼(苏州冯氏实验动物公司)；注射用盐酸吗啡(沈阳第一制药厂，规格10 mg/支)；生理盐水；一抗( sc-168，Santa Cruz Biotechnology，Inc，200 mg/ L)；二抗(羊抗兔抗体，中山生物科技公司)。

试验方法和步骤

3.1 慢传输型便秘小鼠模型的建立

ICR鼠45只，随机分为1个实验组，1个正常对照组和1个模型对照组，每组15只。实验组为：黑茶酵素组。所有小鼠置入45个小鼠代谢笼中，SPF级环境饲养。适应性喂养3天后，实验组和模型对照组小鼠皮下注射盐酸吗啡2.5mg/(kg·d)，正常对照组注射等量生理盐水。每3天记录一次小鼠大便粒数、大便干重及小鼠体重，计算小鼠日均排便重量（g）。以小鼠日均排便量减少，且日均排便量与正常对照组相比具有显著性差异作为慢传输型便秘小鼠模型的建立成功的标志，造模成功后停止注射给药。

小鼠日均排便重量的测定

给与造模成功后（饲养第46天起）的小鼠按照如下给药方案给药，黑茶酵素组小鼠灌胃给药黑茶酵素，给药剂量按照黑茶酵素计15mg/(kg·d)，正常对照组和模型对照组给与蒸馏水。每隔1天记录一次小鼠大便粒数、大便干重及小鼠体重，计算小鼠日均排便重量（g）。小鼠日均排便量与正常组相比减少，表明慢传输型便秘程度增大。

肠道传输功能测定

用活性炭灌胃法测定首粒黑便排出时间。停药1周的所有小鼠禁食24小时，经口灌入100mg/ml活性炭悬液2ml。从活性炭灌胃完毕开始时计时，记录从灌胃到首粒黑便排出的时间。首粒黑便排出时间越长表明慢传输型便秘程度越大。

试验数据的统计学处理

实验数据录入SPSS10.0统计软件包，统计方法选用t检验， p<0.05为差异有显著性意义。

结果

实验结果表明：

（1）与正常组相比，模型组小鼠日均排便量、首粒黑便排出时间以及c-kit 阳性细胞面积均具有极其显著性差异（p<0.01），表明慢传输型便秘小鼠模型建造成功；

（2）与模型组小鼠相比，黑茶酵素组小鼠日均排便量、首粒黑便排出时间具有极显著性差异（p<0.01），这表明黑茶酵素能够明显改善小鼠排便量，增强小鼠肠道推进力，缓解慢传输型小鼠便秘的症状。

表2 黑茶酵素对慢传输型便秘小鼠的影响

项目	粪便重量(g/d)	黑便排出时间 (min)
			正常对照组	11.03±3.22	158±56
模型对照组	3.86±1.98##	383±82##
			黑茶酵素组	8.64±2.48**	198±70**

##与正常对照组比较， p<0.01； **与模型对照组相比，p<0.01。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种黑茶酵素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

杀青：剔除新鲜茶叶中的黄叶、枝梗和杂草，采用热风杀青，控制锅内温度在215~285℃，杀青时间5~10分钟；

揉捻：对步骤（1）杀青后的茶叶进行揉捻，揉捻机转速40~60转/分钟，揉捻时间5~10分钟；

渥堆：将步骤（2）揉捻后茶叶堆放，使用纯水进行喷雾，用水量为茶叶重量的20~30%，进行第一次渥堆，第一次渥堆用时25~30天；第一次渥堆后里外翻拌均匀，使用纯水进行喷雾，用水量为茶叶重量的15~20%，进行第二次渥堆，第二次渥堆用时20~25天；

二次发酵：对步骤（3）渥堆发酵后的茶叶进行榨汁，所得汁液在4℃下保存；所得茶叶渣与玉米胚芽、白扁豆粕、黑豆粕均匀混合后发酵5~8天，过滤，得到发酵液；将发酵液与汁液进行合并，得到混合液；

酶解：调节步骤（4）混合液的pH值，控制温度60~70℃，加入酶，搅拌下进行酶解3.0~4.0h，得到酶解液；酶解液进行15~20min的煮沸灭酶处理，冷却后调节pH值至中性，然后离心除去沉淀，取上清液；

喷雾干燥：对步骤（5）得到的上清液进行喷雾干燥，得到的球形颗粒即为黑茶酵素。

2.如权利要求1所述的一种黑茶酵素的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中茶叶渣与玉米胚芽、白扁豆粕、黑豆粕按照重量比（3~5）:2:1:1混合。

3.如权利要求1所述的一种黑茶酵素的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中发酵液与汁液按照体积比（1~2）:1进行合并。

4.如权利要求1所述的一种黑茶酵素的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中调节混合液的pH值为6.0~7.0。

5.如权利要求1所述的一种黑茶酵素的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中加入酶底比为3.0~4.0%的酶。

6.如权利要求1所述的一种黑茶酵素的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中的酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和果胶酶中的至少一种。

7.如权利要求6所述的一种黑茶酵素的制备方法，其特征在于，所述酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和果胶酶以重量比1:1:2混合的混合物。

8.如权利要求1所述的一种黑茶酵素的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中上清液以2.5 mL/min的加料速率通过喷嘴进行喷雾干燥，入口温度为135~160℃，出口温度为60~85℃，进风量为320~400NL/h。

9.如权利要求1-8任一所述的制备方法获得的黑茶酵素。

10.如权利要求9所述的黑茶酵素在制备治疗便秘药物中的用途。