CN104519881A

CN104519881A - 使用no(一氧化氮)供体诱导动脉生成

Info

Publication number: CN104519881A
Application number: CN201380028543.8A
Authority: CN
Inventors: 米凯拉·哥拉斯
Original assignee: G Pohl Boskamp GmbH and Co KG
Current assignee: G Pohl Boskamp GmbH and Co KG
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2013-05-29
Publication date: 2015-04-15
Also published as: PL2877170T3; AU2018200831A1; US11166931B2; EA032534B1; EP3412285A2; PL2668947T3; AU2013269631A1; EP2877170A1; EP3412285A3; HUE044056T2; CA2872465C; JP2015518030A; DE112013002717T5; ES2617494T3; CA2872465A1; ES2731664T3; US20220096417A1; TR201908817T4; US20170172966A1; HUE033092T2

Abstract

本发明主要涉及一种促进侧支循环的方法，包括使受试者暴露于治疗有效量的NO供体的步骤，其中该治疗有效量的NO供体促进动脉生成，从而足以在生理学或病理学条件下加强侧支循环。

Description

使用NO(一氧化氮)供体诱导动脉生成

技术领域

本发明涉及通过给予NO(一氧化氮)供体来治疗或预防动脉供血不足的方法。

背景技术

心血管疾病以及涉及心血管的其他疾病，更具体地，动脉供血不足影响越来越多的患者群体、主要国际死亡率和发病率统计并且具有重要的经济意义。例如，在德国，每年约有280000名患者患上心肌梗塞，而约有65000名患者死亡。

心血管疾病的一个重要原因是动脉血管部分或完全闭塞，导致由动脉血管供应的组织的氧和营养物质的供应减少。

心绞痛，即胸痛，是一种反映对于心肌代谢的要求的供氧不足的临床症状，导致局部缺血，其通常是由阻塞(狭窄)、冠状动脉的痉挛或微血管功能障碍造成的。

动脉生成是一种其中已经预先存在的小动脉旁系能够发育成完全功能化的电导动脉(conductance artery)的过程，其与动脉闭塞的部位旁通和/或补偿血流至由不足的动脉供血提供的缺血性范围。因此，动脉生成是一种用于在动脉血管中的急性或慢性闭塞事件之后维持并再生血流的高度有效内源性机制。在这种情况下，侧支血管(collateral)能够起到天然旁路的作用。

动脉生成是一种不同于血管生成或新血管生成的过程，其中发生动脉血管的重新(de-novo)形成(Buschmann I.和Schaper W.,Journal of Pathology,2000,190:338-342)。

从数十年前就开始在心血管疾病如冠状动脉疾病(CAD，也被称为缺血性心脏病或冠状动脉疾病)中使用硝化甘油(硝酸甘油)作为血管舒张剂，其是世界范围内导致死亡和残疾的主要原因(McGrae McDermott M.,Journal of the American MedicalAssociation,2007,297(11):1253-1255)。由于硝化甘油对于静脉和动脉的血管舒张作用，使得心脏的工作负荷和能量消耗降低(通过减少预负荷(preload)和后负荷(afterload))以及增加心肌供氧(通过扩张冠状动脉)，其已被单独使用以用于治疗这些疾病的症状，例如稳定心绞痛。这些症状包括胸痛、压迫感、不安、或呼吸困难。然而，硝化甘油还没有被用于治愈基础疾病(underlying disease)或改善其预后。

因此，硝化甘油已被用于并且主要用于心绞痛发作的急性释放或预防，心绞痛发作是CAD的最常见症状(Fox K.等人.,Guidelines on the management of stable anginapectoris:full text.The Task Force on the Management of Stable Angina Pectoris of theEuropean Society of Cardiology.European Heart Journal doi:10.1093/eurheartj/ehl002；Gibbons R.J.等人,ACC/AHA/ACP-ASIM Guidelines for the Management of PatientsWith Chronic Stable Angina.Journal of the American College of Cardiology,1999,33(7):2092-2197)。

在现有技术中，已经描述了硝化甘油在已连续给予该物质(硝化甘油)的情况下不能诱导血管生成(新血管生成)或动脉生成(Hopkins S.P.等人,Journal of VascularSurgery,1998,27(5):886-894；Troidl K.等人,Journal of Cardiovascular Pharmacology,2010,55(2):153-160)。

包含二醇二氮烯鎓和三醇二氮烯鎓(也被称为NONOate类)的长效NO供体已被证明在动脉疾病的治疗中以连续流泵送给予的方式能够诱导和/或改善形成侧支血管(Schaper W.,DE 10 2008 005 484 A1)。

需要提供用于促进侧支循环的药剂。

发明内容

在第一个方面，本发明涉及一种治疗或预防动脉供血不足的方法，其中，以有效诱导动脉生成的量以间断的方式向受试者给予NO供体。

在本发明的上下文中，已经出人意料地发现，NO供体的动脉生成的诱导是有效的，即使没有连续给予NO供体而是以血浆水平仅在短时间内升高的方式给予也是如此(参见实施例部分)。因此，本发明提供了用于促进侧支循环的有效药剂。基于NO供体能够诱导动脉生成的发现，本发明现提供了一种用于预防和治疗动脉供血不足的有效工具。

根据本发明，术语“治疗”或“预防”意指不仅意指疾病的症状被缓解而且还意指疾病本身被治疗或预防。在一种优选的实施方式中，术语“治疗”意指改善所述疾病的预后。

根据本发明，术语“动脉供血不足”是指任何供血或供氧不足或由动脉提供的组织的其他供应不足。这种供应不足能够通过本发明的方法和用途得到克服，其中使用NO供体来增加给定组织的供应。在身体休息过程中和运动过程中都会发生动脉供血不足。

在本发明的一种优选实施方式中，动脉供血不足是在身体休息或运动过程中由于由动脉或旁路或分流供应的组织的供氧或供血不足造成的。

根据一种进一步优选的实施方式，动脉供血不足是由于由于由动脉或旁路或分流供应的组织的氧或血流需求增加造成的。

这种氧或血流的需求增加可具有几个原因，包括但不限于，增加运动或身体活动，以及增加精神活动或需要增加的氧或血流的疾病。

根据一种进一步优选的实施方式，动脉供血不足的特征在于动脉血管的部分(狭窄)或完全闭塞。在本发明的上下文中，术语“部分闭塞”等同于狭窄。

动脉血管的部分或完全闭塞是一种公知的现象。其能够具有多种原因，包括但不限于，血管中物质的沉积(包括不可血管重建的狭窄)、来自邻近血管的外部组织或流体的压力(包括舒张性心肌松弛中的干扰)、血管痉挛、导致运动过程中反常血管收缩的血管内皮细胞的功能障碍或者由于血管内皮功能障碍或平滑肌细胞异常造成的微血管损伤。

在一种优选的实施方式中，动脉供血不足是由于血管中物质的沉积造成的。

血管中物质的沉积是一种公知现象，例如导致动脉粥样硬化。

在另一种优选的实施方式中，动脉供血不足是由于动脉的外部或内部压力造成的。

动脉的内部压力可以是由于水肿造成的，但也可以是由于肿瘤向动脉施加压力造成的。此外，其包括动脉的血管痉挛性收缩，例如在变异型心绞痛(Prinzmetal’s心绞痛)中。另外，其还包括反常性血管收缩(paradoxic vasoconstriction)，例如有时在由于内皮或平滑肌细胞功能障碍造成的血管内皮功能障碍或收缩的小动脉血管中发生的。

外部压力可以是由于能够向动脉施加压力的意外或外力造成的。

在另一种优选的实施方式中，动脉供血不足为血管疾病。

根据一种进一步优选的实施方式，动脉供血不足为选自由动脉粥样硬化、缺血性疾病以及慢性动脉疾病组成的组中的疾病。

在另一种优选的实施方式中，动脉供血不足为冠状动脉供血不足。

在一种优选的实施方式中，冠状动脉供血不足为动脉粥样硬化性冠状动脉供血不足，尤其是冠状动脉疾病(冠状动脉性心脏病或缺血性心脏病)、稳定心绞痛、不稳定心绞痛、心肌缺血或慢性心肌缺血、急性冠脉综合征、或心肌梗塞(心力衰竭或缺血性心肌梗塞)。

在另一种优选的实施方式中，冠状动脉供血不足为非动脉粥样硬化性，尤其是冠状动脉微血管疾病或小血管疾病、变异型心绞痛(Prinzmetal’s心绞痛)和心脏X综合征。

在另一种优选的实施方式中，动脉供血不足为脑动脉供血不足(颅内或颅外)。

在一种优选的实施方式中，脑动脉供血不足为动脉粥样硬化性脑动脉供血不足，尤其是脑缺血、颅外颈动脉疾病、颅外椎动脉疾病、中风前、短暂性脑缺血发作(轻度中风(mini stroke))、中风、血管性痴呆、缺血性脑病或缺血性脑血管疾病。

脑动脉供血不足可以是缺血性微血管脑疾病、小血管性痴呆、皮质下动脉粥样硬化性脑病(宾斯旺格氏病)、阿尔茨海默病或帕金森病。

在一种优选的实施方式中，动脉供血不足为外周动脉供血不足。

在一种优选的实施方式中，外周动脉供血不足为动脉粥样硬化性外周动脉供血不足，尤其是外周血管疾病(周围动脉疾病(PAD)或周围动脉闭塞疾病(PAOD)、包括下肢动脉疾病和上肢动脉疾病)。

在一种优选的实施方式中，外周动脉供血不足为非动脉粥样硬化性外周动脉供血不足，尤其是雷诺氏综合征(血管痉挛性疾病)、血栓闭塞性脉管炎、闭塞性脉管炎或Buerger病(手足的小动脉和中等动脉以及静脉的复发进行性炎症和血栓形成(凝血))、血管炎症性疾病(血管炎)、糖尿病性局部缺血、糖尿病神经病变和筋膜室综合征.。

在另一种优选的实施方式中，动脉供血不足可以是肠动脉供血不足，尤其是动脉粥样硬化性肠动脉供血不足，尤其是缺血性肠病、肠系膜缺血或肠系膜梗塞.

在另一种优选的实施方式中，动脉供血不足可以是泌尿生殖器动脉供血不足，尤其是动脉粥样硬化性泌尿生殖器动脉供血不足，尤其是勃起功能障碍、肾动脉疾病、肾缺血或肾梗死。

在另一种优选的实施方式中，动脉供血不足可以是神经动脉供血不足，尤其是耳鸣。

此外，动脉供血不足可在硬皮病(系统性硬化症)的情况下出现。

此外，动脉供血不足可在纤维肌性发育不良的情况下出现。

在一种优选的实施方式中，动脉供血不足为视网膜中央动脉供血不足，尤其是动脉粥样硬化性视网膜中央动脉供血不足，尤其是眼动脉供血不足。

在另一种优选的实施方式中，动脉供血不足的特征在于，不存在血管内皮功能障碍。

血管内皮功能障碍是一种内皮细胞的公知病理学状态，其能够被广泛定义为由内皮细胞产生的或作用于内皮细胞的血管舒张和血管收缩物质之间的不平衡。

在另一种优选的实施方式中，动脉供血不足为慢性动脉供血不足。在本发明的上下文中，术语“慢性动脉供血不足”意指动脉供血不足的病程是慢性的并且经常是进行性的。

根据一种进一步优选的实施方式，慢性动脉供血不足包括血管内皮功能障碍、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病(冠状动脉心脏病或缺血性心脏病)、稳定型心绞痛、冠状动脉微血管疾病或小血管疾病、变异型心绞痛(Prinzmetal′s心绞痛)和心脏X综合征(cardiac syndrome X)、血管性痴呆、缺血性脑病或缺血性脑血管疾病、缺血性微血管脑疾病、小血管性痴呆、皮质下动脉粥样硬化性脑病(宾斯旺格病(Binswanger`sdisease))、阿尔茨海默病、帕金森病、周围血管疾病(周围动脉疾病(PAD)或周围动脉闭塞疾病(PAOD)、血栓闭塞性脉管炎、闭塞性脉管炎或伯格氏病(Buerger’s disease)、血管炎症性疾病(血管炎)、纤维肌性发育不良、糖尿病性局部缺血、糖尿病神经病变、缺血性肠病、勃起功能障碍、肾动脉疾病、耳鸣、和硬皮病(系统性硬化症)。

根据本发明，术语“NO供体”是指一氧化氮本身或能够在向受试者给药后释放NO的任何分子。

优选地，NO供体为一氧化氮、硝普钠、硝化甘油(硝酸甘油)、单硝酸异山梨醇酯、硝酸异山梨醇酯、季戊四醇四硝酸酯(PETN)、吗多明、亚硝酸戊酯或尼可地尔。

在一种优选的实施方式中，NO供体可选自以下：

无机物(Anorganic)：

一氧化氮

亚硝酸盐

硝酸盐

有机硝酸酯类：

GTN(硝酸甘油；硝化甘油)

PETN(季戊四醇四硝酸酯)

ISDN(硝酸异山梨醇酯)

ISMN(单硝酸异山梨醇酯)

尼可地尔

有机亚硝酸酯类：

IAN(亚硝酸异戊酯；亚硝酸戊酯)

IBN(亚硝酸异丁酯)

N-亚硝基化合物：

N-亚硝胺：

Dephostatin

NDMA

N-甲基-N-亚硝基脲的衍生物

N-羟基-亚硝胺：

制多巴素

铜铁灵

阿拉诺新

2-(甲基亚硝基氨基)-1,4-苯二酚(N-Nitrosimines)

N-二醇二氮烯鎓类(NONOate)：

精胺NONOate

DEA-NONOate

DETA-NONOate

S-亚硝基硫醇类：

S-亚硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)

S-亚硝基谷胱甘肽

金属-NO-配合物：

铁配合物：

硝普酸钠(硝普钠)

双亚硝酰基-铁配合物

铁-硫簇亚硝酰类(例如，陆森红盐、陆森黑盐、陆森红酯)

钌配合物

释放的NO的杂环类：

杂环N-氧化物类：

氧化呋咱

介离子杂环类：

斯德酮亚胺类(Sydnonimine)(例如，吗多明、林西多(SIN-1)、环西多明、哌多明、达西多明)

介离子噁三唑类

胍类和N-羟基胍类：

L-精氨酸

L-高精氨酸

N-羟基-L-精氨酸

N-羟基-L-高精氨酸

其他：

烷基C-亚硝基化合物

芳基C-亚硝基化合物

肟类化合物

N-羟基脲类

在一种优选的实施方式中，NO供体为具有甘油骨架的有机硝酸酯。

在另一种优选的实施方式中，NO供体选自由硝化甘油(硝酸甘油)、1,2-二硝酸甘油酯(1,2-GDN)和1,3-二硝酸甘油酯(1,3-GDN)、1-硝酸甘油酯(1-GMN)和2-硝酸甘油酯(2-GMN)组成的组。

在一种尤其优选的实施方式中，NO供体为硝化甘油。

优选地，NO供体为短效NO供体。根据本发明，术语“短效NO供体”是指NO自身或短暂释放NO的NO供体，在向受试者给予后其具有小于例如45分钟、30分钟或优选15分钟的短半衰期。短效NO供体的实例为硝化甘油(硝酸甘油)、亚硝酸戊酯和硝普钠。

根据本发明的短效NO供体也可以包括通常被称为长效硝酸酯(类)的NO供体，但其可起到短效硝酸酯的作用，这取决于其给予方式、剂量和剂型(标准释放vs.缓释或延迟制剂)。这样的NO供体包括，但不限于，有机硝酸酯硝酸异山梨醇酯(ISDN)，当经颊给予或舌下给予时其具有15至35分钟直至60分钟的可变半衰期，例如以喷雾剂的形式或者作为片剂。以低剂量给予后的半衰期为约30至60分钟或在延迟释放或缓释制剂中半衰期增加至几小时。

因此，根据本发明的“短效NO供体”还指在以特定给予方式向受试者给予之后以60分钟或更短的半衰期释放NO的NO供体，优选当向受试者颊内或舌下给予时。

在本发明的上下文中，已经出人意料地发现给予短效NO供体对于促进侧支循环是尤其适合的。这可通过由短效NO供体诱导的侧支血管的短期扩张来解释，当重复应用时这种短期扩张反过来又会显著改善动脉生成的效果。本申请的实施例1中具体示例性描述了短效NO供体对于新的侧支血管形成的改善效果，以及因而带来的对侧支循环的改善。

因此，在本发明的一种优选实施方式中，NO供体为短效供体。

硝化甘油是这样的短效NO供体的一个尤其优选的实例。

根据本发明，以能够诱导动脉生成的量给予该NO供体。本领域技术人员知晓这种量将取决于给予NO供体的受试者。通常，所给予的量可以为0.1mg/天至8mg/天，但该量能够由于受试者体重、对NO供体的血液动力学反应和/或疾病的严重程度而变化。

所给予的NO供体的量也可以为0.1mg/天至10mg/天，或者可替代地，为0.1mg/天至40mg/天，这取决于NO供体的性质和/或其给予方式。也就是说，如果NO供体以有机硝酸酯硝酸异山梨醇酯(ISDN)的形式给予，则当向受试者颊内或舌下给予时，所给予的量可以为1至40mg/天，优选5mg/天、10mg/天、15mg/天、20mg/天、25mg/天、30mg/天、35mg/天或40mg/天。

因此，硝酸异山梨醇酯(ISDN)是这样的短效NO供体的一个同等优选的实例。

在一种优选的实施方式中，所施加的NO供体的量为0.2mg至0.8mg(0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.6mg、0.8mg)的剂量，每天至少1次至最多4次，使得最大的每日剂量为3.2mg。当NO供体为硝化甘油的情况下具体应用这些数值。

根据本发明，术语“NO供体的给予”意指给予给定剂量的NO供体。根据给予的方式，本领域技术人员将知晓该给予会花费一些时间。在一种优选的实施方式中，该NO供体以喷雾剂、可喷雾或可注射溶液、可咀嚼胶囊、可吸入气体、可吸入气雾剂或粉剂、颗粒剂、粉剂或片剂的形式给予，优选为舌下、颊内或可咀嚼片剂，其意指给药可在几秒钟内完成。然而，NO供体的给予也可以花费更长时间，例如，如果以输注方式或通过膏剂或凝胶剂或贴剂给予NO供体时。下文中进一步讨论了给予NO供体的方式。

此外，根据本发明，以能够诱导动脉生成的方式给予NO供体。

如实施例中所示出的，本发明的发明人已经出人意料地发现，当以间断的方式给予时，NO供体能够诱导动脉生成。

根据本发明，术语“间断方式”意指以其血浆或组织水平在给予该NO供体之后仅以短期方式升高之后再次下降的方式给予NO供体。例如当NO供体为上文中所定义的短效NO供体并且向受试者给予该短效NO供体，然后不给予，然后再次给予NO供体的情况下能够实现。此外，这种给药方式避免了受试者发展针对NO供体的耐受性并且避免了受试者发展血管内皮功能障碍。

血管内皮功能障碍的诱导是在患有冠状动脉疾病的患者中具有预后显著性的一个参数。耐受性的发展和血管内皮功能障碍的诱导是由持续长期暴露于NO供体造成的公知缺陷(Uxa A.等人,Journal of Cardiovascular Pharmacology,2010,56(4):354-359)。

而且，以间断的方式给予短效NO供体具有改善的效果，其模仿生物体的生理学状态，该生理学状态例如可与运动训练之后NO的内源性释放类似(comparable，相比较)。换言之，当以间断的方式施加时，本发明的NO供体起到仿生物质的作用。这清楚地显示出优于现有技术的改善，其中到目前为止仅在以连续，从而非间断的方式给予长效NO供体之后观察到动脉生成的诱导。

因此，在一种尤其优选的实施方式中，该NO供体为以间断的方式给予的短效NO供体。

然而，该NO供体同样有可能是长效NO供体。然而，在本例中，为了实现血浆或组织水平的下降，需注意长效NO供体的给予仅是短暂的并且所获的血浆或组织水平不太高。

在一种优选的实施方式中，该NO供体的血浆或组织水平升高不超过180分钟、120分钟或60分钟，或者不超过50分钟、40分钟、30分钟、15分钟、10分钟或5分钟。

此外，这还暗示了NO供体能够以慢性方式给予，即，不考虑用NO供体进行急性治疗的疾病发展。此外，其还暗示了能够不考虑用NO供体进行急性治疗的疾病发展而建立治疗计划。

在本发明的上下文中，除其他之外，给予NO供体以诱导动脉生成。这暗示了也能够在不需要血管舒张并且类似于疼痛缓解的这种症状缓解的时间点或时期给予NO供体。

这与过去使用NO供体(例如硝化甘油)来实现相应疾病症状的缓解或急性(即，立即)预防不同。这些症状例如包括心血管疾病情况下的疼痛和/或呼吸困难，以及症状的缓解或急性预防是通过血管舒张以及其所带来的疼痛和/或呼吸困难缓解来实现的。然而，如上文中所讨论的，给予NO供体的目的并不在于治疗基础疾病，因为该疾病不能通过血管舒张或疼痛缓解而得到治疗是公知的。

因此，NO供体作为前动脉型药剂(pro-arteriogenic agent)的作用(identification，鉴定)还使得NO供体能够在不需要如疼痛缓解的这种症状缓解的时间点或时间段给予。在另一种优选的实施方式中，NO供体也可以在没有如呼吸困难或疼痛的相应症状的情况下或者在没有预期这样的症状的情况下给予。

在本发明的上下文中，术语“间歇地”还意指NO供体，尤其是短效NO供体不是连续地给予(例如以长期静脉输注的方式给予或借助于向受试者恒定递送NO供体的移植泵给予)。而该术语还意指在两次给予NO供体之间存在间隔，并且多次给予NO供体，例如每天至少1、2、3、4、5、6、8、9、12或16次。

如本领域技术人员将会理解的，一次给予NO供体可以包括以一个或多个剂量形式给予，例如片剂或在喷雾给药时吸入(呼出)。例如，一次给药可以包括给予两片片剂或一至三次吸入(呼出)。

对于给药的时间安排，本领域技术人员知晓可以存在许多方式以实现这种间断性给药。例如，可以每天至少一次且每周至少一天给予NO供体，并持续至少两周。然而，如果在该周内多次给予NO供体，同样也可以仅给予NO供体一周。

优选地，每天一次、两次或三次给予NO供体，其中甚至更优选在两次给予NO供体之间的时间段为至少4小时，尤其是8小时，尤其是至少10小时或12小时。

尽管可以这样做，但两次给予NO供体之间的时间段并不一定是相同的。而是，优选这些时间段是不同的，取决于个体给药时间方案。

在一种优选的实施方式中，一周至少一天给予NO供体。然而，也可以在一周的第2、3、4、5、6或7天给予NO供体。在一种尤其优选的实施方式中，一周的至少第3或4天给予NO供体。

根据本发明，可以给予NO供体持续数周或数月的一段时间。为了有效诱导动脉生成，这是尤其优选的，但也可以进行二分之一周的短期给药。

在一种优选的实施方式中，NO供体给予2至8周。同样优选的是给予NO供体3至6周、3至8周、3至10周或4至8周、4至10周或4至12周。这些数字仅仅是举例并且可根据受试者的个体时间安排变化。

在一种优选的实施方式中，NO供体每周给药至少一次并且持续至少8周，尤其是持续至少12周。

在另一种优选的实施方式中，NO供体给药不超过6个月、8个月或12个约。然而，也可以给予NO供体持续2年、3年或甚至更多年。此外，也可以基于NO供体持续数十年或甚至贯穿受试者终生。

在长期给药的情形中，优选每周给予NO供体一次或两次或者每周给予至少一次或两次。

前文中已经描述了个体中的搏动剪切力(pulsatile shear force)的外源性刺激会导致动脉生成。此外，还描述了如何测量搏动剪切力(WO 2010/072416)。

因此，在一种优选的实施方式中，NO供体的给予与动脉中的搏动剪切力的外源性刺激联合起来。

对于本发明的所述实施方式，NO供体应该以当施加外源性刺激时其在受试者身体内是活性的方式给予。在这种情形中，活性意指NO释放尚未终止或者从NO供体释放的NO仍存在且有活性。根据所使用的具体NO供体、其在受试者体内的生理学半衰期以及其配方，本领域技术人员能够确定何时必须向该受试者给予该NO供体以确保在外源性刺激后其是活性的。

在硝化甘油的情况下，已对例如在静脉或舌下施加之后该受试者体内的半衰期和存留时间进行了重点研究，其中在血浆中其为2至5分钟，参见例如Armstrong P.W.等人,Circulation,1979,59:585-588或Armstrong P.W.等人,Circulation,1980,62:160-166。

通常，硝化甘油在血浆中的半衰期为2至5分钟。

应该理解，在本发明的上下文中，术语“半衰期”是指NO供体在受试者体内的半衰期和/或半衰期时间，尤其是在受试者的血浆中。

在一种优选的实施方式中，NO供体在外源性刺激发生前30分钟直至外源性刺激终止后的30分钟的时间段内给予。

更优选地，NO供体在外源性刺激之前15分钟、优选5分钟、更优选2分钟直至外源性刺激发生(onset)后30分钟、优选15分钟、更优选5分钟的时间段内给予。

在另一种优选的实施方式中，NO供体在外源性刺激之前2-5分钟给予，每天给予一次，每周给予5次，持续6周。

搏动剪切力的外源性刺激可通过任意已知的方式实现。其包括借助于药物进行的刺激，如增加血压的药物。

在一种优选的实施方式中，所述刺激是通过体育锻炼或向动脉血管施加内力实现的。

根据本发明，术语“体育锻炼”意指受试者的任何训练，包括但不限于室内运动训练,慢跑,、步行、越野行走(nordic walking，北欧式健走)、游泳、跳舞、骑车和远足。本领域技术人员将理解，在本发明的情况下任何训练都将是有帮助的，条件是其与NO供体的给予结合进行。优选地，术语“体育锻炼”不包括无人监督的、非医生指定的常规运动，如休闲散步或家务。

如上文中所讨论的，已经发现在本发明的情形下NO供体能够诱导动脉生成。这不仅能够治疗已经存在的疾病。而是，在本发明的上下文中，还可以预防该疾病。因此，在本发明的一种优选实施方式中，该方法的目的在于预防所述动脉供血不足。

如实施例部分中所示，在本发明的上下文中，在已经存在闭塞的情况下减少梗死面积是可能的。此外，减少受试者中的心律失常也是可能的。因此，在本发明的一种优选实施方式中，该方法使得梗死面积减小、心律失常减少或ST段抬高减少。

能够以任何适合的方式给予NO供体，以使得其能够结合至受试者中。这包括口服、肠胃外或静脉内给予以及将NO供体注射到受试者体内，但可以向受试者的粘膜给药。

因此，在本发明的一种优选实施方式中，NO供体可以经舌(lingually)、舌下、吸入、颊内、经粘膜(transmucosally)或经口腔粘膜(oromucosally)给予。

在经舌、舌下、或口腔粘膜给予的情况下，优选该NO供体，优选硝化甘油借助于喷雾剂、可喷雾或可注射溶液、可咀嚼胶囊或以片剂，优选舌下、颊内或可咀嚼片剂、粉剂或颗粒剂的形式给予，或甚至通过NO供体能够容易地从其被吸入或吸收的吸入器装置给予。同等优选以可吸入气体、气雾剂或粉剂的形式给予该NO供体。

优选地，NO供体的给予是非局部给药，即，NO供体不是向受试者的皮肤给予。在本发明的上下文中，术语“皮肤”不包括受试者的粘膜。

NO供体能够以任何适合的方式配制以用于上述给药方式。这样的配方是本领域技术人员已知的，并且包括在适合的缓冲液中，在气体中的配方、气溶胶、片剂、粉剂或颗粒剂。

在一种优选的实施方式中，以使得NO供体能够从制剂快速释放的方式配制该NO供体。这包括，例如，不能长时间阻碍NO供体，但可在例如45分钟、30分钟或15分钟、10分钟、5分钟或1分钟内释放NO供体的制剂。

在本发明全文中，优选施加NO供体的受试者是人类受试者。

在另一方面，本发明还涉及在用于预防或治疗动脉供血不足的方法中使用的NO供体，其中该NO供体以对于动脉生成的诱导有效的量和方式给予。

上文中所讨论的有关治疗或预防动脉供血不足的方法的所有特征和优选实施方式也适用于根据本发明的这方面用途的NO供体。

在另一方面，本发明还涉及抑制与动脉供血不足的任何治疗相关的负面影响的方法，其中该治疗为抗动脉生成的(anti-ateriogenic)或抑制动脉生成，该方法包括以对于动脉生成的诱导有效的量和方式向接受所述治疗的受试者给予NO供体。

在一种优选的实施方式中，所述治疗是乙酰水杨酸(ASA)、糖蛋白IIbIIIa拮抗剂、或依那西普(可溶性肿瘤坏死因子α受体)治疗。

本领域已知ASA是一种动脉生成抑制剂(Singer E.等人,Vasa,2006,35(3):174-177)。因此，尽管心血管疾病的ASA治疗是一种标准治疗，但其具有显著的副作用和缺陷。在本发明的上下文中，已经发现NO供体能够克服与ASA治疗相关的属格效应(genitive effect)(参见实施例部分)。基于这些发现，发明人得出结论认为与其他药物如糖蛋白IIbIIIa拮抗剂或依那西普治疗相关的负面副作用也能够被减少。

此外，本发明还涉及在与动脉供血不足的任何治疗相关的负面影响的抑制的方法中使用的NO供体，其中该治疗为抗动脉生成的(anti-ateriogenic)或抑制动脉生成，其中以对于动脉生成的诱导有效的量和方式向接受所述治疗的受试者给予NO供体。

在一种优选的实施方式中，所述治疗为乙酰水杨酸(ASA)、糖蛋白IIbIIIa拮抗剂、或依那西普(可溶性肿瘤坏死因子α受体)治疗。

上文中所讨论的有关治疗或预防动脉供血不足的方法的所有特征和优选实施方式也适用于根据本发明这方面的用于抑制负面影响的方法或根据本发明这方面的用途的NO供体。

在又一个方面，本发明还涉及一种用于预防或治疗心律不齐的方法，其中以对于治疗所述心律不齐有效的量和方式向受试者给予NO供体。此外，本发明还涉及在用于预防或治疗心律不齐(心律失常)的方法中使用的NO供体，其中以对于治疗所述心律不齐有效的量和方式向受试者给予该NO供体。

在本发明的上下文中，发明人发现了NO供体能够预防和治疗心律失常(参见实施例部分)。

上文中所定义的有关NO供体以及其配制和给药的所有特征和优选实施方式也适用于根据本发明用途的这个方法或NO或供体。

本发明还涉及促进侧支循环的方法，包括使受试者暴露于治疗有效量的NO供体的步骤，其中，所述治疗有效量的NO供体在生理学或病理学条件下促进动脉生成从而足以增强侧支循环。

术语侧支循环描述了通过所谓的侧支血管的血液循环。这些血管是小动脉，其是互连动脉分支的灌注区域的网络的一部分。在主动脉本身不能为组织提供充分的供血时的情况下，例如由于动脉的闭塞，这些侧支血管就被募集起来并且能够发育成大的通道动脉、发育成动脉的闭塞处的旁路和/或向由该动脉或供血不足的动脉供血的动脉缺血性区域补偿血流。在本发明的上下文中，侧支循环的促进经由动脉生成发生。

根据本发明，术语“生理学条件”代表不涉及任何疾病的受试者的任何条件。

根据本发明，术语“病理学条件”代表与疾病相关的受试者的任何条件。

优选地，该受试者患有动脉供血不足。

上文中所讨论的关于治疗或预防动脉供血不足的方法的所有特征和优选实施方式也适用于促进侧支循环的方法。

关于上文中所定义的其中以足以诱导动脉生成的方式给予NO供体的方面，该方式优选为上文中所定义的间断方式。

通过附图和实施例进一步描述了本发明，附图和实施例意在举例说明，而不是意在限制本发明。

附图说明

图1：5-天和10-天-对照-组的FPO(＝最终闭塞以诱导梗塞)之后每次搏动的ST段抬高的时程(course)。中等灰色部分的ECG图表示5天RIP PBS,n＝8:0.104±0.016mV；黑色部分的ECG图表示5天SHAM PBS,n＝8:0.134±0.034mV；浅灰色部分的ECG图表示10天RIP PBS,n＝7:0.055±0.033mV；深灰色部分的ECG图表示10天SHAM PBS,n＝7:0.124±0.039mV。

在FPO之后的90分钟记录ECG。在最初1200次搏动时每次搏动的ST段抬高的时程揭露了在5-和10-天-空白(sham，假手术)-组和5-天-RIP-组之间不存在差异。只在10-天-RIP-组中观察到较低的ST段抬高。

图2：5-和10-天-对照-组的ST段抬高。第1栏示出了5天SHAM PBS组的ST段抬高；第2栏示出了5天RIP PBS组的ST段抬高；第3栏示出了10天SHAM PBS组的ST段抬高；第4栏示出了10天RIP PBS组的ST段抬高；以误差条表示标准差；星号表示与10天SHAM PBS相比显著(定类p值<0.025)；双星号表示与5天RIP PBS相比显著(定类p值<0.025)。

图表示出了每组的最大ST段抬高的平均值。5天后在RIP和SHAM之间没有发现显著差异。10天后，RIP组中的最大ST段抬高显著低于空白(sham)(*)和5-天RIP对照(**)(*、**定类p值<0.025)。

图3：FPO后每次搏动的ST段抬高的时程(模块1：假手术，无RIP)。黑色部分的ECG图表示5天SHAM PBS,n＝8:0.134±0.034mV；浅灰色部分的ECG图表示5天SHAM NTG,n＝7:0.124±0.058mV；中等灰色部分的ECG图表示5天SHAM NTG-安慰剂,n＝6:0.131±0.043mV。

FPO后每次搏动的ST段抬高的时程揭露了在5天后空白对照和治疗组之间无差异。

图4：ST段抬高(模块1：假手术，无RIP)。第1栏示出了5天SHAM PBS；第2栏示出了5天SHAM NTG-安慰剂；第3栏示出了5天SHAM NTG；以误差条表示标准差。

图表示出了每组的最大ST段抬高的平均值。在空白对照(sham control)和治疗组之间没有发现最大ST段抬高的差异。

图5：FPO后每次搏动的ST段抬高的时程(模块2：NO间歇(NTG))。浅灰色部分的ECG图表示5天RIP PBS,n＝8:0.104±0.016mV；中等灰色部分的ECG图表示5天NTG-安慰剂,n＝6；0.096±0.061mV；黑色部分的ECG图表示5天RIP NTG,n＝7:0.052±0.030mV。

相比于用PBS或NTG-安慰剂进行的对照治疗，在RIP后5天在用NTG治疗后检测到较低的ST段抬高时程。

在NTG组(“5天RIP NTG”)中，ST段抬高显著低于PBS和NTG-安慰剂组。在PBS和NTG-安慰剂-组之间无显著性。

图6：ST段抬高(模块2：NO间歇(NTG))。第1栏示出了5天RIP PBS；第2栏示出了5天NTG-安慰剂；第3栏示出了5天RIP NTG；以误差条表示标准差，星号表示相比于PBS和NTG-安慰剂组，ST段抬高显著减少(定类p值<0.017)。

图表示出了每组的最大ST段抬高的平均值。在用NTG治疗后，在RIP后5天，相比于PBS和NTG-安慰剂治疗，最大ST段抬高显著减少(*定类p值<0.017)。

图7：FPO后每次搏动的ST段抬高的时间程(模块3：NO连续(ISDN延迟))。浅灰色部分的ECG图表示5天RIP PBS,n＝8:0.104±0.016mV；中等灰色部分的ECG图表示5天ISDN-安慰剂,n＝7:0.110±0.069mV；黑色部分的ECG图表示5天RIP ISDN,n＝7:0.062±0.027mV。

相比于用PBS或ISDN-安慰剂进行的对照治疗，RIP后5天在用ISDN治疗后检测到较低的ST段抬高时程。

相比于PBS组，ISDN组(“5天RIP ISDN”)中的ST段抬高降低，但与PBS和ISDN-安慰剂-组之间无显著性。

图8：ST段抬高(模块3：NO连续(ISDN延迟))。第1栏示出了5天RIP PBS；第2栏示出了5天RIP ISDN-安慰剂；第3栏示出了5天RIP ISDN；以误差条表示标准差。

图表示出了每组的最大ST段抬高的平均值。在用ISDN治疗后，相比于RIP后5天的PBS和ISDN-安慰剂治疗，最大ST段抬高没有显著减少。

图9：FPO(模块4：NO间歇+ASA)之后的每次搏动的ST段抬高的时程。浅灰色部分的ECG图表示5天RIP PBS,n＝8；0.104±0.016mV；中等灰色部分的ECG图表示5天RIP ASA+PBS,n＝7:0.138±0.098mV；深灰色部分的ECG图表示5天RIP ASA+NTG-安慰剂,n＝6:0.144±0.091mV；黑色部分的ECG图表示5天RIP NTG+ASA,n＝7:0.088±0.071mV。

将用NTG+ASA的治疗与用PBS+ASA、NTG-安慰剂+ASA和PBS的治疗进行比较。通常，所有的曲线在相同的范围重叠。

用PBS和ASA处理组的ST段抬高高于PBS对照组，但没有显著性，与ASA+NTG-安慰剂-组之间也无显著性。相比于用ASA和PBS处理的组，在ASA+NTG-组中的ST段抬高减少。

图10：ST段抬高(模块4：NO间歇+ASA)。第1栏示出了5天RIP PBS；第2栏示出了5天RIP PBS+ASA；第3栏示出了5天RIP NTG-安慰剂；第4栏示出了5天RIP NTG-安慰剂+ASA；第5栏示出了5天RIP NTG；第6栏示出了5天RIP NTG+ASA；以误差条表示标准差。

图表示出了每组的最大ST段抬高的平均值。将用NTG+ASA处理与PBS+ASA,NTG-安慰剂+ASA和PBS进行比较。此外，将所有的ASA组(PBS+ASA、NTG-安慰剂+ASA、NTG+ASA)与它们的对照(PBS、NTG-安慰剂、NTG)进行比较。未检测到显著差异。

图11：FPO过程中的心律失常(模块1：假手术(无RIP))。以组IVb中的栏的连贯顺序给出栏数。第1栏示出了5天SHAM PBS；第2栏示出了5天SHAM NTG-安慰剂；第3栏示出了5天SHAM NTG.

根据Lown分级，所有的空白组主要被划分为IVb级。

在“5天SHAM PBS”组中，87.5％的大鼠具有IVb类心律失常且12.5％具有IVa类心律失常。在“5天SHAM NTG-安慰剂”组中，83.3％的大鼠具有IVb类心律失常且16.7％具有IVa类心律失常，而在“5天SHAM NTG”组中，85.7％的大鼠具有IVb类心律失常且14.3％具有IIIa类心律失常。

图12：FPO过程中的心律失常(模块2：NO间歇(NTG))。以组IVb中的栏的连贯顺序给出栏数。第1栏示出了5天RIP PBS；第2栏示出了5天RIP NTG-安慰剂；第3栏示出了5天RIP NTG。

当两个对照组PBS和NTG-安慰剂中的心律失常主要被划分为IVb级时，NTG处理组更经常被划分为0级。

在“5天RIP PBS”组中，75.0％的大鼠具有IVb类心律失常，12.5％的IVa类心律失常和12.5％的0类心律失常。对于“5天RIP NTG-安慰剂”组，50.0％的大鼠显示出IVb类心律失常、16.7％的IVa类、16.7％的IIIb类和16.7％的0类心律失常。感兴趣的是，“5天RIP NTG”组显示出42.9％的IVb类心律失常和57.1％的0类心律失常。

图13：FPO过程中的心律失常(模块3：NO连续(ISDN延迟))。以组IVb中的栏的连贯顺序给出栏数。第1栏示出了5天RIP PBS；第2栏示出了5天RIP ISDN-安慰剂；第3栏示出了5天RIP ISDN。

在所有的组中，心律失常类似地更经常地被划分为IVb类。

在“5天ISDN-安慰剂”组中，57.1％的大鼠具有IVb类心律失常，14.3％的IVa类心律失常和28.6％的IIIb类心律失常。“5天RIP ISDN”组显示出较低严重性的心律失常，具有57.1％的IVb类、28.6％的IIIb类和14.3％的0类心律失常。

图14：FPO过程中的心律失常(模块4：NO间歇+ASA)。以组IVb中的栏的连贯顺序给出栏数。第1栏示出了5天RIP ASA+PBS；第2栏示出了5天RIP ASA+NTG-安慰剂；第3栏示出了5天RIP ASA+NTG。

在所有的组中，心律失常类似地更多地被划分IVb级。

在“5天RIP ASA+PBS”组中，在用ASA+NTG-安慰剂处理的组中和“5天RIPASA+NTG”组中，83.3％的大鼠为IVb类心律失常且16.7％的为IIIa类心律失常。

图15：VPB-评分。第1栏示出了SHAM PBS；第2栏示出了SHAM NTG-安慰剂；第3栏示出了SHAM NTG；第4栏示出了RIP PBS；第5栏示出了RIP NTG-安慰剂；第6栏示出了RIP NTG；第7栏示出了RIP PBS；第8栏示出了RIP ISDN-安慰剂第9栏示出了RIP ISDN；第10栏示出了RIP PBS+ASA；第11栏示出了RIP NTG-安慰剂+ASA；第12栏示出了RIP NTG+ASA。

对于每一组的每个Lown级别的百分比，能够确定VBP评分。显示出较高级别的动物越多，VBP评分就越高。

VBP评分显示出每一组的每个Lown级别的百分比。空白组(sham groups)具有较高的VBP-评分。相比于具有缺血性实验方案的组(对照组，用PBS处理)，更多的大鼠显示出严重的心律失常。用NTG处理显示减少的心律失常，并且因此较低的VPB-评分。单独用ASA处理的组或用NTG+ASA处理的组中的VPB-评分高于对照组(用PBS处理)。

图16：5-天-和10-天-对照-组的梗死面积。第1栏示出了5天SHAM PBS,n＝8:13.36±5.22％；第2栏示出了5天RIP PBS,n＝8:11.05±5.12％；第3栏示出了10天SHAM PBS,n＝7:13.71±6.04％；第4栏示出了10天RIP PBS,n＝6:6.57±3.26％；以误差条表示标准差；星号表示相比于空白的显著性(定类p值<0.013)。

在5天的缺血性实验方案后，没有测量到显著更小的梗死面积，但在10天的RIP后梗死区域相比于空白显著减少(定类p值<0.013)。

在LAD闭塞后90分钟和再灌注20分钟后，分析梗死面积。

“10天RIP PBS”组相比于“10天SHAM PBS”组具有显著更小的梗死区域。两个5天组之间没有显著性。

图17：梗死面积(模块1：假手术(无RIP))。第1栏示出了5天SHAM PBS,n＝8:13.36±5.22％；第2栏示出了5天SHAM NTG-安慰剂,n＝6:14.21±5.79％；第3栏示出了5天SHAM NTG,n＝7:14.09±5.18％；以误差条表示标准差。

梗死面积显示出SHAM组之间无差异。

三个SHAM组之间无显著性。

图18：梗死面积(模块2：NO间歇(NTG))。第1栏示出了5天RIP PBS,n＝8:11.05±5.12％；第2栏示出了5天NTG-安慰剂:n＝6；9.80±6.79％；第3栏示出了5天RIP NTG,n＝7:3.61±2.08％；以误差条表示标准差，星号表示相比于5天RIP PBS的显著性(定类p值<0.017)。

在用NTG处理后梗死面积比对照(用PBS处理)显著更小(定类p值<0.033)。

相比于“5天RIP PBS”，在“5天RIP NTG”组中观察到显著更小的梗死区域。在PBS和NTG-安慰剂-组之间无显著性。

图19：梗死面积(模块3：NO连续(ISDN延迟))。第1栏示出了5天RIP PBS,n＝8:11.05±5.12％；第2栏示出了5天ISDN-安慰剂,n＝6:9.97±3.65％；第3栏示出了5天RIP ISDN,n＝7:7.59±4.38％；以误差条表示标准差。

用ISDN处理后的梗死面积小于对照(用PBS或ISDN-安慰剂处理)，但无显著性。

ISDN组(“5天RIP ISDN”)中的梗死面积小于PBS组，以及ISDN-安慰剂-组。

图20：梗死面积(模块4：NO间歇+ASA)。第1栏示出了5天RIP PBS,n＝8；11.05±5.12％；第2栏示出了5天RIP ASA+PBS,n＝6:12.51±3.05％；第3栏示出了5天NTG-安慰剂:n＝6；9.80±6.79％；第4栏示出了5天RIP NTG-安慰剂+ASA,n＝6:13.92±1.71％；第5栏示出了5天RIP NTG,n＝7:3.61±2.08％；第6栏示出了5天RIP NTG+ASA,n＝6:13.00±3.82％；以误差条表示标准差，星号表示相比于5天RIP NTG的显著性(定类p值<0.017)。

用NTG+ASA处理后的梗死面积相比于仅用NTG显著增加(定类p值<0.017)。

用ASA处理的组(“5天ASA+PBS”)中的梗死面积相比于PBS对照组稍微增加，同样对于ASA+NTG-安慰剂-组。ASA+NTG-组和用ASS和PBS处理的组之间无差异。然而，NTG组中的梗死区域显著小于ASA+NTG组。

图21：TTC-染色。照片显示出三个水平的切片。梗塞的组织染色为灰白色因为其缺少TTC与之反应的酶。因此，坏死的区域明显可辨别和可计量。

图22：ROI的侧支血管直径(模块1：假手术(无RIP))。第1栏示出了5天SHAMPBS,n＝3:82.7±3.7μm；第2栏示出了5天SHAM NTG-安慰剂,n＝3:89.6μm±10.6μm；第3栏示出了5天SHAM NTG,n＝3:86.8±9.0μm；以误差条表示标准差。

在SHAM之间无可测量的侧支血管生长且无可测量的差异。

三个SHAM-组之间无显著性。

图23：ROI的侧支血管直径(模块2：NO间歇(NTG))。第1栏示出了5天RIPPBS,n＝3:129.8±6.9μm；第2栏示出了5天RIP NTG-安慰剂:n＝3；127.0±12.1μm；第3栏示出了5天RIP NTG,n＝3:158.4±9.2μm；以误差条表示标准差，星号表示相比于5天RIP NTG显著(定类p值<0.033)。

通过用NTG处理，侧支血管的直径相比于对照处理(用PBS或NTG-安慰剂处理)显著增加(定类p值<0.033)。

相比于“5天RIP PBS”，“5天RIP NTG”组中的ROI中的侧支血管直径显著增加。PBS和NTG-安慰剂-组之间无差异。

图24：ROI的侧支血管直径(模块3：NO连续(ISDN延迟))。第1栏示出了5天RIP PBS,n＝3:129.8±6.9μm；第2栏示出了5天ISDN-安慰剂,n＝3:133.0±11.5μm；第3栏示出了5天RIP ISDN,n＝3:148.2±11.3μm；以误差条表示标准差。

在用ISDN或ISDN-安慰剂处理之后侧支血管的直径没有可测量的差异。

相比于PBS组，以及相比于ISDN-安慰剂组，ISDN组(“5天RIP ISDN”)中侧支血管的直径增加。

图25：ROI的侧支血管直径(模块4：NO间歇+ASA)。第1栏示出了5天RIP PBS,n＝3；129.8±6.9μm；第2栏示出了5天RIP PBS+ASA,n＝3:102.5±8.0μm；第3栏示出了5天RIP NTG-安慰剂:n＝3；127.0±12.1μm；第4栏示出了5天NTG-安慰剂+ASA,n＝3:97.1±8.6μm；第5栏示出了5天RIP NTG,n＝3:158.4±9.2μm；第6栏示出了5天RIP ASA+NTG,n＝3:124.4±5.6μm；以误差条表示标准差，一个星号表示相比于5天RIP PBS显著(定类p值<0.039)；双星号表示相比于5天RIP ASA+NTG显著(定类p值<0.039)。

在用ASA处理后侧支血管直径显著小于对照(用PBS处理)(*定类p值<0.039)。用额外的NTG的处理消除了ASA的抑制作用，但单独用NTG-处理显示出相比于用NTG+ASA处理直径显著增加(**相比于5天RIP ASA+NTG显著，定类p值<0.039)。

用PBS和ASA处理的组中的直径显著小于PBS对照组，但相比于ASA+NTG-安慰剂-组无显著性。在ASA+NTG-组中，相比于用PBS和ASA处理的组，直径显著增加。

图26：“ROI”的MicroCT成像：(A)“5天SHAM PBS”；(B)“5天SHAM NTG”；(C)“5天RIP ISDN”；(D)“5天RIP PBS”；(E)“5天RIP NTG”；(F)“5天RIP ASA+PBS；(G)“5天RIP ASA+NTG”。

照片显示出通过用PBS(D)、NTG(E)、或ISDN(C)处理的缺血性实验方案感兴趣区域中侧支血管直径相比于用PBS(A)或NTG(B)处理的SHAM的生长。通过用ASA(F)处理对侧支血管生长的抑制被用NTG(G)的额外处理部分地抵消。

图27：研究流程图。基线期的时长估计为大约两周。介入期的时长为六周。随访期包括立刻调查(介入期后1天至最多3天)和长期随访调查(介入期后1个月)。

具体实施方式

实施例1

临床前研究

1.简介

动脉生成的一个重要机制是诱导剪切应力跨过募集的侧支动脉(副动脉)。

NO在本方案中起基础性作用，因为其调节动脉的血管舒张能力以及侧支动脉的平滑肌细胞上的治疗性增殖方面。

在本文中，我们评价了NitrolingualSpray(G.Pohl-Boskamp GmbH&Co.KG,Hohenlockstedt,德国；U.S.美国商标名Pumpspray)在单一非-心肌梗塞动脉生成模型中的作用。在该模型中，通过左前降冠状动脉(LAD)的重复闭塞诱导侧支血管生长。测量在这些动物中的梗死面积作为实验末的终点。因此，在心肌梗塞和动脉生成之间没有会削弱实验的干扰。此外，我们还评价了乙酰水杨酸(ASA)在该重复冠状动脉闭塞模型中作为动脉生成的可能抑制剂的作用。我们评价了NO的伴随应用(间歇使用硝化甘油)是否可以补偿ASA的负面作用。

2.材料和方法

2.1动物准备

实验使用雄性Sprague-Dawley大鼠(研究开始时体重为300g；n＝182)。对于手术(第0天)，对大鼠进行预治疗(腹膜内氯胺酮50mg/ml+甲苄噻嗪4mg/ml)和插管。在直接观察声带的条件下用耳镜进行口腔插管(I4-G聚乙烯管)。通过吸入异氟烷引入一般麻醉并维持(1.0％至2.0％，具有100％氧)。通过电加热桌将体温控制在37C。利用无菌技术实施手术。开始时将动物置于其背侧上并用皮夹固定。利用偶接于PowerLab数据采集系统(AD Instruments)的BioAmp差分放大器，在手术期间监测并记录ECG参数(心率)。心脏通过左胸廓切开术暴露。将微型气动抓捕封堵器(细节参见微型气动抓捕封堵器部分)植入到中部附近以最接近冠状动脉左前降支(LAD)。在膨胀过程中通过观察左心室(LV)变白和运动功能减退和观察心电图(ST抬高)来初始确定封堵器的功能确认，即产生心肌缺血。将大鼠随机分为4个治疗模块：

模块1：假手术

模块2：NO间歇(硝化甘油)

模块3：NO连续(硝酸异山梨醇酯的延迟制剂)

模块4：NO间歇+ASA

在装设仪器和测量后，在呼气末正压(positive end-expiratory pressure)下关闭胸腔，并且排空胸腔的空气。封堵器在皮下打开通道并在肩胛骨之间取出。通过连接于在肩胛骨之间皮下固定的环的不锈钢弹簧圈来保护这些导管。手术后，给予镇痛剂(丁丙诺啡0.05mg/kg SC)和抗生素(恩氟沙星10mg/kg SC)。在恢复笼舍中观察大鼠2小时并且然后转移至动物保健设施，在其中由技术人员持续监控。术后，每天两次给予丁丙诺啡(0.5mg/kg SC)用于止痛持续8天或13天。在手术后第3天(第3天)，开始缺血性实验方案。实验方案(第8天或第13天)的对应5天或10天后(仅在模块1A和2A中)，将大鼠麻醉，并通过正中开胸术打开胸腔。在显微-CT组中，立即切除心脏。对于最终梗死面积检测，LAD被永久性堵塞(最终永久性闭塞，FPO)，通过TTC染色测量梗死面积。

1.2用于大鼠心脏的微型气动抓捕封堵器(Mini-Pneumatic Snare Occlude)

使用微型气动抓捕封堵器，由微球囊(mini-balloon)、鞘管(sheath tubing)、缝合线和导管仪器构成。球囊(7mm长)由软胶乳膜制成并且足够柔韧以在球囊紧缩过程中在冠状动脉血管上提供可忽略的物理力。将该球囊安装在伞形护鞘中(直径为3.2或4.8mm，长度为12mm；保护球囊免受纤维性浸润)。将普理灵(5–0)绕过LAD并连接于护鞘，确保封堵器连接至心脏，以使得发生由球囊膨胀产生的心肌缺血。膨胀体积小(0.2至0.25mL空气)，但通过两个物理动作发生闭塞：向上/向外“卷曲”LAD并通过膨胀的球囊/护鞘压缩LAD。将球囊连接于从腹腔取出的导管(PE-50)。从大鼠笼舍外控制球囊膨胀和紧缩。

1.3ECG参数的测量

在全部四个模块(1-4))中在实验方案(RIP)的开始(第3天)和结束(分别为第8天与第13天)时，冠状动脉闭塞进行40秒(等于在RIP中闭塞，参见第6页)并且在FPO中进行90分钟(分别第8天与第13天)，测量ECG参数以检验心率和ST抬高。此外，确定FPO过程中发生的心律失常。根据Lown’s分级，每只动物显示出特定级别。级别越高，心律失常就越严重。为了更具体地说明整个组的平均严重性，确定了VPB评分。鉴于此，每个Lown级别被称为特定因数(0级＝因数0；I级＝因数1；II级＝因数2；IIIa级＝因数3；IIIb级＝因数4；VIa级＝因数5；VIb级＝因数6和V级＝因数7)。每个组具有不同百分比的代表每个级别的动物。各个级别的百分比乘以适当的因数得到单个结果，然后将其总结成整个组的VPB评分。因此，具有较高Lown级别的一组动物具有相应较高的VPB评分。

1.4利用显微-CT进行的冠状动脉微血管成像

另外，使用显微-CT作为进一步终点以使侧支血管成像。准备一组大鼠(每个模块中的每个组为3只大鼠；总共36只大鼠)用于经由显微-CT的冠状动脉血管可视化。通过修改大鼠显微-CT研究的方法使冠状动脉循环填充有造影剂(黄色microfil)。造影剂的粘度使得能够填充至冠状动脉小动脉水平(coronary arteriolar level)而没有或仅有少量填充毛细血管。通过主动脉插管立即通过导管插入切除的心脏，且在85mm Hg下逆向灌注冠状动脉循环。使用灌流液(25℃至27℃的盐水，含有2％普鲁卡因)以避免心肌代谢收缩并且最大程度上扩张冠状动脉血管系统。通过二尖瓣经由左心耳将聚乙烯管插入到LV中以卸载LV。在85mmHg压力下在3分钟内注射温热的造影剂(42℃)，同时监测灌注压力。通过浸入冷的盐水中来冷却心脏(0℃至4℃)直至其(黄色microfil)变硬。然后，除去心脏并在4％多聚甲醛溶液(4℃)中固定过夜。整个心脏被用于冠状动脉侧支血管生长的显微-CT成像。利用显微-CT使冠状动脉血管系统可视化。简言之，整个心脏以1°的增量关于其由顶至底(apex-to-base)纵向轴被360°扫描。本研究中选择的空间分辨率具有18*18*18m³的体素尺寸(voxel size)以聚焦于侧支血管的尺寸并且使来自较小血管的信号最小。最后，将CT数据重构为3D图像。这些图像的主要目的是建立存在或不存在动脉-动脉的吻合连接。对于多个组由独立的观察者来测量侧支血管，即动脉的-动脉吻合连接。用Amira 5.2.2软件(Visage Imaging,柏林,德国)来分析侧支动脉的网络形态。

1.5实验方案

利用以下实验方案通过封堵器的自主膨胀引入重复缺血实验方案(RIP)：每20分钟进行40秒的闭塞，持续2小时20分钟，之后“休息”(紧缩)一段时间持续5小时40分钟。该8-小时组每天重复3次持续5或10天(仅在模块1A和2A中)。通过除去膨胀或紧缩通过导管自主地发生LAD闭塞。在空白大鼠中(参见模块1)，植入球囊，但不施加RIP。在RI实验方案下将大鼠随机分为三个模块2、3和4。

1.6梗死面积检测

在最终永久性闭塞之后通过TTC染色检测梗死面积。在实验方案的5或10天(只在模块1A和2A中)后，使封堵器永久性膨胀90分钟。通过TTC染色(n＝10/组)测量梗死面积。因此，将大鼠麻醉并再次经历ECG记录以确认闭塞(ST抬高)并计算ECG参数和心律失常的数目。在没有侧支血管的动物中，冠状动脉闭塞造成系统性血液动力学的恶化和心律失常，包括室性早搏、室性心动过速和心室纤维性颤动；在具有良好发育的侧支血管的动物中，注意到没有这样的不良反应。利用计算机化程序(Lab chart 7)来记录和分析ECG参数。

通过正中开胸术打开胸腔。立即切除心脏并且平行于房室沟从顶至底将其切成厚度为2m的横向切片。在37℃以含有1.0％氯化三苯四唑(TTC)和8％右旋糖苷的0.09mol/L磷酸钠缓冲液培养切片20分钟。在10％甲醛中固定切片并且然后用安装在立体显微镜上的数字照相机拍照。利用计算机化的平面程序(Adobe Photoshop)测量梗塞的尺寸。以TTC-阴性组织确定梗塞的面积并将其表示为左心室(LV)面积的百分比。

1.7关于测试化合物的细节

1.8向动物递送的途径、时间点和浓度

在随后的器件闭塞时间之前给予所有的药物(ASA和NTG和ISDN延迟)。在最先的两次闭塞之前以相同的方式给予对照缓冲液(PBS)。

NO间歇(NTG)

每天早上8点钟制备新测试溶液。通过注射器从瓶中吸取溶液。

NO间歇(NTG)以8小时的时间间隔每天给予两次。

由于大鼠的仪器装设较慢以及避免进一步的应力，通过经颊施加给予NTG。在模块1、2和4中，每次经颊施加给予50μl的每日制备的测试溶液，其中含有17.37μg硝化甘油(等于0.8mg的人类剂量，如通过公式剂量/动物[mg]＝代谢体重[kg^0,75]*人类剂量[mg/kg]*重新计算因数[kg/kg^0,75]计算，根据W.,Ungemach,F.R.,Kroker,R.,1998,Blackwell Science,第3版)。施加的时间点为在早9点和下午5点恰好在球囊膨胀之前，因此具有对于募集的侧支动脉的最大影响。

这种浓度恰好在给予前取自上述反应瓶。

载体化合物溶液作为储备溶液以用于制备测试溶液。

NO间歇的载体化合物(NTG-安慰剂)

以与NO间歇完全相同的方式给予载体化合物。

NO连续(ISDN延迟)

递送用于延长NO递送的药物(延迟释放制剂硝酸异山梨醇酯＝长效硝酸酯ISDN)作为延迟的颗粒1x/天。

对于延迟释放制剂ISDN而言，选择2.6mg ISDN/大鼠的剂量。因此，将13mg的颗粒悬浮于0.5ml饮用水中并经由强饲法在每天早上9点钟施用(相当于人类剂量2mg/kg/体重)。

NO连续载体化合物(ISDN-安慰剂)

以与NO连续完全相同的方式给予载体化合物。

NO间歇+ASA(乙酰水杨酸)

在每天早上9:30，经由强制灌胃法给予每只大鼠溶解于0.5ml饮用水中的2.22mgASA。

ASA浓度为2.22mg ASA/大鼠(6.34mg/kg体重)等同于人类剂量的100mg/天。

1.9动物和组

10只大鼠/组(FPO＝最终永久性闭塞以诱发梗塞)

组d：像对应的组a、b和c那样用相同的药物和结扎方案处理另外3只动物，但没有FPO。这9只动物/模块用于显微CT图像。

模块1：假手术(无RIP)：

A.对照缓冲液(磷酸盐缓冲盐水PBS)，具有用于梗死面积检测的功能性FPO n＝20

1.n＝10:“5天SHAM PBS”

2.n＝10“10天SHAM PBS”

B.载体化合物无NO+用于梗死面积检测的功能性FPO

n＝10:“5天SHAM NTG-安慰剂”

C.NTG，具有用于梗死面积检测的功能性FPO

n＝10:“5天SHAM NTG”

D.A1.)n＝3A2.)n＝3B)n＝3C)n＝3用于显微CT图像

n＝12

总计：n＝52

模块2：NO间歇：

A.间歇对照缓冲液，具有用于梗死面积检测的功能性FPO

n＝20

1.n＝10:“5天RIP PBS”

2.n＝10:“10天RIP PBS”

C.间歇载体化合物+用于梗死面积检测的功能性FPO

n＝10:“5天RIP NTG-安慰剂”

D.间歇NTG，具有用于梗死面积检测的功能性FPO

n＝10:“5天RIP NTG”

E.A1.)n＝3A2.)n＝3B)n＝3C)n＝3用于显微CT图像

n＝12

总计：n＝52

模块3：NO连续：

A.连续对照缓冲液(饮用水)，具有用于梗死面积检测的功能性FPO

(n＝10)：“5天RIP DW”

B.连续载体化合物+用于梗死面积检测的功能性FPO

n＝10:“5天RIP ISDN-安慰剂”

C.连续NO用于梗死面积检测的功能性FPO

n＝10:“5天RIP ISDN”

D.A.)n＝3B.)n＝3C.)n＝3用于显微CT图像

n＝9

总计：n＝(39)

模块4：NO间歇+ASA：

A.间歇对照缓冲液+ASA，具有用于梗死面积检测的功能性FPO

n＝10:“5天RIP PBS+ASA”

B.间歇NO载体化合物+ASA+用于梗死面积检测的功能性FPO

n＝10:“5天RIP NTG-安慰剂+ASA”

C.间歇NTG+ASA用于梗死面积检测的功能性FPO

n＝10:“5天RIP NTG+ASA”

D.A.)n＝3B.)n＝3C.)n＝3用于显微CT图像

n＝9

总计：n＝39

2.统计学分析

所有的数据以平均±SD给出。图表示出了平均±SEM。

通过利用SPSS 20软件包(IBM SPSS Statistics,NY,USA)，分析由测量ST段抬高、梗死面积和血管直径获得的结果的统计学显著性。ANOVA具有错误发现率(falsediscovery rate，FDR)，使用校正。利用FDR程序调整p值以用于多次测试，以达到p≤0.05的实验-广泛显著性。FDR考虑舍弃的空假设的数目并且已显示出与Bonferroni校正相比增加的统计学能力。

3.结果

3.1最终永久性闭塞

LAD闭塞提供了对侧支血管功能的前瞻性研究。这样的血管能够在冠状动脉闭塞后处于缺血风险中时保护心肌组织。

在RI(重复缺血性)实验方案结束时，在全部组的亚组中实施永久性LAD闭塞并且测量以检查ST段抬高和室性心律不齐。在永久性闭塞90分钟后，确定梗塞区域。

3.2ECG分析

当存在侧支血管时，由LAD闭塞引起的缺血的心电图波形不明显。

3.3ST段抬高

在LAD闭塞期间，在巨大的ST段抬高量级和侧支血管供血的程度之间存在负相关。

侧支血管功能是在急性冠状动脉闭塞期间ST段响应于缺血的方向的重要决定因素。在急性LAD闭塞期间的可逆ST段抬高与侧支动脉的功能不足有关。在具有可逆ST段压低的患者中，冠状动脉侧支血管功能显得更好，并且作为结果，显示出较少的缺血结果。

在90分钟闭塞期间，“10天SHAM PBS”组中的ST段抬高显著高于“10天RIPPBS”组(10天SHAM,n＝7:0.124±0.039mV；10天RIP,n＝7:0.055±0.033mV)。相对而言，“5天SHAM PBS”中的ST段抬高类似于“5天RIP PBS”组(5天SHAM,n＝8:0.134±0.034mV；5天RIP,n＝8:0.104±0.016mV)(图1和图2)。

模块1：假手术(无RIP)

在三个SHAM-组之间(5天SHAM PBS,n＝8:0.134±0.034mV；5天SHAM NTG-安慰剂,n＝6:0.131±0.043mV；5天SHAM NTG,n＝7:0.124±0.058mV)(图3和图4)没有显著性。

模块2：NO间歇(NTG)

在NTG组(“5天RIP NTG”)中，ST抬高相比于PBS组(5天RIP PBS,n＝8:0.104±0.016mV；5天RIP NTG,n＝7:0.052±0.030mV)显著减少。在PBS和NTG-安慰剂-组之间(5天NTG-安慰剂:n＝6；0.096±0.061mV)(图5和图6)没有显著性。

模块3：NO连续(ISDN延迟)

ISDN组(“5天RIP ISDN”)中的ST段抬高相比于PBS组(5天RIP PBS,n＝8:0.104±0.016mV；5天RIP ISDN,n＝7:0.062±0.027mV)减少，但无显著性，在PBS和ISDN-安慰剂-组之间(5天ISDN-安慰剂,n＝7:0.110±0.069mV)同样无显著性(图7和图8)。

模块4：NO间歇+ASA

在用PBS和ASA处理的组中的ST段抬高高于PBS对照组(5天RIP ASA+PBS,n＝7:0.138±0.098mV；5天RIP PBS,n＝8；0.104±0.016mV)，但无显著性，与ASA+NTG-安慰剂-组之间(5天RIP ASA+NTG-安慰剂,n＝6:0.144±0.091mV)同样无显著性。在ASA+NTG-组中，ST抬高低于用PBS和ASA处理的组(5天RIP NTG+ASA,n＝7:0.088±0.071mV)(图9和图10)。

3.4室性心律不齐

室性早搏(VPBs)的重要性导致其可能与心脏猝死的风险增加相关。根据Lown分级满足VPB。较高的Lown等级已经显示出预测急性心肌梗塞之后的死亡率。

0级：无室性异位搏动

I级：偶尔，分离的VPB

II级：经常VPB(>1/min或30/h)

III级：多种形式的VPB

(a)VPB

(b)Bigenimus

IV级：重复VPB

(a)Couplets

(b)Salvos

V级：早期VPB

模块1：假手术(无RIP)

在“5天SHAM PBS”组中，87.5％的大鼠具有IVb级心律失常且12.5％的大鼠具有IVa级。在“5天SHAM NTG-安慰剂”组中，83.3％的大鼠具有IVb级心律失常且16.7％的大鼠具有IVa级，并且在“5天SHAM NTG”组中，85.7％的大鼠具有IVb级心律失常且14.3％的大鼠具有IIIa级心律失常(图11)。

模块2：NO间歇(NTG)

在“5天RIP PBS”组中，75.0％的大鼠具有IVb级心律失常，12.5％的大鼠具有Iva级且12.5％的大鼠为0级。对于“5天RIP NTG-安慰剂”组，50.0％的大鼠显示出IVb级心律失常，16.7％的大鼠为IVa级，16.7％的大鼠为IIIb级，以及16.7％的大鼠为0级心律失常。感兴趣的是，“5天RIP NTG”组显示出42.9％的IVb级心律失常以及57.1％的0级心律失常(图12)。

模块3：NO连续(ISDN延迟)

在“5天ISDN-安慰剂”组中，57.1％的大鼠具有IVb级心律失常，14.3％为IVa级且28.6％的为IIIb级。“5天RIP ISDN”组显示出严重性较低的心律失常，其中57.1％为IVb级，28.6％为IIIb级以及14.3％为0级心律失常(图13)。

模块4：NO间歇+ASA

在“5天RIP ASA+PBS”组中，在用ASS+NTG-安慰剂处理的组中以及在“5天RIP ASS+NTG”组中，83.3％的大鼠具有IVb级心律失常且16.7％为IIIa级(图14)。

对于每个组的每个Lown等级的百分比，能够确定VBP评分。越多的动物显示出较高等级，VBP评分就越高(图15)。

图15：VPB-评分

组	VPB-评分
		模块1
SHAM PBS	5.88
		SHAM NTG-安慰剂	5.83
SHAM NTG	5.71
		模块2
RIP PBS	5.13
		RIP NTG-安慰剂	4.50
RIP NTG	2.57
		模块3
RIP PBS	5.13
		RIP ISDN-安慰剂	5.29
RIP ISDN	4.57
		模块4
RIP ASA+PBS	5.50
		RIP ASA+NTG-安慰剂	5.50
RIP ASA+NTG	5.50

表1：VPB-评分

3.5梗死面积

LAD闭塞90分钟和20分钟再灌注之后，分析梗死面积。

相比于“10天SHAM PBS”组，“10天RIP PBS”组具有显著更小的梗死区域(10天RIP PBS,n＝6:6.57±3.26％；10天SHAM PBS,n＝7:13.71±6.04％)。在两个5天组之间无显著性(5天SHAM PBS,n＝8:13.36±5.22％；5天RIP PBS,n＝8:11.05±5.12％)(图16)。

模块1：假手术(无RIP)

在三个SHAM-组之间无显著性(5天SHAM PBS,n＝8:13.36±5.22％；5天SHAMNTG-安慰剂,n＝6:14.21±5.79％；5天SHAM NTG,n＝7:14.09±5.18％)(图17)。

模块2：NO间歇(NTG)

相比于“5天RIP PBS”，在“5天RIP NTG”组(5天RIP PBS,n＝8:11.05±5.12％；5天RIP NTG,n＝7:3.61±2.08％)中观察到显著更小的梗死区域。在PBS和NTG-安慰剂-组(5天NTG-安慰剂:n＝6；9.80±6.79％)之间无显著性(图18)。

模块3：NO连续(ISDN延迟)

ISDN组(“5天RIP ISDN”)中的梗死面积小于PBS组(5天RIP PBS,n＝8:11.05±5.12％；5天RIP ISDN,n＝7:7.59±4.38％)和ISDN-安慰剂-组(5天ISDN-安慰剂，n＝6:9.97±3.65％)(图19)。

模块4：NO间歇+ASA

用ASA(“5天ASA+PBS”)处理组中的梗死面积相比于PBS对照组(5天RIP ASA+PBS,n＝6:12.51±3.05％；5天RIP PBS,n＝8；11.05±5.12％)稍微增加，ASA+NTG-安慰剂-组(5天RIP ASA+NTG-安慰剂,n＝6:13.92±1.71％)也是这样。在ASA+NTG-组和用ASA和PBS处理的组之间无差异(图20)。然而，在NTG组中的梗死区域相比于ASA+NTG组(5天RIP NTG,n＝7:3.61±2.08％；5天RIP NTG+ASS,n＝6:13.00±3.82％)显著更小(图20)。

3.6利用显微-CT的冠状动脉微血管成像

侧支动脉是平行于主动脉运行的预先存在的血管。在主动脉堵塞的情况下，即使是很短的时间(在该RIP中40秒)，侧支血管也会承担供血的作用。因此，在该区域(ROI，感兴趣区域)内的侧支动脉开始在长度上生长(以螺旋模式清晰可见)并且其直径最为显著。所以，我们测量了ROI中侧支血管的直径。

模块1：假手术(无RIP)

在三个SHAM-组(5天SHAM PBS,n＝3:82.7±3.7μm；5天SHAM NTG-安慰剂,n＝3:89.6μm±10.6μm；5天SHAM NTG,n＝3:86.8±9.0μm)中无显著性(图22和图26)。

模块2：NO间歇(NTG)

相比于“5天RIP PBS，“5天RIP NTG”组中ROI中侧支血管的直径显著增加(5天RIP PBS,n＝3:129.8±6.9μm；5天RIP NTG,n＝3:158.4±9.2μm)。在PBS和NTG-安慰剂-组(5天NTG-安慰剂:n＝3；127.0±12.1μm)之间无差异(图23和图26)

模块3：NO连续(ISDN延迟)

相比于PBS组(5天RIP PBS,n＝3:129.8±6.9μm；5天RIP ISDN,n＝3:148.2±11.3μm)，以及相比于ISDN-安慰剂组(5天ISDN-安慰剂,n＝3:133.0±11.5μm)，ISDN组(“5天RIP ISDN”)中侧支血管的直径增加(图24和图26)。

模块4：NO间歇+ASA

用PBS和ASA处理的组中的直径显著小于PBS对照组(5天RIP PBS+ASA,n＝3:102.5±8.0μm；5天RIP PBS,n＝3；129.8±6.9μm)，但相比于ASA+NTG-安慰剂-组(5天NTG-安慰剂+ASA,n＝3:97.1±8.6μm)无显著性。在ASA+NTG–组中，相比于用PBS和ASA处理的组(5天RIP ASA+NTG,n＝3:124.4±5.6μm)直径显著增加(图25和图26)。

4.结论

我们检查了“10天SHAM PBS”组和“5天SHAM PBS”组，它们均没有RIP(重复缺血性实验方案)以及“10天RIP PBS”组和“5天RIP PBS”组，它们均具有5天和10天的RIP。

在永久性LAD闭塞(FPO，最终永久性闭塞)90分钟后测量梗塞体积揭示了在10天RIP组中的梗塞面积比在“10天SHAM”中的梗塞面积显著更小。相对而言，在5天RIP后，在SHAM和RIP组之间未出现差异。

而且，我们首次使用了ECG参数来检查和评价。我们发现，LAD的FPO之后最大ST抬高显示出在“5天RIP PBS”和SHAM组之间没有关键性差异。然而，在10天后RIP组中的ST抬高显著下降。

除了在FPO期间测量ST抬高，我们能够以差异化方式分析和评价心律失常。

基于针对大鼠RMI模型的表征的新观点，我们决定在预期刺激动脉生成的情况下使用5天RIP。10天RIP后ST抬高增强程度和梗塞体积也能够用前动脉生成(pro-arteriogenic)物质在5天RIP内获得。

这提供了能够证明我们的梗塞体积测量结果的另外的参数。

相比于对照组，间歇施用NTG溶液(颊粘膜上，每天两次)使得在FPO期间大鼠心脏的严重心律失常减少。另外，相比于对照组，在90分钟FPO后梗塞体积减少了超过50％。这梗死面积的减少是对照组在长达10天RIP也不可获得的。此外，用NTG溶液处理显著减少了FPO期间的ST抬高。基于μCT分析，可测量到显著增大的侧支动脉。

用ISDN延迟(每天一次灌胃给予)对大鼠进行处理还会导致在FPO期间ST抬高减少，较少的心律失常和减小的梗塞体积。然而，梗塞参数的这些改善相比于用NTG处理的区别不大。而且，其并未显示出任何显著性。

相比于对照，用ASA处理显示出对ECG参数的损害并且由于损害的侧支血管生长而造成梗塞体积增加。ASA对于动脉生成的这些负面影响是已知的。感兴趣的是，通过另外的NTG处理(颊粘膜上，每天两次)其能够被部分消除。因此，ROI中的侧支血管直径增加并且ECG参数增加。除此之外，FPO之后的梗塞体积显示出未减小。

SHAM组彼此之间无不同。

另外，在安慰剂组和相应的对照组之间没有测量到差异。

因此，本发明结果说明，用NTG溶液间歇处理使得实验诱导的心肌梗塞的尺寸减小。另外，对心率的影响得到改善。这些发现对于临床方面具有显著的相关性。

实施例2

临床研究

本研究的目的在于调查在患有慢性稳定性CAD的患者中，受监督的、医师控制的标准化锻炼项目对于症状治疗、功能改善和动脉容量增加的影响。

1研究设计

1.1假设和研究组(Study Arm)

1.1.1假设

I.间歇施用GTN的积极的医师控制的锻炼训练优于无GTN的积极的医师控制的锻炼训练。

(A+)>(A-)

II.间歇施用GTN的消极的医师控制的锻炼训练优于无GTN的消极医师控制的锻炼训练。

(P+)>(P-)

III.间歇应用GTN的保守CAD治疗优于未使用GTN的保守CAD治疗。

(C+)>(C-)

1.1.2研究组

A+间歇施用GTN的积极的医师控制的锻炼训练

A-积极的医师控制的锻炼训练

P+间歇施用GTN的消极的医师控制的锻炼训练

P-消极的医师控制的锻炼训练

C+间歇应用GTN的保守CAD治疗

C-保守CAD治疗

患者在心绞痛的情况下可以使用GTN，然而将提供对于研究应用的另外研究GTN。

间歇施用GTN的积极的医师控制的锻炼训练。对患有慢性稳定性心绞痛的患者护理施以目前的指南(AHA,ESC)中详细说明的最好的医疗和常规保健。每天(周一至周五)进行30分钟时段的体育锻炼(physical exercise intervals of 30min)(跑步机)(>1W/kg体重)，之后根据目前的EACPR指南中的详细记载进行风险等级评分和个体计算并调整训练强度，总共持续六周。允许使用GTN来治疗心绞痛发作。另外，在锻炼开始前2-5分钟给予0.4mg GTN。

积极的医师控制的锻炼训练。对于患有慢性稳定性心绞痛的患者护理施以目前的指南(AHA,ESC)中详细说明的最好的医疗和常规保健。每天(周一至周五)进行30分钟时段的体育锻炼(跑步机)(>1W/kg体重)，之后根据目前的EACPR指南中的详细记载进行风险等级评分和个体计算并调整训练强度，总共持续六周。允许使用GTN来治疗心绞痛发作。

间歇施用GTN的消极的医师控制的锻炼训练对于患有慢性稳定性心绞痛的患者护理施以目前的指南(AHA,ESC)中详细说明的最好的医疗和常规保健。每天(周一至周五)进行每天1小时时段的治疗(treatment intervalsof one hour per day)，总共持续六周，如(Arora RR,Chou TM,Jain D,Fleishman B,Crawford L,McKiernan T,Nesto RW.The multicenter study of enhanced externalcounterpulsation(MUST-EECP):effect of EECP on exercise-induced myocardialischemia and anginal episodes.J Am Coll Cardiol.1999 Jun；33(7):1833-40)中详细记载的。允许使用GTN来治疗心绞痛发作。另外，在锻炼开始前2-5分钟给予0.4mg GTN。允许使用GTN来治疗心绞痛发作。

消极的医师控制的锻炼训练对于患有慢性稳定性心绞痛的患者护理施以目前的指南(AHA,ESC)中详细说明的最好的医疗和常规保健。每天(周一至周五)进行每天1小时时段的治疗，总共持续六周，如(Arora等人,同上)中详细记载的。允许使用GTN来治疗心绞痛发作。

间歇应用GTN的保守CAD治疗

对于患有慢性稳定性心绞痛的患者护理施以目前的指南(AHA,ESC)中详细说明的最好的医疗和常规保健。允许使用GTN来治疗心绞痛发作。另外，每天一次给予0.4mg GTN，优选在日常生活的自发性活动开始前给予。

保守CAD治疗。对于患有慢性稳定性心绞痛的患者护理施以目前的指南(AHA,ESC)中详细说明的最好的医疗和常规保健。允许使用GTN来治疗心绞痛发作。

1.2临床实验设计

1.2.1临床实验设计–通用

该研究被设计为

●前瞻性

●随机的

●多中心(位于德国，位于美国)

临床实验，为了评价硝酸甘油对运动能力的影响，建议的病理机制学为动脉生成前效应(pro-arteriogenic effects)的诱发。

1.2.2研究终点

初步(终点)

变化在于

功能性运动能力，如第3次访视时在标准化平板运动试验(sETT)中由摄氧量(VO₂max)的峰值体积和从基线在无氧阈值(VO₂max AT)下的最大摄氧量测量的。

第二(终点)

变化在于

(1)运动诱发的缺血的时间，如在标准化平板运动试验(sETT)中通过达到>1-mmST-段压低的时间所测量的，

(2)对sETT的血液动力学反应，如通过率压乘积(RPP)¹定量化的，其被定义为收缩压(mm Hg)乘以心率(bpm)。在J-点+60ms处电测量心率、血压和ST段趋势，

(3)每天心绞痛发作的次数，

(4)在sETT上的锻炼期间，

(5)相对峰值斜率指数(Relative Peak Slope Index，RPSI),

(4)多普勒推导的最大心脏收缩加速度[ACCmax],

(5)CCS和NYHA功能状态，¹率压乘积(RPP)是心肌氧耗量(mVO₂)的敏感指标。通过在最大ST压低时存在的率压乘积(RPP)对患者进行分类。在不存在ST压低的情况下，记录最大RPP。

(6)平板运动试验Duke评分²，

(7)在处理阶段期间心血管事件的发生率，以及

(8)与初步终点相同，但在介入期后一个月。

1.2.3患者

合格的患者必须是临床上稳定的，入选之前接受过抗心绞痛和CAD治疗且完全符合目前的用于治疗慢性稳定性CAD的ESC/AHA指南。

禁止用药

●长效硝酸酯

●西地那非等

●抗炎化合物(除阿司匹林之外)例如类固醇或依那西普等。

²平板运动试验Duke评分计算风险；其等于以分钟计的锻炼时间减去(5倍ST-段偏移，在锻炼过程中或锻炼之后，以毫米计)减去(4倍心绞痛指数，如果没有心绞痛则其值为“0”，如果发生心绞痛为“1”，并且如果心绞痛为中止实验的原因则为“2”)。在疑似具有CAD的门诊患者中，三分之二的具有指示低风险评分的患者的四年存活率为99％(平均年死亡率为0.25％)，并且4％的具有指示高风险评分的患者的四年存活率为79％(平均年死亡率为5％)。该评分对于住院患者和门诊患者都具有很好的效果，并且初步数据暗示了该评分对于男性和女性都具有很好的效果[Gibbons等人,2003AHA/ACC Guideline]。

随机化

将入选的患者以1:1:1的比率随机分配以接受/经历积极训练、治疗或常规保健，即根据目前的指南的持续基线治疗。在这些组中，患者被以1:1量随机分为"+GTN"或"-GTN"组接受三硝酸甘油酯，不包括或包括其标准药物治疗。

1.2.4研究计划、进程和管理

实验由Arteriogenesis Network Art.Net计划。

研究管理由Arteriogenesis Network Art.Net进行。

c/o Campus Technologies Freiburg GmbH

弗莱堡大学的技术转移(Technology Transfer of the University of Freiburg)

CEO：Bernhard Arnolds博士、教授

Stefan-Meier Straβe 8,79104 Freiburg(德国)

电话:+49(0)761 203 4990

传真:+49(0)761 203 4992

实验的赞助商为CTF。

报告结构和报告方案将在指定参与中心之后具体化。

研究地点

参与中心：待定

有问题时联系，信息传播

出现不良事件时联系，信息传播

1.2.5研究流程图和试验方案

图27中给出了研究流程图。

1.2.6处理分配

经由信封在进行中心实施随机化。

根据年龄组、性别和发病率来进行分组。

由访问员来进行研究访视。

研究中心由访问员随机指定，其不知道随机化并且其在基线和第一次随访时进行医学检查和测试。

在每次研究访问时，患者被引导填写短的标准化生活治疗评价表(SF-36³)。

被指定为C+/C-组的患者与研究人员定期接触以帮助控制潜在的偏好影响，因为这些受试者不像接受或进行锻炼的组那样具有与研究人员的定期接触。

1.2.7研究访视

访视1：资格筛选(第1天)

●医疗病历，包括之前的介入、体检

●入选y/n

访视2：基线访视(直至第14天(+3天)) ³http://www.rand.org/health/surveys_tools/mos/mos_core_36item.html

●详细医疗病历和体检，包括评价每天心绞痛发作次数、CCS和NYHA状态以及评价自愿体力活动。

●在具有心肺测试能力的标准的、经校准的平板设备上进行的平板试验(改进的Naughton实验方案)：

功能性运动能力(VO₂max和VO₂max AT)，诱导缺血的运动时间，如通过达到>1-mm ST-段压低的时间所测量的，在J-点+60ms处电测量的率压乘积(RPP)、心率、血压和ST段趋势、锻炼期间、平板运动试验Duke评分，

连续监测生命指征包括12导联ECG和VO₂，VO₂max被定义为个体患者能够达到的锻炼的最大水平时的VO₂(呼吸率>1，无氧阈值)

●相对峰值斜率指数(RPSI)

●多普勒推导的最大心脏收缩加速度[ACCmax]

●随机化

临时随访(不定期)

建议患者在任何时间关于其身体状况联系研究中心。在随机化6周后安排患者返回以接受其第一次随访(follow-up)。

访视3：短期随访(介入期后1-3天)

●医疗病历和体检，包括评价每天心绞痛发作次数、CCS和NYHA状态以及评价自愿体力活动。

连续监测生命指征包括12导联ECG和VO2，VO2max被定义为个体患者能够达到的锻炼的最大水平时的VO2(呼吸率>1，无氧阈值)

●相对峰值斜率指数(RPSI)

●多普勒推导的最大心脏收缩加速度[ACCmax]

●在治疗阶段期间心血管事件的发生率

访视4：长期随访(介入期后1个月)

(本研究点的合理性在于评价在介入期后研究药物的长期作用)。

●相对峰值斜率指数(RPSI)

●多普勒推导的最大心脏收缩加速度[ACCmax]

1.2.8统计学考虑

主要效率参数为功能性运动能力，如通过在标准化平板运动试验(sETT)中摄氧量的峰值体积(VO2max)和在无氧阈值(VO2max AT)处的最大摄氧量所测量的。我们假设在基线处无差异但在随访时GTN组中具有显著更高的值。

统计学方法

在本实验中有两个需要考虑的主要方差来源：GTN治疗效果和积极训练/消极训练/保守治疗的效果。因此，将以双向ANOVA来分析数据。以描述而非推理统计的方式报告与GTN无关的任何治疗效果。

对于二次参数，将适当地采用参数测试或非参数测试。

样品大小/功效

为了获得用于建议的双向ANOVA的必要样品尺寸，我们做出了以下假设(基于文献综述和内部数据)：统计功效＝80％，结果测量值的标准差＝平均的15％，效应量(GTN是/否之间变化的组差异)＝平均的5％。在Monte Carlo刺激中在每组n为30至60位患者的范围内基于10000次重复/样品大小确定功效。这种刺激确定了48位受试者/组的最小样品大小，考虑中途退出者我们建议包括50位受试者/组，使得总样品大小为300位患者。

1.3伦理学和法律方面

调查人员计划并实施关于人类的任何实验，包括获自人类的可识别样品和可识别数据，应符合：

(a)由世界医学协会(WMA)在1964年6月达成的赫尔辛基宣言(Declarationof Helsinki)(关于人类受试者的医学研究伦理准则(Ethical Principles for MedicalResearch Involving Human Subjects))，最新校正版；

(b)ICH协调的三方指南：临床试验管理规范E6/人用药物注册技术要求国际协调会(ICH E6，1996年5月1日)以及

(c)当前形式的可适用的德国规定(例如，Arzneimittelgesetz法案)，以及可适用的FDA规定(例如，赞助者、研究者、知情同意要素的指导，21 CFR§50.25(c)。

5.缩写对照表

ACC_max：多普勒推导的最大心脏收缩加速度

Art.Net.：CTF的网络分包商

CAD：冠状动脉疾病

个性化反搏治疗

CCS:加拿大分类学会(Canadian Class Society)(心绞痛分类)

CTF：Campus Technologies Freiburg

FSS：流体剪切应力

GTN：硝酸甘油

IABP：主动脉内球囊泵

NYHA：纽约心脏学会(New York Heart Association)

RPSI：相对峰值斜率指数

sETT：标准化平板运动试验

SMC：血管平滑肌细胞

VO₂max：摄氧量的峰值体积

VO₂max AT：无氧阈值处的最大摄氧量

本发明进一步涉及以下项：

1.一种治疗或预防动脉供血不足的方法，其中，以间断的方式以对于诱导动脉生成有效的量向受试者给予NO供体。

2.根据第1项所述的方法，其中，所述动脉供血不足是由于在身体休息或锻炼过程中，由动脉或旁路或分流供氧或供血的组织的供氧或供血不足。

3.根据第1项或第2项所述的方法，其中，所述动脉供血不足是由于由动脉或旁路或分流供氧或供血的组织对氧或血流的需要增加。

4.根据第1项至第3项中任一项所述的方法，其中，所述动脉供血不足的特征在于动脉血管的部分或完全闭塞。

5.根据第1项至第4项中任一项所述的方法，其中，动脉供血不足是由于血管内的物质沉积。

6.根据第1项至第5项中任一项所述的方法，其中，动脉供血不足是由于动脉的外部或内部压力。

7.根据第1项至第6项中任一项所述的方法，其中，动脉供血不足是血管疾病。

8.根据第1项至第6项中任一项所述的方法，其中，动脉供血不足是选自由动脉粥样硬化、缺血性疾病以及另外的慢性动脉疾病组成的组中的疾病。

9.根据第1项至第6项中任一项所述的方法，其中，动脉供血不足是冠状动脉供血不足。

10.根据第1项至第6项中任一项所述的方法，其中，动脉供血不足是脑动脉供血不足。

11.根据第1项至第6项中任一项所述的方法，其中，动脉供血不足是外周动脉供血不足。

12.根据第1项至第6项中任一项所述的方法，其中，动脉供血不足是肠动脉供血不足。

13.根据第1项至第6项中任一项所述的方法，其中，动脉供血不足是泌尿生殖器动脉供血不足。

14.根据第1项至第6项中任一项所述的方法，其中，动脉供血不足是神经动脉供血不足。

15.根据第1项至第6项中任一项所述的方法，其中，动脉供血不足在硬皮病的情况下发生。

16.根据第1项至第6项中任一项所述的方法，其中，动脉供血不足为视网膜中央动脉供血不足。

17.根据第1项至第16项中任一项所述的方法，其中，动脉供血不足的特征在于不存在血管内皮功能障碍。

18.根据第1项至第17项中任一项所述的方法，其中，NO供体为一氧化氮、硝普钠、硝化甘油(硝酸甘油)、单硝酸异山梨醇酯、硝酸异山梨醇酯、季戊四醇四硝酸酯(PETN)、吗多明、亚硝酸戊酯或尼可地尔。

19.根据第1项至第6项中任一项所述的方法，其中，NO供体为短效NO供体。

20.根据第1项至第19项中任一项所述的方法，其中，NO供体为硝化甘油。

21.根据第1项至第19项中任一项所述的方法，其中，NO供体每天给予至少一次，并且每周给予至少一天，持续至少两周。

22.根据第1项至第21项中任一项所述的方法，其中，NO供体持续给予数周或数月。

23.根据第1项至第22项中任一项所述的方法，其中，NO供体与所述动脉中的搏动剪切力的外源性刺激联合给予。

24.根据第23项所述的方法，其中，NO供体在外源性刺激发生前30分钟直至外源性刺激终止后的30分钟的时间段内给予。

25.根据第24项所述的方法，其中，NO供体在外源性刺激发生前15分钟直至外源性刺激终止后的30分钟的时间段内给予。

26.根据第23项至第25项中任一项所述的方法，其中，所述刺激是通过体育锻炼或向动脉血管施加内力实现的。

27.根据第1项至第26项中任一项所述的方法，其中，所述方法目的在于防止所述动脉供血不足。

28.根据第1项至第27项中任一项所述的方法，其中，NO供体经舌、舌下、吸入、颊内、经粘膜或经口腔粘膜给予。

29.一种在用于预防或治疗动脉供血不足的方法中使用的NO供体，其中，以对于诱导动脉生成有效的量以间断的方式给予NO供体。

30.根据第29项所述用途的NO供体，其具有由第2项至第28项中任一项所限定的特征。

31.一种用于抑制与动脉供血不足的任何治疗相关的负面影响的方法，其中，所述治疗为抗动脉的或抑制动脉生成，所述方法包括以对于动脉生成的诱导有效的量和方式向接受所述治疗的受试者给予NO供体。

32.一种在抑制与动脉供血不足的任何治疗相关的负面影响的方法中使用的NO供体，其中，以对于动脉生成的诱导有效的量和方式向接受所述治疗的受试者给予NO供体。

33.根据第32项使用的NO供体或根据第32项所述方法，其具有由第2项至第28项中任一项所限定的特征。

34.一种用于预防或治疗心律不齐的方法，其中，以对于所述心律不齐有效的量和方式向受试者给予NO供体。

35.根据第34项所述的方法，其具有由第18项至第28项中任一项所限定的特征。

36.一种在用于预防或治疗心律不齐的方法中使用的NO供体，其中，以对于所述心律不齐有效的量和方式向受试者给予NO供体。

37.根据第36项所述的方法，其具有由第18项至第28项中任一项所限定的特征。

38.一种促进侧支血管循环的方法，包括使受试者暴露于治疗有效量的NO供体的步骤，其中，所述治疗有效量的NO供体促进动脉生成，从而足以在生理学或病理学条件下加强侧支循环。

39.根据第38项所述的方法，其中，所述受试者患有动脉供血不足。

40.根据第39项所述的方法，其具有由第2项至第28项中任一项所限定的特征。

Claims

1.一种在用于预防或治疗动脉供血不足的方法中使用的NO供体，其中，以间断的方式以诱导动脉生成有效的量给予所述NO供体。

2.根据权利要求1所述用途的NO供体，其中，所述动脉供血不足的特征在于动脉血管的部分或完全闭塞。

3.根据权利要求1或2中任一项所述用途的NO供体，其中，所述动脉供血不足是由于所述血管中的物质沉积造成的，或者其中所述动脉供血不足是由于动脉的外部或内部压力造成的。

4.根据权利要求1至3中任一项所述用途的NO供体，其中，所述动脉供血不足为血管疾病，或者其中所述动脉供血不足为选自由动脉粥样硬化、缺血性疾病以及另外的慢性动脉疾病组成的组中的疾病，或者其中所述动脉供血不足为冠状动脉供血不足、脑动脉供血不足、外周动脉供血不足、肠动脉供血不足、泌尿生殖器动脉供血不足、神经动脉供血不足、硬皮病或视网膜中央动脉供血不足。

5.根据权利要求1至4中任一项所述用途的NO供体，其中，所述NO供体为一氧化氮、硝普钠、硝化甘油(硝酸甘油)、单硝酸异山梨醇酯、硝酸异山梨醇酯、季戊四醇四硝酸酯(PETN)、吗多明、亚硝酸戊酯或尼可地尔，尤其是其中所述NO供体为硝化甘油。

6.根据权利要求1至5中任一项所述用途的NO供体，其中，所述NO供体为短效NO供体。

7.根据权利要求1至6中任一项所述用途的NO供体，其中，所述NO供体每天给予至少一次，并且每周给予至少一天，持续至少两周。

8.根据权利要求1至7中任一项所述用途的NO供体，其中，所述NO供体持续给予数周或数月。

9.根据权利要求1至8中任一项所述用途的NO供体，其中，所述NO供体与所述动脉中的搏动剪切力的外源性刺激联合给予。

10.根据权利要求9所述用途的NO供体，其中，所述NO供体在外源性刺激发生前30分钟直至外源性刺激终止后的30分钟的时间段内给予。

11.根据权利要求9或10中任一项所述用途的NO供体，其中，所述刺激是通过体育锻炼或向动脉血管施加内力实现的。

12.根据权利要求1至11中任一项所述用途的NO供体，其中，所述方法的目的在于防止所述动脉供血不足。

13.根据权利要求1至12中任一项所述用途的NO供体，其中，所述NO供体经舌、舌下、吸入、颊内、经粘膜或经口腔粘膜给予。

14.一种在抑制与动脉供血不足的任何治疗相关的负面影响的方法中使用的NO供体，其中所述治疗为抗动脉生成的或抑制动脉生成，其中以对于动脉生成的诱导有效的量和方式向接受所述治疗的受试者给予NO供体，尤其是，其中所述NO供体是如权利要求2至13中任一项中所限定的。

15.一种在用于预防或治疗心律不齐的方法中使用的NO供体，其中，以对于治疗所述心律不齐有效的量和方式向受试者给予NO供体，尤其是，其中所述NO供体是如权利要求5至13中任一项中所限定的。