TWI650326B - 醫藥組合物、化合物的用途及合成方法 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容提供一種釋放一氧化氮之化合物，具有式(I)之結構： 本揭示內容並提供一種醫藥組合物，包含式(I)之化合物和載劑。本揭示內容並提供式(I)之化合物之用途，其係用於釋放一氧化氮，以及用於製備治療疾病之藥物，其中疾病為糖尿病、傷口、末端循環不良、心肌梗塞、或腦中風。本揭式內容並提供式(I)之化合物的合成方法。

Description

醫藥組合物、化合物的用途及合成方法
本揭露內容係有關於一氧化氮釋放劑。
一氧化氮(NO)是生物體內重要的訊息傳導分子和效應分子，與許多生理和病理過程相關，具有廣泛的生理功能，例如，血管舒張、調控免疫反應、神經傳遞、細胞死亡、血管新生、促進內皮細胞生長、和傷口癒合等。
不同濃度的一氧化氮對生理過程的調節機制極為不同，例如低濃度的一氧化氮可促進細胞生長，而高濃度的一氧化氮則會導致細胞死亡。由於一氧化氮為半衰期短的自由基，為了達到治療的效果，一氧化氮必須有足夠量存在於作用部位中。但是，如果過量施用於接受者，可能會產生副作用。
由於一氧化氮性質不穩定，故其很難直接應用到生物個體中。一氧化氮釋放劑，或稱一氧化氮供體(NO donor)，是指一類在體內經由酶反應或非酶作用釋放一氧化氫的化合物，具有存儲和提供一氧化氮的功能。一氧化氮 釋放劑之化合物可以消除一氧化氮本身的缺點，例如難以攜帶、難以定量、半衰期短等，因此具有廣泛的應用價值。
目前一些促進血管增生及傷口癒合的一氧化氮釋放劑，如精胺(Spermine，簡稱SP)、二乙烯三胺(diethylenetriamine，簡稱DETA)、1-(羥基-亞硝酸氮-氧化偶氮基)-L-脯氨酸二鈉(Proli NONOate，簡稱Proli)、羥基二氮烯磺酸-1-氧化物二鈉鹽(Sulpho NONOate，簡稱Sulpho)、1-羥基-2-氧代-3-(N-甲基-6-氨基己基)-3-甲基-1-三氮烯(MAHMA NONOate，簡稱MAHMA)、及N-[雙(3-氨基丙基)氨基]-N-羥基亞硝酰胺(DPTA NONOate，簡稱DPTA)，主要是利用電子轉移形成並釋放一氧化氮；這些藥物在體內有不同程度的半衰期，且釋放一氧化氮的效率會隨著作用環境變異而改變。
此外，目前已知的一氧化氮釋放劑化合物類型大致可分為四類：二醇二氮烯翁類、亞硝基硫醇類、硝基苯類衍生物、和金屬亞硝酰配合物。其中，二醇二氮烯翁類供體的性質不穩定，在到達作用目標前，就可能在血液循環過程中分解釋放大量的一氧化氮。亞硝基硫醇類供體的穩定性亦欠佳。硝基苯類衍生物之供體在生理條件下熱力學性質穩定且在光激發下可釋放一氧化氮，但是其需要高能紫外光激發才能釋放一氧化氮。金屬亞硝酰配合物，例如魯森鹽和硝普化鈉等具有光照釋放一氧化氮的性能，但是穩定性較差，在生理條件溶液中易發生水解，且此類供體在體內也會迅速代謝為有毒的氰化物，因此極大限制了使用範圍。
因此，目前極需發展釋放一氧化氮之化合物，可直接釋放一氧化氮分子，具較高的穩定性，且化合物的其餘部分不會在生物體內代謝成高毒性分子。
本揭露內容之一實施方式為提供一種釋放一氧化氮之化合物，具有式(I)之結構：
本揭露內容之一實施方式為一種醫藥組成物，包含式(I)之化合物和載劑。
本揭露內容之一實施方式為一種式(I)之化合物之用途，其係用於釋放一氧化氮。
本揭露內容之一實施方式為一種式(I)之化合物之用途，其係用於製備治療疾病之藥物，其中該疾病為糖尿病、傷口、末端循環不良、心肌梗塞、或腦中風。
本揭露內容之一實施方式為提供一種合成式(I)之化合物的方法，包含：使五羰基鐵與亞硝酸鈉和18- 冠醚-6反應生成三羰基亞硝基鐵；以及將三羰基亞硝基鐵與四氟硼酸亞硝反應，之後加入2-巰基乙醇反應，而得到式(I)之化合物。
第1圖為根據本揭露內容之化合物的X-ray單晶繞射三維分子結構圖。
第2圖為根據本揭露內容之化合物的紅外線吸收光譜。
第3A圖至第3F圖為根據一實驗例之細胞的顯微鏡影像，其中第3A圖至第3C圖為添加RRE-1之細胞影像，第3D圖至第3F圖為控制組，為無添加RRE-1之細胞影像。第3A圖及第3D圖為螢光影像，第3B圖及第3E圖為明視野影像。 第3C圖為第3A圖與第3B的合併影像。第3F圖為第3D圖與第3E圖之合併影像。
第4圖為根據一實驗例之長條圖，以不同的一氧化氮釋放劑測試細胞存活率。
第5A圖至第5H圖為根據一實驗例之影像，分別以不同的一氧化氮釋放劑加入細胞後1小時內所拍攝的影像。
第6A圖至第6H圖分別為第5A圖至第5H圖中的細胞，於各一氧化氮釋放劑加入細胞後第24小時所拍攝的影像。
第7A圖為根據一實驗例之長條圖，以不同的一氧化氮釋放劑測試細胞發展程度。
第7B圖為根據一實驗例之長條圖，以不同的一氧化氮釋放劑測試細胞發展程度。
第7C圖為根據一實驗例之長條圖，以不同的一氧化氮釋放劑測試細胞發展程度。
第8A圖至第8I圖為根據一實驗例之影像，為體外測試傷口癒合能力，分別以不同的一氧化氮釋放劑加入細胞後1小時內所拍攝的影像。
第9A圖至第9I圖分別為第8A圖至第8I圖中的細胞，於各一氧化氮釋放劑加入細胞後第24小時所拍攝的影像。
第10圖為根據第9A圖至第9I圖之影像量化後的長條圖。
第11圖為根據一實驗例之長條圖，顯示第9A圖至第9I圖的細胞之細胞存活率。
第12圖為根據一實驗例之西方轉印法之影像。
第13圖為根據一實驗例之長條圖，以不同的一氧化氮釋放劑，測試小鼠的血管新生。
第14A圖至第14E圖為根據一實驗例之斑馬魚胚胎影像，測試斑馬魚的血管新生，加入不同的一氧化氮釋放劑後1小時內所拍攝的影像。
第15A圖至第15E圖分別為第14A圖至14E圖中的斑馬魚胚胎，加入不同的一氧化氮釋放劑後第24小時內所拍攝的影像。
第16A圖至第16E圖分別為第14A圖至14E圖中的斑馬魚胚胎，加入不同的一氧化氮釋放劑後第48小時內所拍攝的影像。
第17圖為根據第14A圖至第14E圖、第15A圖至第15E圖、以及第16A圖至第16E圖之影像量化後的長條圖。
第18A圖至18E圖為根據一實驗例之影像，以不同的一氧化氮釋放劑，測試雞胚胎的血管新生。
第19A圖至第19E圖分別為第18A圖至第18E圖的局部放大影像。
第20圖為根據第18A圖至18E圖之影像量化後的長條圖。
第21圖為根據一實驗例，小鼠之體重紀錄圖。
第22A圖至第22F圖為根據一實驗例，染eNOS抗體之組織切片的影像，其中第22A圖至第22C圖之組織來自缺血下肢，第22D圖至第22F圖之組織來自非缺血下肢。
第23A圖至第23H圖為根據一實驗例之組織影像，下肢缺血的糖尿病小鼠給予RRE-1，之後組織切片分別染CD31抗體、抗CD34抗體、MMP-11抗體和VEGFA抗體。其中第23A圖至第23D圖之組織來自缺血下肢，第23E圖至第23H圖之組織來自非缺血下肢。
第24A圖至第24H圖為根據一實驗例之組織影像，下肢缺血的糖尿病小鼠給予VEGF，之後組織切片分別染CD31抗體、抗CD34抗體、MMP-11抗體和VEGFA抗體。其中 第24A圖至第24D圖之組織來自缺血下肢，第24E圖至第24H圖之組織來自非缺血下肢。
第25A圖至第25H圖為根據一實驗例之組織影像，下肢缺血的糖尿病小鼠給予磷酸鹽緩衝溶液(PBS)，之後組織切片分別染CD31抗體、抗CD34抗體、MMP-11抗體和VEGFA抗體。其中第25A圖至第25D圖之組織來自缺血下肢，第25E圖至第25H圖之組織來自非缺血下肢。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文將參照附隨圖式來描述本發明之實施方式與具體實施例；但這並非實施或運用本揭示內容具體實施例的唯一形式。以下所揭示的各實施例，在有益的情形下可相互組合或取代，也可在一實施例中附加其他的實施例，而無須進一步的記載或說明。
在本文及圖式中，以RRE-1代表式(I)之化合物：
在一實施方式中，提供一種釋放一氧化氮之化合物，具有式(I)之結構。在一實施例中，式(I)之化合物可溶於水或含水溶液，並於溶液中釋放一氧化氮。
在一實施方式中，提供一種醫藥組合物，以RRE-1為有效成份，且包含醫藥學上可接受的載劑。載劑可視投藥所需之製劑形式採用多種形式。
在一實施方式中，醫藥組合物的製劑型式，可為注射劑型、口服劑型、外用軟膏、皮膚貼片、或傷口敷料。
在一實施方式中，醫藥組合物為注射劑型，其中載劑為水或含水溶液，例如：生理食鹽水或磷酸鹽緩衝水溶液。以靜脈注射的方式，將含RRE-1之醫藥組合物輸入接受者體內。
在一實施方式中，含RRE-1之醫藥組合物可應用於人類或動物，例如家畜、家禽或寵物。動物可為脊椎動物，例如魚類、爬蟲類、兩生類、鳥類或哺乳類。
在一實施方式中，由於RRE-1為一氧化氮釋放劑，因此可使用含RRE-1之醫藥組合物，促進接受者體內與一氧化氮相關的生理功能，例如促進接受者的血管新生，血管舒張，或內皮細胞增生。
在一實施方式中，由於RRE-1為一氧化氮釋放劑，因此可製備含RRE-1之藥物，以治療臨床上以一氧化氮釋放劑治療之疾病，例如：糖尿病、傷口、末端循環不良、心肌梗塞、或腦中風。
製備RRE-1。
在一實施方式中，RRE-1可以按照以下過程實現：
RRE-1之製備包含兩個主要過程：
(a)使五羰基鐵(Fe(CO)5)與亞硝酸鈉(NaNO2)和18-冠醚-6(18-crown-6-ether)反應生成三羰基亞硝基鐵([Fe(CO)3(NO)]-)。
(b)將三羰基亞硝基鐵([Fe(CO)3(NO)]-)與四氟硼酸亞硝(NOBF4)反應，之後加入2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)反應，所得的產物為RRE-1。
RRE-1之製備步驟詳述如下：
步驟1：秤取亞硝酸鈉(NaNO2)(0.311g，4.5mmol)及18-冠醚-6(18-crown-6-ether)(1.189g，4.5mmpl)置於充滿氮氣的舒倫克管(Schlenk tube)中，加入四氫呋喃(tetrahydrofuran,THF)(15mL)攪拌一分鐘後冰浴，並持續攪拌。以塑膠針筒抽取五羰基鐵(Fe(CO)5)(0.26mL)打入舒倫克管內，上層液顏色由透明轉成深黃色的三羰基亞硝基鐵([Fe(CO)3(NO)]-)，測其紅外線(infrared；IR)光譜吸收1978s，1875vs，1650s cm-1(THF)。
步驟2：接著加入四氟硼酸亞硝(NOBF4)(0.526g，4.5mmol)並持續在冰浴下炔速攪拌至不在產生氣體。將舒倫克管中紅色溶液抽至另一浸泡在液態氮下的舒倫克管中，測其紅外線光譜吸收2088s，2038vs，1806s，1760vs cm-1(THF)。
步驟3：以塑膠針筒抽取2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)(0.32mL)打入舒倫克管，連接油 管，並在室溫下攪拌，溶液由橘色轉變成紅棕色，反應6小時後，氣體不再產生，測其紅外線光譜吸收1749s，1774s，1809vw cm-1(THF)。
步驟4：接著抽乾，回溶四氫呋喃(15mL)，打入純氧，攪拌5分鐘，過濾至另一個已經脫氣(degas)好的舒倫克管中，然後再抽乾一次。用正己烷(Hexane)洗成固體，並去除上層液後抽乾，可得到紅棕色的RRE-1固體。
之後，可於醚與正己烷(Ether/Hexane)中以雙層(double layer)的方式養晶，在-20℃下5天後長出紅棕色塊狀結晶(0.193g，0.5mmol)，產率50%。所得產物以二甲基亞碸(DMSO)：磷酸鹽緩衝溶液(PBS)=1：99混合液配置進行後續測試。
將RRE-1之X-ray單晶繞射分析結構，可得鑑定結果如下：Fe1...Fe1A2.706(1)；Fe1-N(1)1.672(4)；Fe-N(2)；Fe1-S1 2.254(1)；Fe1-S1A 2.261(1)；N1-Fe-N2 117.95(17)；N1-Fe-S1 105.49(13)；N2-Fe-S1 110.51(14)；N1-Fe-S1A 110.18(13)；N2-Fe-S1A 105.83(14)；S1-Fe-S1A 106.38(4)；N1-Fe1-Fe1A120.72(13)；N2-Fe1-Fe1A121.33(13)；S1-Fe1-Fe1A53.31(4)；S1A-Fe1-Fe1A53.07(4)。請參看第1圖，為RRE-1的X-ray單晶繞射三維分子結構圖。
請參看第2圖，為RRE-1之紅外線吸收光譜，用以進行特性官能機之鑑定。第2圖顯示IR吸收光譜的兩個峰值：1781.59及1755.81。此外，水相下的紅外線(IR)光 譜特性吸收如下：IR νNO：1809vw,1774s和1749s cm-1(νNO)(THF)；IR νNO：1814vw,1783s,1755s cm-1(D2O)。
由上述實驗結果證實所得產物RRE-1具有式(I)的結構。
以下通過一些實驗例，證明RRE-1可釋放一氧化氮於細胞中。並且以體外細胞實驗及體內動物實驗，測試RRE-1與目前已知的其他一氧化氮釋放劑對於血管新生及傷口癒合的效果。所測式的其他一氧化氮釋放劑為精胺(Spermine，簡稱SP)、二乙烯三胺(diethylenetriamine，簡稱DETA)、1-(羥基-亞硝酸氮-氧化偶氮基)-L-脯氨酸二鈉(簡稱Proli)、羥基二氮烯磺酸-1-氧化物二鈉鹽(簡稱Sulpho)、1-羥基-2-氧代-3-(N-甲基-6-氨基己基)-3-甲基-1-三氮烯(簡稱MAHMA)、N-[雙(3-氨基丙基)氨基]-N-羥基亞硝酰胺(簡稱DPTA)，以及血管內皮生長因子(VEGF)。
本揭露內容之細胞實驗所選取的細胞株為EAHY926(人類血管內皮細胞株)，小鼠動物實驗所選取的品種為BALB/c Nude小鼠。
實驗例1 RRE-1釋放一氧化氮的能力。
取EAHY926細胞種植於蓋玻片上生長24小時後，添加劑量濃度7.8μM的RRE-1及一氧化氮探針(FAOMe)。於一氧化氮釋放劑添加後第4小時，再以磷酸鹽緩衝溶液清洗3次，以4%甲醛(formaldehyde)於室溫下固 定30分鐘，最後將蓋玻片以磷酸鹽緩衝溶液和甘油(1：1)混合液固定於玻片上，以共軛焦螢光顯微鏡進行觀測。
請參看第3A圖至第3F圖，為利用一氧化氮探針(FAOMe)進行標定顯影後的影像。其中第3A圖至第3C圖為添加RRE-1之細胞，第3D圖至第3F圖為控制組，為無添加RRE-1之細胞。第3A圖至第3C圖顯示添加RRE-1之組別的細胞有FAOMe之綠色螢光訊號。第3D圖至第3F圖顯示對照組的細胞內無綠色螢光訊號。因此，可證實RRE-1確實為一氧化氮釋放劑，可有效地釋放一氧化氮於細胞中。
實驗例2 細胞存活率分析。
本實驗以3-(4，5-二甲基噻唑-2)(4，二甲基噻唑-2)2，5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide；簡稱MTT)測試細胞的存活率。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用於活細胞粒線體中的呼吸鏈，在琥珀酸去氫酶(SDH)和細胞色素C的作用下會使得tetrazolium環開裂而生成藍色結晶，結晶的生成量與活細胞數目成正比(死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原)。可利用測O.D.值得知細胞還原MTT的能力來間接代表細胞存活率。
實驗方法為利用各濃度之一氧化氮釋放劑：精胺、DETA、Proli、Sulpho、MAHMA、DPTA、RRE-1及VEGF，與EAHY926細胞於37℃環境下共培養24小時，並評估其細胞存活率與最低有效劑量。
請參看第4圖，顯示在15.6μM濃度以下，各種一氧化氮釋放劑中以RRE-1促進細胞生長效果最顯著。尤其在測試劑量濃度7.8μM時，RRE-1的效果最佳，其次是DPTA及MAHMA。此外，臨床用藥血管內皮生長因子(VEGF)在各濃度作用下，促進細胞生長之效果並未比其他商品化之一氧化氮釋放劑有效果。
實驗例3 細胞發展指數分析(Cell development index assay)。
將EAHY926細胞種植於細胞培養皿中於37℃進行培養。待細胞數約三成滿時置換新的培養液並各別添加劑量濃度7.8μM之各種一氧化氮釋放劑：精胺、DETA、Proli、Sulpho、MAHMA、DPTA、RRE-1及VEGF。於一氧化氮釋放劑添加後1小時內及第24小時進行顯微鏡拍照，之後影像使用「Angiogenesis Analyzer for ImageJ」軟體分析細胞發展指數。其中分析的項目包含：細胞網孔(cell meshes)、細胞間連結數(cell junctions)及細胞分支數(cell branch)。
請參看第5A圖至第5H圖，及第6A圖至第6H圖。細胞發展程度分析中以藍色及綠色線條評估為細胞間連結之分支線(cell branch)，當細胞生長情況越發達時該線條就越多。此外，當細胞分支數越來越發達時將進一步以黃色線條來表示。隨著細胞發展程度越高時，細胞間的連接數(cell junctions)(紫色圓點)也就越多。甚至細胞間能圍起多個圓圈(水藍色線條)我們稱之為細胞網孔(cell meshes)。第6A圖至第6H圖顯示，細胞發展程度以RRE-1(第6G圖)處理組最高。
請參看第7A圖至第7C圖，是進一步將細胞網孔(cell meshes)、細胞間連結數(cell junctions)及細胞分支數(cell branch)進行量化，結果顯示，無論在細胞網孔、細胞間連結數及細胞分支數皆以RRE-1效果最顯著。其中，第7A圖顯示細胞網孔生成數的排序為RRE-1>DETA>Proli。第7B圖顯示細胞間連結生成數的排序為RRE-1>DETA>VEGF>Proli。第7C圖顯示細胞分支生成數的排序為RRE-1>DETA>精胺>VEGF。
從上述結果可得知，各種一氧化氮釋放劑促進細胞增長的效果皆不同，但是在細胞存活率與細胞發展程度指標皆以RRE-1的效果最為顯著。
實驗例4 細胞傷口癒合能力分析(Wound healing assay)。
將EAHY926細胞種植於細胞培養皿中於37℃進行培養。待細胞數約8成滿時置換新的培養液並各別添加劑量濃度7.8μM一氧化氮釋放劑：精胺、DETA、Proli、Sulpho、MAHMA、DPTA、RRE-1及VEGF。在細胞培養皿中刮出一道1毫米(mm)寬之線條，於1小時內及第24小時拍照記錄並量化傷口癒合之百分比。
請參看第8A圖至第8I圖，為各一氧化氮釋放劑加入細胞後1小時內所拍攝的影像。第9A圖至第9I圖分別為第8A圖至第8I圖中的細胞，於各一氧化氮釋放劑加入細胞 後第24小時所拍攝的影像，顯示細胞傷口癒合之百分比以RRE-1、VEGF、SP、DPTA及Proli效果較為顯著。
請參看第10圖，為第7A圖之影像量化的結果，顯示在傷口癒合的測試實驗中，以RRE-1的效果最為顯著。
本實驗例緊接著利用該分析之細胞培養皿加入MTT試劑來分析細胞總存活率之分析，結果如第11圖所示，RRE-1的總細胞存活率是所有組別中最高的，該結果與第4圖的結果吻合。第11圖的細胞存活率由高至低分別為：RRE-1>DPTA>MAHMA，該趨勢與第10圖的結果相似。
實驗例5 西方轉印分析(western blot assay)。
文獻中指出，NO釋放劑在體內環境具備促進血管新生及傷口癒合之潛力，也是能有效促進血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)表現之臨床用藥。因此本實驗欲測試各一氧化氮釋放劑對於血管新生相關之蛋白質(例如：TIE-2,和VEGFR-2)之表現的影響。因此，於細胞培養中分別添加不同的一氧化氮釋放劑，之後以西方轉印法分析TIE-2和VEGFR-2這兩種蛋白質的表現。
將EAHY926細胞種植於細胞培養皿中於37℃進行培養。待細胞數約8成滿時置換新的培養液並各別添加劑量濃度7.8μM一氧化氮釋放劑(RRE-1、RRE-2、SP、MAHMA和VEGF)，培養24小時後，反覆以磷酸鹽緩衝溶液清洗三次，加入250微升(μL)的細胞裂解液(lysis buffer)，以刮勺將細胞刮下後，萃取蛋白質進行西方轉印法實驗。
請參看第12圖，為以不同的一氧化氮釋放劑測試細胞之西方轉印之結果。第12圖顯示含有劑量濃度7.8μM之一氧化氮釋放劑與EAHY926細胞共培養24小時後，RRE-1誘發TIE-2及VEGFR-2蛋白質表現量增加之效果最為顯著。市售之一氧化氮釋放劑精胺及MAHMA及臨床用藥VEGF則僅誘發少量TIE-2及VEGFR-2蛋白質表現。
實驗例6小鼠活體血管新生分析(In vivo angiogenesis assay,DIVAA)。
本實驗是利用活體血管新生分析套組來進行，測試一氧化氮釋放劑：Spermine、DETA、sulpho、MAHA、DPTA、RRE-1和VEGF，其中VEGF為正對照組。
將免疫缺乏之裸鼠(每組數目為6隻)固定於手術台，並進行麻醉(1-3%異氟烷(isoflurane)/100%氧氣，流量1L/min)，待老鼠穩定後，以手術刀於老鼠背上左右各切開約1公分缺口，將細胞營養劑含有劑量濃度7.8μM一氧化氮釋放劑進行混合後充填至軟管，並埋植於老鼠背部，最後以生理食鹽水沖洗傷處並縫合。待20天後再將軟管取出並溶出管內之血紅素，利用ELISA分析儀檢測軟管內總血紅素之含量作為血管新生之相關性數值。
本實驗測試的一氧化氮釋放劑為精胺、DATE、Prole、Sulpho、MAHMA、DPTA、RRE-1及VEGF，控制組的條件為軟管內不加一氧化氮釋放劑。
第13圖顯示，含有劑量濃度7.8μM之各一氧化氮釋放劑在老鼠體內置放20天後，RRE-1可以明顯促進血管新生至軟管內，其次為VEGF及精胺。
由以上結果顯示，RRE-1無論在體外或體內各項試驗裡都充分具備細胞生長與血管增生之效果。甚至比臨床用藥之VEGF效果還顯著，因此可視為血管新生治療之臨床潛力藥物。
實驗例7 斑馬魚活體血管新生分析(In vivo angiogenesis assay,Zebrafish assay)。
本實驗利用帶有螢光基因Tg(fli1：EGFP)y1之斑馬魚進行活體血管新生分析，將斑馬魚營養劑分別添加劑量濃度7.8μM之各一氧化氮釋放劑。將斑馬魚於一氧化氮釋放劑之營養劑培養24至48小時。於培養後第0小時、第24小時及第48小時進行共軛焦顯微鏡拍照記錄，並進行斑馬魚卵囊區域新生血管之半定量分析。
本實驗測試的一氧化氮釋放劑為精胺、MAHMA、RRE-1及VEGF，控制組為營養劑中無添加一氧化氮釋放劑。
第14A圖至第14E圖為加入一氧化氮釋放劑後1小時內所拍攝的影像。第15A圖至第15E圖為加入一氧化氮釋放劑後第24小時內所拍攝的影像。第16A圖至第16E圖為加入一氧化氮釋放劑後第48小時內所拍攝的影像。斑馬魚卵囊區域新生血管為紅色箭頭所指之處。
第17圖顯示第14A圖至第14E圖、第15A圖至第15E圖、以及第16A圖至第16E圖之影像量化後的結果。第17圖顯示含有劑量濃度7.8μM之各一氧化氮釋放劑與斑馬魚共培養第24小時，以RRE-1及MAHMA效果較為顯著。在共培養第48小時則以RRE-1促進血管增生之效果最為顯著，其次為MAHMA。
以上結果中值得注意的是，臨床用藥之VEGF並未如預期中有效，甚至效果還比其他商品化之一氧化氮釋放劑還差。因此，就以上結果可驗證RRE-1在血管新生作用是非常有潛力的。
實驗例8 雞胚胎絨毛膜試驗(Chicken chorioallantoic membrane assays,CAM)。
在本實驗例中，將授精的雞蛋，氣室朝上置於孵蛋箱內的蛋架上，在孵蛋箱內進行孵化，孵化至第6天時，以檢卵器進行雞蛋篩選，將有孵化的授精雞蛋挑出。於雞蛋的氣室端(鈍端)及側邊各鑽一小孔，將7.8μM的一氧化氮釋放劑由小孔注入，並用已滅菌的濾膜覆蓋於氣室孔洞上，貼上透氣膠帶，置於孵蛋箱繼續培養，培養2天後將雞蛋撥開，放置於培養皿中觀察，並以照相機紀錄。
本實驗測試的一氧化氮釋放劑為RRE-1、精胺、MAHMA及VEGF，控制組為不加一氧化氮釋放劑於雞蛋中。
第18A圖至第18E圖為雞胚胎之影像，第19A圖至第19E圖分別為第18A圖至第18E圖的局部放大影像。 第20圖為對第18A圖至第18E圖之影像的量化結果。第20圖顯示，各一氧化氮釋放劑中，以RRE-1血管增生效果最為顯著，其次為MAHMA。臨床用藥VEGF的血管增生效果則與商品化之一氧化氮釋放劑精胺(Spermine)效果相似。
在以上研究結果顯示，RRE-1無論在體外(in vitro)與體內(in vivo)模式皆為血管增生效果最有效之組別，甚至在活體試驗中效果更比臨床用藥VEGF還要優越。
實驗例9 下肢缺血糖尿病鼠試驗(Diabetic mouse hindlimb ischemia model studies)。
本研究對糖尿病鼠實施下肢缺血手術，將糖尿病第二型老鼠(每組數目為6隻)固定於手術台，並進行麻醉(1-3%異氟烷/100%氧氣，流量1L/min)，待老鼠穩定後，將欲進行手術之區域剃毛。以手術刀從膝蓋處沿大腿內側切開約1公分缺口，以生理食鹽水及棉花沖洗，並移除大腿肌肉周圍之脂肪組織。待移除完成，股動脈裸露後，以7-0手術線分別將動脈上下兩端打結，以確保下肢缺血產生。最後以生理食鹽水沖洗傷處並縫合。待老鼠穩定恢復後，給予劑量濃度7.8μM一氧化氮釋放劑(RRE-1及VEGF)，進行體重紀錄，並於第6天及第21天犧牲糖尿病鼠，取其下肢組織切片進行免疫組織染色，分別觀察其血管新生相關蛋白質：eNOS、CD31、CD34、MMP-11及VEGFA之表現情形。本實驗中，以給予磷酸鹽緩衝溶液(PBS)為控制組。
由第21圖顯示，在實驗觀察期間，三個組別 (RRE-1、VEGF及PBS)之糖尿病鼠體重均為穩定上升，未因給予不同藥物而有差異，此結果顯示，RRE-1對於糖尿病鼠沒有明顯毒性及副作用產生。
第22A圖至第22F圖為染eNOS抗體之組織切片，其中第22A圖至第22C圖之組織來自缺血下肢，第22D圖至第22F圖之組織來自非缺血下肢。第22A圖至第22F圖顯示給予小鼠RRE-1，相較於給予VEGF，更能促進下肢缺血處組織的eNOS表現。
請參看第23A圖至第23H圖，為下肢缺血的糖尿病小鼠給予RRE-1，之後組織切片的染色結果。其中第23A圖至第23D圖之組織來自缺血下肢，第23E圖至第23H圖之組織來自非缺血下肢。
請參看第24A圖至第24H圖，為下肢缺血的糖尿病小鼠給予VEGF，之後組織切片的染色結果。其中第24A圖至第24D圖之組織來自缺血下肢，第24E圖至第24H圖之組織來自非缺血下肢。
請參看第25A圖至第25H圖，為下肢缺血的糖尿病小鼠給予磷酸鹽緩衝溶液(PBS)，之後組織切片的染色結果。其中第25A圖至第25D圖之組織來自缺血下肢，第25E圖至第25H圖之組織來自非缺血下肢。
將第23A圖至第23D圖與第24A圖至第24D圖比較，顯示給予RRE-1之小鼠，相較於給予臨床用藥VEGF之小鼠，有較為顯著之血管增生相關蛋白質CD31、CD34、VEGFA之表現。
以上結果證實，給予RRE-1可有效促進血管增生效果，其效果更比臨床用藥VEGF還要優越。
由上述本揭露內容之各實驗例，顯示RRE-1為一有效的一氧化氮釋放劑，並且相較於現行臨床使用的一氧化氮釋放劑，具有更佳的細胞增生效果，並且更能有效促進內皮細胞的發展，也有更佳的促進傷口癒合能力，以及促進血管新生的功效。
在臨床上，一氧化氮釋放劑的選用必須針對病理上所需之一氧化氮釋放短效或長效型條件來決定。以血管新生為例，目前已知不同的一氧化氮釋放劑在血管新生的作用上有不同效果，像是半衰期較短暫者具備較佳的細胞轉移與細胞生長之功效，半衰期較長者則對於血管的成熟與血管新生作用較有幫助。本揭露內容之RRE-1在細胞生長及血管新生之功效皆優於其他測試的一氧化氮釋放劑，顯示RRE-1於溶液中或動物體內時，即可較有效地釋放一氧化氮，並且此釋放一氧化氮的能力亦有較長的效期。因此，RRE-1為有效且穩定性高的一氧化氮釋放劑。
雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (8)

  1. 一種醫藥組成物，包含：一種釋放一氧化氮之化合物，該化合物為式(I)之結構：；以及一載劑，該載劑為水或水溶液；其中該醫藥組成物為注射治劑。
  2. 一種具有式(I)之結構的化合物的用途， ，其係用於製備治療疾病之藥物，其中該疾病為糖尿病、傷口、末端循環不良、心肌梗塞、或腦中風。
  3. 如請求項2所述之用途，其中該藥物用以釋放一氧化氮。
  4. 如請求項2所述之用途，其中該藥物用以促進血管新生，血管舒張，或內皮細胞增生。
  5. 如請求項2所述之用途，其中該藥物的接受者為人類或動物。
  6. 如請求項5所述之用途，其中該藥物經由靜脈輸入該接受者。
  7. 如請求項5所述之用途，其中該藥物用於該接受者的體內。
  8. 一種合成具有式(I)結構的化合物的方法 ，該方法包含：(a)使五羰基鐵與亞硝酸鈉和18-冠醚-6反應生成三羰基亞硝基鐵；以及(b)將三羰基亞硝基鐵與四氟硼酸亞硝反應，之後加入2-巰基乙醇反應，而得到該式(I)之化合物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114249773A (zh) * 2021-12-06 2022-03-29 苏州大学 释放一氧化氮的四价铂类化合物及其制备和应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW202306566A (zh) * 2021-08-07 2023-02-16 國立清華大學 口服之醫藥組成物之用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI382851B (zh) * 2009-09-16 2013-01-21 Univ Nat Chiao Tung 配位化合物及用於製備血池及目標化對比劑之金屬錯合物

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100247680A1 (en) 2007-06-15 2010-09-30 Csaba Szabo Compositions and Methods to Modulate Angiogenesis
PL2668947T3 (pl) * 2012-05-31 2017-06-30 G. Pohl-Boskamp Gmbh & Co. Kg Indukcja arteriogenezy donorem NO, takim jak nitrogliceryna
US20160256522A1 (en) 2015-03-05 2016-09-08 National Sun Yat-Sen University Method for enhancing wound healing
US10538545B2 (en) * 2017-01-24 2020-01-21 Chung Yuan Christian University Dinitrosyl iron complex, pharmaceutical composition comprising the same, composite material comprising the same, and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI382851B (zh) * 2009-09-16 2013-01-21 Univ Nat Chiao Tung 配位化合物及用於製備血池及目標化對比劑之金屬錯合物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Tsou et al, Journal of the American Chemical Society, 2014, 136, p9424-9433
Tsou et al, Journal of the American Chemical Society, 2014, 136, p9424-9433 Wu et al, Inorganic Chemistry, 2016, 55, p9383-9392 *
Wu et al, Inorganic Chemistry, 2016, 55, p9383-9392

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114249773A (zh) * 2021-12-06 2022-03-29 苏州大学 释放一氧化氮的四价铂类化合物及其制备和应用

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