TWI666214B - 雙亞硝基鐵錯合物、包含該錯合物之藥學組合物或複合材料及其用途 - Google Patents
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Abstract
本揭示內容是關於式(I)及式(II)之新穎化合物，其可作為一種用以傳遞一氧化氮的試劑，以及作為一種可治療與一氧化氮相關之疾病的治療藥劑。本揭示內容亦提供一種包含式(I)或式(II)化合物的藥學組合物、一種包含式(I)或式(II)化合物的複合材料，以及其用途。
Description
本揭示內容是關於治療與一氧化氮相關之疾病的領域。更具體來說，本揭示內容是關於二種雙亞硝基鐵錯合物(dinitrosyl iron complex, DNIC)，及其作為一氧化氮釋放試劑以治療與一氧化氮相關疾病及/或徴狀的用途。
一氧化氮(Nitric oxide、NO、nitrogen oxide或nitrogen monoxide)的化學式為●NO，其中●代表氮原子中未成對的電子。●NO參與調控多細胞生物體內不同的訊息傳遞路徑，包含血管、免疫及神經系統，而●NO的特性及產生位置會影響其生理及病理功能。●NO會與可溶性鳥苷酸環化酶(soluble guanylate cyclase, sGC)的血紅素中心作用，將GTP轉換為cGMP，進而活化與cGMP相關之血管舒張反應、與cGMP/MAPK相關之血管新生反應及與cGMP相關之神經傳遞物質的釋放。細菌的●NO可藉由調控線蟲(C. elegans
)體內hsf-1/daf-16
等基因表現，來增加其抗壓性及壽命。經由與核受體蛋白UNF及E75的作用，●NO亦可以濃度相關的方式來轉換調控神經元退化及軸突(axon)再生。在罹患亞歷山大氏症(Alexander disease，一種退化性神經疾病)的病患體內，由神經膠細胞(glia)所產生的●NO會誘發星狀細胞(astrocyte)造成神經元退化及死亡。
次硝酸(Nitroxyl、NO–
或azanone)是●NO的單電子還原形式。與●NO相似，NO–
亦可藉由活化sGC來促使血管舒張。此外，NO–
可增強心血管系統(特別是處於充血性心臟衰竭時的心血管系統)的心肌收縮作用(inotropic effect)，該收縮作用與β-腎上腺素性(β-adrenergic)的傳遞路徑無關。除了對心血管的作用外，已知NO–
亦可藉由抑制GAPDH的活性來產生抗腫瘤的功效。
基於上述生物功能，●NO及NO–
供體可作為一種治療與●NO及/或NO–
相關之疾病的藥劑。然而，目前的●NO/NO–
供體皆有其缺點，例如低活性、低溶解性、低專一性、半衰期短及會產生副作用，該些缺點侷限了該些供體於臨床上的應用性。有鑑於此，相關領域亟需一種新穎之具有●NO/NO–
釋放活性的化合物，可作為先導化合物來製備用以治療●NO/NO–
相關疾病的藥物。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
本揭示內容的第一態樣是關於一種如式(I)之化合物，(I)， 或其藥學上可接受的鹽類(salt)、溶劑化物(solvate)、衍生物(derivative)或先驅藥物(prodrug)。
依據本揭示內容某些實施方式，R是可經-OH、-COOH或-NH2
取代的C1-6
烷基或苯基，且x是一介於-2及+2之間的整數。例示性的R包含，但不限於-CH2
CH2
OH、-CH2
CH2
COOH、-CH2
CH3
、-C6
H5
COOH及-CH2
CH2
NH2
。依據一較佳實施例，R是-CH2
CH2
COOH，且x為0。
本揭示內容的第二態樣是關於一種如式(II)之化合物，(II)， 或藥學上可接受的鹽類、溶劑化物、衍生物或先驅藥物。
依據本揭示內容某些實施方式，R’是-NH2
、-NO2
、-CH3
或-C6
H5
，且y是一介於-2及+2之間的整數。較佳地，R’是-NH2
、-NO2
或-C6
H5
，且y為0。
本揭示內容亦提供一種可用以傳遞一氧化氮的藥學組合物及複合材料，藉以於個體產生延緩老化、延長壽命、促使血管舒張、誘發心肌舒張及收縮的功效，或治療個體體內與一氧化氮相關之疾病及/或徴狀。本發明藥學組合物包含， (a)一有效量之本發明式(I)或(II)化合物、其藥學上可接受的鹽類、溶劑化物、衍生物或先驅藥物；以及 (b)一藥學上可接受的賦形劑。
本發明複合材料包含一活性劑及一金屬有機骨架(metal-organic framework, MOF)，其中該金屬有機骨架具有一孔洞結構以包覆式(I)或式(II)化合物、其藥學上可接受的鹽類、溶劑化物、衍生物或先驅藥物。
本揭示內容的另一態樣是關於一種用以傳遞一氧化氮的方法，藉以於個體產生延緩老化、延長壽命、促使血管舒張、誘發心肌舒張及收縮的功效，或治療個體體內與一氧化氮相關之疾病及/或徴狀。依據本揭示內容某些實施方法，該方法包含對一有需要之個體投予一有效量之本發明任一種藥學組合物或複合材料。
例示性之可接受本發明方法治療的疾病包含，但不限於，心血管疾病(cardiovascular disease)、糖尿病(diabetes mellitus)、氣喘(asthma)、鐮形血球貧血症(sickle cell disease)、陽萎(impotence)、囊腫纖化症(cystic fibrosis)、幽門狹窄(pyloric stenosis)、慢性腎臟疾病(chronic kidney disease)、神經退化性疾病(neurodegenerative disorder)、癌症(cancer)、勃起功能障礙(erectile dysfunction)及感染性疾病(infectious disease)。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
本揭示內容所列之數值範圍包含不同數值及該範圍內的次範圍。舉例來說，「C1–6
」可包含C1
、C2
、C3
、C4
、C5
、C6
、C1-6
、C1-5
、C1–4
、C1–3
、C1–2
、C2–6
、C2–5
、C2–4
、C2–3
、C3–6
、C3–5
及C3–4
。
除非另有所指，否則「烷基」(alkyl)一詞是指一直鏈、支鏈及/或環狀(即「環烷基」(cycloalkyl))碳氫化合物，其係具有1到6個(例如1到6個、1到5個、1到4個、1到3個、1到2個，或1個)碳原子。將具有1到4個碳原子的烷基(C1–4
烷基)稱為「低碳數烷基」(lower alkyl)。例示性的烷基包含甲基(methyl)、乙基(ethyl)、丙基(propyl)、異丙基(isopropyl)、正丁基(n-butyl)、叔丁基(t-butyl)、異丁基(isobutyl)、2-異丙基-3-甲基丁基 (2-isopropyl-3-methyl butyl)、戊基(pentyl)、戊-2-基(pentan-2-yl)、己基(hexyl)及異己基(isohexyl)。例示性的環烷基包含環丙基(cyclopropyl)、環丁基(cyclobutyl)、環戊基(cyclopentyl)及環己基(cyclohexyl)。除非另有所指，否則各烷基可分別為包含非必要取代基的烷基，即可以是未經取代的烷基，或是具有一或多取代基的烷基。
除非另有所指，否則當用以闡述一化學結構或官能基時，「可經取代的」(substituted)一詞是指該化學結構或部分的衍生物，其中一或多個氫原子被一原子、化學部分或官能基所取代，例如，但不限於，-OH、-CHO、-COOH、-NH2
、烷氧基(alkoxy)、烷醯氧基(alkanoyloxy，例如-OAc) 、烯基、烷基(例如甲基、乙基、丙基、叔丁基)、芳香基(aryl)、芳氧基(aryloxy)、鹵素或鹵烷基(haloalkyl，例如-CCl3
、-CF3
、-C(CF3
)3
)。在一特定實施例中，當用以闡述一化學結構或官能基時，「可經取代的」(substituted)一詞是指一衍生物，其化學結構或官能基中一或多個氫原子可取代為一或多個：羥基、胺基或羧基。
除非另有所指，否則一或多個置於一系列名詞前的形容詞應視為用以形容各個名詞。舉例來說，「包含非必要取代基的烷基或苯基」應解讀為「包含非必要取代基的烷基或包含非必要取代基的苯基」。
在本揭示內容中，「一氧化氮」(nitric oxide或NO)是指一氧化氮的反應形式，特別是指(1)不帶電的一氧化氮(化學式為●NO)，(2)帶負電的一氧化氮(例如次硝酸，化學式為NO–
)，以及(3)帶正電的一氧化氮(例如亞硝，化學式為NO+
)。
在本揭示內容中，「先驅藥物」(prodrug)一詞是指任一種化合物，當投予至一生物系統後會經由自發性化學反應、酵素催化作用或代謝反應產生「藥物」(drug)物質。
「治療」(treating)一詞包含部份或完全預防、改善、減輕及/或處理與一氧化氮相關之病徵、次要病徵或症狀，其中是藉由增加一氧化氮的含量來使罹患或疑似患有相關病徵、疾病或症狀之個體獲得效益。「治療」(treating)一詞於此說明書中亦指應用或投予本揭示內容之一或多種化合物至一個體，其係患有與一氧化氮相關之病徵、次要病徵或症狀，以達到部份或完全減輕、減緩、治癒疾病、延遲發病、抑制病程發展、降低疾病嚴重性，及/或降低一或多個與一氧化氮相關之病徵、症狀、或次要病徵的發生。與一氧化氮相關之病徵、次要病徵及/或症狀包含，但不限於，心血管疾病、糖尿病、氣喘、鐮形血球貧血症、陽萎、囊腫纖化症、幽門狹窄、慢性腎臟疾病、神經退化性疾病、癌症、勃起功能障礙及感染性疾病。在此「治療」亦可以是投予至患有早期該些病徵或症狀之個體，以降低該個體發展成為與一氧化氮相關之病徵、次要病徵及／或症狀的風險。若可減少一個或多個病徵或臨床標記，則該治療為「有效」治療。或者是，若可降低、減緩或終止疾病病程、病徵或症狀的發展，則該治療為「有效」治療。
「有效量」(effective amount) 在此處係指一藥物的用量足以產生所欲的療效反應。具體的有效量取決於多種因素，如欲治療的特定狀況、患者的生理條件(如，患者體重、年齡或性別)、接受治療的哺乳動物或動物的類型、治療持續時間、目前療法(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。有效量亦指一種化合物或組合物，其治療利益效果超越其毒性或有害影響。舉例來說，可將有效量表示成藥物的總重量(譬如以克、毫克或微克為單位)或表示成藥物重量與體重之比例(其單位為毫克/公斤(mg/kg))。習知技藝者可依據動物模式的劑量來計算藥物(如本揭示內容之化合物)的人體等效劑量(human equivalent dose, HED)。舉例來說，習知技藝者可依據美國食品藥物管理局(US Food and Drug Administration, FDA)所公告之「估算成人健康志願者在初始臨床治療測式之最大安全起始劑量」(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)來估算人體使用之最高安全劑量。
「個體」(subject)一詞是指包含人類的動物，其係依據本揭示內容之方法，能接受本揭示內容之化合物的治療。除非特定指出，否則「個體」(subject)一詞同時意指男性及女性，且可以是任何年齡，例如兒童或成人。
本揭示內容提供二種化合物，該些化合物皆可作為一氧化氮釋放劑，以於個體產生延緩老化、延長壽命、促使血管舒張、誘發心肌舒張及收縮的功效，或治療個體體內與一氧化氮相關之疾病及/或徴狀。所述一氧化氮包含不帶電的一氧化氮(●NO)及帶電形式的一氧化氮(特別包含次硝酸 (NO–
)及亞硝(nitrosonium, NO+
))。第一種化合物具式(I)之化學結構：(I)， 其中R是可經-OH、-COOH或-NH2
取代的C1-6
烷基或苯基，且x是一介於-2及+2之間的整數。
依據本揭示內容實施方式，R是-CH2
CH2
OH、-CH2
CH2
COOH、-CH2
CH3
、-C6
H5
COOH或-CH2
CH2
NH2
。依據一實施例，R是-CH2
CH2
COOH，且x為0。
依據本揭示內容一實施方式，一旦投予至個體體內，所述第一種化合物可延緩個體的老化程度，並延長其壽命。依據本揭示內容另一實施方式，所述第一種化合物可引發個體的血管舒張及心肌舒張。
第二種化合物具有式(II)的化學結構：(II)， 其中R’是-NH2
、-NO2
、-CH3
或-C6
H5
，且y是一介於-2及+2之間的整數。依據本揭示內容較佳的實施方式， R’是-NH2
、-NO2
或-C6
H5
，且y為0。
依據本揭示內容一實施方式，在投予至個體體內後，所述第二種化合物可誘發個體的心肌收縮；依據本揭示內容實施方式，所述第二種化合物可增加個體的短縮分率(fractional shortening, FS)及心輸出量(cardiac output)。依據本揭示內容另一實施方式，所述第二種化合物可引發個體的血管舒張。
此外，本揭示內容亦包含式(I)或式(II)化合物的鹽類、溶劑化物、衍生物或先驅藥物，據以製備本揭示內容所述藥學組合物及複合材料，及/或應用於本揭示內容所述之方法。本揭示內容更包含式(I)或式(II)化合物的所有可能立體異構物(stereoisomers)及幾何異構物(geometric isomers)。本發明同時包含外消旋化合物(racemic compounds)及光學活性異構物(optically active isomers)。當式(I)或式(II)化合物設計為單一鏡像異構物(enantiomer)時，可以藉由最終產物之離析(resolution)或由異構體純起始材料(isomerically pure starting material)或手性輔助試劑(chiral auxiliary reagent)之立體特異合成(stereospecific synthesis)來製得該異構物。可藉由相關技術領域任何已知的適合方法來離析出最終產物、中間產物或起始材料。此外，若式(I)或式(II)化合物的互變異構物(tautomers)可能存在下，本揭示內容也包含式(I)或式(II)化合物之所有互變異構物形式。本揭示內容亦包含式(I)或式(II)化合物的前驅藥物。已知利用前驅藥物法可成功短暫地(例如，生物可逆轉(bioreversibly))改變化合物之物化特性，其中該方法係將一種化合物衍生為一種適用於配置及／或施予的劑型，再於活體中以藥物形式釋放出來。舉例來說，適用的前驅藥物包含酸類衍生物(例如醯胺(amides)及酯類(esters))。
可由化合物最終的分離及純化過程或是藉由將化合物與一帶有一適當陽離子之酸類反應來製備式(I)或式(II)化合物的鹽類。式(I)或式(II)化合物之藥學上可接受的鹽類可以是由藥學上可接受之酸類所形成的酸加成鹽(acid addition salts)。用以形成藥學上可接受鹽類的酸類示例包含無機酸(例如，硝酸、硼酸、鹽酸、氫溴酸、硫酸及磷酸)及有機酸(例如，草酸、順丁烯二酸、琥珀酸、酒石酸和檸檬酸)。本發明例示性的化合物鹽類包含，但不限於氫氯酸鹽、氫溴酸鹽)、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、2-羥乙基磺酸鹽(2-hydroxyethansulfonate)、磷酸鹽、磷酸氫鹽、醋酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、二葡糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、甲酸鹽、琥珀酸鹽、反丁烯二酸鹽、順丁烯二酸鹽、抗壞血酸鹽、羥乙磺酸鹽、水楊酸鹽、甲磺酸鹽、均三甲苯磺酸鹽(mesitylenesulfonate)、萘磺酸鹽(naphthylenesulfonate)、煙酸鹽、2-萘磺酸鹽(2-naphthalenesulfonate)、草酸鹽、雙羥萘酸鹽(pamoate)、果凍酸鹽(pectinate)、過硫酸鹽、3 - 苯基丙酸鹽、苦味酸鹽(picrate)、新戊酸鹽、丙酸鹽、三氯乙酸鹽、三氟乙酸鹽、磷酸鹽、麩胺酸鹽、碳酸氫鹽、對甲苯磺酸鹽(paratoluenesulfonate)、十一酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、葡萄糖酸鹽、甲磺酸鹽、乙二磺酸鹽(ethanedisulfonate)、苯磺酸鹽(benzene sulphonate)及對甲苯磺酸鹽(p
-toluenesulfonate)。另外，下述鹽類化合物可對本發明化合物之可用的氨基進行季銨化(quaternized)：含甲基(methyl)、乙基(ethyl)、丙基(propyl)及丁基(butyl)的氯化物、溴化物和碘化物；含二甲基、二乙基、二丁基及二戊基的硫酸鹽；含癸基、十二烷基、十四烷基及十八烷基的氯化物、溴化物及碘化物；以及含苯甲基及苯乙基(phenethyl)的溴化物。鑑於前述，此說明書中任何關於式(I)或(II)化合物的引述皆包含式(I)或(II)化合物及其藥學上可接受之鹽類、溶劑化物或前驅藥物。
式(I)或式(II)化合物可作為一種用以傳遞一氧化氮的平台，據以成為一種先導化合物來製備可治療與一氧化氮相關之疾病或徴狀的藥物。可應用的疾病或徴狀包含，但不限於，心血管疾病、糖尿病、氣喘、鐮形血球貧血症、陽萎、囊腫纖化症、幽門狹窄、慢性腎臟疾病、神經退化性疾病、癌症、勃起功能障礙及感染性疾病。
本揭示內容的第二態樣是關於一種藥學組合物，其係包含一有效量之活性劑及一藥學上可接受的賦形劑。依據本揭示內容某些實施方式，該活性劑是式(I)化合物、其藥學上可接受的鹽類、溶劑化物、衍生物或先驅藥物。依據本揭示內容某些實施方式，該活性劑是式(II)化合物、其藥學上可接受的鹽類、溶劑化物、衍生物或先驅藥物。
依據使用目的不同，可將本發明藥學組合物配製成固體、半固體或液體形式，例如錠片、膠囊、粉末、顆粒、軟膏、溶液、栓劑和注射劑。因此，活性化合物可以經由不同路徑投予至個體體內，例如口服、腸內、鼻腔、局部、經黏膜、皮下、真皮內、肌肉內、靜脈內及腹腔內注射等方式。在藥劑的形式上，活性化合物可以單獨或與其他已知的藥學活性劑合併施予以治療藉由抑制與一氧化氮相關之疾病或徴狀而獲得療效的疾病和症狀。各途徑所適用之不同藥劑型式為該技術領域習知技藝者所熟知。需知在任何情況下，最佳施予途徑取決於疾病的本質或疾病的嚴重程度，或是治療的特定狀況。
在某些實施方式中，本揭示內容的藥學組合物是以固體劑型作口服施予。該些固體劑型可以是膠囊、密封袋、錠片、丸劑、錠劑、粉末或顆粒。在該些劑型中，將活性成分(如任一種上述化合物)與至少一種藥學上可接受之賦形劑混合。任何上述之固體劑型可選擇性地包含包衣(coatings)和殼層(shells)，例如腸溶包衣(enteric coatings)及用以改善任何成分之釋放率的包衣。該些包衣的範例為該技術領域所熟知的。在一實施例中，本揭示內容的藥學組合物為錠片，例如快速釋放錠片(quick-release tablets)。在另一實施例中，本揭示內容的藥學組合物配製為長效釋放劑型(sustained release forms)。在再一實施方式中，本揭示內容的藥學組合物為粉末，其係包覆於軟式及硬式明膠膠囊中。
在某些實施方式中，本揭示內容的藥學組合物是以液體劑型作口服施予。液體劑型可以更包含一緩衝藥劑以維持一期望的pH值。亦可將液體劑型填充於軟式明膠膠囊中。舉例來說，液體可以包含一溶液、懸浮液、乳膠、微浮膠、沈澱物或任何期望的液體介質，其係帶有任一種上述之化合物，或一藥學上可接受之衍生物、鹽類或其溶劑合物，或其組合。液體可加以設計來改善上述活性化合物之溶解度，以形成一包含藥物的乳膠或經釋放後的分散質(disperse phase)。
在某些實施方式中，本揭示內容的藥學組合物是適用於非口腔施予的劑型，例如注射施予，其係包含但不限於皮下、彈丸注射(bolus injection)、肌肉、腹腔及靜脈注射。藥學組合物可以配製成油性或水性的等張懸浮液、溶液或乳膠，且可以包含處方藥劑(formulatoary agents)，例如懸浮、穩定或分散藥劑。另外，組合物可以製成乾燥形式，例如粉末、晶體或冷凍乾燥的固體，並附與使用前為無菌且無熱原(pyrogen-free)的水或等張生理食鹽水。組合物亦可置於無菌的安瓶(ampoules)或小瓶(vials)中。
本揭示內容的第三態樣是關於一種複合材料，其係包含一具有可包覆活性劑之孔洞結構的金屬有機骨架。依據本揭示內容某些實施方式，活性劑是式(I)化合物、其藥學上可接受的鹽類、溶劑化物、衍生物或先驅藥物。依據本揭示內容某些實施方式，活性劑是式(II)化合物、其藥學上可接受的鹽類、溶劑化物、衍生物或先驅藥物。
在結構上，金屬有機骨架是一種由金屬離子/金屬團簇所組成的化合物，其中有機配體是作為連接子，以連接金屬離子/金屬團簇。形成的網狀物可具有一、二或三維的結構，且包含複數個孔隙(例如孔洞或通道)。基於高藥物承載量、生物降解性及多功能特性，金屬有機骨架可作為藥物傳遞的平台。金屬有機骨架的特性(例如金屬有機骨架的大小或結構，及其中孔隙的數量與形狀)會隨著金屬離子的不同而有所差異，其中金屬離子通常係選自由鋁(Al)、鉻(Cr)、銻(Sb)、鎵(Ga)、鈷(Co)、鎳(Ni)、鎂(Mg)、錳(Mn)、鐵(Fe)、鋅(Zn)、鎘(Cd)及釕(Ru)所組成的群組。依據本揭示內容一實施方式，本發明金屬有機骨架的金屬離子是鐵。
之後，可將金屬有機骨架浸漬於包含活性劑(例如治療藥物或本發明化合物)的溶液中，據以將活性劑承載於金屬有機骨架的孔隙中。一旦接觸適當的親核劑(nucleophile；舉例來說，水、血液、蛋白或酵素)或刺激環境(舉例來說，高於室溫的溫度(例如37°C)或電磁照射(例如紫外光))，活性劑可由金屬有機骨架釋放至液體環境中。依據本揭示內容一實施方式，是將金屬有機骨架MIL-88B(Fe)浸漬於包含式(I)或式(II)化合物之溶液中，以製備本發明複合材料。
依據使用需求，可將金屬有機骨架浸漬於包含不同活性劑的溶液中，以製備本發明複合材料；舉例來說，包含本發明化合物(即式(I)或(II)之化合物)及另一試劑的溶液。所述另一試劑可以是一標的分子(例如對一組織特定抗原具有結合親和力的抗體、適體(aptamer)或多肽)、一治療性藥物、一預防性藥物或任一對延緩老化或治療一氧化氮相關疾病可產生有益功效的試劑。
本揭示內容的另一態樣是關於一種用以傳遞一氧化氮的方法，以於個體產生延緩老化、延長壽命、促使血管舒張、誘發心肌舒張及收縮的功效，或治療個體體內與一氧化氮相關之疾病及/或徴狀。本發明方法包含對個體投予一有效量之式(I)或式(II)化合物。依據本揭示內容某些實施方式，由式(I)或式(II)化合物釋放的一氧化氮可活化一氧化氮相關的訊息傳遞路徑，進而引發個體的抗老化反應及/或產生治療功效。本發明方法可對個體投予式(I)或(II)之純化合物、其藥學組合物或其複合材料。
例示性之可以本發明方法治療的疾病包含，但不限於，心血管疾病、糖尿病、氣喘、鐮形血球貧血症、陽萎、囊腫纖化症、幽門狹窄、慢性腎臟疾病、神經退化性疾病、癌症、勃起功能障礙及感染性疾病。
當可想見，本發明方法可單獨投予至個體體內，或是與其他可對延緩老化或治療一氧化氮相關疾病具有助益功效的治療共同投予至個體體內。依據治療目的不同，本發明方法可在投予其他治療之前、期間或之後，投予至個體體內。
可接受本發明方法治療的個體可以是人類或非人類，舉例來說，蟲、魚、小鼠、大鼠、貓、狗、猴子、星猩猩、羊或牛。
本發明式(I)或式(II)化合物可藉口服、腸內、鼻腔、局部、經黏膜及非口服方式投予至個體體內，其中非口服投予可以是皮下、真皮內、肌肉內、動脈內、靜脈內、脊椎內或腹腔內注射。依據本揭示內容某些實施方式，是以口服方式對個體投予式(I)或(II)化合物。
在本揭示內容一實施方式中，投予式(I)化合物可延緩個體的老化程度，以及延長其壽命。在本揭示內容另一實施方式中，投予式(I)或式(II)化合物可引發血管舒張。在本揭示內容再另一實施方式中，投予式(I)化合物可引發心肌舒張。在本揭示內容另一實施方式中，投予式(II)化合物可引發心肌收縮。在本揭示內容再另一實施方式中，投予式(II)化合物可增加短縮分率(FS)及心輸出量。
當可想見，式(I)或式(II)化合物可與一標的分子(例如與標的分子連接，或是包覆於一與標的分子連接之囊泡內)共同投予至個體體內，藉以改善其治療功效。一般來說，標的分子可以是對一組織特定抗原具有結合親和力的抗體、適體或多肽。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。實施例
儀器
以購入形式直接使用試劑變性肌紅素 (metmyoglobin, TCI)、革利士試劑(Griess reagent, Aldrich)、5-溴基-4-氯基-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷酶(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- galactosiase, Aldrich)、亞鐵氰化鉀(potassium ferrocyanide, Alfa Aesar)、鐵氰化鉀(potassium ferriccyanide, ACROS)、硝普鈉(ACROS)、腎上腺素(Sigma)。利用Milli-Q試劑水純化系統來製備去離子水。以具有密封溶液槽的JASCO 4200光譜儀(0.1毫米，CaF2
視窗)記錄紅外光光譜的νNO
拉伸頻率。以JASCO V-630光譜儀來記錄紫外光-可見光光譜。利用Hitachi F-7000螢光光譜儀來記錄螢光光譜。以共軛焦顯微鏡系統(TCS-SP5-XAOBS, Leica, Germany; ECLIPSE TE2000-U, Nikon, Japan)及螢光顯微鏡(SMZ1500, Nikon/HG Lamp MODEL LH-M100C-1/4000R, QIamging)來記錄明視野及螢光照片。
製備
DNIC
[(NO)2
Fe(μ-SEtOH)2
Fe(NO)2
] (DNIC-1a
)
、
[(NO)2
Fe(μ-SEtCOOH)2
Fe(NO)2
] (DNIC-1b
)
、
[(NO)2
Fe(μ-SEt)2
Fe(NO)2
] (DNIC-1c
)
、
[(NO)2
Fe(μ-SPhCOOH)2
Fe(NO)2
] (DNIC-1d
)
及
[(NO)2
Fe(μ-SEtNH2
)2
Fe(NO)2
] (DNIC-1e
)
以[Na-18-crown-6-ether][Fe(CO)3
(NO)] (0.914克，2毫莫耳)及[NO][BF4
] (0.256克，2.2毫莫耳)新鮮製備[Fe(CO)2
(NO)2
] (1.0毫莫耳)的THF溶液，將其於正氮氣(positive N2
)壓力下利用套管轉移至一裝有4-氫硫基苯酸(4-mercaptobenzoic acid，0.2313克，1.5毫莫耳)的20毫升Schlenk試管中。於室溫下攪拌反應溶液至隔日，再以傅氏轉換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)進行測量。在IR νNO
及νCO
光譜中，三個分別位於1787、1759及1720 cm-1
的吸收高峰顯示錯合物[(NO)2
Fe(μ-SPhCOOH)2
Fe(NO)2
] (DNIC-1d)
的形成。接著以矽鈣石(Celite)過濾DNIC-1d
的THF溶液。將己烷加入DNIC-1d
的THF溶液，使 [(NO)2
Fe(μ-SPhCOOH)2
Fe(NO)2
] (DNIC-1d)
沉澱形成棕色固體(產率為0.137克，23%)。IR νNO
: 1787, 1759, 1720 cm-1
(THF)。吸收光譜(THF)：396 (10200)奈米。
以相似方法製備DNIC-1a
(產率為0.102克，53%)、DNIC-1b
(產率為0.143克，81%)、DNIC-1c
(產率為0.103克，58%)及DNIC-1e
(產率為0.110克，57%)。DNIC-1a
: IR νNO
: 1779, 1752 cm-1
(THF)。吸收光譜(H2
O)：312 (9300), 362 (8500)奈米。DNIC-1b
: IR νNO
: 1776, 1751 cm-1
(THF)。吸收光譜(H2
O)：311 (9950), 362 (9100)奈米。DNIC-1c
: IR νNO
: 1773 (9800), 1748 (9000) cm-1
(THF)。吸收光譜(DMSO)：306, 361奈米。DNIC-1e
: IR νNO
: 1773, 1748 cm-1
(THF).
(NO)2
Fe(μ-NH2
Pyr)2
Fe(NO)2
] (DNIC-2a)
、
[(NO)2
Fe(μ-NO2
Pyr)2
Fe(NO)2
] (DNIC-2b)
、
[(NO)2
Fe(μ-Me
Pyr)2
Fe(NO)2
] (DNIC-2c)
及
[(NO)2
Fe(μ-Ph
Pyr)2
Fe(NO)2
] (DNIC-2d)
於4°C的環境中，將[Na-18-crown-6-ether][Fe(CO)3
(NO)] (0.446克，1.0毫莫耳)及[NO][BF4
] (0.116克，1.0毫莫耳)溶於THF以新鮮製備[Fe(CO)2
(NO)2
] (1.0毫莫耳)。將該[Fe(CO)2
(NO)2
] (1.0毫莫耳)的THF溶液於正氮氣壓力下利用套管轉移至一裝有3-胺基吡唑琳桐(3-aminopyrazolate，0.082克，1.0毫莫耳)的20毫升Schlenk試管中。於室溫下攪拌反應溶液至隔日後，分別位於1807、1790、1736及1722 cm-1
的IR νNO
高峰指出錯合物[(NO)2
Fe(μ-NH2
Pyr)2
Fe(NO)2
] (DNIC-2a)
的形成。真空移除溶劑。將粗製棕色固體溶於乙醚後，以矽鈣石進行過濾。真空移除溶劑以製得深棕色粉末[(NO)2
Fe(μ-NH2
Pyr)2
Fe(NO)2
] (DNIC-2a
) (產率為0.182克，46%)。IR νNO
: 1807, 1791, 1736, 及1722 cm-1
(CH2
Cl2
)；1802, 1785, 1735, 1720 cm-1
(乙醚)。吸收光譜(CH3
OH)：339(3835)。
以相似方法製備DNIC-2b
(產率為0.133克，67%)、DNIC-2c
(產率為0.124克，62%)及DNIC-2d
(產率為0.148克，57%)。DNIC-2b
: IR νNO
: 1813 sh, 1797 s, 1743 sh, 1728 s cm-1
(THF)；1813 sh, 1802 s, 1745 s, 1737 sh (乙醚)。吸收光譜(THF)：330(6900)。DNIC-2c
: IR νNO
: 1807 sh, 1793 s, 1739 sh, 1724 s cm-1
(THF)；1809 sh, 1795 s, 1740 s, 1726 sh (CH2
Cl2
)。吸收光譜(THF)：357(5870)。DNIC-2d
：IR νNO
: 1810, 1797, 1743, 1728 cm-1
(THF)；1810, 1797, 1743, 1728 cm-1
(CH2
Cl2
)；1811, 1798, 1746, 1731 cm-1
(乙醚)；1810, 1801, 1745, 1736 cm-1
(己烷)。吸收光譜(THF)：323 (3900)。
[(NO)2
Fe(μ-SEtCOOH)2
Fe(NO)2
]@MIL-88B (Fe)
將5毫升之DNIC-1b的THF溶液(0.044克，0.1毫莫耳)加至一裝有0.1克MIL-88B(Fe)的20毫升Schlenk燒瓶中。於氮氣環境中室溫攪拌反應溶液24小時。將反應溶液以6,000 rpm的轉速離心10分鐘，以移除上層THF溶液。以5毫升的THF二次萃取殘留的棕色固體後，進行真空乾燥(0.088克)。棕色固體的IR光譜顯示二個位於1777及1751 cm-1
的IR νNO
拉伸頻率(stretching frequencies)，而棕色固體的pXRD光譜則顯示二個位於2q = 9.3o
及10.4o
的高峰。該些光譜數據證實成功合成[(NO)2
Fe(μ-SEtCOOH)2
Fe(NO)2
]@MIL-88B (Fe)。
晶體分析
將欲進行X光繞射分析的DNIC-2b
及DNIC-2d
晶體固定於一玻璃纖維上，再快速塗佈環氧樹脂(epoxy resin)。以最小平方精密計算單位細胞參數。利用SMART Apex CCD繞射儀以石墨-單波Mo Kα
輻射(l = 0.71073 A)來繞射測量DNIC-2b
及DNIC-2d
，其中DNIC-2b
的設定是介於2.38與22.69o
之間，而DNIC-2d
的設定則是介於1.59與25.04o
之間。基於F2
來最小平方精算所有非氫原子及固定氫原子的位置及異向性溫度參數。得到一SADABS吸收校正。使用SHELXTL結構精算程式。
[(NO)2
Fe(μ-R
Pyr)2
Fe(NO)2
] (DNIC-2)
與變性肌紅素
(metMb)
的反應
以下利用DNIC-2a
作為例示來闡述DNIC-2
及變性肌紅素的次硝酸反應流程，其中DNIC-2b
/DNIC-2d
與變性肌紅素的反應是以相同流程進行。於厭氧氮氣環境中，將溶於3.3毫升之25 mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)的10 μM變性肌紅素加至一4毫升石英比色管中，再以橡膠隔片密封。將10 μM之DNIC-2a
(取13.0微升之2.5 mMDNIC-2a
原液至THF)加至可穩定存在於25°C的液體溶液中。將反應溶液放置10分鐘後，測量反應溶液的紫外光-可見光光譜。紫外光-可見光吸收帶由407、503及629奈米位移至419、543及577奈米指出次硝酸由DNIC-2a
轉移至變性肌紅素供給{Fe(NO)}7
形式(MbNO)。DNIC-2b
及DNIC-2d
亦具有將次硝酸轉移至變性肌紅素的相似反應特性。
[(NO)2
Fe(μ-SR)2
Fe(NO)2
] (DNIC-1)
與變性肌紅素的反應
以下闡述DNIC-1
與變性肌紅素的反應流程。於室溫利用密封的注射器將10 μM之DNIC-1
(取13.0微升之2.5 mMDNIC-1
原液至THF)加至一4毫升石英比色管中，其中該比色管裝有10 μM之溶於3.3毫升之25 mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)的變性肌紅素。使反應溶液於室溫環境反應8小時。未觀察到該反應溶液的紫外光-可見光光譜變化。
利用革利士試劑及螢光探針
FA-OMe
確認
DNIC-1
於活體外的
●NO
釋放量
以下闡述利用革利士試劑來確認由DNIC-1a
、DNIC-1b
及DNIC-1d
釋放之一氧化氮總量的實驗流程。將300微升之溶於DMSO的0.75 mMDNIC-1
原液加至14.7毫升之25 mM KPi緩衝液(pH 7.0)中，以製備15 μM的DNIC-1
。使該溶液於好氧環境中反應48小時後，加入1.5毫升之溶於水的10 mM革利士試劑。測量A540
，依據由0、1、2、5、10、20及50 μM之NaNO2
得到的校正曲線來評估DNIC-1
的一氧化氮釋放量。利用3次獨立實驗來測量15 μM之DNIC-1a
的平均●NO釋放量。
進一步利用對●NO具有專一性的螢光探針FA-OMe來測量DNIC-1a
、DNIC-1b
及DNIC-1d
的一氧化氮釋放量。將1.0微升之溶於DMSO的100 mM FA-OMe原液加入5毫升之25 mM KPi緩衝液(pH 7.0)中，以製備20 μM的FA-OMe。將500 μMDNIC-1
(取50.0微升之50 mMDNIC-1
原液至DMSO)加至20 μM FA-OMe後，以波長為460奈米的光波激發，並記錄524奈米的螢光強度，以證實DNIC-1
及DEANONOate的一氧化氮釋放特性。
線蟲及斑馬魚的種類及培養
所有的實驗皆是依照動物保護規範來進行，且取得國立清華大學動物試驗委員的許可(許可號為00990001)。由台灣線蟲核心實驗設施(C. elegans core facility Taiwan，CECF)取得WT 線蟲 (N2)及CX3553株。二線蟲株皆係培養於20°C、線蟲培養基(nematode growth medium, NGM)盤上，並餵食OP50細菌。依據Zebrafish Book 所述方法來操作及培養AB (野生型)及Tg (kdr: EGFP)斑馬魚的成魚及胚胎。
線蟲吸收及排出
DNIC-1a
利用鐵含量的改變來評估線蟲對DNIC-1a
的吸收及排出。將140隻N2線蟲培養於500 μM之DNIC-1a
15分鐘後，以M9緩衝液洗滌3次，再將其移至含有大腸桿菌OP50的瓊脂培養基上。分別於0、0.25、0.5、1、2及6小時後，收集線蟲，以M9緩衝液洗滌3次。將該些線蟲培養於80微升之家用漂白水及25微升之10 M NaOH中1小時，以分解該些線蟲。加入5% HNO3
酸化溶液，並將溶液稀釋至2.5毫升，之後利用ICP-MS來定量鐵的含量。在投予DNIC-1a
後，以3次獨立實驗來測量線蟲體內鐵含量的平均值。除了未與500 μM之DNIC-1a
培養15分鐘的操作步驟外，利用相似方法來測量線蟲體內的背景鐵含量。
DNIC-1a
於線蟲活體內釋放
●NO
將10隻N2線蟲培養於500 μM之DNIC-1a
15分鐘，再以M9緩衝液洗滌3次。進一步以20 μM之FA-OMe培養0.5、1、2及4小時後，以M9緩衝液洗滌3次，之後拍攝其明視野及螢光照片。利用螢光顯微鏡來拍攝螢光照片。實驗對照組是將N2線蟲以500 μM之DNIC-1a
培養15分鐘或以20 μM之FA-OMe培養30分鐘後，再拍攝螢光照片。
分析線蟲的壽命
所有的實驗皆是於20°C的環境中操作，並重複至少3次。於第0天確認L4時期的線蟲，以分析其壽命。為使線蟲接觸DNIC-1a
，於第1、4及7天時，將線蟲移至不含OP50細菌的NGM培養盤，之後投予以M9緩衝液製備之15 μM的DNIC-1a
處理15分鐘。除了以M9緩衝液置換DNIC-1a
(僅投予M9緩衝液)之外，以相同步驟處理對照組。將線蟲移回包含OP50細菌的NGM培養盤進行培養後，以M9緩衝液沖洗線蟲3次。當線蟲停止咽泵(pharyngeal pumping)或對白金絲的戳刺不再有反應時，即視為已死亡。由培養盤移除7天內死亡或體內孵化的線蟲，且不分析計算其壽命。
分析線蟲的細胞老化
利用5-溴基-4-氯基-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷酶(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- galactosiase, X-gal)作為受質，藉由偵測與老化相關之β-半乳糖苷酶的活性來評估細胞的老化形成。依據標準流程來製備β-半乳糖苷酶細胞染色所需的溶液及試劑。在二試驗組中，將線蟲轉移至不包含OP50細菌的NGM培養盤上。於第1、4及7天，分別對線蟲投予10 μM之DNIC-1a
或M9緩衝液。培養後以M9緩衝液洗滌3次。將線蟲放回包含OP50細菌的NGM培養盤上，培養至第13天。收集第13天的線蟲，並以1倍PBS沖洗1次，之後將線蟲浸泡於1倍固定溶液15分鐘。移除1倍固定溶液後，以1倍PBS沖洗2次。進一步將線蟲置於β-半乳糖苷酶染色溶液中，於37°C作用至隔日。利用ImageJ來定量每隻蟲體中代表SA-βgal活性之深藍色染色的強度及區域。所有的實驗皆至少重複3次。於第1、7及13天挑選對照組的線蟲進行β-半乳糖苷酶細胞染色。
CX3553
線蟲之
sGC
的活化
利用CX3553 (str-1
::GFP)之GFP表現可受cGMP調控的特性來評估sGC的活化狀態。於第1天分別對10隻線蟲投予M9緩衝液、400 μM之DNIC-1a
及400 μM之DNIC-2a
，30分鐘後以M9緩衝液沖洗3次。以0.1%三卡因/0.01%四咪唑麻醉後，拍攝線蟲的螢光照片。利用ImageJ來定量各線蟲的螢光強度。
DNIC
對斑馬魚胚胎的毒性試驗
將受精3天後(days post fertilization, dpf)的WT-AB胚胎分別浸泡於50 μM之DNIC-1a
、50 μM之DNIC-1b
、50 μM之DNIC-2a
及200 μM之SNP，作用30分鐘。沖洗胚胎3次後，培養於28°C的環境中。處理後觀查48小時，以分析胚胎的存活率。所有的實驗皆重複3次。
分析斑馬魚胚胎的血管舒張
將50隻受精3天後的Tg (kdr:EGFP)胚胎分別培養於淡水、50 μM之DNIC-1b
、50 μM之DNIC-2a
及200 μM之硝普鈉(SNP)，作用30分鐘。處理後以淡水沖洗胚胎3次。拍攝明視野及螢光照片以測量背大動脈的直徑。所有的實驗皆重複3次。
分析斑馬魚胚胎的心肌收縮力及心輸出量
對受精3天後的AB (野生型)胚胎分別投予淡水、50 μM之DNIC-1b
、50 μM之DNIC-2a
、200 μM之SNP及每毫升5微克的腎上腺素(epinephrine)，作用30分鐘後，以淡水沖洗3次。拍攝50張連續照片記錄至少8次連續心搏週期，以測量在心室心縮期(end systole, ES)及心舒期(end diastole, ED)時，心室直徑的短軸。以公式：計算短縮分率。將心室視為一長球體，以公式：計算心室體積，其中l
為心室的長軸半徑，而s
為心室的短軸半徑。人工計算20秒內的心跳次數，以測量心率(每分鐘跳動次數)。以公式：心輸出量 計算心輸出量。所有的實驗皆重複3次。
統計
利用微軟Excel軟體來分析所有數據，並以平均值標準差來表示分析結果。利用Student’s t-test或Log-Rank test進行數據比對。當p值 ＜ 0.05時，則該差異視為具有統計意義。統計意義表示如下：*代表p值 ＜ 0.05，**代表p值 ＜ 0.01，而***則代表p值 ＜ 0.001。
實施例
1
次硝酸轉移及一氧化氮釋放活性
實施例1將分析不同DNIC與變性肌紅素的反應，以證實硫醇鹽(thiolate)與吡唑特(pyrazolate)二種橋接配體(bridging ligand)於NO–
轉移的反應特性。如第1圖所示，相較於不反應的DNIC-1
(第1圖之圖A-C)，一旦將10 μMDNIC-2
加至10 μM變性肌紅素，會使紫外光-可見光吸收帶由407、503及629奈米移動到419、543及577奈米(第1圖之圖D-F)，該結果顯示MbNO的形成，且證實吡唑特配體於DNIC-2
之快速次硝酸轉移反應中扮演著關鍵的角色。
關於DNIC-1c
之●NO電子結構及零NO–
轉移反應性，則利用比色革利士試劑及特定螢光探針FA-OMe來評估DNIC-1
的●NO釋放反應特性。相較於厭氧環境所呈現的穩定性，DNIC-1a
於好氧環境中位於362奈米紫外光-可見光吸收帶會穩定的衰退，該結果顯示O2
會造成DNIC-1a
的分解(第2圖)。此外，假設DNIC-1
的衰退符合假一級動力學(pseudo-first order kinetics)，則DNIC-1a
、DNIC-1b
及DNIC-1d
的半衰期分別為27.4±0.5小時、25.9±0.4小時及0.6±0.1小時。如表1及第3圖所示，比色革利士試劑特定的螢光探針FA-OMe進一步證實DNIC-1
的好氧性分解會伴隨著●NO的穩定釋放。基於DNIC-1
會穩定釋放●NO的反應特性及DNIC-2
的NO–
轉移反應特性，接著分析具有雙效●NO/NO–
供體反應特性之DNIC-1
/DNIC-2
於活體內及於一氧化氮反應生理作用中的生物活性。考量到在液體溶液中的穩定性，進一步挑選DNIC-1a
、DNIC-1b
及DNIC-2a
進行後續活體內試驗分析。 表1 利用革利士試劑分析由DNIC-1
所釋放的一氧化氮總量
實施例
2
生物功能
2.1
對老化及壽命的功效
接著利用透明且未分化的線蟲(壽命較短)來研究老化過程的機制，藉以確認與老化相關的基因及可調控老化的生物活性化合物。實施例2.1將分析DNIC-1a
於線蟲體內的運輸及由DNIC-1a
釋放之●NO於老化過程所產生的作用。第4圖所示之動力學數據闡述了將 140隻N2線蟲與500 μM之DNIC-1a
共同培養15分鐘後，其體內鐵總含量的變化。相較於起始量為每100隻線蟲46.8±3.6奈克，投予DNIC-1a
處理會使鐵總含量快速增加至每100隻線蟲190.7±39.4奈克，之後鐵含量又會快速地減少，該結果證實線蟲可有效地吸收並快速代謝排出DNIC-1a
(第4圖)。接著利用特定螢光探針FA-OMe來評估於線蟲體內運輸時，DNIC-1a
的●NO 釋放反應性。相較於培養於FA-OMe或DNIC-1a
的線蟲不會產生螢光訊號(第5圖之圖E及F)，DNIC-1a
會將●NO釋放於線蟲的小腸中(第5圖之圖A)。依據減少的螢光訊號可知，●NO的釋放量會隨著時間的增加而減少，該結果與DNIC-1a
於線蟲體內的運輸動力學結果相似(第5圖之圖A-D)。
為探討DNIC-1a
於線蟲體內釋放●NO所產生的生物功能，進一步分析DNIC-1a
對壽命及細胞老化形成(可作為生物老化的指標)的影響。分別於第1、4及7天將線蟲(n = 200)培養於0 μM及10 μM的DNIC-1a
15分鐘，以進行壽命分析實驗。將線蟲培養於10 μM之DNIC-1a
3次，會將其壽命延長10.7%，由16.9±0.5天增加至18.7±0.4天(第6圖之圖A)。已知在生物老化過程所累積的老化細胞會負向影響小鼠的壽命，並使其產生老化相關的變化；清除老化細胞則可延緩老化相關的病狀。為了將●NO延長線蟲壽命的功效反應至生物老化過程，利用產色受質X-gal 來分析與老化相關之β-半乳糖苷酶的活性，藉以確認細胞老化的形成及生物老化的發生。相較於老化細胞會隨年齡增加而逐漸累積，將線蟲於第1、4及7天培養在10 μM之DNIC-1a
(共3次，每次15分鐘)可顯著延緩細胞老化(第6圖之圖B)。此外，以DNIC-1a
處理之13天大的線蟲具有與7天大之線蟲相近的β-半乳糖苷酶活性，證實了DNIC-1a
可減緩線蟲的老化過程，並延長其壽命。
2.2
對血管及心肌系統的功效
除了分析DNIC-1a
之●NO釋放反應性對老化過程的長期生理調控，本研究亦探討DNIC-1a
之●NO釋放反應性及DNIC-2a
之NO–
轉移反應性對血管及心肌系統的影響。可溶性鳥苷酸環化酶可用以偵測●NO及NO–
於使GTP加速轉換為cGMP及與●NO/cGMP相關的生理反應。利用線蟲體內包含血紅素之sGC作為一氧化氮的活體偵測器，以受cGMP調控綠色螢光蛋白(green fluorescence protein, GFP)表現之CX3553線蟲的AWB神經元來分析DNIC-1a
及DNIC-2a
的亞硝基化反應性。如第7圖所示，DNIC-1a
及DNIC-2a
可增加CX3553線蟲體內約5.7倍的GFP螢光訊號。該結果證實DNIC-1a
及DNIC-2a
對sGC之FeII
/FeIII
-血紅素中心的亞硝基化反應性，可促使GTP轉換為cGMP。為證實受一氧化氮調控而活化之sGC於血管系統的生理活性，接著以斑馬魚胚胎來分析DNIC的血管舒張功效。以硝普鈉(一種臨床使用的●NO供體)來比對DNIC (作為一種新穎NO供體)的功效。先分別將受精3天後的斑馬魚培養於淡水、50 μMDNIC-1a
、50 μMDNIC-1b
、50 μMDNIC-2a
及200 μM SNP中30分鐘，以進行DNIC-1a
、DNIC-1b
及DNIC-2a
的毒性測試(表2)。50 μMDNIC-1b
、50 μMDNIC-2a
及200 μM SNP不會對斑馬魚胚胎產生急性毒性，而以DNIC-1a
處理後之受精5天後的斑馬魚則會於第3天死亡。據此，不再進一步分析DNIC-1a
對血管舒張及心臟功能的功效。分別將受精3天後的KDR斑馬魚培養於淡水、50 μMDNIC-1b
、50 μMDNIC-2a
及200 μM SNP中30分鐘。以淡水沖洗3次後，拍攝螢光照片以檢測背大動脈的直徑。如第8圖及表3所示，Fe-NO錯合物DNIC-1b
、DNIC-2a
及SNP可產生血管舒張的功效(推測是經由sGC/cGMP訊息傳遞路徑)，進而增加背大動脈的直徑，分別使其由21.2±0.2微米增加至23.0±1.1微米、25.6±0.6微米及25.1±0.8微米。 表2 培養於Fe-NO錯合物30分鐘之斑馬魚於第3天的存活率(n =300，三重複)
表3 投予/不投予Fe-NO錯合物處理之斑馬魚的短軸直徑、短縮分率、心室體積、背大動脈直徑、心率及心輸出量 a
分別將斑馬魚培養於50 μM之DNIC-1b
、50 μM之DNIC-2a
、200 μM之SNP及每毫升5微克之腎上腺素 30分鐘，以淡水沖洗3次後，進行測量。 b
ED=心舒期，ES=心縮期，Dd
=心舒期的短軸直徑，Ds
=心縮期的短軸直徑。 c
以公式：計算短縮分率。假設心室為一長球體， d
以公式：計算心室體積，其中l
為心室的長軸半徑，而s
為心室的短軸半徑。 e
以公式：來計算心輸出量。
2.3
心肌收縮功效
有鑑於DNIC-2
對FeIII
-血紅素中心的次硝酸-轉移反應性及藉由活化sGC來促進血管舒張的功效，進一步利用斑馬魚胚胎來確認其對心肌系統的作用。以DNIC-1b
及SNP作為●NO供體，來比對●NO/NO–
於心肌系統的雙重功效，而腎上腺素(epi)則是作為活化β-腎上腺素性相關訊息傳遞路徑的代表性化合物。分別將受精3天後的斑馬魚培養於淡水、50 μMDNIC-1b
、50 μMDNIC-2a
、200 μM SNP及每毫升5微克腎上腺素中30分鐘，之後拍攝50張連續照片以記錄至少8次連續心搏週期。表3總結了心舒期及心縮期的短軸直徑、短縮分率、心室體積、心率及心輸出量。值得注意的是，於以DNIC-1b
或SNP處理後的斑馬魚可觀察到顯著增加的心臟短軸直徑及心舒期的心室體積。心舒期短軸的增加證實了具有●NO釋放功效的Fe-NO錯合物可引發心舒期的心肌舒張，而對心縮期則不會有影響(表3，第9圖)。相反地，由心縮期心臟短軸直徑的顯著減少可知，NO–
供體DNIC-2a
具有引發心肌收縮的功效，可增加心肌的收縮力。在●NO供體DNIC-1b
/SNP、NO–
供體DNIC-2a
及β-腎上腺素性相關的腎上腺素中，最具潛力的DNIC-2a
可增加約2倍的短縮分率及心輸出量，藉以強化心肌及心血管的功能。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
無
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1圖為依據本揭示內容實施例1所闡述之線性圖，其係關於特定反應的紫外光-可見光吸光度；以紫外光-可見光光譜來偵測在pH 7.4之25 mM磷酸鹽緩衝液中，10 μM之變性肌紅素(metmyoglobin, metMb)與DNIC-1a
(圖A)、DNIC-1b
(圖B)、DNIC-1d
(圖C)、DNIC-2a
(圖D)、DNIC-2b
(圖E)及DNIC-2d
(圖F) 的反應；其中是將反應溶液放置0分鐘(實線)、5分鐘(點線)及8小時(短劃線)後來測量其紫外光-可見光光譜； 第2圖為依據本揭示內容實施例1所闡述之線性圖，其係關於特定反應的紫外光-可見光吸光度；以紫外光-可見光光譜來偵測在25 mM KPi緩衝液(pH 7.0)的好氧環境中，DNIC-1a
(圖A)、DNIC-1b
(圖B)及DNIC-1d
(圖C) 隨時間變化的分解狀況；以紫外光-可見光光譜偵測362奈米、361奈米或396奈米的吸光度，以分別評估DNIC-1a
、DNIC-1b
及DNIC-1d
的分解率； 第3圖為依據本揭示內容實施例1所闡述之線性圖，其係關於特定反應的紫外光-可見光吸光度；利用5-胺基-2-(6-羥-3-氧基-3H-二苯并哌喃-9-基)苯甲酸甲酯(5-amino-2-(6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9 -yl) benzoic acid methyl ester, (FA-OMe))偵測DNIC-1a
(圖A)、DNIC-1b
(圖B)及DNIC-1d
(圖C)於活體外的一氧化氮釋放量；將500 μM之DNIC-1
加至10 μM之溶於25 mM KPi緩衝液(pH 7.0)的FA-OMe中；將反應溶液分別放置0小時(短劃線)及13小時(實線)後，以460奈米的激發波長偵測其螢光強度； 第4圖為依據本揭示內容實施例2.1所闡述之點狀圖，其係關於與DNIC-1a
培養後，於不同時間點觀查線蟲體內的鐵含量；將140隻N2 線蟲與500 μM的DNIC-1a
培養15分鐘後，以M9緩衝液洗滌3次，接著於鹼性環境中分解線蟲，稀釋至2.5毫升；以ICP-MS測量鐵含量，其中鐵含量可作為線蟲吸收及排出DNIC-1a
的指標；將由3次獨立實驗得到的鐵含量平均數值以平均值±標準差來表示；未與500 μM之DNIC-1a
培養之線蟲體內的鐵含量為每100隻線蟲46.8±3.6奈克； 第5圖為依據本揭示內容實施例2.1所闡述之照片，其係關於利用FA-OMe來偵測DNIC-1a
於線蟲體內的●NO釋放量；將N2線蟲與500 μM之DNIC-1a
培養15分鐘後，以M9緩衝液洗滌3次；進一步與10 μM之FA-Ome分別培養0.5小時(圖A)、1小時(圖B)、2小時(圖C)及4小時(圖D)後，以M9緩衝液洗滌3次，再拍攝其明視野及螢光照片；圖E及圖F為與10 μM之FA-OMe培養0.5小時(圖E)及與500 μM之DNIC-1a
培養15分鐘(圖F)後，線蟲的明視野及螢光照片； 第6圖為依據本揭示內容實施例2.1所闡述之數據，其係關於在投予或未投予●NO供體DNIC-1a
後，線蟲的壽命；圖A：在第1、4及7天時，將N2線蟲分別與0 μM (點線)及10 μM之DNIC-1a
(實線)培養15分鐘後，以M9緩衝液洗滌3次；由3次獨立實驗得到之線蟲(n = 200)平均壽命顯示DNIC-1
可延長線蟲的壽命；圖B：利用產色受質X-gal 來分析線蟲體內與老化相關之β-半乳糖苷酶的活性(β-galactosidase activity, SA-β-gal activity)；比較1天大、7天大及13天大之線蟲的SA-β-gal活性可發現老化細胞會隨年齡的增長而累積於線蟲體內；將由3次獨立實驗得到之SA-β-gal活性的平均數值以平均值±標準差來表示；*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01；***P ＜ 0.001； 第7圖為依據本揭示內容實施例2.2所闡述之結果，其係關於經特定處理後之線蟲的相對螢光強度；將CX3553 (str-1
::GFP)線蟲(n = 10)與400 μM之DNIC-1a
(或400 μM之DNIC-2a
)培養30分鐘後，以M9緩衝液洗滌3次；以0.1%三卡因(tricane)/0.01%四咪唑(tetramisole)麻醉後，拍攝線蟲的螢光照片；螢光強度的定量結果顯示DNIC可活化CX3553 (str-1
::GFP)體內的sGC；將由3次獨立實驗得到之螢光強度的平均數值以平均值±標準差來表示；*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01；***P ＜ 0.001； 第8圖為依據本揭示內容實施例2.2所闡述之數據，其係關於特定處理所產生的血管舒張功效；將3天大的KDR斑馬魚(n = 50)培養於淡水、50 μM之DNIC-1b
、50 μM之DNIC-2a
或200 μM之硝普鈉(sodium nitroprusside, SNP) 30分鐘；以淡水洗滌3次後，拍攝其明視野及螢光照片，以測量其背大動脈直徑；DNIC-1b
、DNIC-2a
及SNP對斑馬魚之背大動脈直徑的血管舒張功效；將由3次獨立實驗得到之血管直徑的平均數值以平均值±標準差來表示，結果闡述了●NO供體DNIC-1b
及SNP，以及NO–
供體DNIC-2a
的血管舒張功效；*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01；***P ＜ 0.001；以及 第9圖之柱狀圖闡述了斑馬魚在ED及ES時期的短軸心室直徑；將WT-AB斑馬魚(n = 50)分別培養於淡水、50 μM之DNIC-1b
、50 μM之DNIC-2a
及200 μM之SNP 30分鐘；以淡水洗滌3次後，拍攝50張連續照片(曝光時間為25毫秒)記錄至少8次連續心搏週期，據以測量在心室ES及ED時期，WT-AB斑馬魚心臟的短軸心室直徑；將由3次獨立實驗得到之平均數值以平均值±標準差來表示；●NO供體DNIC-1b
或SNP可增加ED時期的短軸心室直徑，而NO–
供體DNIC-2a
則可引發心肌收縮，以減少ES時期短軸心室直徑及心室體積；將心室視為一長球體來計算心室體積；*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01；***P ＜ 0.001。
Claims (8)
- 一種如式(II)之化合物，
- 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中R’是-NH2，且y是0。
- 一種用以延緩老化或治療與一氧化氮相關之疾病的藥學組合物，包含：(a)一有效量之如申請專利範圍第1項所述之式(II)化合物、其藥學上可接受的鹽類或溶劑化物；以及(b)一藥學上可接受的賦形劑。
- 一種如申請專利範圍第3項所述之藥學組合物的用途，其係用以製備一可延緩老化或治療與一氧化 氮相關之疾病的藥物。
- 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該與一氧化氮相關之疾病是心血管疾病、糖尿病、氣喘、鐮形血球貧血症、陽萎、囊腫纖化症、幽門狹窄、慢性腎臟疾病、神經退化性疾病、癌症、勃起功能障礙或感染性疾病。
- 一種用以延緩老化或治療與一氧化氮相關之疾病的複合材料，包含：如申請專利範圍第1項所述之式(II)之化合物、其藥學上可接受的鹽類或溶劑化物，以及一金屬有機骨架，具有孔洞結構以包覆式(II)之化合物、其藥學上可接受的鹽類或溶劑化物。
- 一種如申請專利範圍第6項所述之複合材料的用途，其係用以製備一可延緩老化或治療與一氧化氮相關之疾病的藥物。
- 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該與一氧化氮相關之疾病是心血管疾病、糖尿病、氣喘、鐮形血球貧血症、陽萎、囊腫纖化症、幽門狹窄、慢性腎臟疾病、神經退化性疾病、癌症、勃起功能障礙或感染性疾病。
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|---|---|---|---|
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Cited By (1)
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| TWI786820B (zh) * | 2021-09-12 | 2022-12-11 | 國立清華大學 | 雙亞硝基鐵錯合物用於製備美化皮膚的皮膚外用組成物之用途 |
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| US20100190850A1 (en) * | 2008-06-02 | 2010-07-29 | Institute Of Problems Of Chemical Physics Ras (Ipcp Ras) | Water-soluble binuclear nitrosyl iron complexes with natural aliphatic thiolyls possessing cytotoxic, apoptotic and no-donor activity |
-
2017
- 2017-01-24 TW TW106102747A patent/TWI666214B/zh not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
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| Christopher Glidewell et al., "Reactions of nucleophiles with bis(μ-thiosulfato-S)bis(dinitrosylferrate)(2-), [Fe2(S2O3)2(NO)4]2-, and of electrophiles with heptanitrosyltri-μ3-thiotetraferrate(1-), [Fe4S3(NO)7]-: new routes to bis (μ-organothiolato)-bis(dinitrosyliron) complexes [Fe2(SR)2(NO)4] and the crystal and molecular structure of trimethylsulfonium heptanitrosyltri-μ3-thiotetraferrate(1-), |
| Ming-Li Tsai et al., "Dinitrosyl Iron Complexes (DNICs) Containing S/N/O Ligation: Transformation of Roussin's Red Ester into the Neutral {Fe(NO)2}10 DNICs", Inorganic Chemistry (2007), 46(12), pp. 5110-5117 |
| Ming-Li Tsai et al., "Dinitrosyl Iron Complexes (DNICs) Containing S/N/O Ligation: Transformation of Roussin's Red Ester into the Neutral {Fe(NO)2}10 DNICs", Inorganic Chemistry (2007), 46(12), pp. 5110-5117 Yu-Ting Tseng et al., "To Transfer or Not to Transfer? Development of a Dinitrosyl Iron Complex as a Nitroxyl Donor for the Nitroxylation of a FeIII-Porphyrin Center", Chemistry - A European Journal (20151022 published online), 21(49), pp. 17570-17573 * |
| Wu SC et al.," Water-Soluble Dinitrosyl Iron Complex (DNIC): a Nitric Oxide Vehicle Triggering Cancer Cell Death via Apoptosis.", Inorg Chem. ,2016 ;55(18):9383-9392 * |
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| 呂忠諺博士論文：水溶性雙亞硝基鐵硫錯合物及四亞硝基雙鐵硫錯合物的合成與反應機構探討，2015年8月20日上架公開 * |
| 呂忠諺博士論文：水溶性雙亞硝基鐵硫錯合物及四亞硝基雙鐵硫錯合物的合成與反應機構探討，2015年8月20日上架公開。 |
| 鄒智欽博士論文：雙亞硝基鐵錯合物轉換成亞硝硫醇以及單電子氧化之雙亞硝基鐵錯合物電子結構之研究與探討，2013/11/30上架公開 * |
| 鄒智欽博士論文：雙亞硝基鐵錯合物轉換成亞硝硫醇以及單電子氧化之雙亞硝基鐵錯合物電子結構之研究與探討，2013/11/30上架公開。 |
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| US11883517B2 (en) | 2021-09-12 | 2024-01-30 | National Tsing Hua University | External dermal composition and method for beautifying skin |
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| TW201827450A (zh) | 2018-08-01 |
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