EA032534B1

EA032534B1 - Способ профилактики или лечения артериальной недостаточности

Info

Publication number: EA032534B1
Application number: EA201492251A
Authority: EA
Inventors: Михаэла Горат
Original assignee: Г. Поль-Боскамп Гмбх Унд Ко. Кг
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2013-05-29
Publication date: 2019-06-28
Also published as: CA2872465A1; US11166931B2; US20170172966A1; PL2877170T3; HUE033092T2; ES2731664T3; WO2013178715A1; EP2668947B1; AU2018200831A1; AU2013269631A1; AU2013269631B2; EP3412285A2; US20150164845A1; PL2668947T3; DE112013002717T5; HUE044056T2; TR201908817T4; EP2668947A1; US20220096417A1; CN110251500A

Abstract

Изобретение относится к способу профилактики или лечения артериальной недостаточности, включающему введение нитроглицерина в количестве от 0,1 до 8 мг/день прерывистым образом лингвально, сублингвально, ингаляторно, трансбуккально, трансмукозально или оромукозально по меньшей мере один раз в день и по меньшей мере пять дней в неделю в течение по меньшей мере двух недель. Изобретение обеспечивает стимулирование коллатерального кровообращения.

Description

Изобретение относится к способам лечения или предотвращения артериальной недостаточности путем назначения донора N0 (оксида азота).

Сердечно-сосудистые заболевания также как и другие болезни, включающие в себя сердечнососудистую и, более конкретно, артериальную недостаточность, влияют на все возрастающую совокупность пациентов, возглавляют международную смертность и статистику заболеваемости и имеют огромную экономическую важность. В Германии, например, приблизительно 280000 пациентов страдают каждый год от инфаркта миокарда, в то время как приблизительно 65000 пациентов умирают.

Одной важной причиной сердечно-сосудистого заболевания является частичная или полная окклюзия артериальных сосудов, приводящая к уменьшению подачи кислорода и питательных веществ к ткани, снабжаемой артериальным сосудом.

Стенокардия, боль в груди, является клиническим синдромом, отражающим неадекватную миокардиальным метаболическим требованиям подачу кислорода с результирующей ишемией, и обычно вызывается обструкцией (стенозом), спазмом коронарных артерий, эндотелиальной или капиллярной дисфункцией.

Артериогенез представляет собой процесс, в котором уже существующие ранее малые артериолярные коллатерали могут развиться до полнофункциональных проводящих артерий, которые обходят место артериальной окклюзии и/или компенсируют кровоток к ишемическим территориям, снабжаемым недостаточной артерией. Следовательно, артериогенез представляет собой очень эффективный эндогенный механизм для поддержания и регенерации кровотока после острого или хронического окклюзионного случая в артериальном сосуде. В этом случае коллатерали могут функционировать как естественные шунты.

Артериогенез представляет собой процесс, отличающийся от ангиогенеза или образования новых сосудов, когда происходит формирование новых артериальных сосудов (Визсйтапи I. Лп4 8сйарег 1оита1 оГ Ра1йо1оду, 2000, 190: 338-342).

Нитроглицерин (глицерилтринитрат) десятилетиями используется в качестве сосудорасширяющего средства при сердечно-сосудистых заболеваниях, таких как болезнь коронарных артерий (ОАЭ, также ишемическая болезнь сердца или заболевание коронарной артерии), которые являются главной причиной смерти и инвалидности во всем мире (МсОгае МсИегшой М., 1оигпа1 оГ 111е Ашепсап Ме41са1 АззоааОоп. 2007, 297 (11): 1253-1255). Нитроглицерин использовался исключительно для лечения симптомов этих заболеваний, например стабильной стенокардии, благодаря его эффекту расширения вен и артерий, которое приводит к уменьшению рабочей нагрузки и энергопотребления сердца (путем уменьшения конечно-диастолического давления и постнагрузки), а также к увеличению поступления кислорода к миокарду (за счет расширения коронарных артерий). Эти симптомы включают в себя боль в груди, давление, дискомфорт или одышку. Однако нитроглицерин не использовался для лечения основного заболевания или улучшения его прогноза.

Следовательно, нитроглицерин использовался и используется прежде всего для неотложной помощи или профилактики приступов стенокардии, наиболее распространенного симптома ОАЭ (Рох К. е! а1., Ошйейиез оп 111е тападетеп! оГ з1аЫе апдта ресЮпз: Ги11 !ех!. ТНе Тазк Рогсе оп Иге Мападетеп! оГ 8!аЫе Апдта РесЮпз оГ !ке Еигореап 8ос1е1у оГ Саг4ю1оду. Еигореап Неаг! 1оигпа1 4о1:10.1093/еиг11еаг1)/е111002: С|ЬЬопз К! е! а1., АСС/аНа/АСР-А81М Ошйекпез Гог Иге Мападетеп! оГ РаИеп18 \νί!1ι Скгошс 81аЫе Апд1па. 1оигпа1 оГ 111е Атепсап Со11еде оГ Саг4ю1оду, 1999, 33 (7): 2092-2197).

В данной области техники было описано, что нитроглицерин не вызывает ангиогенеза (образования новых сосудов) или артериогенеза в ситуации, когда это вещество принимается непрерывно (Норктз 8. Р. е! а1., 1оигпа1 оГ Уазсн1аг 8игдегу, 1998, 27 (5): 886-894: ТгоШ1 К. е! а1., 1оигпа1 оГ Саг4юуазси1аг Рйагтасо1оду, 2010, 55 (2): 153-160).

Доноры оксида азота длительного действия, охватывающие группу диазениум диолатов и диазениум триолатов (также называемых ΝΟΝΟ-атами), использовались в индукции и/или усилении формирования коллатералей в лечении артериальных болезней посредством назначения прямоточного насоса (8сйарег №., ΌΕ 102008005484 А1).

Существует потребность в средствах для стимуляции коллатерального кровообращения.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или предотвращения артериальной недостаточности, включающему введение нитроглицерина в количестве от 0,1 до 8 мг/день прерывистым образом лингвально, сублингвально, ингаляторно, трансбуккально, трансмукозально или оромукозально по меньшей мере один раз в день и по меньшей мере пять дней в неделю в течение по меньшей мере двух недель.

В одном из вариантов осуществления изобретения артериальная недостаточность характеризуется частичной или полной окклюзией артериального сосуда. В ещё одном варианте осуществления артериальная недостаточность происходит из-за внешней или внутренней компрессии артерии. В ещё одном варианте осуществления артериальная недостаточность представляет собой сосудистое заболевание. В ещё одном варианте осуществления артериальная недостаточность представляет собой болезнь, выбранную из группы, состоящей из атеросклероза, ишемической болезни и дополнительного хронического артериального заболевания. В ещё одном варианте осуществления артериальная недостаточность пред

- 1 032534 ставляет собой коронарную артериальную недостаточность, мозговую артериальную недостаточность, периферическую артериальную недостаточность, кишечную артериальную недостаточность, мочеполовую артериальную недостаточность, нервную артериальную недостаточность.

В одном из вариантов осуществления изобретения нитроглицерин вводят в течение нескольких недель или месяцев. В ещё одном варианте осуществления нитроглицерин вводят в комплексе с экзогенной стимуляцией пульсирующих усилий сдвига в артерии. В ещё одном варианте осуществления нитроглицерин вводят в интервале времени от 30 мин до начала экзогенной стимуляции и до 30 мин после завершения экзогенной стимуляции.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанная стимуляция достигается физическими упражнениями или применением эндогенной силы к артериальному сосуду.

В ещё одном варианте осуществления изобретения способ нацелен на профилактику артериальной недостаточности.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу подавления отрицательных эффектов, связанных с лечением артериальной недостаточности, которое является антиартериогенным или ингибирующим артериогенез, и представляет собой лечение ацетилсалициловой кислотой (Ά8Ά), антагонистом гликопротеина 11Ь/111а, или этанерцептом, включающий введение нитроглицерина в количестве от 0,1 до 8 мг в день по меньшей мере один раз в день и по меньшей мере пять дней в неделю в течение по меньшей мере двух недель.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к применению нитроглицерина прерывистым образом для индукции артериогенеза.

В контексте настоящего изобретения неожиданно было найдено, что доноры оксида азота являются эффективными при индукции артериогенеза, даже если они принимаются не постоянно, а таким образом, при котором их уровни в плазме увеличиваются лишь в течение короткого промежутка времени (см. раздел примеров). Следовательно, настоящее изобретение предлагает эффективные средства для стимуляции коллатерального кровообращения. На основании обнаруженного факта, что доноры оксида азота способны к стимулированию артериогенеза, настоящее изобретение теперь предлагает эффективный инструмент для предотвращения и лечения артериальной недостаточности.

В соответствии с настоящим изобретением термин лечение или профилактика означает, что не только облегчаются симптомы болезни, но и что само заболевание также лечится или предотвращается. В предпочтительном варианте осуществления термин лечение означает улучшение прогноза упомянутого заболевания.

В соответствии с настоящим изобретением термин артериальная недостаточность относится к любому недостаточному поступлению крови или кислорода или к любому другому недостаточному снабжению ткани, которая снабжается артерией. Это недостаточное снабжение может быть преодолено с помощью способов и использований настоящего изобретения, в котором донор оксида азота используется для того, чтобы увеличить снабжение данной ткани. Артериальная недостаточность может образовываться как во время физического покоя, так и во время физической активности.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения артериальная недостаточность происходит из-за недостаточного снабжения кислородом или недостаточного кровоснабжения ткани, снабжаемой артерией или обходным анастомозом или шунтом во время физического покоя или во время физической активности.

В соответствии с дополнительным предпочтительным вариантом осуществления артериальная недостаточность происходит из-за увеличенного потребления кислорода или увеличенного кровоснабжения ткани, снабжаемой артерией или обходным анастомозом или шунтом.

Это увеличенное потребление кислорода или увеличенное кровоснабжение может иметь несколько причин, включая, но не ограничиваясь этим, увеличенную спортивную или физическую активность, а также увеличенную умственную активность или заболевание, требующее увеличенного потребления кислорода или увеличенного кровоснабжения.

В соответствии с дополнительным предпочтительным вариантом осуществления артериальная недостаточность характеризуется частичной (стеноз) или полной окклюзией артериального сосуда. В контексте настоящего изобретения термин частичная окклюзия эквивалентен стенозу.

Частичная или полная окклюзия артериального сосуда представляет собой хорошо известный феномен. Она может иметь различные причины, включая, но не ограничиваясь этим, отложение материала в кровеносных сосудах (включая невосстановимый стеноз), компрессию со стороны внешней ткани или жидкости, окружающей сосуд (включая расстройство в диастолическом миокардиальном расслаблении), сосудистый спазм, дисфункцию эндотелия сосуда, приводящую к парадоксальному ангиоспазму во время физической активности или к повреждению капилляров из-за эндотелиальной дисфункции или расстройств гладкомышечных клеток.

В предпочтительном варианте осуществления артериальная недостаточность происходит из-за отложения материала в кровеносных сосудах.

Отложение материалов в кровеносных сосудах является хорошо известным феноменом, приводящим, например, к атеросклерозу.

- 2 032534

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления артериальная недостаточность происходит из-за внешней или внутренней компрессии артерии.

Внутренняя компрессия артерии может произойти из-за отека, но также из-за опухоли, оказывающей давление на артерию. Кроме того, причиной может быть вазоспастическое сужение артерии, как, например, в стенокардии Принцметала. В дополнение к этому причиной может быть также парадоксальный ангиоспазм, который, например, иногда встречается при эндотелиальной дисфункции или сужении малых артериальных сосудов из-за эндотелиальной дисфункции или расстройств гладкомышечных клеток.

Внешняя компрессия может произойти вследствие несчастного случая или любой внешней силы, которая может оказать давление на артерию.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления артериальная недостаточность представляет собой сосудистое заболевание.

В соответствии с дополнительным предпочтительным вариантом осуществления артериальная недостаточность представляет собой болезнь, выбранную из группы, состоящей из атеросклероза, ишемической болезни и дополнительного хронического артериального заболевания.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления артериальная недостаточность представляет собой коронарную артериальную недостаточность.

В предпочтительном варианте осуществления коронарная недостаточность представляет собой атеросклеротическую коронарную артериальную недостаточность, в частности заболевание коронарной артерии (ишемическую болезнь сердца или СЛЭ). стабильную стенокардию, нестабильную стенокардию, ишемию миокарда или хроническую ишемию миокарда, острый коронарный синдром или инфаркт миокарда (сердечный приступ или ишемический инфаркт миокарда).

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления коронарная недостаточность является неатеросклеротической, в частности болезнью коронарных капилляров или болезнью малых сосудов, стенокардией Принцметала и кардиальным синдромом X.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления артериальная недостаточность представляет собой мозговую артериальную недостаточность (внутричерепную или внечерепную).

В предпочтительном варианте осуществления мозговая артериальная недостаточность представляет собой атеросклеротическую мозговую артериальную недостаточность, в частности ишемию головного мозга, внечерепную болезнь сонной артерии, внечерепную болезнь позвоночной артерии, предварительный инсульт, преходящее ишемическое нарушение (мини-инсульт), инсульт, сосудистую деменцию, ишемическую болезнь головного мозга или ишемическую цереброваскулярную болезнь.

Мозговая артериальная недостаточность может также быть ишемической капиллярной болезнью мозга, сосудистой деменцией малых сосудов, подкорковой артериосклеротической энцефалопатией (болезнь Бинсванджера), болезнью Альцгеймера или болезнью Паркинсона.

В предпочтительном варианте осуществления артериальная недостаточность представляет собой периферическую артериальную недостаточность.

В предпочтительном варианте осуществления периферическая артериальная недостаточность представляет собой атеросклеротическую периферическую артериальную недостаточность, в частности периферическое сосудистое заболевание (заболевание периферических артерий (РАО) или облитерирующий артериит (ΡΑΟΌ), включая заболевание артерий нижних и верхних конечностей).

В предпочтительном варианте осуществления периферическая артериальная недостаточность представляет собой неатеросклеротическую периферическую артериальную недостаточность, в частности синдром Рейно (вазоспазматический), облитерирующий тромбангиит, облитерирующий эндоваскулит или болезнь Бюргера (рецидивирующее прогрессирующее воспаление и тромбоз (свертывание) малых и средних артерий и вен рук и ног), сосудистое воспалительное заболевание (васкулит), диабетическую ишемию, диабетическую невропатию и синдромы межфасциального пространства.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления артериальная недостаточность может быть кишечной артериальной недостаточностью, в частности атеросклеротической кишечной артериальной недостаточностью, в частности ишемической болезнью кишечника, мезентериальным тромбозом или инфарктом брыжейки.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления артериальная недостаточность может быть мочеполовой артериальной недостаточностью, в частности атеросклеротической мочеполовой артериальной недостаточностью, в частности эректильной дисфункцией, болезнью почечной артерии, почечной ишемией или почечным инфарктом.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления артериальная недостаточность может быть нервной артериальной недостаточностью, в частности шумом в ушах.

Кроме того, артериальная недостаточность может быть в контексте склеродермии (системный склероз).

Кроме того, артериальная недостаточность может быть в контексте фиброзно-мышечной дисплазии.

- 3 032534

В предпочтительном варианте осуществления артериальная недостаточность представляет собой недостаточность центральной артерии сетчатки, в частности атеросклеротическую недостаточность центральной артерии сетчатки, в частности недостаточность глазной артерии.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления артериальная недостаточность характеризуется отсутствием эндотелиальной дисфункции.

Эндотелиальная дисфункция представляет собой известное системное патологическое состояние эндотелия и может быть широко определена как дисбаланс между сосудорасширяющими и сосудосужающими веществами, производимыми эндотелием или действующими на него.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления артериальная недостаточность представляет собой хроническую артериальную недостаточность. В контексте настоящего изобретения термин хроническая артериальная недостаточность означает, что течение артериальной недостаточности является хроническим и часто прогредиентным.

В соответствии с дополнительным предпочтительным вариантом осуществления хроническая артериальная недостаточность включает в себя эндотелиальную дисфункцию, атеросклероз, болезнь коронарных артерий (ишемическую болезнь сердца или заболевание коронарной артерии), стабильную стенокардию, болезнь коронарных капилляров или болезнь малых сосудов, стенокардию Принцметала и кардиальный синдром X, сосудистую деменцию, ишемическую болезнь головного мозга или ишемическую цереброваскулярную болезнь, ишемическую капиллярную болезнь мозга, сосудистую деменцию малых сосудов, подкорковую атеросклеротическую энцефалопатию (болезнь Бинсванджера), болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, периферическое сосудистое заболевание (заболевание периферических артерий (РАО) или облитерирующий артериит (ΡΑΘΏ), облитерирующий тромбангиит, облитерирующий эндоваскулит или болезнь Бюргера, сосудистое воспалительное заболевание (васкулит), фиброзно-мышечную дисплазию, диабетическую ишемию, диабетическую невропатию, ишемическую болезнь кишечника, эректильную дисфункцию, болезнь почечной артерии, шум в ушах и склеродермию (системный склероз).

В соответствии с настоящим изобретением термин донор оксида азота относится либо к самому оксиду азота, либо к любой молекуле, которая способна высвобождать оксид азота при назначении субъекту.

Предпочтительно донор оксида азота представляет собой оксид азота, нитропруссид натрия (пентацианонитрозо-железо(3)кислый натрий), нитроглицерин (глицерилтринитрат), изосорбидмононитрат, изосорбиддинитрат, тетранитрат пентаэритрита (ΡΕΤΝ), молсидомин, амилнитрит или никорандил.

В предпочтительном варианте осуществления доноры оксида азота могут быть выбраны из следующего списка.

Неорганика:

оксид азота;

нитрит;

нитрат.

Органические нитраты:

ΟΤΝ (глицерилтринитрат; нитроглицерин);

ΡΕΤΝ (тетранитрат пентаэритрита);

Ι8ΏΝ (изосорбиддинитрат);

Ι8ΜΝ (изосорбидмононитрат);

никорандил.

Органические нитриты:

ΙΑΝ (изоамилнитрит; амилнитрит);

ΙΒΝ (изобутилнитрит).

Ν-нитрозосоединения:

Ν-нитрозамины: дефостатин;

ΝΟΜΑ;

производные №метил-Ы-нитрозомочевины;

Ν-гидроксинитрозоамины:

допастин;

капферрон;

аланозин;

Ν-нитрозимины.

Ν-диазениум диолаты (ΝΟΝΟ-аты):

спермин ΝΟΝΟ-ат;

ΏΕΑ-ΝΟΝΟ-ат;

ΏΕΤΑ-ΝΟΝΟ-ат.

С-нитрозотиолы:

-нитрозо -Ν-ацетилпеницилламин (8ΝΑΡ);

- 4 032534

С-нитрозоглютатион.

Комплексные соединения металл-ΝΟ:

комплексные соединения железа:

нитропруссид (пентацианонитрозо-железо(3)-кислый натрий);

комплексные соединения динитрозил-железо;

железосерные кластерные нитрозилы (как, например, красная соль Руссина, черная соль Руссина, красный сложный эфир Руссина);

комплексные соединения рутения.

Гетероциклы, высвобождающие оксид азота:

Гетероциклические оксиды азота:

Фуроксаны.

Мезоионные гетероциклические соединения:

сиднонимины (как, например, молсидомин, линсидомин (8ΙΝ-1), циклозидомин, пирсидомин, марсидомин);

Мезоионные оксатриазолы.

Гуанидины и Ν-гидроксигуанидины:

Ь-аргинин;

Ь-гомоаргинин;

Ν-гидрокси-Ь-аргинин;

Ν-гидрокси-Ь-гомоаргинин.

Другие:

алкил С-нитрозосоединения;

арил С-нитрозосоединения;

оксимы;

Ν-гидроксимочевины.

В предпочтительном варианте осуществления донор оксида азота представляет собой органический нитрат с глицериновой главной цепью.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления донор оксида азота выбирается из группы, состоящей из нитроглицерина (глицерилтринитрат), глицерол-1,2-динитрата (1,2-ΟΌΝ) и глицерол-1,3-динитрата (1,3-ΟΌΝ), глицерол-1-нитрата (1-6ΜΝ) и глицерол-2-нитрата (2-6ΜΝ).

В конкретном предпочтительном варианте осуществления донор оксида азота представляет собой нитроглицерин.

Предпочтительно, донор оксида азота представляет собой донор оксида азота короткого действия. В соответствии с настоящим изобретением термин донор оксида азота короткого действия относится либо непосредственно к оксиду азота, либо к донору оксида азота, который высвобождает ΝΟ в течение короткого времени, с коротким периодом полураспада после введения субъекту, составляющим, например, менее 45 мин, 30 мин или предпочтительно 15 мин. Примерами доноров оксида азота короткого действия являются нитроглицерин (глицерилтринитрат), амилнитрит и пентацианонитрозожелезо(3)кислый натрий.

Доноры оксида азота короткого действия в соответствии с настоящим изобретением могут также включать в себя доноров оксида азота, которые обычно рассматриваются как нитрат (нитраты) длительного действия, но которые могут действовать как нитраты короткого действия в зависимости от способа их назначения, дозировки и состава (стандартное высвобождение в противоположность длительному высвобождению или препарату замедленного действия). Такие доноры оксида азота включают в себя, не ограничиваясь этим, органический нитрат изосорбиддинитрат (Ι8ΌΝ), который имеет переменный период полураспада от 15-35 до 60 мин при трансбуккальном или сублингвальном назначении, например, в форме спрея или таблетки. Период полураспада после перорального приема составляет приблизительно 30-60 мин при малых дозах или увеличивается до нескольких часов в случае препаратов замедленного действия или длительного высвобождения.

Соответственно, донор оксида азота короткого действия в соответствии с настоящим изобретением также относится к донору оксида азота, который высвобождает оксид азота со временем периода полураспада 60 мин или меньше при назначении субъекту конкретным способом назначения, предпочтительно при трансбуккальном или сублингвальном назначении.

В контексте настоящего изобретения неожиданно было найдено, что назначение донора оксида азота короткого действия является особенно подходящим для стимуляции коллатерального кровообращения. Это может быть объяснено кратковременным расширением коллатерального сосуда, вызываемым донором оксида азота короткого действия, который, в свою очередь, имеет значительно улучшенное влияние на артериогенез при повторном применении. Улучшенное влияние донора оксида азота короткого действия на формирование новых коллатеральных сосудов и тем самым на стимуляцию коллатерального кровообращения подробно иллюстрируется в примере 1 настоящей патентной заявки.

Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения донор оксида азота представляет собой донор оксида азота короткого действия.

- 5 032534

Нитроглицерин является особенно предпочтительным примером такого донора оксида азота короткого действия.

В соответствии с настоящим изобретением донор оксида азота назначается в количестве, которое способно индуцировать артериогенез. Специалисту в данной области техники будет понятно, что это количество будет зависеть от субъекта, которому назначается донор оксида азота. Обычно назначаемое количество может составлять от 0,1 до 8 мг/сутки, но оно может меняться в соответствии с массой субъекта, его гемодинамической реакцией на донор оксида азота, и/или серьезностью болезни.

Количество назначаемого донора оксида азота может также составлять от 0,1 до 10 мг/сутки, или, альтернативно, от 0,1 до 40 мг/сутки, в зависимости от природы донора оксида азота и/или способа назначения. Таким образом, если донор оксида азота находится, например, в форме органического нитрата изосорбиддинитрат (Ι8ΌΝ), назначаемое количество может составлять от 1 до 40 мг/сутки, предпочтительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 мг/сутки при трансбуккальном или сублингвальном назначении.

Соответственно, изосорбиддинитрат (Ι8ΌΝ) является одинаково предпочтительным примером такого донора оксида азота короткого действия.

В предпочтительном варианте осуществления донор оксида азота применяется в дозировке от 0,2 до 0,8 мг (0,2, 0,3, 0,4, 0,6, 0,8) по меньшей мере от одного до максимально 4 раз в день, давая максимальную ежедневную дозу 3,2 мг. Эти цифры особенно применимы в тех случаях, когда донор оксида азота является нитроглицерином.

В соответствии с настоящим изобретением термин назначение донора оксида азота означает, что вводится данная дозировка донора оксида азота. В зависимости от способа назначения специалисту в данной области техники будет понятно, что прием может потребовать некоторого времени. В предпочтительном варианте осуществления донор оксида азота назначается в форме спрея, распыляемого или впрыскиваемого раствора, жевательной капсулы, вдыхаемого газа, вдыхаемого аэрозоля или порошка, гранул, порошка или таблетки, предпочтительно подъязычной, защечной или жевательной таблетки, что означает, что прием может быть завершен в течение нескольких секунд. Однако прием донора оксида азота может также занять больше времени, например, если донор оксида азота назначается пациенту инфузионно или в виде мази или геля или пластыря. Способы приема донора оксида азота дополнительно обсуждаются ниже.

Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением донор оксида азота назначается так, чтобы стимулировать артериогенез.

Как показано в примерах, авторы настоящего изобретения неожиданно нашли, что донор оксида азота способен к стимулированию артериогенеза при приеме прерывистым образом.

В соответствии с настоящим изобретением термин прием прерывистым образом означает, что донор оксида азота назначается таким способом, при котором его уровни в плазме или ткани увеличиваются лишь кратковременно после приема донора оксида азота, а затем снова уменьшаются. Это может быть достигнуто, например, если донор оксида азота является донором оксида азота короткого действия, как определено выше, и за введением донора оксида азота короткого действия следует некоторый интервал времени без введения, а затем донор оксида азота снова вводится субъекту. Кроме того, этот способ назначения позволяет избежать привыкания субъекта к донору оксида азота и формирования у субъекта эндотелиальной дисфункции.

Индукция эндотелиальной дисфункции является параметром, который имеет прогностическое значение для пациентов с заболеванием коронарной артерии. Развитие привыкания, а также индукция эндотелиальной дисфункции, являются хорошо известными недостатками, вызываемыми непрерывным и длительным воздействием доноров оксида азота (Иха А. с! а1., 1оитиа1 о£ Сатбюуа8си1аг Рйаттасо1оду, 2010, 56 (4): 354-359).

Более того, назначение донора оксида азота короткого действия прерывистым образом дает улучшенный эффект, поскольку оно подражает физиологической ситуации в организме, сопоставимой, например, с эндогенным высвобождением оксида азота после физической тренировки. Другими словами, донор оксида азота по настоящему изобретению при его применении прерывистым образом действует как биомиметик. Это ясно представляет улучшение по сравнению с предшествующим уровнем техники, где индукция артериогенеза до сих пор наблюдалась только после назначения доноров оксида азота длительного действия при непрерывном и тем самым постоянном приеме.

Соответственно, в особенно предпочтительном варианте осуществления донор оксида азота представляет собой донор оксида азота короткого действия, который назначается прерывистым образом.

Однако равным образом возможно, чтобы донор оксида азота являлся донором оксида азота длительного действия. В этом случае, однако, для того чтобы достичь снижения уровня донора оксида азота в плазме или в ткани, необходимо позаботиться о том, чтобы прием донора оксида азота длительного действия был кратким и чтобы получаемые уровни донора оксида азота в плазме или ткани не были слишком высокими.

В предпочтительном варианте осуществления уровни донора оксида азота в плазме или ткани являются повышенными в течение не более 180, 120 или 60 мин или не более 50, 40, 30, 15, 10 или 5 мин.

- 6 032534

Кроме того, это также подразумевает, что донор оксида азота может приниматься хроническим образом, т.е. без учета развития заболевания, подразумевающего неотложное лечение донором оксида азота. Кроме того, это также подразумевает, что план лечения может быть составлен без учета развития заболевания, подразумевающего неотложное лечение донором оксида азота.

В контексте настоящего изобретения донор оксида азота среди прочего назначается для того, чтобы вызвать артериогенез. Это подразумевает, что донор оксида азота можно также принимать в те моменты времени или в те интервалы времени, в которых нет никакой потребности в сосудорасширении и снятии симптомов, например, в снятии боли.

Это контрастирует с предшествующими применениями, в которых донор оксида азота, например, нитроглицерин, использовался для того, чтобы достичь снятия или неотложного (т.е. немедленного) предотвращения симптомов соответствующего заболевания. Эти симптомы включают в себя, например, боль и/или одышку в случае сердечно-сосудистого заболевания, и снятие или неотложное предотвращение симптомов достигались сосудорасширением и получающимся в результате снятием болью и/или одышки. Однако целью назначения донора оксида азота являлось, как обсуждено выше, не лечение основной болезни, поскольку было хорошо известно, что заболевания не могут быть вылечены снятием боли или сосудорасширением.

Следовательно, идентификация донора оксида азота в качестве проартериогенного средства делает также возможным назначение донора оксида азота в те моменты времени или в те интервалы времени, в которых нет никакой потребности в таком снятии симптомов, как снятие боли. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления донор оксида азота можно также назначать в тех случаях, в которых нет никаких соответствующих симптомов, таких как одышка или боль, или в тех случаях, когда такие симптомы не должны ожидаться.

В контексте настоящего изобретения термин прерывистым образом также означает, что донор оксида азота, в частности, донор оксида азота короткого действия, не назначают непрерывно, например посредством долговременной внутривенной инфузии или с помощью имплантированного насоса, который постоянно подает донор оксида азота к субъекту. Скорее, этот термин также означает, что имеется некоторый интервал между двумя приемами донора оксида азота, и что донор оксида азота дается несколько раз в день, например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 12 или 16 раз в день.

Как будет понятно специалисту в данной области техники, один прием донора оксида азота может включать в себя прием одной или более форм дозировки, например в таблетках или нажатиях (вдохах) в случае распыления. Например, один прием может включать в себя прием двух таблеток или от одного до трех нажатий (вдохов).

Что касается плана приема, специалисту в данной области техники будет понятно, что имеется много способов достичь такого прерывистого приема. Например, можно принимать донор оксида азота по меньшей мере один раз в день и по меньшей мере один день в неделю в течение по меньшей мере двух недель. Однако равным образом можно принимать донор оксида азота в течение только одной недели, если донор оксида азота принимается несколько раз в течение этой недели.

Предпочтительно донор оксида азота принимается один, два или три раза в день, причем даже более предпочтительный интервал времени между двумя приемами донора оксида азота составляет по меньшей мере 4 ч, в частности 8 ч, в частности по меньшей мере 10 или 12 ч.

Хотя это и возможно, но не является необходимым, чтобы интервалы времени между двумя приемами донора оксида азота были одинаковыми. Скорее, даже предпочтительно, чтобы эти интервалы времени различались в зависимости от индивидуального плана приема.

В предпочтительном варианте осуществления донор оксида азота принимается по меньшей мере один день в неделю. Однако донор оксида азота можно также принимать 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней в неделю. В особенно предпочтительном варианте осуществления донор оксида азота принимается по меньшей мере 3 или 4 дня в неделю.

В соответствии с настоящим изобретением можно принимать донор оксида азота в течение нескольких недель или месяцев. Это особенно предпочтительно для того, чтобы эффективно вызвать артериогенез, хотя возможно также более короткое назначение, в течение одной или двух недель.

В предпочтительном варианте осуществления донор оксида азота принимается в течение от 2 до 8 недель. Равным образом предпочтительно, чтобы донор оксида азота принимался в течение от 3 до 6, от 3 до 8, от 3 до 10 или от 4 до 8, от 4 до 10 или от 4 до 12 недель. Эти числа являются лишь примерами и могут изменяться в зависимости от индивидуального плана субъекта.

В предпочтительном варианте осуществления донор оксида азота принимается по меньшей мере один раз в неделю в течение по меньшей мере 8 недель, в частности в течение по меньшей мере 12 недель.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления донор оксида азота принимается не дольше чем 6, 8 или 12 месяцев. Однако возможно также принимать донор оксида азота в течение 2, 3 или даже больше лет. Кроме того, возможно также, чтобы донор оксида азота принимался в течение многих десятилетий или даже на протяжении всей жизни субъекта.

- 7 032534

В контексте таких долговременных назначений предпочтительно, чтобы донор оксида азота принимался один или два раза в неделю или по меньшей мере один или два раза в неделю.

Ранее было описано, что экзогенная стимуляция пульсирующих усилий сдвига в человеке может привести к артериогенезу. Кроме того, было описано, как пульсирующие усилия сдвига могут быть измерены (см. патентный документ \УО 2010/072416).

Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления донор оксида азота назначается в комплексе с экзогенным возбуждением пульсирующих усилий сдвига в артерии.

Что касается упомянутого варианта осуществления настоящего изобретения, донор оксида азота должен приниматься таким способом, чтобы он был активным в теле субъекта при применении экзогенной стимуляции. В этом контексте активный означает, что либо высвобождение оксида азота еще не завершилось, либо оксид азота, высвобожденный донором оксида азота, все еще присутствует и активен. В зависимости от конкретного используемого донора оксида азота, его периода физиологического полураспада в субъекте и его состава специалист в данной области техники будет способен определить, когда донор оксида азота должен быть назначен субъекту для того, чтобы гарантировать, что он будет активным при экзогенном возбуждении.

В случае нитроглицерина его период полураспада и устойчивость в теле субъекта интенсивно изучались, например, после внутривенного или сублингвального применения, где период полураспада составлял от 2 до 5 мин в плазме крови, см., например, публикацию Лгтйгоид Р.^. е! а1., С1гси1а1юп, 1979, 59: 585-588 или Лгтйгопд Р.^. е! а1., С1гси1айоп, 1980, 62:160-166.

В большинстве случаев период полураспада нитроглицерина в плазме крови составляет от 2 до 5 мин.

Следует понимать, что в контексте настоящего изобретения термин период полураспада относится к периоду полураспада и/или ко времени периода полураспада донора оксида азота в теле субъекта, в частности в плазме крови субъекта.

В предпочтительном варианте осуществления донор оксида азота принимается в интервале времени от 30 мин до начала экзогенной стимуляции, и до 30 мин после завершения экзогенной стимуляции.

Более предпочтительно донор оксида азота принимается в интервале времени от 15 мин, предпочтительно 5 мин, более предпочтительно 2 мин до начала экзогенной стимуляции и до 30, предпочтительно 15, более предпочтительно 5 мин после начала экзогенной стимуляции.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления донор оксида азота принимается один раз в день, пять раз в неделю в течение 6 недель за 2-5 мин до экзогенной стимуляции.

Экзогенная стимуляция пульсирующих усилий сдвига может быть достигнута любым известным способом. Это включает стимуляцию с помощью медикаментов, таких как медикаменты, которые увеличивают кровяное давление.

В предпочтительном варианте осуществления упомянутая стимуляция достигается физическими упражнениями или применением эндогенной силы к артериальному сосуду.

В соответствии с настоящим изобретением термин физические упражнения означает любую тренировку субъекта, включая, но не ограничиваясь этим, тренировку в тренажерных залах, оздоровительный бег, ходьбу, скандинавскую ходьбу, плавание, танцы, езду на велосипеде и пеший туризм. Специалисту в данной области техники будет понятно, что любое упражнение будет полезным в контексте настоящего изобретения, при условии, что оно выполняется в совокупности с приемом донора оксида азота. Предпочтительно термин физические упражнения не включает в себя безнадзорные и непредписанные обычные движения, такие как обычная ходьба или домашняя работа.

Как было обсуждено выше, в контексте настоящего изобретения было найдено, что донор оксида азота способен стимулировать артериогенез. Это позволяет не только лечить уже существующую болезнь. Вместо этого в контексте настоящего изобретения также возможно предотвращать болезнь.

Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ нацелен на профилактику упомянутой артериальной недостаточности.

Как показано в разделе примеров, в контексте настоящего изобретения было возможно уменьшить размер инфаркта в случае уже существующей окклюзии. Кроме того, было возможно уменьшить аритмию у субъектов. Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ приводит к уменьшению размера инфаркта, к уменьшению аритмии или к уменьшению подъема сегмента 8Т.

Донор оксида азота может быть назначен любым подходящим способом так, чтобы он мог быть включен в субъект. Это включает в себя пероральное, парентеральное или внутривенное введение, инъекцию донора оксида азота в тело субъекта, а также назначение на слизистую оболочку субъекта.

Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения донор оксида азота назначается лингвально, сублингвально, ингаляторно, трансбуккально, трансмукозально или оромукозально.

В случае лингвального назначения сублингвального назначения или назначения через слизистую оболочку предпочтительно, чтобы донор оксида азота, предпочтительно нитроглицерин, назначался с помощью спрея, распыляемого или впрыскиваемого раствора, жевательной капсулы или в форме таблет

- 8 032534 ки, предпочтительно подъязычной, защечной или жевательной таблетки, порошка или гранул или даже с помощью ингаляционного устройства, из которого донор оксида азота можно легко вдохнуть и адсорбировать. В равной степени предпочтительно, чтобы донор оксида азота назначался в форме вдыхаемого газа, аэрозоля или порошка.

Предпочтительно назначение донора оксида азота является нелокальным назначением, т.е. донор оксида азота не назначается на кожу субъекта. В контексте настоящего изобретения термин кожа исключает слизистые оболочки субъекта.

Донор оксида азота может быть сформулирован любым способом, подходящим для вышеупомянутых способов назначения. Такие рецептуры известны специалистам в данной области техники и включают в себя рецептуры в подходящих буферах, в виде газа, аэрозоля, таблеток, порошка или гранул.

В предпочтительном варианте осуществления донор оксида азота формулируется в таком виде, который обеспечивает быстрое высвобождение донора оксида азота из рецептуры. Это включает в себя, например, рецептуры, которые не удерживают донор оксида азота в течение длительного интервала времени, но которые высвобождают донор оксида азота в пределах, например, 45, 30, или 15, 10, 5, или 1 мин.

В настоящем изобретении предпочтительно, чтобы субъект, к которому применяется донор оксида азота, являлся человеком.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение также относится к донору оксида азота для использования в способе для профилактики или лечения артериальной недостаточности, который назначается в таком количестве и таким образом, которые являются эффективными для индукции артериогенеза.

Все особенности и предпочтительные варианты осуществления, обсужденные выше для способа лечения или предотвращения артериальной недостаточности, также относятся к донору оксида азота для использования в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения.

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к способу подавления отрицательных эффектов, связанных с любым лечением артериальной недостаточности, который является антиартериогенным или ингибирующим артериогенез, включающему в себя назначение субъекту, подвергнутому упомянутому лечению, донора оксида азота в таком количестве и таким образом, которые являются эффективными для индукции артериогенеза.

В предпочтительном варианте осуществления упомянутое лечение представляет собой лечение ацетилсалициловой кислотой (Л8Л), антагонистами гликопротеина 11Ы11а или этанерцептом (растворимый альфа-рецептор фактора некроза опухоли).

В данной области техники известно, что ацетилсалициловая кислота является ингибитором артериогенеза (8тдег Е. с1 а1., Уаза, 2006, 35 (3): 174-177). Следовательно, лечение ацетилсалициловой кислотой сердечно-сосудистых заболеваний, хотя и является стандартной терапией, имеет значительные побочные эффекты и недостатки. В контексте настоящего изобретения было найдено, что доноры оксида азота способны преодолевать негативные эффекты, связанные с лечением ацетилсалициловой кислотой (см. раздел примеров). На основе этих результатов исследования авторы настоящего изобретения делают вывод, что негативные побочные эффекты, связанные с другими лекарствами, такими как антагонисты гликопротеина 11Ы11а или этанерцепт, также могут быть уменьшены.

Кроме того, настоящее изобретение также относится к донору оксида азота для использования в способе подавления негативных эффектов, связанных с любым лечением артериальной недостаточности, которое является антиартериогенным или ингибирующим артериогенез, причем донор оксида азота назначают субъекту, подвергнутому упомянутому лечению, в таком количестве и таким образом, которые являются эффективными для индукции артериогенеза.

Все особенности и предпочтительные варианты осуществления, обсужденные выше для способа лечения или предотвращения артериальной недостаточности, также относятся к способу подавления негативных эффектов в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения или к упомянутому донору оксида азота для использования в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение также относится к способу для предотвращения или лечения аритмии сердца, в котором донор оксида азота назначают субъекту в таком количестве и таким образом, которые являются эффективными для лечения упомянутой аритмии сердца. Кроме того, настоящее изобретение также относится к донору оксида азота для использования в способе для предотвращения или лечения аритмии сердца, в котором донор оксида азота назначают субъекту в таком количестве и таким образом, которые являются эффективными для лечения упомянутой аритмии сердца.

В контексте настоящего изобретения авторы настоящего изобретения обнаружили, что доноры оксида азота способны предотвращать и лечить аритмии (см. раздел примеров).

Все особенности и варианты осуществления, определенные выше в отношении донора оксида азота и его рецептуры и назначению, также относятся к этому способу или к донору оксида азота для использования в соответствии с настоящим изобретением.

- 9 032534

Настоящее изобретение также относится к способу стимуляции коллатерального кровообращения, включающему в себя стадию воздействия на субъект терапевтически эффективного количества донора оксида азота, в котором терапевтически эффективное количество донора оксида азота стимулирует артериогенез, достаточный для того, чтобы увеличить коллатеральное кровообращение в физиологическом или патологическом состоянии.

Термин коллатеральное кровообращение описывает циркуляцию крови через так называемые коллатеральные сосуды. Эти сосуды представляют собой малые артериолы, которые являются частью сосудистой сети, которая связывает территории перфузии артериальных ветвей. В том случае, когда сама главная артерия не способна снабжать ткань в достаточной степени, например, из-за артериальной окклюзии, эти коллатеральные сосуды начинают работать и могут развиться до больших проводящих артерий с тем, чтобы обойти место артериальной окклюзии и/или компенсировать кровоток к ишемическим территориям, снабжаемым поврежденной артерией. В контексте настоящего изобретения стимуляция коллатерального кровообращения происходит посредством артериогенеза.

В соответствии с настоящим изобретением термин физиологическое состояние означает любое состояние субъекта, которое не связано с какой-либо болезнью.

В соответствии с настоящим изобретением термин патологическое состояние означает любое состояние субъекта, которое связано с определенной болезнью.

Предпочтительно субъект страдает артериальной недостаточностью.

Все особенности и предпочтительные варианты осуществления, обсужденные выше для способа лечения или предотвращения артериальной недостаточности, также относятся к способу стимуляции коллатерального кровообращения.

Что касается аспектов, определенных выше, в которых донор оксида азота назначается таким образом, который является достаточным для индукции артериогенеза, этот образ предпочтительно является прерывистым образом, как определено выше.

Далее настоящее изобретение описывается при помощи приложенных чертежей и примеров, которые предназначены для иллюстрирования, но не для ограничения настоящего изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - подъем сегмента 8Т на одно сокращение после ТРО (= окончательная окклюзия для индуцирования инфаркта) 5- и 10-дневных контрольных групп. График ЭКГ среднего серого цвета означает группу 5 дней КГР РВ8, п=8: 0,104±0,016 мВ; график ЭКГ черного цвета означает группу 5 дней симуляции РВ8, п=8: 0,134±0,034 мВ; график ЭКГ светло-серого цвета означает группу 10 дней К1Р РВ8, п=7: 0,055±0,033 мВ; график ЭКГ темно-серого цвета означает группу 10 дней симуляции РВ8, п=7: 0,124±0,039 мВ. ЭКГ снималась спустя 90 мин после ТРО. Подъем сегмента 8Т на одно сокращение в течение первых 1200 сокращений не показал различий между группами 5 дней симуляции и 10 дней симуляции и группой 5 дней КГР. Более низкий подъем сегмента 8Т наблюдалось только в группе 10 дней К1Р;

фиг. 2 - подъем сегмента 8Т в 5- и 10-дневных контрольных группах. Первый столбец показывает подъем сегмента 8Т для группы 5 дней симуляции РВ8; второй столбец показывает подъем сегмента 8Т для группы 5 дней К1Р РВ8; третий столбец показывает подъем сегмента 8Т для группы 10 дней симуляции РВ8; четвертый столбец показывает подъем сегмента 8Т для группы 10 дней К1Р РВ8; среднеквадратичное отклонение показано вертикальными отрезками; звездочка означает значительное изменение по сравнению с группой 10 дней симуляции РВ8 (номинальное значение р<0,025); двойная звездочка означает значительное изменение по сравнению с группой 5 дней К1Р РВ8 (номинальное значение р<0,025).

Диаграмма показывает средний подъем сегмента 8Т, максимальный для группы. После 5 дней не было найдено никакой значительной разницы между группами КГР и группами симуляции. После 10 дней в группе КГР максимум подъема сегмента 8Т был значительно ниже по сравнению с симуляцией (*) и 5-дневной контрольной группой КГР (**) (*, ** номинальное значение р<0,025);

фиг. 3 - подъем сегмента 8Т на одно сокращение после ТРО (модуль 1: операция симуляции без КГР). График ЭКГ черного цвета означает группу 5 дней симуляции РВ8, п=8: 0,134±0,034 мВ; график ЭКГ светло-серого цвета означает группу 5 дней симуляции ЫТ6, п=7: 0,124±0,058 мВ; график ЭКГ среднего серого цвета означает группу 5 дней симуляции ЫТС-плацебо, п=6: 0,131±0,043 мВ.

Подъем сегмента 8Т на одно сокращение после ТРО не показало различий после 5 дней между контрольными группами симуляции и группами, принимавшими лекарство;

фиг. 4 - подъем сегмента 8Т (модуль 1: операция симуляции без КГР). Первый столбец показывает группу 5 дней симуляции РВ8; второй столбец показывает группу 5 дней симуляции ЫТС-плацебо; третий столбец показывает группу 5 дней симуляции ЫТС; среднеквадратичное отклонение показано вертикальными отрезками.

Диаграмма показывает средний подъем сегмента 8Т, максимальный для группы. Никакого различия в максимуме подъема сегмента 8Т не было найдено между контрольными группами симуляции и группами, принимавшими лекарство;

- 10 032534 фиг. 5 - подъем сегмента δΤ на одно сокращение после ΡΡΟ (модуль 2: прерывистый прием оксида азота (нитроглицерин)). График ЭКГ светло-серого цвета означает группу 5 дней Κ1Ρ ΡΒδ, п=8: 0,104±0,016 мВ; график ЭКГ среднего серого цвета означает группу 5 дней ΝΤΟ-плацебо, п=6; 0,096±0,061 мВ; график ЭКГ черного цвета означает группу 5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ, п=7: 0,052±0,030 мВ.

По сравнению с контрольным приемом забуференного фосфатом физиологического раствора или ΝΤΟ-плацебо более низкий подъем сегмента δΤ был обнаружен после лечения нитроглицерином в течение 5 дней по протоколу КРР.

В нитроглицериновой группе (5 дней КРР ΝΤΟ) подъем сегмента δΤ значительно уменьшен по сравнению с группой, принимавшей ΝΤΟ-плацебо и забуференный фосфатом физиологический раствор. Нет никакой значимой разницы между группами, принимавшими забуференный фосфатом физиологический раствор и ΝΤΟ-плацебо;

фиг. 6 - подъем сегмента δΤ (модуль 2: прерывистый прием оксида азота (нитроглицерин)). Первый столбец показывает группу 5 дней К1Р ΡΒδ; второй столбец показывает группу 5 дней ΝΤΟ-плацебо; третий столбец показывает группу 5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ; среднеквадратичное отклонение показано вертикальными отрезками, звездочка указывает значительное уменьшение подъема сегмента δΤ по сравнению с группами, принимавшими забуференный фосфатом физиологический раствор и ΝΤΟ-плацебо (номинальное значение р<0,017).

Диаграмма показывает средний подъем сегмента δΤ, максимальный для группы. После лечения нитроглицерином максимум подъема сегмента δΤ был значительно уменьшен по сравнению с 5дневными группами ΚΙΡ ΡΒδ и ΝΤΟ-плацебо (* номинальное значение р<0,017);

фиг. 7 - подъем сегмента δΤ на одно сокращение после ΡΡΘ (модуль 3: непрерывный прием оксида азота (изосорбиддинитрат замедленного действия)). График ЭКГ светло-серого цвета означает группу 5 дней ΚΙΡ ΡΒδ, п=8: 0,104±0,016 мВ; график ЭКГ среднего серого цвета означает группу 5 дней ΙδΌΝплацебо, п=7: 0,110±0,069 мВ; график ЭКГ черного цвета означает группу 5 дней ΚΙΡ ΙδΌΝ, п=7: 0,062±0,027 мВ.

По сравнению с контрольным лечением забуференный фосфатом физиологический раствор или ΙδΌΝ-плацебо более низкий подъем сегмента 8Τ был обнаружен после лечения изосорбиддинитратом после 5 дней протокола ΚΙΡ.

Подъем сегмента 8Τ в группе ΙδΌΝ (5 дней ΚΙΡ ΙδΌΝ) уменьшается по сравнению с группой забуференный фосфатом физиологический раствор, но значимого различия нет, также как между группами забуференный фосфатом физиологический раствор и ΙδΌΝ-плацебо;

фиг. 8 - подъем сегмента δΤ (модуль 3: непрерывный прием оксида азота (изосорбиддинитрат замедленного действия)). Первый столбец показывает группу 5 дней ΚΙΡ ΡΒδ; второй столбец показывает группу 5 дней ΚΙΡ ΙδΌΝ-плацебо; третий столбец показывает группу 5 дней ΚΙΡ ΙδΌΝ; среднеквадратичное отклонение показано вертикальными отрезками.

Диаграмма показывает средний подъем сегмента δΤ, максимальный для группы. После лечения изосорбиддинитратом максимум подъема сегмента δΤ был незначимым образом уменьшен по сравнению с лечением забуференным фосфатом физиологическим раствором и ΙδΌΝ-плацебо после 5 дней протокола ΚΙΡ;

фиг. 9 - подъем сегмента δΤ на одно сокращение после ΡΡΘ (модуль 4: прерывистый прием оксида азота плюс ацетилсалициловая кислота). График ЭКГ светло-серого цвета означает группу 5 дней ΚΙΡ ΡΒδ, п=8; 0,104±0,016 мВ; график ЭКГ среднего серого цвета означает группу 5 дней ΚΙΡ ΑδΑ+ΡΒδ, п=7: 0,138±0,098 мВ; график ЭКГ темно-серого цвета означает группу 5 дней ΚΙΡ ΑδΑ+ΝΤΟ-плацебо, п=6: 0,144±0,091 мВ; график ЭКГ черного цвета означает группу 5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ+ΑδΑ, п=7: 0,088±0,071 мВ.

Лечение комплексом ΝΤΟ+ΑδΑ было сравнено с лечением ΡΒδ+ΑδΑ, NΤΟ-плацебо+ΑδΑ и ΡΒδ. В целом все кривые накладываются друг на друга в одном и том же диапазоне.

Подъем сегмента δΤ в группе, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор и ацетилсалициловую кислоту, выше по сравнению с контрольной группой забуференный фосфатом физиологический раствор, но значимого различия нет, так же как по сравнению с контрольной группой ΑδΑ+ΝΤΟ-плацебо. В группе, принимавшей ΑδΑ+ΝΤΟ, подъем сегмента δΤ уменьшается по сравнению с группой, принимавшей ацетилсалициловую кислоту и забуференный фосфатом физиологический раствор;

фиг. 10 - подъем сегмента δΤ (модуль 4: прерывистый прием оксида азота плюс ацетилсалициловая кислота). Первый столбец показывает группу 5 дней ΚΙΡ ΡΒδ; второй столбец показывает группу 5 дней ΚΙΡ ΡΒδ+ΑδΑ; третий столбец показывает группу 5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ-плацебо; четвертый столбец показывает группу 5 дней ΚΙΡ NΤΟ-плацебо+ΑδΑ; пятый столбец показывает группу 5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ; шестой столбец показывает группу 5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ+ΑδΑ; среднеквадратичное отклонение показано вертикальными отрезками.

Диаграмма показывает средний подъем сегмента δΤ, максимальный для группы. Лечение комплексом ΝΤΟ+ΑδΑ было сравнено с лечением ΡΒδ+ΑδΑ, NΤΟ-плацебо+ΑδΑ и ΡΒδ. Кроме того, все группы,

- 11 032534 принимавшие ацетилсалициловую кислоту (ΡΒδ+ΑδΑ, ЫТС-плацебо+АЗА, ΝΤΟ+Α8Α), были сравнены с их контрольными группами, не принимавшими ацетилсалициловую кислоту (забуференный фосфатом физиологический раствор, ΝΤΟ-плацебо, нитроглицерин). Никаких существенных различий обнаружено не было;

фиг. 11 - аритмии во время ΕΡΘ (модуль 1: операция симуляции (без ВР)). Столбцы расположены в порядке их следования в группе ГУЬ. Первый столбец показывает группу 5 дней симуляции ΡΒ8; второй столбец показывает группу 5 дней симуляции ΝΤΟ-плацебо; третий столбец показывает группу 5 дней симуляции ΝΤΟ.

В соответствии с классификацией Лауна все группы симуляции были преимущественно отнесены к уровню ГУЬ.

В группе 5 дней симуляции ΡΒ8 87,5% крыс имеют аритмии класса ГУЬ и 12,5% крыс имеют аритмии класса ГУа. В группе 5 дней симуляции ΝΤΟ-плацебо 83,3% крыс имеют аритмии класса ГУЬ и 16,7% крыс имеют аритмии класса ГУа, а в группе 5 дней симуляции ΝΤΟ 85,7% крыс имеют аритмии класса ГУЬ и 14,3% крыс имеют аритмии класса ГГГа;

фиг. 12 - аритмии во время ΕΡΘ (модуль 2: прерывистый прием оксида азота (нитроглицерин)). Столбцы расположены в порядке их следования в группе ГУЬ. Первый столбец показывает группу 5 дней Κ1Ρ ΡΒ8; второй столбец показывает группу 5 дней ВР ΝΤΟ-плацебо; третий столбец показывает группу 5 дней ΜΡ ΝΤΟ.

В то время как аритмии в обеих контрольных группах забуференный фосфатом физиологический раствор и ΝΤΟ-плацебо были преимущественно отнесены к уровню ГУЬ, группа, принимавшая нитроглицерин, более часто относилась к уровню 0.

В группе 5 дней ВР ΡΒδ 75,0% крыс имеют аритмии класса ГУЬ, 12,5% крыс имеют аритмии класса ГУа и 12,5% крыс имеют аритмии класса 0. Что касается группы 5 дней ВР ΝΤΟ-плацебо, 50,0% крыс показали аритмии класса ГУЬ, 16,7% крыс показали аритмии класса ГУа, 16,7% крыс показали аритмии класса ГГГЬ и 16,7% крыс показали аритмии класса 0. Интересно, что группа 5 дней ВГИ ΝΤΟ показала 42,9% аритмий класса ГУЬ и 57,1% аритмий класса 0;

фиг. 13 - аритмии во время ΕΡΘ (модуль 3: непрерывный прием оксида азота (изосорбиддинитрат замедленного действия)). Столбцы расположены в порядке их следования в группе ГУЬ. Первый столбец показывает группу 5 дней ВР ΡΒ8; второй столбец показывает группу 5 дней ΒΖΡ ΡΟΝ-плацебо; третий столбец показывает группу 5 дней Κ1Ρ [ΞΩΝ.

Во всех группах аритмии сходным образом чаще всего относились к уровню ГУЬ.

В группе 5 дней РЭХ-плацебо 57,1% крыс имеют аритмии класса ГУЬ, 14,3% крыс имеют аритмии класса ГУа и 28,6% крыс имеют аритмии класса ГГГЬ. Группа 5 дней ВР ΡΩΝ показывает менее тяжелые аритмии, из которых 57,1% относятся к классу ГУЬ, 28,6% к классу ГГГЬ и 14,3% аритмий относятся к классу 0;

фиг. 14 - аритмии во время ΕΡΘ (модуль 4: прерывистый прием оксида азота плюс ацетилсалициловая кислота). Столбцы расположены в порядке их следования в группе ГУЬ. Первый столбец показывает группу 5 дней ВР ΑδΑ+ΡΒδ; второй столбец показывает группу 5 дней ВР ΑδΑ+ΝΤΟ-плацебо; третий столбец показывает группу 5 дней Κ1Ρ Α8Α+ΝΤΟ.

В группе 5 дней Κ1Ρ ΑδΑ+ΡΒδ, в группе, принимавшей ΑδΑ+ΝΤΟ-плацебо, и в группе 5 дней ВР Α8Α+ΝΤΟ 83,3% крыс имеют аритмии класса ГУЬ и 16,7% крыс имеют аритмии класса ГГГа;

фиг. 15 - оценка ΥΡΒ. Первый столбец показывает группу симуляции ΡΒ8; второй столбец показывает группу симуляции ΝΤΟ-плацебо; третий столбец показывает группу симуляции ΝΤΟ; четвертый столбец показывает группу Κ1Ρ ΡΒ8; пятый столбец показывает группу ВР ΝΤΟ-плацебо; шестой столбец показывает группу Κ1Ρ ΝΤΟ; седьмой столбец показывает группу ВР ΡΒ8; восьмой столбец показывает группу Κ1Ρ Г§^N-плацебо; девятый столбец показывает группу ВР ΡΩΝ; десятый столбец показывает группу ВР ΡΒδ+ΑδΑ; одиннадцатый столбец показывает группу ВР NΤΟ-плацебо+Α§Α; двенадцатый столбец показывает группу ВР ΝΤΟ+Α8Α.

Что касается процента каждого уровня Лауна каждой группы, может быть определена оценка ΥΒΡ. Чем больше животных показывает более высокий уровень, тем выше оценка ΎΒΡ.

Оценка ΑΒΡ показывает процент каждого уровня Лауна каждой группы. Группы симуляции имеют более высокие оценки \ΒΡ. По сравнению с группой с ишемическим протоколом (контрольная группа, принимающая забуференный фосфатом физиологический раствор), большее количество крыс показывает тяжелые аритмии. Лечение нитроглицерином показало уменьшенные аритмии и, следовательно, более низкую оценку ^Β. Оценка ^Β в группах, принимавших одну только ацетилсалициловую кислоту или нитроглицерин + ацетилсалициловую кислоту, выше по сравнению с контрольными группами (принимавшими забуференный фосфатом физиологический раствор);

фиг. 16 - размер инфаркта 5-дневных и 10-дневных контрольных групп. Первый столбец показывает группу 5 дней симуляции ΡΒ8, п=8: 13,36±5,22%; второй столбец показывает группу 5 дней Κ1Ρ ΡΒ8, п=8: 11,05±5,12%; третий столбец показывает группу 10 дней симуляции ΡΒ8, п=7: 13,71±6,04%; чет

- 12 032534 вертый столбец показывает группу 10 дней КГР РВ8, п=6: 6,57±3,26%; среднеквадратичное отклонение показано вертикальными отрезками; звездочка указывает значимое по сравнению с симуляциями изменение (номинальное значение р<0,013).

После применения ишемического протокола в течение 5 дней не было обнаружено значительно меньшего измеримого размера инфаркта, но после применения ШР в течение 10 дней площадь инфаркта значительно уменьшается по сравнению с симуляциями (номинальное значение р<0,013).

После 90 мин окклюзии ΓΆΌ и 20 мин реперфузии анализировался размер инфаркта.

Группа 10 дней ШР РВ8 имеет значительно меньшую площадь инфаркта по сравнению с группой 10 дней симуляции РВ8. Значимого различия между обеими 5-дневными группами нет;

фиг. 17 - размер инфаркта (модуль 1: операция симуляции (без ШР)). Первый столбец показывает группу 5 дней симуляции РВ8, п=8: 13,3±5,22%; второй столбец показывает группу 5 дней симуляции ΝΤΟ-плацебо, п=6: 14,21±5,79%; третий столбец показывает группу 5 дней симуляции ΝΤΟ, п=7: 14,09±5,18%; среднеквадратичное отклонение показано вертикальными отрезками.

Размер инфаркта показывает отсутствие различий между группами симуляции.

Значимого различия между тремя группами симуляции нет;

фиг. 18 - размер инфаркта (модуль 2: прерывистый прием оксида азота (нитроглицерин)). Первый столбец показывает группу 5 дней К1Р РВ8, п=8: 11,05±5,12%; второй столбец показывает группу 5 дней ΝΤΟ-плацебо: п=6; 9,80±6,79%; третий столбец показывает группу 5 дней ШР ΝΤΟ, п=7: 3,61±2,08%; среднеквадратичное отклонение показано вертикальными отрезками, звездочка указывает значимое различие по сравнению с группой 5 дней К1Р РВ8 (номинальное значение р<0,017).

Размер инфаркта значительно меньше после лечения нитроглицерином по сравнению с контрольными группами, принимавшими забуференный фосфатом физиологический раствор (номинальное значение р<0,033).

По сравнению с группой 5 дней ШР РВ8 в группе 5 дней ШР ΝΤΟ наблюдалась значительно меньшая площадь инфаркта. Значимого различия между группой, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор, и группой, принимавшей ΝΤΟ-плацебо, нет;

фиг. 19 - размер инфаркта (модуль 3: непрерывный прием оксида азота (изосорбиддинитрат замедленного действия)). Первый столбец показывает группу 5 дней ШР РВ8, п=8: 11,05±5,12%; второй столбец показывает группу 5 дней ΙδΌΝ-плацебо, п=6: 9,97±3,65%; третий столбец показывает группу 5 дней К1Р Ι8ΌΝ, п=7: 7,59±4,38%; среднеквадратичное отклонение показано вертикальными отрезками.

Размер инфаркта после лечения изосорбиддинитратом меньше по сравнению с контрольными группами, принимавшими забуференный фосфатом физиологический раствор или ΙδΌΝ-плацебо, но значимого различия нет.

Размер инфаркта в группе ΙδΌΝ (5 дней ШР Ι8ΌΝ) меньше по сравнению с группой, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор, так же как и по сравнению с группой, принимавшей ΙδΌΝ-плацебо;

фиг. 20 - размер инфаркта (модуль 4: прерывистый прием оксида азота плюс ацетилсалициловая кислота). Первый столбец показывает группу 5 дней К1Р РВ8, п=8; 11,05±5,12%; второй столбец показывает группу 5 дней К1Р Л8Л+РВ8, п=6: 12,51±3,05%; третий столбец показывает группу 5 дней ΝΤΟплацебо: п=6; 9,80±6,79%; четвертый столбец показывает группу 5 дней ЮР №ГО-плацебо+Л8Л, п=6: 13,92±1,71%; пятый столбец показывает группу 5 дней ШР ΝΤΟ, п=7: 3,61±2,08%; шестой столбец показывает группу 5 дней ШР ΝΤ6+Ά8Ά, п=6: 13,00±3,82%; среднеквадратичное отклонение показано вертикальными отрезками, звездочка указывает значимое отличие по сравнению с группой 5 дней КГР ΝΤΟ (номинальное значение р<0,017).

Размер инфаркта после лечения нитроглицерином в комплексе с ацетилсалициловой кислотой значительно увеличивается по сравнению с лечением одним только нитроглицерином (номинальное р-значение <0,017).

Размер инфаркта в группе, принимавшей ацетилсалициловую кислоту (5 дней Л8Л+РВ8), минимально увеличивается по сравнению с контрольной группой, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор, так же как и по сравнению с контрольной группой, принимавшей ΆδΆ+ΝΤΟплацебо. Значимого различия между группой, принимавшей Λ8Λ+ΝΤ6. и группой, принимавшей ацетилсалициловую кислоту и забуференный фосфатом физиологический раствор, нет. Однако площадь инфаркта в группе, принимавшей нитроглицерин, значительно меньше по сравнению с группой, принимавшей ацетилсалициловую кислоту и нитроглицерин;

фиг. 21 - окрашивание 2,3,5-трифенилтетразолийхлоридом (ТТС). Изображения показывают слои трех уровней. Инфарктная ткань окрашена в палево-белый цвет, поскольку она испытывает недостаток в ферментах, с которыми реагирует ТТС. Таким образом, области некроза являются четко различимыми и измеримыми;

фиг. 22 - диаметры коллатералей в интересующей области (модуль 1: операция симуляции (без КГР)). Первый столбец показывает группу 5 дней симуляции РВ8, п=3: 82,7±3,7 мкм; второй столбец

- 13 032534 показывает группу 5 дней симуляции ΝΤΟ-плацебо, п=3: 89,6±10,6 мкм; третий столбец показывает группу 5 дней симуляции ΝΤΟ, п=3: 86,8±9,0 мкм; среднеквадратичное отклонение показано вертикальными отрезками.

Никакого роста коллатералей и никаких измеримых различий между группами симуляции нет.

Между тремя группами симуляции нет значимых различий;

фиг. 23 - диаметры коллатералей в интересующей области (модуль 2: прерывистый прием оксида азота (нитроглицерин)). Первый столбец показывает группу 5 дней ΚΙΡ ΡΒ8, п=3: 129,8 ± 6, 9 мкм; второй столбец показывает группу 5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ-плацебо: п=3; 127,0±12,1 мкм; третий столбец показывает группу 5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ, п=3: 158,4±9,2 мкм; среднеквадратичное отклонение показано вертикальными отрезками, звездочка указывает значимое отличие по сравнению с группой 5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ (номинальное значение р<0,033).

Диаметры коллатералей значительно увеличиваются при лечении нитроглицерином по сравнению с контрольными группами, принимавшими забуференный фосфатом физиологический раствор или ΝΤΟплацебо (номинальное значение р<0,033).

По сравнению с группой 5 дней ΚΙΡ ΡΒ8 диаметры коллатералей в интересующей области в группе 5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ значительно увеличиваются. Значимого различия между группой, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор, и группой, принимавшей ΝΤΟ-плацебо, нет;

фиг. 24 - диаметры коллатералей в интересующей области (модуль 3: непрерывный прием оксида азота (изосорбиддинитрат замедленного действия)). Первый столбец показывает группу 5 дней ΚΙΡ ΡΒ8, п=3: 129,8±6,9 мкм; второй столбец показывает группу 5 дней ΙδΌΝ-плацебо, п=3: 133,0±11,5 мкм; третий столбец показывает группу 5 дней ΚΙΡ Ι8ΌΝ, п=3: 148,2±11,3 мкм; среднеквадратичное отклонение показано вертикальными отрезками.

Никаких измеримых различий в диаметре коллатералей после лечения изосорбиддинитратом или ΙδΌΝ-плацебо нет.

Диаметры коллатералей в группе Ι8ΌΝ (5 дней ΚΙΡ Ι8ΌΝ) увеличиваются по сравнению с группой, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор, также как и по сравнению с группой, принимавшей ΙδΌΝ-плацебо;

фиг. 25 - диаметры коллатералей в интересующей области (модуль 4: прерывистый прием оксида азота плюс ацетилсалициловая кислота). Первый столбец показывает группу 5 дней ΚΙΡ ΡΒ8, п=3; 129,8±6,9 мкм; второй столбец показывает группу 5 дней ΚΙΡ ΡΒ8+Ά8Ά, п=3: 102,5±8,0 мкм; третий столбец показывает группу 5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ-плацебо: п=3; 127,0±12,1 мкм; четвертый столбец показывает группу 5 дней NΤΟ-плацебо+Α8Α, п=3: 97,1±8,6 мкм; пятый столбец показывает группу 5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ, п=3: 158,4±9,2 мкм; шестой столбец показывает группу 5 дней ΚΙΡ Α8Α+ΝΤΟ, п=3: 124,4±5,6 мкм; среднеквадратичное отклонение показано вертикальными отрезками, одна звездочка указывает значимое отличие по сравнению с группой 5 дней ΚΙΡ ΡΒ8 (номинальное значение р<0,039); две звездочки указывают значимое отличие по сравнению с группой 5 дней ΚΙΡ Α8Α+ΝΤΟ (номинальное значение р<0,039).

Диаметры коллатералей после лечения ацетилсалициловой кислотой значительно меньше по сравнению с контрольной группой, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор (*номинальное значение р<0,039). Дополнительное лечение нитроглицерином нейтрализовало ингибирующий эффект ацетилсалициловой кислоты, но лечение одним только нитроглицерином показало значительное увеличение диаметра по сравнению с лечением нитроглицерином в комплексе с ацетилсалициловой кислотой (**значимое отличие по сравнению с группой 5 дней ΚΙΡ Α8Α+ΝΤΟ, номинальное значение р<0,039).

Диаметры в группе, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор и ацетилсалициловую кислоту, значительно меньше по сравнению с контрольной группой, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор, но никакого значимого различия по сравнению с группой ΑδΑ+ΝΤΟ-плацебо нет. В группе Α8Α+ΝΤΟ диаметры значительно увеличены по сравнению с группой, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор и ацетилсалициловую кислоту;

фиг. 26 - компьютерная микротомографическая визуализация интересующей области: (А) 5 дней симуляции ΡΒ8; (В) 5 дней симуляции ΝΤΟ; (С) 5 дней ΚΙΡ Ι8ΌΝ; (Ό) 5 дней ΚΙΡ ΡΒ8; (Е) 5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ; (Е) 5 дней ΚΙΡ Α8Α+ΡΒ8; (Ο) 5 дней ΚΙΡ Α8Α+ΝΤΟ.

Изображения показывают рост диаметра коллатералей в интересующей области при применении ишемического протокола и приеме забуференного фосфатом физиологического раствора (Ό), нитроглицерина (Е) или изосорбиддинитрата (С) по сравнению с симуляцией и приемом забуференного фосфатом физиологического раствора (А) или нитроглицерина (В). Торможение роста коллатералей лечением ацетилсалициловой кислотой (Е) частично нейтрализуется дополнительным лечением нитроглицерином (Ο);

фиг. 27 - блок-схема исследования. Продолжительность начального периода оценивается приблизительно в 2 недели. Продолжительность интервенционного периода составит шесть недель. Послеоперационный период будет включать непосредственное исследование (от одного до максимум трех дней после интервенционного периода), и долговременное послеоперационное исследование (1 месяц после ин

- 14 032534 тервенционного периода).

Пример 1.

Преклиническое исследование.

1. Введение.

Одним важным механизмом артериогенеза является индукция сдвигового напряжения в укрепляемых коллатеральных артериях.

Оксид азота играет фундаментальную роль в этом сценарии, поскольку он регулирует сосудорасширяющую способность артерии, а также аспекты терапевтической пролиферации на гладкомышечных ячейках коллатеральных артерий.

Здесь мы оценивали эффекты ΝίΙΐΌ1ίη§ι.ι;·ι1 аки1® Зргау (производства компании О. РоЫ-Воккатр ОтЬН & Со. КО, г. Хоэнлокштедт, Германия; американское зарегистрированное патентованное название ΝίίΓοΙίηβΐιαΙ® Ритркргау) в модели артериогенеза при единичном немиокардиальном инфаркте. Коллатеральный рост в этой модели индуцируется посредством периодически повторяющейся окклюзии левой передней нисходящей коронарной артерии (БАБ). Размер инфаркта у этих животных измерялся как результат в конце эксперимента. Таким образом, никакие перекрестные взаимодействия между инфарктом миокарда и артериогенезом не снижали эффективности эксперимента. Кроме того, мы оценивали влияние ацетилсалициловой кислоты (АЗА) в этой модели повторяющейся коронарной окклюзии в качестве возможного ингибитора артериогенеза. Мы оценивали, может ли сопутствующее применение оксида азота (прерывистое использование нитроглицерина) компенсировать это отрицательное влияние ацетилсалициловой кислоты.

2. Материалы и способы.

1.1. Подготовка животных.

Для экспериментов используются самцы крыс линии Спраг Доули (масса тела в начале исследования 300 г; п=182). Для хирургической операции (день 0) крысы подвергаются премедикации (кетамин 50 мг/мл плюс ксилазин 4 мг/мл интраперитонеально) и интубируются. Интубация через рот (полиэтиленовой трубкой 14-О) делается при непосредственном наблюдении голосовых складок через отоскоп. Общий наркоз дается и поддерживается ингаляцией изофлюрана (от 1,0 до 2,0% со 100%-ным кислородом). Температура тела поддерживается равной 37°С с помощью электроподогреваемого стола. Хирургическая операция выполняется с использованием асептической методики. Животное первоначально помещается на его дорсальную сторону, и кожные зажимы фиксируются. С помощью дифференциального усилителя ВюАтр, соединенного с системой получения и накопления данных Ро^егБаЬ (производства компании АБ 1п51гитеп15). параметры ЭКГ (частота сердечных сокращений) отслеживаются и регистрируются во время хирургической операции. Доступ к сердцу обеспечивается при помощи левой торакотомии. Минипневматический петельный окклюдатор (см. раздел Мини-пневматический петельный окклюдатор) имплантируется вокруг середины проксимальной левой передней нисходящей коронарной артерии (БАБ). Подтверждение того, что окклюдатор работает, т.е. создает ишемию миокарда, первоначально определяется наблюдением за побледнением и гипокинезией левого желудочка (БУ) и наблюдением за электрокардиограммой (подъем сегмента ЗТ) во время надувания. Крысы случайным образом разделяются на 4 терапевтических модуля:

модуль 1: операция симуляции;

модуль 2: прерывистый прием оксида азота (нитроглицерина);

модуль 3: непрерывный прием оксида азота (препарат изосорбиддинитрата замедленного действия); модуль 4: прерывистый прием оксида азота плюс ацетилсалициловая кислота.

После оснащения измерительной аппаратурой и измерений грудная клетка закрывается под положительным давлением на выдохе, и воздух из грудной полости удаляется. Окклюдаторы вводятся подкожно и располагаются между лопатками. Эти катетеры защищены пружинной обмоткой из нержавеющей стали, соединенной с кольцом, которое подкожно фиксируется между лопатками. После хирургической операции назначаются анальгетик (бупренорфин 0,05 мг/кг подкожно) и антибиотик (энрофлоксацин 10 мг/кг подкожно). Крысы наблюдаются в реанимационной клетке в течение 2 ч, а затем передаются в отделение ухода за животными, где они непрерывно наблюдаются техническим персоналом. Послеоперационно дается бупренорфин (0,5 мг/кг подкожно) для снятия боли два раза в день в течение 8-13 дней. На третий день после хирургической операции (день 3) начинается ишемический протокол. После 5-10 дней (только в модуле 1А и 2А) экспериментального протокола (день 8-13) крысы анестезируются и грудная клетка вскрывается срединной торакотомией. В группе компьютерной микротомографии сердца немедленно удаляются. Для заключительного определения размера инфаркта БАБ полностью закрывается (заключительная постоянная окклюзия, ГРО), и размер инфаркта измеряется посредством окрашивания 2,3,5 -трифенилтетразолийхлоридом.

1.2. Мини-пневматический петельный окклюдатор для крысиного сердца.

Используется мини-пневматический петельный окклюдатор, состоящий из мини-баллона, оболочечной трубки, нити и катетера. Баллон (7 мм длиной) делается из мягкой латексной мембраны и является достаточно сгибаемым для того, чтобы создавать незначительное физическое усилие на коронарных

- 15 032534 сосудах во время выпуска воздуха из баллона. Баллон устанавливается в пределах зонтообразной оболочки (3,2 или 4,8 мм в диаметре, 12 мм в длину; защищает баллон от волокнистой инфильтрации). Пролен (5-0) проходит вокруг ЬАЭ и присоединяется к оболочке, прикрепляя окклюдатор к сердцу, так что ишемия миокарда создается путем раздувания баллона. Объем раздувания является небольшим (от 0,2 до 0,25 мл воздуха), но окклюзия происходит за счет двух физических действий: обжатия ЬАЭ в направлении вверх/наружу и сжатия ЬАЭ надутым баллоном/оболочкой. Баллон соединен с катетером (РЕ-50), который выводится на поверхность тела. Надуванием и сдуванием баллона управляют снаружи крысиной клетки.

1.3. Измерения параметров ЭКГ.

Во всех четырех модулях (1-4) в начале (день 3) и в конце (день 8-13) экспериментального протокола (КГР) коронарная окклюзия выполняется в течение 40 с (эквивалентно окклюзии в ΡΙΡ; см. стр. 6) и во время ГРО в течение 90 мин (день 8-13) параметры ЭКГ измеряются для того, чтобы исследовать частоту сердечных сокращений и подъем сегмента 8Τ. Кроме того, определяется возникновение аритмии во время ГРО. В соответствии с классификацией Лауна каждое животное демонстрирует некоторый уровень. Чем выше уровень, тем больше тяжесть аритмии. Для того чтобы более описательно иллюстрировать среднюю тяжесть для всей группы, вводится оценка УРВ. Для этого каждый уровень Лауна относится к конкретному фактору (уровень 0 = фактор 0; уровень I = фактор 1; уровень II = фактор 2; уровень 111а = фактор 3; уровень ШЬ = фактор 4; уровень У1а = фактор 5; уровень У1Ь = фактор 6 и уровень V = фактор 7). Каждая группа имеет различный процент животных, представляющих каждый уровень. Процент соответствующих уровней умножается на подходящий коэффициент, что дает индивидуальные результаты, которые затем суммируются для получения оценки УРВ группы в целом. Следовательно, группа животных с более высокими уровнями Лауна имеет скоррелированное высокое значение оценки УРВ.

1.4. Визуализация коронарных капилляров с помощью компьютерной микротомографии.

В дополнение к этому компьютерная микротомография используется в качестве дополнительного результата для визуализации коллатералей. Одна группа крыс (3 крысы из каждой группы в каждом модуле; общее количество 36 крыс) готовится к визуализации коронарных сосудов с помощью компьютерной микротомографии. Коронарное кровообращение заполняется контрастным веществом (желтый микрофил) с помощью модификации методологии для компьютерно-микротомографического исследования у крыс. Вязкость контрастного вещества обеспечивает заполнение вплоть до коронарного артериолярного уровня без заполнения или с минимальным заполнением капилляров. Отсеченное сердце немедленно канюлируется аортальным катетером, и коронарное кровообращение ретроградно перфузируется под давлением в 85 мм рт.ст. Перфузат (солевой раствор с 2%-ным новокаином с температурой от 25 до 27°С) используется для того, чтобы избежать метаболического сокращения миокарда и максимально расширить коронарную сосудистую сеть. Трубка из полиэтилена вставляется в левый желудочек сквозь левый придаток через митральный клапан для того, чтобы разгрузить левый желудочек. Нагретое контрастное вещество (с температурой 42°С) вводится под давлением 85 мм рт.ст. в течение 3 мин при постоянном отслеживании давления перфузии. Сердце охлаждается путем погружения в холодный солевой раствор (с температурой от 0 до 4°С) до тех пор, пока (желтый микрофил) не затвердеет. Затем сердце вынимается из солевого раствора и оставляется на ночь для фиксации в 4%-ном растворе параформальдегида (с температурой 4°С). Целые сердца используются для компьютерно-микротомографической визуализации роста коронарных коллатералей. Коронарная сосудистая сеть визуализируется с помощью компьютерной микротомографии. Вкратце, целое сердце сканируется с инкрементом 1° приблизительно на 360° вокруг его вертикальной продольной оси. Пространственное разрешение, выбранное в данном исследовании, имеет размер воксела 18x18x18 м³, чтобы сфокусироваться на размере коллатеральных сосудов и минимизировать сигналы от меньших сосудов. Наконец, компьютерно-томографические данные реконструируются в трехмерные изображения. Главное назначение этих изображений состоит в том, чтобы установить наличие или отсутствие артериально-артериальных анастомотических соединений.

Коллатеральные сосуды, т.е. артериально-артериальные анастомотические соединения измеряются независимыми наблюдателями для групп. Морфология коллатеральной артериальной сети анализируется с помощью программного обеспечения АтЛа 5.2.2 (производства компании Укаде 1тадтд, Берлин, Германия).

1.5. Экспериментальный протокол.

Протокол повторяющейся ишемии (К1Р) вводится автоматизированным раздуванием окклюдатора с использованием следующего протокола: 40 с окклюзии каждые 20 мин в течение 2 ч 20 мин, после чего следует период отдыха (сдувания) в течение 5 ч 40 мин. Этот 8-часовой цикл повторяется 3 раза в день в течение 5-10 дней (только в модуле 1А и 2А). ЬАО перекрывается автоматически с помощью удаленного раздувания или сдувания через катетер. У крыс симуляционной группы (см. модуль 1) баллон имплантируется, но протокол повторяющейся ишемии не применяется. Крысы в соответствии с протоколом повторяющейся ишемии случайным образом делятся на три модуля 2, 3 и 4.

- 16 032534

1.6. Определение размера инфаркта.

Размер инфаркта определяется окрашиванием 2,3,5-трифенилтетразолийхлоридом после заключительной постоянной окклюзии. После 5-10 дней (только в модуле 1А и 2А) экспериментального протокола окклюдатор постоянно надувается в течение 90 мин. Размер инфаркта измеряется окрашиванием 2,3,5трифенилтетразолийхлоридом (п=10/группу). Следовательно, крысы подвергаются анестезии и снятию ЭКГ для того, чтобы подтвердить окклюзию (подъем сегмента 8Т) и вычислить параметры ЭКГ и количества аритмий. У животных без коллатералей коронарная окклюзия вызывает ухудшение системной гемодинамики и аритмии, включая преждевременные желудочковые сокращения, желудочковую тахикардию и желудочковую фибрилляцию; у животных с хорошо развитыми коллатералями никаких отрицательных воздействий не отмечается. Параметры ЭКГ регистрируются и анализируются с использованием автоматизированной программы (ЬаЬ сйаг! 7).

Грудная клетка вскрывается срединной торакотомией. Сердце немедленно отсекается и делится от вершины до основания на поперечные слои 2 мм толщиной, параллельные предсердно-желудочковой борозде. Слои инкубируются буфером из фосфорнокислого натрия с концентрацией 0,09 моль/л, содержащим 1,0% трифенилтетразолийхлорида (ТТС) и 8% декстрана, в течение 20 мин при температуре 37°С. Слои фиксируются в 10% растворе формальдегида, а затем фотографируются цифровым фотоаппаратом, установленным на стереомикроскопе. Размер инфаркта определяется количественно с использованием автоматизированной планиметрической программы (АйоЬе ΡΗοίοδΗορ). Площадь инфаркта идентифицируется как не содержащая трифенилтетразолийхлорида ткань и выражается как процент площади левого желудочка (ЬУ).

1.7. Описание тестируемых соединений.

Ацетилсалициловая Мегск СНешгсаТз кислота

Прерывистый прием оксида азота (нитроглицерин)

Непрерывный прием оксида азота (изосорбиддинитрат замедленного действия)

Соединение-носитель для прерывистого приема оксида азота (ΝΤΟплацебо)

Соединение-носитель для непрерывного приема оксида азота (Ι3ΏΝплацебо)

Контрольный буфер

РоН1

ЫгСгоИлдиа!

нитроглицерина;

СшЬН &

.Хоэнлокштедт, Германия

Таблетки изосорбид динитрата замедленного действия;

Νί-ЬгозогЬоп® замедленного действия; С. РоЫ-Возкашр СтЬН & Со. КС, г.Хоэнлокштедт, Германия раствор плацебо ПТкгоИпдиа! акиб® Зргау, РоЫ-Возкашр СтЬН & Со. КС, г.Хоэнлокштедт, Германия

Нейтральные таблетки ΝίΈΓθ3θΓ6οη® замедленного действия; С. РоЫ-Возкашр СтЬН & Со. КС, г.Хоэнлокштедт, Германия РВЗ (забуференный фосфатом физиологический раствор)

1.8. Способ введения, время и концентрация вводимых животным веществ.

Все лекарства (ацетилсалициловая кислота, нитроглицерин и изосорбиддинитрат замедленного действия) даются перед следующей окклюзией с помощью устройства. Контрольный буфер (РВ8) дается тем же самым образом перед первыми двумя окклюзиями.

Прерывистый прием оксида азота (нитроглицерин).

Новый тестовый раствор готовится каждое утро в восемь часов. Раствор берется из пробирок шприцем.

Прерывистый прием оксида азота (нитроглицерин) осуществляется два раза в день с временным интервалом 8 ч.

Из-за постоянного присутствия у крыс средств измерения и во избежание дополнительного стресса нитроглицерин дается трансбуккально. 50 мкл ежедневно приготовляемого тестового раствора, содержащего 17,37 мкг нитроглицерина (эквивалентно человеческой дозе 0,8 мг, вычисленной по формуле доза/животное [мг] = метаболическая масса тела [кг^0,75] х человеческая доза [мг/кг] х коэффициент перерасчета [кг/кг^0,75],

- 17 032534 в соответствии с публикацией Ьбксйег Иидетасй Ρ.Κ., Кгокег К., 1998, В1аск\\е11 8с1еисе, 3¹'¹ еб1ίίοη), назначается трансбуккально в модуле 1, 2 и 4. Время применения - непосредственно перед раздуванием баллона в 9:00 и 17:00, с помощью чего достигается максимальное влияние на задействованные коллатеральные артерии.

Эта концентрация берется из вышеупомянутых реакционных пробирок непосредственно перед назначением.

Раствор соединения-носителя служит основным раствором для приготовления тестового раствора.

Соединение-носитель для прерывистого приема оксида азота (ΝΤΟ-плацебо).

Соединение-носитель назначается способом, идентичным прерывистому приему оксида азота. Непрерывный прием оксида азота (изосорбиддинитрат замедленного действия).

Лекарство для непрерывного приема оксида азота (препарат изосорбиддинитрата замедленного действия = нитрат длительного действия Ι8ΌΝ) дается в виде таблеток замедленного действия 1 раз в сутки.

В качестве препарата замедленного действия выбирается изосорбиддинитрат в дозировке 2,6 мг Ι8ΌΝ на крысу. Следовательно, таблетки массой 13 мг суспендируются в 0,5 мл питьевой воды и применяются посредством искусственного питания каждое утро в 9:00 (эквивалентно человеческой дозе 2 мг/кг массы тела).

Соединение-носитель для непрерывного приема оксида азота (ΙδΌΝ-плацебо).

Соединение-носитель назначается способом, идентичным непрерывному приему оксида азота. Прерывистый прием оксида азота плюс Ά8Ά (ацетилсалициловая кислота).

Каждое утро в 9:30 посредством искусственного питания непосредственно в желудок дается 2,22 мг на крысу ацетилсалициловой кислоты, растворенной в 0,5 мл питьевой воды.

Концентрация ацетилсалициловой кислоты, равная 2,22 мг ацетилсалициловой кислоты на крысу (6,34 мг/кг массы тела), коррелирует с человеческой дозировкой 100 мг/сутки.

1.9. Животные и группы.

крыс на группу (ΡΡΘ = заключительная постоянная окклюзия для индуцирования инфарктов).

Группа б: 3 дополнительных животных лечатся теми же самыми лекарствами и с той же схемой лигирования, что и соответствующие группы а, Ь и с, но без ΡΡΘ. Эти 9 животных на модуль используются для получения изображений компьютерной микротомографии.

Модуль 1. Операция симуляции (без ΚΙΡ).

A. Контрольный буфер (забуференный фосфатом физиологический раствор ΡΒ8) с функциональной ΡΡΘ для определения размера инфаркта, η=20.

1. η=10: 5 дней симуляции ΡΒ8.

2. η=10 10 дней симуляции ΡΒ8.

B. Соединение-носитель без оксида азота плюс функциональная ΡΡΟ для определения размера инфаркта.

η=10: 5 дней симуляции ΝΤΟ-плацебо.

C. Нитроглицерин с функциональной ΡΡΟ для определения размера инфаркта.

η=10: 5 дней симуляции ΝΤΟ.

Ό. А1.) η=3; А2.) η=3; В) η=3; С) η=3 для получения изображений компьютерной микротомографии, η=12.

Итого: η=52.

Модуль 2. Прерывистый прием оксида азота.

A. Прерывистый прием контрольного буфера с функциональной ΡΡΟ для определения размера инфаркта η=20.

1. η=10: 5 дней ΚΙΡ ΡΒ8.

2. η=10: 10 дней ΚΙΡ ΡΒ8.

B. Прерывистый прием соединения-носителя плюс функциональная ΡΡΟ для определения размера инфаркта.

η=10: 5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ-плацебо.

C. Прерывистый прием нитроглицерина с функциональной ΡΡΟ для определения размера инфаркта. η=10: 5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ.

Итого: η=52.

Модуль 3. Непрерывный прием оксида азота.

A. Непрерывный прием контрольного буфера (питьевая вода) с функциональной ΡΡΟ для определения размера инфаркта.

(η=10): 5 дней ΚΙΡ питьевая вода.

B. Непрерывный прием соединения-носителя плюс функциональная ΡΡΟ для определения размера инфаркта.

η=10: 5 дней ΚΙΡ ΙδΌΝ-плацебо.

- 18 032534

С. Непрерывный прием оксида азота плюс функциональная ΓΡΘ для определения размера инфаркта.

п=10: 5 дней ΚΙΡ Ι8ΌΝ.

Ό. А.) п=3; В.) п=3; С.) п=3 для получения изображений компьютерной микротомографии, п=9.

Итого: п=(39).

Модуль 4. Прерывистый прием оксида азота плюс ацетилсалициловая кислота.

A. Прерывистый прием контрольного буфера плюс ацетилсалициловая кислота с функциональной ΡΡΘ для определения размера инфаркта.

п=10: 5 дней ΚΙΡ РВ8+А8А.

B. Прерывистый прием соединения-носителя оксида азота плюс ацетилсалициловая кислота плюс функциональная ΡΡΘ для определения размера инфаркта.

п=10: 5 дней ΚΙΡ №Г6-плацебо+А8А.

C. Прерывистый прием нитроглицерина плюс ацетилсалициловая кислота плюс функциональная ΡΡΘ для определения размера инфаркта.

п=10: 5 дней ΚΙΡ КГ6+А8А.

Итого: п=39.

2. Статистический анализ.

Все данные даются как средние значения ± стандартное отклонение. Графики показаны как средние значения ± стандартная средняя ошибка.

Результаты, полученные путем измерения подъема сегмента 8Т, размера инфаркта и диаметров сосудов, анализируются на статистическую значимость с помощью пакета программ 8Ρ88 20 (ΙΒΜ 8Ρ88 Ξΐαΐίδΐίοδ. г. Нью-Йорк, США). Используется дисперсионный анализ (АNΟVА) с коррекцией уровня ложноположительных результатов (ΓΌΚ). Значения р подстраиваются в ходе многократного тестирования с использованием процедуры ΓΌΚ так, чтобы достичь значимости всего эксперимента р < 0,05. ΓΌΚ принимает во внимание число отклоненных нулевых гипотез и, как было показано, увеличивает статистическую мощность по сравнению с коррекцией Бонферрони.

3. Результаты.

3.1. Заключительная постоянная окклюзия.

Окклюзия БАЭ позволила провести перспективное исследование функции коллатеральных сосудов. Такие сосуды могут защитить ткань миокарда при риске ишемии после коронарной окклюзии.

В конце протокола ΚΙΡ постоянная окклюзия БАЭ выполняется в одной подгруппе для всех групп и измеряются параметры ЭКГ для исследования подъема сегмента 8Т электрокардиограммы и желудочковых аритмий. После 90 мин постоянной окклюзии определяется площадь инфаркта.

3.2. Анализ электрокардиограммы.

Электрокардиографические проявления ишемии, инициированной окклюзией БАЭ, являются менее выраженными, когда присутствуют коллатеральные сосуды.

3.3. Подъем сегмента 8Т.

Во время окклюзии БАЭ существует обратная корреляция между величиной подъема сегмента 8Т и степенью коллатерального снабжения.

Коллатеральная функция является важным определяющим фактором направления реакции сегмента 8Т на ишемию во время острой коронарной окклюзии. Обратимый подъем сегмента 8Т во время острой окклюзии БАЭ связан с неадекватной коллатеральной артериальной функцией. У пациентов с обратимой депрессией сегмента 8Т коронарная коллатеральная функция, по-видимому, лучше и, как следствие, показывает меньше результатов ишемии.

В течение 90 мин окклюзии подъем сегмента 8Т в группе 10 дней симуляции ΡΒ8 значительно выше по сравнению с группой 10 дней ΚΙΡ ΡΒ8 (10 дней симуляции, п=7: 0,124±0,039 мВ; 10 дней ΚΙΡ, п=7: 0,055±0,033 мВ). Напротив, подъем сегмента 8Т в группе 5 дней симуляции ΡΒ8 аналогично группе 5 дней ΚΙΡ ΡΒ8 (5 дней симуляции, п=8: 0,134±0,034 мВ; 5 дней ΚΙΡ, п=8: 0,104±0,016 мВ) (см. фиг. 1 и 2).

Модуль 1. Операция симуляции (без ΚΙΡ).

Нет никакого значимого различия между тремя группами симуляции (5 дней симуляции ΡΒ8, п=8: 0,134±0,034 мВ; 5 дней симуляции ЭТС-плацебо, п=6: 0,131±0,043 мВ; 5 дней симуляции ΝΓ6, п=7: 0,124±0,058 мВ) (см. фиг. 3 и 4).

Модуль 2. Прерывистый прием оксида азота (нитроглицерин).

В группе, принимавшей нитроглицерин (5 дней ΚΙΡ №ГС), подъем сегмента 8Т значительно уменьшается по сравнению с группой, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор (5 дней ΚΙΡ ΡΒ8, п=8: 0,104±0,016 мВ; 5 дней ΚΙΡ ΝΓ6, п=7: 0,052±0,030 мВ). Нет никакого значимого различия между группой, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор, и группой, принимавшей ЭТС-плацебо (5 дней ЭТС-плацебо: п=6; 0,096±0,061 мВ) (см. фиг. 5 и 6).

- 19 032534

Модуль 3. Непрерывный прием оксида азота (изосорбиддинитрат замедленного действия).

Подъем сегмента δΤ в группе, принимавшей изосорбиддинитрат (5 дней ΚΙΡ ΙδΌΝ), уменьшается по сравнению с группой, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор (5 дней ΚΙΡ ΡΒ8, п=8: 0,104±0,016 мВ; 5 дней ΚΙΡ ΙδΌΝ, п=7: 0,062±0,027 мВ), но никакого значимого отличия нет, также как и между группой, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор, и группой, принимавшей ΙδΌΝ-плацебо (5 дней ΙδΌΝ-плацебо, п=7: 0,110±0,069 мВ) (см. фиг. 7 и 8).

Подъем сегмента 8Т в группе, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор и ацетилсалициловую кислоту, выше по сравнению с контрольной группой, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор (5 дней ΚΙΡ ΆδΆ+ΡΒδ, п=7: 0,138±0,098 мВ; 5 дней ΚΙΡ ΡΒδ, п=8; 0,104±0,016 мВ), но никакого значимого отличия нет, также как и по сравнению с группой ΑδΑ+ΝΤΟплацебо (5 дней ΚΙΡ ΑδΑ+ΝΤΟ-плацебо, п=6: 0,144±0,091 мВ). В группе, принимавшей ацетилсалициловую кислоту и нитроглицерин, подъем сегмента δΤ уменьшается по сравнению с группой, принимавшей ацетилсалициловую кислоту и забуференный фосфатом физиологический раствор (5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ+ΑδΑ, п=7: 0,088±0,071шУ) (см. фиг. 9 и 10).

3.4. Желудочковые аритмии.

Важность желудочковых преждевременных сокращений (νΡΒ) следует из их возможной связи с увеличенным риском внезапной смерти из-за остановки сердца. Преждевременные сокращения делились на группы согласно классификации Лауна. Было показано, что высокий уровень Лауна предсказывает летальность после острого инфаркта миокарда.

Уровень 0: эктопические желудочковые сокращения отсутствуют.

Уровень Ι: случайные, изолированные νΡΒ.

Уровень ΙΙ: частые νΡΒ (>1/мин или 30/ч).

Уровень ΙΙΙ: полиморфные νΡΒ.

(a) νΡΒ;

(b) гибридные.

Уровень Ιν: повторяющиеся νΡΒ.

(a) дуплеты;

(b) очереди.

Сорт ν. Ранние νΡΒ.

Модуль 1. Операция симуляции (без ΚΙΡ).

В группе 5 дней симуляции ΡΒδ 87,5% крыс имеют аритмии класса ΙΑ6 и 12,5% крыс имеют аритмии класса Ινα. В группе 5 дней симуляции ΝΤΟ-плацебо 83,3% крыс имеют аритмии класса и 16,7% крыс имеют аритмии класса Ινα. а в группе 5 дней симуляции ΝΤΟ 85,7% крыс имеют аритмии класса Ι^ и 14,3% крыс имеют аритмии класса Ша (см. фиг. 11).

В группе 5 дней ΚΙΡ ΡΒδ 75,0% крыс имеют аритмии класса ΙνΚ 12,5% крыс имеют аритмии класса Ινα и 12,5% крыс имеют аритмии класса 0. Что касается группы 5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ-плацебо, 50,0% крыс показали аритмии класса ΙνΚ 16,7% крыс показали аритмии класса Ινα, 16,7% крыс показали аритмии класса ШЬ и 16,7% крыс показали аритмии класса 0. Интересно, что группа 5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ показала 42,9% аритмий класса Ι^ и 57,1% аритмий класса 0 (см. фиг. 12).

В группе 5 дней ΙδΌΝ-плацебо 57,1% крыс имеют аритмии класса ΙνΚ 14,3% крыс имеют аритмии класса Ινα и 28,6% крыс имеют аритмии класса ШЬ. Группа 5 дней ΚΙΡ ΙδΌΝ показывает менее тяжелые аритмии, из которых 57,1% относятся к классу ΙνΚ 28,6% к классу ШЬ и 14,3% аритмий относятся к классу 0 (см. фиг. 13).

В группе 5 дней ΚΙΡ ΑδΑ+ΡΒδ, в группе, принимавшей ΑδΑ+ΝΤΟ-плацебо, и в группе 5 дней ΚΙΡ ΑδΑ+ΝΤΟ 83,3% крыс имеют аритмии класса Ι^ и 16,7% крыс имеют аритмии класса ΙΙΙα (см. фиг. 14).

Что касается процента каждого уровня Лауна каждой группы, может быть определена оценка νΒΡ. Чем больше животных показывает более высокий уровень, тем выше оценка νΒΡ (см. фиг. 15).

Фиг. 15. Оценка νΡΒ.

- 20 032534

Таблица 1

Оценка ΥΡΒ

3.5. Размер инфаркта.

После 90 мин окклюзии ΓΑΌ и 20 мин реперфузии анализировали размер инфаркта.

Группа 10 дней ΚΙΡ ΡΒ8 имеет значительно меньшую площадь инфаркта по сравнению с группой 10 дней симуляции ΡΒ8 (10 дней ΚΙΡ ΡΒ8, п=6: 6,57±3,26%; 10 дней симуляции ΡΒ8, п=7: 13,71±6,04%). Значимого различия между обеими 5-дневными группами нет (5 дней симуляции ΡΒ8, п=8: 13,36±5,22%; 5 дней ΚΙΡ ΡΒ8, п=8: 11,05±5,12%) (см. фиг. 16).

Модуль 1. Операция симуляции (без ΚΙΡ).

Значимого различия между тремя группами симуляции нет (5 дней симуляции ΡΒ8, п=8: 13,36±5,22%; 5 дней симуляции ΝΤΟ-плацебо, п=6: 14,21±5,79%; 5 дней симуляции ΝΤΟ, п=7: 14,09±5,18%) (см. фиг. 17).

Модуль 2. Прерывистый прием оксида азота (ΝΤΟ).

По сравнению с группой 5 дней ΚΙΡ ΡΒ8 в группе 5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ наблюдалась значительно меньшая площадь инфаркта (5 дней ΚΙΡ ΡΒ8, п=8: 11,05±5,12%; 5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ, п=7: 3,61±2,08%). Значимого различия между группой, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор, и группой, принимавшей ΝΤΟ-плацебо, нет (5 дней ΝΤΟ-плацебо: п=6; 9,80±6,79%) (см. фиг. 18).

Размер инфаркта в группе Ι8ΌΝ (5 дней ΚΙΡ Ι8ΌΝ) меньше по сравнению с группой, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор (5 дней ΚΙΡ ΡΒ8, п=8: 11,05±5,12%; 5 дней ΚΙΡ Ι8ΌΝ, п=7: 7,59±4,38%), также как и по сравнению с группой, принимавшей Ι8Ι)Ν-ιплацебо (5 дней Ι8ΌΝплацебо, п=6: 9,97±3,65%) (см. фиг. 19).

Размер инфаркта в группе, принимавшей ацетилсалициловую кислоту (5 дней Α8Α+ΡΒ8), минимально увеличивается по сравнению с контрольной группой, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор (5 дней ΚΙΡ Α8Α+ΡΒ8, п=6: 12,51±3,05%; 5 дней ΚΙΡ ΡΒ8, п=8; 11,05±5,12%), также как и по сравнению с контрольной группой, принимавшей Α8Α+NΤΟ-плацебо (5 дней ΚΙΡ Α8Α+NΤΟ-плацебо, п=6: 13,92±1,71%). Значимого различия между группой, принимавшей Α8Α+ΝΤΟ, и группой, принимавшей ацетилсалициловую кислоту и забуференный фосфатом физиологический раствор, нет (см. фиг. 20). Однако площадь инфаркта в группе, принимавшей нитроглицерин, значительно меньше по сравнению с группой, принимавшей ацетилсалициловую кислоту и нитроглицерин (5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ, п=7: 3,61±2,08%; 5 дней ΚΙΡ ΝΤΟ+Α8Α, п=6: 13,00±3,82%) (см. фиг. 20).

3.6. Визуализация коронарных капилляров с помощью компьютерной микротомографии.

Коллатеральные артерии представляют собой существующие сосуды, идущие параллельно главной артерии. В случае окклюзии главная артерия закрывается, коллатерали в течение короткого периода времени (40 с во время использованного протокола ΚΙΡ) принимают кровоснабжение на себя. В результате, коллатеральные артерии в этой области (ΚΟΙ, интересующая область) начинают расти в длину (ясно видимые структуры в виде штопора) и особенно заметно начинает расти их диаметр. Таким образом, мы измеряли диаметр коллатералей в ΚΟΙ.

- 21 032534

Модуль 1. Операция симуляции (без ШГР).

Между тремя группами симуляции нет значимых различий (5 дней симуляции РВ8, п=3: 82,7±3,7 мкм; 5 дней симуляции ΝΤΟ-плацебо, п=3: 89,6±10,6 мкм; 5 дней симуляции ΝΤΟ, п=3: 86,8±9,0 мкм) (см. фиг. 22 и 26).

По сравнению с группой 5 дней ШГР РВ8 диаметры коллатералей в интересующей области в группе 5 дней ШГР ΝΤΟ значительно увеличиваются (5 дней ШР РВ8, п=3: 129,8±6,9 мкм; 5 дней ШР ΝΤΟ, п=3: 158,4±9,2 мкм). Значимого различия между группой, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор, и группой, принимавшей ΝΤΟ-плацебо, нет (5 дней ΝΤΟ-плацебо: п=3; 127,0±12,1 мкм) (см. фиг. 23 и 26).

Диаметры коллатералей в группе ΙδΌΝ (5 дней ШГР ΙδΌΝ) увеличиваются по сравнению с группой, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор (5 дней ШГР РВ8, п=3: 129,8±6,9 мкм; ШГР 5 дней ΙδΌΝ, п=3: 148,2±11,3 мкм), также как и по сравнению с группой, принимавшей ΙδΌΝ-плацебо (5 дней ΙδΌΝ-плацебо, п=3: 133,0±11,5 мкм) (см. фиг. 24 и 26).

Диаметры в группе, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор и ацетилсалициловую кислоту, значительно меньше по сравнению с контрольной группой, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор (5 дней КЛР РВ8+А8А, п=3: 102,5±8,0 мкм; 5 дней КЛР РВ8, п=3; 129,8±6,9 мкм), но никакого значимого различия по сравнению с группой ΑδΑ+ΝΤΟ-плацебо нет (5 дней NΤΟ-плацебо+ΑδΑ, п=3: 97,1±8,6 мкм). В группе ΑδΑ+ΝΤΟ диаметры значительно увеличены по сравнению с группой, принимавшей забуференный фосфатом физиологический раствор и ацетилсалициловую кислоту (5 дней К1Р ΑδΑ+ΝΤΟ, п=3: 124,4±5,6 мкм) (см. фиг. 25 и 26).

4. Заключение.

Мы исследовали группы 10 дней симуляции РВδ и 5 дней симуляции РВδ - каждая без использования К1Р (протокол повторяющейся ишемии) и группы 10 дней РЛР РВδ и 5 дней РЛР РВδ - каждая с использованием протокола ШР в течение пяти и десяти дней.

Измерение объема инфаркта после 90-минутной постоянной окклюзии ΕΑΌ (ЕРО, заключительная постоянная окклюзия) показало значительно меньшие площади инфаркта в группе 10 дней К1Р, чем в группе 10 дней симуляции. Напротив, после применения протокола ШР в течение пяти дней различия между группами ШР и симуляции не были очевидными.

Кроме того, мы впервые использовали параметры ЭКГ для экспертиз и оценки. Мы нашли, что максимальный подъем сегмента δΤ после ЕРО ΕΑΌ не показывает серьезных различий между группой 5 дней ШР РВδ и группами симуляции. Однако после 10 дней подъем сегмента δΤ был значительно меньше в группе ШГР.

Кроме измерения подъема сегмента δΤ во время ЕРО, мы смогли проанализировать и оценить аритмии дифференцированным способом.

Основываясь на этих новых идеях в характеризации модели ШΜI для крыс, мы решили использовать 5-дневный протокол повторяющейся ишемии в случае ожидаемой стимуляции артериогенеза. Степень улучшения подъема сегмента δΤ и объем инфаркта после 10-дневного применения протокола ШГР тем не менее могут быть получены с проартериогенными веществами в пределах 5-дневного применения протокола ШГР.

Это обеспечивает дополнительные параметры, которые могут подтвердить наши результаты измерения объема инфаркта.

Прерывистое применение раствора нитроглицерина (два раза в день на слизистой оболочке щеки) уменьшало серьезные аритмии сердца крыс во время ЕРО по сравнению с контрольной группой. Дополнительно к этому, объем инфаркта уменьшается больше чем на 50% после 90 мин ЕРО по сравнению с контрольной группой. Это сокращение размера инфаркта не может быть получено с контрольными группами, подвергнутыми 10-дневному протоколу ШР. Кроме того, лечение раствором нитроглицерина значительно ослабило подъем сегмента δΤ во время ЕРО. На основе компьютерного микротомографического анализа были измерены значительно увеличенные коллатеральные артерии.

Лечение крыс изосорбиддинитратом замедленного действия (один раз в день внутрижелудочно) также привело к уменьшениям подъема сегмента δΤ во время ЕРО, к уменьшению количества аритмий и к уменьшению объемов инфаркта. Однако эти улучшения параметров инфаркта являются менее выраженными по сравнению с лечением нитроглицерином. Кроме того, они не показали статистической значимости.

По сравнению с контрольными группами лечение ацетилсалициловой кислотой показало ухудшение параметров ЭКГ и увеличение объемов инфаркта из-за ухудшения роста коллатералей. Эти отрицательные эффекты ацетилсалициловой кислоты при артериогенезе являются известными. Интересно то, что они могут быть частично нейтрализованы посредством дополнительного лечения нитроглицерином (два раза в день на слизистую оболочку щеки). Таким образом, диаметры коллатеральных артерий в ин

- 22 032534 тересующей области были увеличены, а параметры ЭКГ были улучшены. Однако объемы инфаркта после ГРО не показали уменьшения.

Группы симуляции не отличались друг от друга.

Кроме того, не было никаких измеримых различий между группами, принимавшими плацебо, и их соответствующими контрольными группами.

В заключение представленные результаты указывают, что прерывистое лечение раствором нитроглицерина уменьшает размер экспериментально вызванного инфаркта миокарда. В дополнение к этому может быть улучшен сердечный ритм. Эти новые знания имеют важное значение для клинических аспектов.

Пример 2.

Клиническое исследование.

Это исследование нацелено на изучение влияния контролируемой, управляемой врачом стандартизированной программы физических упражнений для симптоматического лечения, функционального улучшения и увеличения артериогенной способности у больных с хронической устойчивой ишемической болезнью сердца.

1. Схема исследования.

1.1. Гипотезы и направления исследования.

1.1.1. Гипотезы.

I. Активная, управляемая врачом физическая тренировка с прерывистым применением нитроглицерина лучше, чем активная, управляемая врачом физическая тренировка без нитроглицерина.

(А+)>(А-).

II. Пассивная, управляемая врачом физическая тренировка (СагФоАссе1®) с прерывистым применением нитроглицерина лучше, чем пассивная, управляемая врачом физическая тренировка без нитроглицерина.

(Р+)>(Р-).

III. Консервативная терапия ишемической болезни сердца с прерывистым применением нитроглицерина лучше, чем консервативная терапия ишемической болезни сердца без нитроглицерина.

(С+)>(С-).

1.1.2. Направления исследования.

А+ Активная, управляемая врачом физическая тренировка с прерывистым применением нитроглицерина.

А- Активная, управляемая врачом физическая тренировка.

Р+ Пассивная, управляемая врачом физическая тренировка (СагйюАссе1®) с прерывистым применением нитроглицерина.

Р- Пассивная, управляемая врачом физическая тренировка (СагШоЛссе1®).

С+ Консервативная терапия ишемической болезни сердца с прерывистым применением нитроглицерина.

С- Консервативная терапия ишемической болезни сердца.

Пациенты могут использовать нитроглицерин в случае стенокардии, однако нитроглицерин для использования в целях настоящего исследования будет дополнительным.

Активная, управляемая врачом физическая тренировка с прерывистым применением нитроглицерина. Наилучшая медицинская терапия и обычный уход в соответствии с текущими руководствами (АНА, Е8С) для ухода за пациентами с хронической стабильной стенокардией. Ежедневные (понедельник-пятница) физические упражнения (бегущая дорожка) по 30 мин (>1 Вт/кг массы тела) с последующей оценкой риска и индивидуальным вычислением и подстройкой интенсивности тренировки, как подробно описано в текущих руководящих принципах ЕАСРЕ, в течение в общей сложности шести недель. Использование нитроглицерина для лечения эпизодов стенокардии разрешается. В дополнение к этому 0,4 мг нитроглицерина принимается за 2-5 мин перед началом тренировки.

Активная, управляемая врачом физическая тренировка. Наилучшая медицинская терапия и обычный уход в соответствии с текущими руководствами (АНА, Е8С) для ухода за пациентами с хронической стабильной стенокардией. Ежедневные (понедельник-пятница) физические упражнения (бегущая дорожка) по 30 мин (>1 Вт/кг массы тела) с последующей оценкой риска и индивидуальным вычислением и подстройкой интенсивности тренировки, как подробно описано в текущих руководящих принципах ЕАСРЯ, в течение в общей сложности шести недель.

Использование нитроглицерина для лечения эпизодов стенокардии разрешается.

Пассивная, управляемая врачом физическая тренировка (Сагй1оАссе1®) с прерывистым применением нитроглицерина.

Наилучшая медицинская терапия и обычный уход в соответствии с текущими руководствами (АНА, Е8С) для ухода за пациентами с хронической стабильной стенокардией. Ежедневные (понедельник-пятница) интервалы физической тренировки Сагй1оАссе1® по 1 ч в день в течение в общей сложности шести недель, как подробно описано в публикации (Агога К.К., СЕои Т.М., άηίη Ό., НеЫипап В.,

- 23 032534

Сга\\Тогб Ь., МсКлетап Т., №Чо ЯЮ. ТНе тиШсеЫег Чибу оТ епЬапсеб ех1егпа1 соиЫегрикабоп (МИ8ТЕЕСР): еТТес! оТ ЕЕСР оп ехегсЬе-тбисеб туосагб1а1 18сйет1а апб апдша1 ерЬобеч 1. Ат. Со11. Сагбю1. 1999 1ип; 33(7): 1833-40). Использование нитроглицерина для лечения эпизодов стенокардии разрешается. В дополнение к этому, 0,4 мг нитроглицерина назначают за 2-5 мин перед началом тренировки. Использование нитроглицерина для лечения эпизодов стенокардии разрешается.

Пассивная, управляемая врачом физическая тренировка (СагбюАссе1®). Наилучшая медицинская терапия и обычный уход в соответствии с текущими руководствами (АНА, Е8С) для ухода за пациентами с хронической стабильной стенокардией. Ежедневные (понедельник-пятница) интервалы физической тренировки СагбюАссе1® по одному часу в день в течение в общей сложности шести недель, как подробно описано в публикации (Агога и др., см. выше). Использование нитроглицерина для лечения эпизодов стенокардии разрешается.

Консервативная терапия ишемической болезни сердца с прерывистым применением нитроглицерина. Наилучшая медицинская терапия и обычный уход в соответствии с текущими руководствами (АНА, Е8С) для ухода за пациентами с хронической стабильной стенокардией. Использование нитроглицерина для лечения эпизодов стенокардии разрешается. В дополнение к этому, 0,4 мг нитроглицерина назначают один раз в день, предпочтительно перед началом произвольной повседневной активности.

Консервативная терапия ишемической болезни сердца. Наилучшая медицинская терапия и обычный уход в соответствии с текущими руководствами (АНА, Е8С) для ухода за пациентами с хронической стабильной стенокардией. Использование нитроглицерина для лечения эпизодов стенокардии разрешается.

1.2. Схема клинического испытания.

1.2.1. Схема клинического испытания - главные моменты.

Исследование планируется как перспективное;

рандомизированное;

территориально распределенное (немецкая площадка, американская площадка) клиническое испытание для оценки влияния глицерилтринитрата (№1го1тдиа1®) на способность переносить физическую нагрузку, причем предложенный патофизиологический механизм является индукцией проартериогенных эффектов.

1.2.2. Результаты исследования.

Основные.

Изменения в функциональной способности переносить физическую нагрузку, измеряемой при посещении 3 с помощью пикового объема поглощения кислорода (УО₂ тах) и максимального поглощения кислорода при анаэробном пороге (УО₂ тах АТ) от базовой линии в стандартизированном упражнении на бегущей дорожке (§ЕТТ).

Побочные.

Изменения.

(1) Во времени упражнения, необходимом для вызывания ишемии, измеряемом как время до достижения >1 мм депрессии сегмента 8Т в стандартизированном упражнении на бегущей дорожке (&ЕТТ), (2) в гемодинамических реакциях на &ЕТТ, определяемых количественно произведением давления на пульс (ЯРР) (произведение давления на пульс (ЯРР) является чувствительным показателем потребления кислорода миокардом (тУО₂). Пациенты делятся на группы в соответствии со значением произведения давления на пульс (ЯРР), которые существовали на момент максимальной депрессии сегмента 8Т. При отсутствии депрессии сегмента 8Т записывается максимальное ЯРР.), которое определяется как систолическое кровяное давление (мм рт.ст.), умноженное на частоту сердечных сокращений (ударов в минуту). Сердечный ритм, кровяное давление и тенденции изменения сегмента 8Т измеряются с помощью электроники в точке 1+60 мс, (3) в количестве эпизодов стенокардии за сутки, (4) в продолжительности упражнения &ЕТТ, (5) в относительном индексе крутизны пика (ЯР81), (4) в полученном с помощью эффекта Допплера максимальном систолическом ускорении [АССтах], (5) в функциональном статусе СС8 и НУНА, (6) в оценке Дьюка на бегущей дорожке (оценка Дьюка на бегущей дорожке рассчитывает риск; она равна времени тренировки в минутах минус (5-кратное отклонение 8Т-сегмента во время или после тренировки, в миллиметрах) минус (4-кратный индекс стенокардии, который имеет значение 0, если нет стенокардии, значение 1, если стенокардия есть, и значение 2, если стенокардия является причиной остановки теста). Среди амбулаторных больных с подозрением на ишемическую болезнь сердца две трети пациентов с оценкой, указывающей на низкий риск, имели четырехлетнюю выживаемость 99% (в среднем ежегодная смертность составляет 0,25%), и 4%, имевшие оценку, указывающую на высокий риск, имели четырехлетнюю выживаемость 79% (в среднем ежегодная смертность составляет 5%). Дан

- 24 032534 ная оценка хорошо работает как для стационарных, так и для амбулаторных пациентов, и предварительные данные позволяют предположить, что оценка одинаково хорошо работает для мужчин и женщин [61ЬЬоп8 е! а1., 2003 АНА/АСС СшйеНпе]), (7) в числе случаев сердечно-сосудистых событий во время фазы лечения и (8) то же, что и основной результат, но спустя один месяц после интервенционного периода.

1.2.3. Пациенты.

Подходящие пациенты должны быть клинически стабильными, получающими перед включением в исследование терапию против стенокардии и терапию против ишемической болезни сердца, которые находятся в полном соответствии с текущими руководящими принципами Е8С/АНА для лечения хронической устойчивой ишемической болезни сердца.

Запрещенные лекарства:

нитраты длительного действия;

силденафил и т.д.;

противовоспалительные соединения (кроме аспирина), такие как стероиды или этанерцепт и т.д. Критерии включения.

Возраст >18 лет.

Подтвержденное документами доказательство устойчивой ишемической болезни сердца либо с помощью положительного результата стрессового тестирования на физическую нагрузку, либо с помощью ангиографическим образом зарегистрированного коронарного стеноза, либо с помощью зарегистрированной истории подъема сегмента 8Т или инфаркта миокарда.

Способность тренироваться на бегущей дорожке, причем упражнение ограничивается только связанными со стенокардией симптомами.

Критерии исключения.

Индивидуальная непереносимость нитратов или индивидуальная непереносимость любого лекарственного компонента, используемого в ходе исследования.

Лечение, которое представляет собой угрозу фармакологического взаимодействия с нитроглицерином.

Острый коронарный синдром или нестабильная стенокардия <6 предшествующих недель.

Стеноз левой главной коронарной артерии >50%.

Чрескожная коронарная ангиопластика (РСГ) или аорто-коронарное шунтирование (САБО) <3 предшествующие месяца.

Коронарная вазография <3 предшествующие недели.

Застойная сердечная недостаточность/ЕТ <30%.

Заболевание клапанов сердца или миокардит.

Неконтролируемая артериальная гипертензия со значениями кровяного давления >180/100 мм рт.ст.

Тяжелое симптоматическое заболевание периферических артерий, варикоз, тромбоз глубоких вен (текущий или в задокументированной истории болезни), флебит или язва.

Нарушение коагуляции или терапевтическая антикоагуляция.

Аритмии сердца, которые интерферируют с запуском ЕСР (наружная контрпульсация).

Характеристики электрокардиограммы, которые лишают смысла отслеживание сегмента 8Т: депрессия базовой линии сегмента 8Т, зависимые от кардиостимулятора ритмы, продолжительность комплекса ОК8>0.12 с, аритмии, отличающиеся от синусовой аритмии.

Объем воздуха при форсированном выдохе в единицу времени ТЕУ1<1,5 л.

Текущее участие в программе кардиальной реабилитации.

Медицинские, психологические, когнитивные, социальные или юридические условия, которые могут повлиять на способность пациента дать информированное согласие на участие и/или на его или ее способность выполнить требования исследования, включая выделение необходимого количества времени.

Участие в качестве субъекта в клиническом интервенционном исследовании за предыдущие 30 дней.

Женщины, которые являются беременными или имеют потенциал забеременеть и не следуют рекомендованным способам контрацепции.

Рандомизация.

Отобранные пациенты рандомизируются в отношении 1:1:1 с тем, чтобы получать активные тренировки, терапию СагйюАссе1® или обычный уход, т.е. продолжение начального лечения в соответствии с текущими руководящими принципами. В пределах этих групп пациенты рандомизируются в отношении 1:1 на группы +ОТЫ или к -ОТЫ, первая из которых получает тринитроглицерин в дополнение к их стандартному лечению, а вторая нет.

- 25 032534

1.2.4. Планирование, проведение и управление исследованием.

Испытание планируется организацией Лйсподспсмх ΝοΙ\\όγ1< ΑγΙ. Νβΐ.

Управление исследованием будет осуществляться организацией Л^ιе^^одеηе8^8 ΝοΙ\\όγ1< ΑγΙ. Νβΐ. через компанию Сатрик Τοο^Μ^ί^ РгеФигд ΟтЬΗ, осуществляющую передачу технологий университета Фрайбурга.

Президент: профессор доктор Бернхард Арнольдс.

Адрес: Штефан-Майер штрассе 8, 79104 Фрайбург (Германия).

Телефон: + 49 (0) 761 203 4990.

Факс: +49 (0) 761 203 4992.

Спонсор испытания - СТР.

Структура отчетности и схемы отчетности будут детализированы после определения участвующих центров.

Исследовательские площадки.

Участвующие центры: должны быть определены.

Контакт в случае вопросов, распространение информации.

Контакт при неблагоприятном случае, распространение информации.

1.2.5. Блок-схема и протокол исследования.

Блок-схема исследования приведена на фиг. 27.

1.2.6. Назначение лечения.

Рандомизация будет проведена в каждом участвующем центре с использованием конвертов.

Стратификация будет проведена в соответствии с возрастными группами, полом и заболеваемостью.

Посещения в ходе исследования проводятся исследователем.

Участвующие в исследовании центры заранее назначают исследователей, которые не информированы о рандомизации и которые выполняет медицинские экспертизы и тестирование на начальном этапе и на первом последующем этапе.

При каждом посещении в ходе исследования пациентов просят заполнить короткую стандартизированную форму оценки качества жизни (δΡ-36) (См. 1Шр://\у\у\у.гапб.огд/11еа1111/5игуеу5_1оо15/то5/то5_ соге_36йет.Шт1).

С пациентами, вошедшими в группы С+/С-, персонал исследования контактирует на регулярной основе, чтобы помочь управлению потенциальными эффектами погрешности измерения, поскольку эти субъекты не имеют таких регулярных контактов с персоналом исследования, как группы Са^ά^оΑссе1® или группы физических тренировок.

1.2.7. Посещения в ходе исследования.

Посещение 1. Скрининг пригодности (день 1).

История болезни, включая предыдущие вмешательства, физический осмотр;

принятие решения о включении/невключении в исследование.

Посещение 2. Посещение первоначального периода (до дня 14 (+3 дня)).

Детализированная история болезни и физический осмотр, включая оценку количества эпизодов стенокардии в сутки, статуса ί,'ί,'δ и ΝΥΗΑ, а также оценку произвольной физической активности.

Тестирование на стандартной, калиброванной бегущей дорожке с возможностью экстрапульмонального тестирования (модифицированный протокол Нотона):

функциональная способность переносить физическую нагрузку (УО₂ тах и УО₂ тах ΑΤ), время упражнения, необходимое для вызывания ишемии, измеряемое как время до достижения >1 мм депрессии сегмента δΤ, произведение давления на пульс (ΚΡΡ), частота сердечных сокращений, кровяное давление и тенденции изменения сегмента δΤ, измеренные с помощью электроники в точке 1+60 мс, продолжительность упражнения, оценка Дьюка на бегущей дорожке, непрерывный мониторинг показателей жизненно важных функций, включая ЭКГ в 12 отведениях и УО₂, причем УО₂тах определяется как νθ₂ при максимальном уровне нагрузки, который отдельный пациент в состоянии достичь (дыхательное отношение >1, анаэробный порог);

относительный индекс крутизны пика (ΚΡδΙ);

полученное с помощью эффекта Допплера максимальное систолическое ускорение [АССтах];

рандомизация.

Промежуточные (внеплановые) посещения.

Пациентам рекомендуют контактировать с исследовательским центром по поводу их заболевания в любое время. Первые контрольные посещения пациентов планируются через 6 недель после рандомизации.

Посещение 3. Краткосрочный контроль (спустя 1-3 дня после интервенционного периода).

История болезни и физический осмотр, оценку количества эпизодов стенокардии в сутки, статуса ί,'ί,'δ и ΝΥΗΑ, а также оценку произвольной физической активности;

- 26 032534 функциональная способность переносить физическую нагрузку (УО₂ тах и УО₂ тах АТ), время упражнения, необходимое для вызывания ишемии, измеряемое как время до достижения >1 мм депрессии сегмента 8Т, произведение давления на пульс (КРР), частота сердечных сокращений, кровяное давление и тенденции изменения сегмента 8Т, измеренные с помощью электроники в точке 1+60 мс, продолжительность упражнения, оценка Дьюка на бегущей дорожке, непрерывный мониторинг показателей жизненно важных функций, включая ЭКГ в 12 отведениях и УО₂, причем УО₂тах определяется как УО₂ при максимальном уровне нагрузки, который отдельный пациент в состоянии достичь (дыхательное отношение >1, анаэробный порог);

относительный индекс крутизны пика (КР81);

полученное с помощью эффекта Допплера максимальное систолическое ускорение [АССтах]; количество случаев сердечно-сосудистых событий во время фазы лечения.

Посещение 4. Долгосрочный контроль (спустя 1 месяц после интервенционного периода).

(Целью этой части исследования является оценка долговременного эффекта лечения в ходе исследования после интервенционного периода).

История болезни и физический осмотр, включая оценку количества эпизодов стенокардии в сутки, статуса СС8 и ЫУНА, а также оценку произвольной физической активности;

функциональная способность переносить физическую нагрузку (УО₂ тах и УО₂ тах АТ), время упражнения, необходимое для вызывания ишемии, измеряемое как время до достижения >1 мм депрессии сегмента 8Т, произведение давления на пульс (КРР), частота сердечных сокращений, кровяное давление и тенденции изменения сегмента 8Т, измеренные с помощью электроники в точке 1+60 мс, продолжительность упражнения, оценка Дьюка на бегущей дорожке, непрерывный мониторинг показателей жизненно важных функций, включая ЭКГ в 12 отведениях и УО2, причем УО2тах определяется как УО2 при максимальном уровне нагрузки, который отдельный пациент в состоянии достичь (дыхательное отношение >1, анаэробный порог);

относительный индекс крутизны пика (КР81);

полученное с помощью эффекта Допплера максимальное систолическое ускорение [АССтах].

1.2.8. Статистические расчеты.

Главным параметром эффективности является функциональная способность переносить физическую нагрузку, измеряемая пиковым объемом поглощения кислорода (УО₂ тах) и максимальным поглощением кислорода при анаэробном пороге (УО2 тах АТ) в стандартизированном испытании на бегущей дорожке (&ЕТТ). Мы предполагаем, что различий в изолинии нет, но группы, принимающие нитроглицерин, имеют значительно более высокие значения в последующем периоде.

Статистические методы.

Существуют два основных источника отклонений, рассматриваемых в данном испытании: эффекты лечения нитроглицерином и эффекты активной тренировки/пассивной тренировки/консервативной терапии. Соответственно данные будут проанализированы с помощью двухфакторного дисперсионного анализа. Любые эффекты терапии, не относящиеся к нитроглицерину, будут отмечаться описательным образом без статистических выводов.

Для вторичных параметров по обстоятельствам будут применяться параметрические или непараметрические тесты.

Объем/мощность выборки.

Для того чтобы установить необходимый объем выборки для предложенного двухфакторного дисперсионного анализа, мы сделали следующие предположения (основываясь на литературном обзоре и внутренних данных): статистическая мощность = 80%, среднеквадратичное отклонение для измерения результата = 15% среднего, величина эффекта (групповое различие в изменении между группой, принимающей нитроглицерин, и группой, не принимающей нитроглицерин) = 5% среднего. Мощность была установлена в ходе моделирования по методу Монте-Карло с использованием 10000 повторений на объем выборки в диапазоне значений п для группы от 30 до 60 пациентов. Это моделирование установило минимальный объем выборки 48 субъектов на группу, чтобы учесть потенциальные выпадения, мы предлагаем включать 50 субъектов на группу, что приводит к полному объему выборки 300 пациентов.

1.3. Этические и юридические аспекты.

Исследователи планируют и проводят любые эксперименты, включающие людей, включающие идентифицируемые образцы, взятые у людей, а также идентифицируемые данные, в соответствии с:

(a) Хельсинкской Декларацией (Этические принципы медицинских исследований, затрагивающих человеческие существа), принятой Всемирной Медицинской Ассоциацией (АМА) в июне 1964 г., в ее последней редакции;

(b) Согласованным Трехсторонним Руководством Международной конференции по гармонизации (1СН): Руководство по надлежащей клинической практике Е6/Международная конференция по вопросам гармонизации технических требований для регистрации фармацевтических препаратов для человеческого использования (1СН Е6, 1 мая 1996 г.), а также

- 27 032534 (с) применимыми немецкими нормативными документами (например, Лг/пс1тШс1дс5с1/. законы о наркотиках) в их текущих формах, а также применимыми нормативными документами ΕΌΑ (например, Руководство для спонсоров и исследователей по элементам информированного согласия, 21 ΟΕΚ § 50.25(с).

5. Список сокращений.

ΑΟΟ^: полученное с помощью эффекта Допплера максимальное систолическое ускорение;

ΑγΙ. Νβΐ.: сетевые субподрядчики СТЕ;

САЭ: заболевание коронарной артерии, ишемическая болезнь сердца;

ΟαΓάίοΑοοβΙ®: персонифицированная терапия контрпульсации;

СО: Канадское классификационное общество (классификация стенокардии);

СТЕ: технологический кампус Фрайбурга;

Εδδ: сдвиговое напряжение жидкости;

ΟΤΝ: глицерилтринитрат, нитроглицерин;

ΙΑΒΡ: внутриаортальный баллонный насос;

ΝΥΗΑ: Нью-Йоркская Ассоциация Сердца;

ΚΡδΙ: относительный индекс крутизны пика;

&ΕΤΤ: стандартизированное упражнение на бегущей дорожке;

δΜΟ сосудистая гладкомышечная клетка;

νθ₂ таx: пиковый объем поглощения кислорода;

νθ₂ таx ΑΤ: максимальное поглощение кислорода при анаэробном пороге.

Изобретение дополнительно относится к следующим объектам.

1. Способ лечения или предотвращения артериальной недостаточности, в котором донор оксида азота назначается субъекту прерывистым образом в количестве, эффективном для индукции артериогенеза.

2. Способ в соответствии с п.1, в котором артериальная недостаточность происходит из-за недостаточного снабжения кислородом или недостаточного кровоснабжения ткани, снабжаемой артерией или обходным анастомозом или шунтом во время физического покоя или во время физической активности.

3. Способ по любому из пп.1 или 2, в котором артериальная недостаточность происходит из-за увеличенного потребления кислорода или увеличенного кровоснабжения ткани, снабжаемой артерией или обходным анастомозом или шунтом.

4. Способ по любому из пп.1-3, в котором артериальная недостаточность характеризуется частичной или полной окклюзией артериального сосуда.

5. Способ по любому из пп.1-4, в котором артериальная недостаточность происходит из-за отложения материала в кровеносных сосудах.

6. Способ по любому из пп.1-5, в котором артериальная недостаточность происходит из-за внешней или внутренней компрессии артерии.

7. Способ по любому из пп.1-6, в котором артериальная недостаточность представляет собой сосудистое заболевание.

8. Способ по любому из пп.1-6, в котором артериальная недостаточность представляет собой болезнь, выбранную из группы, состоящей из атеросклероза, ишемической болезни и дополнительного хронического артериального заболевания.

9. Способ по любому из пп.1-6, в котором артериальная недостаточность представляет собой коронарную артериальную недостаточность.

10. Способ по любому из пп.1-6, в котором артериальная недостаточность представляет собой мозговую артериальную недостаточность.

11. Способ по любому из пп.1-6, в котором артериальная недостаточность представляет собой периферическую артериальную недостаточность.

12. Способ по любому из пп.1-6, в котором артериальная недостаточность представляет собой кишечную артериальную недостаточность.

13. Способ по любому из пп.1-6, в котором артериальная недостаточность представляет собой мочеполовую артериальную недостаточность.

14. Способ по любому из пп.1-6, в котором артериальная недостаточность представляет собой нервную артериальную недостаточность.

15. Способ по любому из пп.1-6, в котором артериальная недостаточность находится в контексте склеродермии.

16. Способ по любому из пп.1-6, в котором артериальная недостаточность представляет собой недостаточность центральной артерии сетчатки.

17. Способ по любому из пп.1-16, в котором артериальная недостаточность характеризуется отсутствием эндотелиальной дисфункции.

18. Способ по любому из пп.1-17, в котором донор оксида азота представляет собой оксид азота, нитропруссид натрия (пентацианонитрозо-железо(3)кислый натрий), нитроглицерин (глицерилтринитрат), изосорбидмононитрат, изосорбиддинитрат, тетранитрат пентаэритрита (ΡΕΤΝ), молсидомин, амил

- 28 032534 нитрит или никорандил.

19. Способ по любому из пп.1-6, в котором донор оксида азота представляет собой донор оксида азота короткого действия.

20. Способ по любому из пп.1-19, в котором донор оксида азота представляет собой нитроглицерин.

21. Способ по любому из пп.1-19, в котором донор оксида азота принимается по меньшей мере один раз в день и по меньшей мере один день в неделю в течение по меньшей мере двух недель.

22. Способ по любому из пп.1-21, в котором донор оксида азота принимается в течение нескольких недель или месяцев.

23. Способ по любому из пп.1-22, в котором донор оксида азота принимается в комплексе с экзогенной стимуляцией пульсирующих усилий сдвига в артерии.

24. Способ в соответствии с п.23, в котором донор оксида азота принимается в интервале времени от 30 мин до начала экзогенной стимуляции и до 30 мин после завершения экзогенной стимуляции.

25. Способ в соответствии с п.24, в котором донор оксида азота принимается в интервале времени от 15 мин до начала экзогенной стимуляции и до 30 мин после завершения экзогенной стимуляции.

26. Способ по любому из пп.23-25, в котором упомянутая стимуляция достигается физическими упражнениями или применением эндогенной силы к артериальному сосуду.

27. Способ по любому из пп.1-26, который нацелен на профилактику упомянутой артериальной недостаточности.

28. Способ по любому из пп.1-27, в котором донор оксида азота назначается лингвально, сублингвально, ингаляторно, трансбуккально, трансмукозально или оромукозально.

29. Донор оксида азота для применения в способе для профилактики или лечения артериальной недостаточности, который назначается прерывистым образом в количестве, эффективном для индукции артериогенеза.

30. Донор оксида азота для применения в соответствии с п.29 с признаками по любому из пп.2-28.

31. Способ подавления отрицательных эффектов, связанных с любым лечением артериальной недостаточности, которое является антиартериогенным или ингибирующим артериогенез, включающий назначение субъекту, подвергнутому упомянутому лечению, донора оксида азота в таком количестве и таким образом, которые являются эффективными для индукции артериогенеза.

32. Донор оксида азота для применения в способе подавления отрицательных эффектов, связанных с любым лечением артериальной недостаточности, которое является антиартериогенным или ингибирующим артериогенез, где донор оксида азота назначают субъекту, подвергнутому упомянутому лечению, в таком количестве и таким образом, которые являются эффективными для индукции артериогенеза.

33. Донор оксида азота для применения в соответствии с п.32 или способ по п.32 с признаками по любому из пп.2-28.

34. Способ для предотвращения или лечения аритмии сердца, в котором донор оксида азота назначают субъекту в таком количестве и таким образом, которые являются эффективными для лечения упомянутой аритмии сердца.

35. Способ в соответствии с п.34 с признаками по любому из пп.18-28.

36. Донор оксида азота для применения в способе для предотвращения или лечения аритмии сердца, где донор оксида азота назначают субъекту в таком количестве и таким образом, которые являются эффективными для лечения упомянутой аритмии сердца.

37. Донор оксида азота для применения в соответствии с п.36 с признаками по любому из пп.18-28.

38. Способ стимуляции коллатерального кровообращения, включающий стадию воздействия на субъект терапевтически эффективного количества донора оксида азота, в котором терапевтически эффективное количество донора оксида азота стимулирует артериогенез, достаточный для того, чтобы увеличить коллатеральное кровообращение в физиологическом или патологическом состоянии.

39. Способ в соответствии с п.38, в котором субъект страдает артериальной недостаточностью.

40. Способ в соответствии с п.39 с признаками по любому из пп.2-28.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ профилактики или лечения артериальной недостаточности, включающий введение нитроглицерина в количестве от 0,1 до 8 мг/день прерывистым образом лингвально, сублингвально, ингаляторно, трансбуккально, трансмукозально или оромукозально по меньшей мере один раз в день и по меньшей мере пять дней в неделю в течение по меньшей мере двух недель.
2. Способ по п.1, где артериальная недостаточность характеризуется частичной или полной окклюзией артериального сосуда.
3. Способ по любому из пп.1 или 2, где артериальная недостаточность происходит из-за внешней или внутренней компрессии артерии.
4. Способ по любому из пп.1-3, где артериальная недостаточность представляет собой сосудистое заболевание.

- 29 032534
5. Способ по любому из пп.1-3, где артериальная недостаточность представляет собой болезнь, выбранную из группы, состоящей из атеросклероза, ишемической болезни и дополнительного хронического артериального заболевания.
6. Способ по любому из пп.1-3, где артериальная недостаточность представляет собой коронарную артериальную недостаточность, мозговую артериальную недостаточность, периферическую артериальную недостаточность, кишечную артериальную недостаточность, мочеполовую артериальную недостаточность, нервную артериальную недостаточность.
7. Способ по любому из пп.1-6, где нитроглицерин вводят в течение нескольких недель или месяцев.
8. Способ по любому из пп.1-7, где нитроглицерин вводят в комплексе с экзогенной стимуляцией пульсирующих усилий сдвига в артерии.
9. Способ по п.8, где нитроглицерин вводят в интервале времени от 30 мин до начала экзогенной стимуляции и до 30 мин после завершения экзогенной стимуляции.
10. Способ по любому из пп.8 или 9, где указанная стимуляция достигается физическими упражнениями или применением эндогенной силы к артериальному сосуду.
11. Способ по любому из пп.1-10, где способ нацелен на профилактику артериальной недостаточности.
12. Способ подавления отрицательных эффектов, связанных с лечением артериальной недостаточности, которое является антиартериогенным или ингибирующим артериогенез и представляет собой лечение ацетилсалициловой кислотой (А8А), антагонистом гликопротеина 11Ь/111а или этанерцептом, включающий введение нитроглицерина в количестве от 0,1 до 8 мг/день по меньшей мере один раз в день и по меньшей мере пять дней в неделю в течение по меньшей мере двух недель.
13. Применение нитроглицерина прерывистым образом для индукции артериогенеза.