CN104379146B - 抑制病毒聚合酶的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供如本文所述的式I化合物：(I)式I化合物可用于抑制病毒RNA聚合酶活性和病毒复制的方法中。本发明还提供包含式I化合物的药物组合物以及使用式I化合物治疗病毒感染的方法。

Description

抑制病毒聚合酶的组合物和方法
相关申请
本申请要求2012年4月18日提交的美国临时专利申请61/625,994号的优先权权益。
发明背景
病毒造成包括哺乳动物且特别是人类的动物中的许多感染性疾病。与细菌感染不同，对于病毒感染的预防和治疗，只有相对较少的药剂有效。现在已经充分了解了病毒性疾病的生物学，包括病毒基因组转录、转译和复制。在含RNA的病毒中，一种重要的酶是RNA依赖性RNA聚合酶，其负责病毒基因组复制。RNA依赖性RNA聚合酶为在具有负义RNA、且无DNA阶段的所有含RNA的病毒的基因组中编码的必要蛋白。该酶催化与指定RNA模板互补的RNA链的合成。因为病毒的复制依赖RNA聚合酶，所以该酶是新型抗病毒化合物的研发中有前途的靶标。
发明概述
本发明提供在抑制病毒RNA聚合酶活性或病毒复制和治疗病毒感染中使用的式I化合物，包括其药学上可接受的盐。所述化合物通过活性药物成分的有利药物动力学、特别是结合肠道施用，包括特别是口服来部分地表征。本发明还提供包含一种或多种式I化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物以及其制备方法。本发明还提供抑制病毒RNA聚合酶活性、病毒复制和治疗病毒感染的方法。
附图简述
图1为描绘在将化合物12i (三角形，对照)和化合物30f (圆形，实验)单剂量口服给大鼠之后化合物12i的血浆药物动力学的曲线图，N = 4只/组。
图2为描绘化合物12i (CMPD 1)对被黄热病毒感染的仓鼠的存活率的影响的曲线图。**，与安慰剂相比较，P<0.01。***，与安慰剂相比较，P<0.001。dpi (days postinfection)：感染后的天数。
发明详述
本发明的一方面为由式I表示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
L1、L2、L3、L4、L5和L6各自独立地为键或-C(R0)2-O-连接基团；
R0在每次出现时独立地为H或(C1-C6)烷基；
R1、R2和R3各自独立地选自H、氨酰基、氨基硫酰基、酰基、R10OC(O)-、磷酰基和氨基磷酰基；或R1和R2合起来或R2和R3合起来选自羰基、硫羰基、磷酰基和(C1-C6)烷基磷酰基；
R4、R5和R6各自独立地选自H、酰基、磷酰基、烷硫基、R10OC(O)-和氨基烷基；
R7为H；或R6、R7和它们所连接的氮合起来代表-N=CR20R21；
R10在每次出现时独立地选自H、(C1-C6)烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基；
R20和R21各自独立地选自H、烷基、氨基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基；
条件是由式I表示的所述化合物不为
。
在某些实施方案中，所述式I化合物为由式IA表示的化合物或其药学上可接受的盐：
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，L1-R1为H。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，L2-R2为H。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，L3-R3为H。
或者，在根据上述项中任一项的某些实施方案中，L2-R2和L3-R3相同。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，L2-R2和L3-R3各自为H。
或者，在根据上述项中任一项的某些实施方案中，L1-R1和L3-R3相同。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，L1-R1和L2-R2相同。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，L1-R1和L2-R2各自为H。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，L1-R1和L3-R3各自为H。
或者，在根据上述项中任一项的某些实施方案中，L1-R1、L2-R2和L3-R3相同；且L1-R1、L2-R2和L3-R3中一个也不为H。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，氨酰基在每次出现时独立地为-C(=O)CH(NH2)(CH2)nCHR30R31，其中n为0或1；且R30和R31各自独立地选自H、(C1-C6)烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基。
在某些实施方案中，R30和R31各自独立地选自H和(C1-C6)烷基。
在某些实施方案中，R30和R31各自独立地为(C1-C6)烷基。
在某些实施方案中，n为0；且R30和R31各自独立地为甲基。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，氨基硫酰基在每次出现时独立地为-C(=S)CH(NH2)(CH2)nCHR30R31，其中n为0或1；且R30和R31各自独立地选自H、(C1-C6)烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基。
在某些实施方案中，R30和R31各自独立地选自H和(C1-C6)烷基。
在某些实施方案中，R30和R31各自独立地为(C1-C6)烷基。
在某些实施方案中，n为0；且R30和R31各自独立地为甲基。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，酰基在每次出现时独立地为-C(=O)R40，其中R40选自H、(C1-C6)烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基。
在某些实施方案中，R40为H。
在某些实施方案中，R40为(C1-C6)烷基。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，R10在每次出现时独立地为H。
或者，在根据上述项中任一项的某些实施方案中，R10在每次出现时独立地为(C1-C6)烷基。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，氨基磷酰基在每次出现时独立地为-P(=O)(OR50)NR51R52，其中
R50选自H、(C1-C6)烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳烷基和-(CH2)mSC(=O)C(CH3)2CH2OH；
m为1或2；
R51为H或(C1-C6)烷基；且
R52选自H、(C1-C6)烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基和-CR60R61C(=O)OR62，其中
R60和R61各自独立地为H或(C1-C6)烷基；且
R62选自H、(C1-C6)烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，R50为H。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，R50为芳基。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，R50为-(CH2)mSC(=O)C(CH3)2CH2OH。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，m为2。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，R51为H。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，R52为芳烷基。
或者，在根据上述项中任一项的某些实施方案中，R52为-CR60R61C(=O)OR62。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，R60为H；R61为(C1-C6)烷基；且R62为(C1-C6)烷基。
在某些实施方案中，所述式I化合物为由式IB表示的化合物或其药学上可接受的盐：
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，R7为H；L4、L5和L6各自为键；且R4、R5和R6中的任意两个各自为H。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，R4和R5各自为H。
或者，在根据上述项中任一项的某些实施方案中，R5和R6各自为H。
或者，在根据上述项中任一项的某些实施方案中，R4和R6各自为H。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，R4、R5和R6的任意R10OC(O)-的R10为H或(C1-C6)烷基。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，R4、R5和R6的任意氨基烷基为-CH2N(CH3)2。
在某些实施方案中，L4、L5和L6各自为键；且R6、R7和它们所连接的氮合起来代表-N=CR20R21。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，R20为H且R21为氨基。
在根据上述项中任一项的某些实施方案中，R4和R5各自为H。
或者，在某些实施方案中，R7为H；L4、L5和L6中的至少一个为-C(R0)2-O-连接基团；且与所述至少一个-C(R0)2-O-连接基团连接的任何R4、R5或R6为磷酰基。
定义
本文使用的术语“烷基”为本领域术语且是指饱和脂族基团，包括直链烷基、支链烷基、环烷基(脂环族)基团、烷基取代的环烷基和环烷基取代的烷基。在某些实施方案中，直链或支链烷基在其主链上具有约30个或更少的碳原子(例如，对于直链，C1-C30；对于支链，C3-C30)，并且，供选地，约20个或更少的碳原子。同样，环烷基在其环结构中具有约3-约10个碳原子，并且，供选地，在环结构中具有5、6或7个碳。
术语“氨基”为本领域术语且如在本文中所用，是指未被取代和被取代的胺，例如可由以下通式表示的部分：
和，
其中Ra、Rb和Rc各自独立地代表氢、烷基、烯基、-(CH2)x-Rd，或Ra和Rb与它们所连接的N原子合起来完成在环结构中具有4-8个原子的杂环；Rd代表芳基、环烷基、环烯基、杂环基或多环基；且x为0或在1-8范围内的整数。在某些实施方案中，Ra或Rb中仅一个可为羰基，例如Ra、Rb和氮不会一起形成酰亚胺。在其他实施方案中，Ra和Rb(和任选的Rc)各自独立地代表氢、烷基、烯基或-(CH2)x-Rd。
术语“酰基”为本领域术语且如本文中所用，是指形式RCO-的任何基或基团，其中R为任何有机基团，例如烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基。代表性酰基包括乙酰基、苯甲酰基和丙二酰基。
本文使用的术语“氨基烷基”是指被一个或多个氨基取代的烷基。
术语“氨基酰基”为本领域术语且如在本文中所用，是指被一个或多个氨基取代的酰基。
本文使用的术语“氨基硫酰基”是指氨酰基的类似物，其中RC(O)-的O已经被硫置换，因此具有形式RC(S)-。
术语“磷酰基”为本领域术语，且如在本文中所用可通常由下式表示：
，
其中Q50代表S或O，且R59代表氢、低级烷基或芳基；例如-P(O)(OMe)-或-P(O)(OH)2。当用以取代例如烷基时，磷酰基烷基的磷酰基可由以下通式表示：
，
其中Q50和R59各自独立地如上文限定，且Q51代表O、S或N；例如-O-P(O)(OH)OMe或-NH-P(O)(OH)2。当Q50为S时，该磷酰基部分为“硫代磷酸酯(phosphorothioate)”。
本文使用的术语“氨基磷酰基”是指被至少一个如本文定义的氨基取代的磷酰基；例如-P(O)(OH)NMe2。
本文使用的术语“羰基”是指-C(O)-。
本文使用的术语“硫羰基”是指-C(S)-。
本文使用的术语“烷基磷酰基”是指被至少一个如本文定义的烷基取代的磷酰基；例如-P(O)(OH)Me。
本文使用的术语“烷硫基”是指烷基-S-。
术语“芳基”为本领域术语且如本文所用，是指包括单环、二环和多环芳烃基团，例如苯、萘、蒽和芘。该芳环可在一个或多个环位置上被一个或多个诸如以下基团的取代基取代：卤素、叠氮基、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰胺基、膦酸酯、亚膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、磺酰胺基、酮、醛、酯、杂环基、芳族或杂芳族部分、氟烷基(诸如三氟甲基)、氰基等。术语“芳基”还包括具有两个或更多个环状环的多环体系，在这些环中两个或更多个碳为两个邻接环所共有(这些环为“稠合环”)，其中这些环中的至少一个为芳族烃，例如其他环状环可为环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。
术语“杂原子”为本领域认可的，且包括除碳和氢之外的任何元素的原子。说明性杂原子包括硼、氮、氧、磷、硫和硒和供选的氧、氮或硫。
术语“杂芳基”为本领域术语且如本文所用，是指在环结构中具有一个或多个杂原子的单环、二环或多环芳族基团，例如吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。“杂芳基”可在一个或多个环位置上被一个或多个诸如以下基团的取代基取代：卤素、叠氮基、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰胺基、膦酸酯、亚膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、磺酰胺基、酮、醛、酯、杂环基、芳族或杂芳族部分、氟烷基(诸如三氟甲基)、氰基等。术语“杂芳基”还包括具有两个或更多个环状环的多环体系，在这些环中两个或更多个碳为两个邻接环所共有(这些环为“稠合环”)，其中这些环中的至少一个为在环结构中具有一个或多个杂原子的芳族基团，例如其他环状环可为环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。
术语“芳烷基”为本领域术语且如在本文中所用，是指被芳基取代的烷基。
术语“杂芳烷基”为本领域术语且如在本文中所用，是指被杂芳基取代的烷基。
在本发明的组合物中包含的某些化合物可以特定的几何或立体异构形式存在。另外，本发明的化合物也可为光学活性的。本发明预期属于本发明的范围内的所有这样的化合物，包括顺式和反式异构体、(R)-和(S)-对映异构体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体、其外消旋混合物及其其他混合物。另外的不对称碳原子可在诸如烷基的取代基中存在。所有这样的异构体以及其混合物意欲包括在本发明中。
例如，如果希望本发明的化合物的特定对映异构体，则其可通过不对称合成或通过用手性助剂衍生来制备，其中将所产生的非对映混合物分离和使辅助基团解离以提供纯的所希望的对映异构体。或者，在所述分子含有诸如氨基的碱性官能团或诸如羧基的酸性官能团的情况下，非对映异构盐用适当光学活性的酸或碱、接着通过本领域熟知的分步结晶或层析方法拆分这样形成的非对映异构体且随后回收纯对映异构体来形成。
应理解，“取代”或“用……取代”包括以下隐含附带条件：所述取代根据被取代的原子和取代基的容许化合价且所述取代产生稳定的化合物，例如该混合物不会自发经历诸如通过重排、环化、消除的转化或其他反应。
术语“被取代”还预期包括有机化合物的所有容许的取代基。在一个广泛方面，所述容许取代基包括有机化合物的非环状和环状、分支和不分支、碳环和杂环、芳族和非芳族取代基。说明性取代基例如包括上文描述的那些。所述容许取代基可为对于适当有机化合物相同或不同的一种或多种取代基。对于本发明的目的，诸如氮的杂原子可具有氢取代基和/或满足杂原子的化合价的本文描述的有机化合物的任何容许取代基。本发明并非想要以任何方式受限于有机化合物的容许取代基。
对于本发明的目的，化学元素根据元素周期表，CAS版，化学和物理手册(Handbookof Chemistry and Physics)，第67版，1986-87，内封面确定。
本文中的其他化学术语根据本领域的常规用途使用，如麦格劳-希尔化学术语词典(McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms)(Parker, S.编，1985)，麦格劳-希尔出版公司，旧金山，以引用的方式结合到本文中来)所举例说明。除非另作定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。
本文使用的术语“保护基团”为保护潜在反应性官能团以免经历不希望的化学转化的临时性取代基。所述保护基团的实例包括羧酸和硼酸的酯、醇的醚及醛和酮的缩醛和缩酮。例如，本文使用的短语“N-端保护基团”或“氨基-保护基团”是指可用以保护氨基酸或肽的N-末端以防止在合成程序期间的不希望的反应的各种氨基-保护基团。合适基团的实例包括酰基保护基团，诸如(为了说明)甲酰基、丹磺酰基、乙酰基、苯甲酰基、三氟乙酰基、丁二酰基和甲氧基丁二酰基；芳族氨基甲酸酯保护基团，例如苄氧基羰基(Cbz)；和脂族氨基甲酸酯保护基团，诸如叔丁氧基羰基(Boc)或9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)。
术语“氨基-保护基团”或“N-端保护基团”是指用以保护氨基酸或肽的α-N-末端或另外保护氨基酸或肽的氨基以防止在合成程序期间的不希望的反应的那些基团。常用的N-保护基团公开在Greene，有机合成中的保护基团(Protective Groups In OrganicSynthesis)，(John Wiley & Sons, New York (1981))中，其通过引用结合到本文中。另外，保护基团可作为前药使用，这些前药例如通过酶促水解在体内容易地解离以释放生物学活性母体。α-N-保护基团包括低级烷酰基，诸如甲酰基、乙酰基(“Ac”)、丙酰基、特戊酰基、叔丁基乙酰基等；其他酰基包括2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻苯二甲酰基、邻硝基苯氧基乙酰基、氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基等；磺酰基，诸如苯磺酰基、对甲苯磺酰基等；氨基甲酸酯形成基团，诸如苄氧基羰基、对氯苄氧基羰基、对甲氧基苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基、对-溴苄氧基羰基、3,4-二甲氧基苄氧基羰基、3,5-二甲氧基苄氧基羰基、2,4-二甲氧基苄氧基羰基、4-乙氧基苄氧基羰基、2-硝基-4,5-二甲氧基苄氧基羰基、3,4,5-三甲氧基苄氧基羰基、1-(对联苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苄氧基羰基、二苯甲基氧基羰基、叔丁氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧基羰基、环戊氧基羰基、金刚烷氧基羰基、环己氧基羰基、苯硫基羰基等；芳基烷基，诸如苄基、三苯甲基、苄氧基甲基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)等；和甲硅烷基，诸如三甲基甲硅烷基等。其他实例包括叔己基(theyl)、丁二酰基、甲氧基丁二酰基、戊二酰基、己二酰基、壬二酰基、丹磺酰基、苄氧基羰基、甲氧基壬二酰基、甲氧基己二酰基、甲氧基戊二酰基和2,4-二硝基苯基。
术语“羧基保护基团”或“C-末端保护基团”是指在进行涉及化合物的其他官能位点的反应的同时用以阻断或保护羧酸官能团的羧酸保护酯或酰胺基团。羧基保护基团公开在Greene，有机合成中的保护基团，第152-186页(1981)中，其通过引用结合到本文中。另外，羧基保护基团可作为前药使用，由此这些羧酸保护基团可例如通过酶促水解在体内容易地解离以释放生物学活性母体。所述羧酸保护基团为本领域的技术人员所熟知，它们已经在青霉素和头孢菌素领域中广泛用于保护羧基，如在美国专利3,840,556号和3,719,667号中所述，这些专利的公开内容以引用的方式结合到本文中来。代表性羧基保护基团有C1-C8低级烷基(例如，甲基、乙基或叔丁基等)；芳基烷基，诸如苯乙基或苄基及其被取代的衍生物，诸如烷氧基苄基或硝基苄基等；芳基烯基，诸如苯基乙烯基等；芳基及其被取代的衍生物，诸如5-茚满基等；二烷基氨基烷基，诸如二甲氨基乙基等)；烷酰氧基烷基，诸如乙酰氧基甲基、丁酰氧基甲基、戊酰氧基甲基、异丁酰氧基甲基、异戊酰氧基甲基、1-(丙酰氧基)-1-乙基、1-(特戊酰氧基)-1-乙基、1-甲基-1-(丙酰氧基)-1-乙基、特戊酰氧基甲基、丙酰氧甲基等；环烷酰氧基烷基，诸如环丙基羰氧基甲基、环丁基羰氧基甲基、环戊基羰氧基甲基、环己基羰氧基甲基等；芳酰氧基烷基，诸如苯甲酰氧基甲基、苯甲酰氧基乙基等；芳烷基羰氧基烷基，诸如苄基羰氧基甲基、2-苄基羰氧基甲基等；烷氧基羰基烷基或环烷氧基羰基烷基，诸如甲氧基羰基甲基、环己氧基羰基甲基、1-甲氧基羰基-1-乙基等；烷氧基羰氧基烷基或环烷氧基羰氧基烷基，诸如甲氧基羰氧基甲基、叔丁氧基羰氧基甲基、1-乙氧基羰氧基-1-乙基、1-环己氧基羰氧基-1-乙基等；芳氧基羰氧基烷基，诸如2-(苯氧基羰氧基)乙基、2-(5-二氢茚氧基羰氧基)乙基等；烷氧基烷基羰氧基烷基，诸如2-(1-甲氧基-2-甲基丙-2-酰氧基)乙基等；芳基烷氧基羰氧基烷基，诸如2-(苄氧基羰氧基)乙基等；芳基烯氧基羰氧基烷基，诸如2-(3-苯基丙烯-2-基氧基羰氧基)乙基等；烷氧基羰基氨基烷基，诸如叔丁氧基羰基氨基甲基等；烷基氨基羰基氨基烷基，诸如甲基氨基羰基氨基甲基等；烷酰基氨基烷基，诸如乙酰基氨基甲基等；杂环羰氧基烷基，诸如4-甲基哌嗪基羰氧基甲基等；二烷基氨基羰基烷基，诸如二甲基氨基羰基甲基、二乙基氨基羰基甲基等；(5-(低级烷基)-2-氧代-1,3-二氧杂戊烯-4-基)烷基，诸如(5-叔丁基-2-氧代-1,3-二氧杂戊烯-4-基)甲基等；和(5-苯基-2-氧代-1,3-二氧杂戊烯-4-基)烷基，诸如(5-苯基-2-氧代-1,3-二氧杂戊烯-4-基)甲基等。代表性酰胺羧基保护基团有氨羰基和低级烷基氨羰基。例如，天门冬氨酸可在α-C-末端通过酸不稳定基团(例如，叔丁基)保护且在β-C-末端通过氢化不稳定基团(例如，苄基)保护，且随后在合成期间选择性地去保护。如上所述，受保护的羧基也可为低级烷基、环烷基或芳基烷基酯，例如，甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯、丁酯、仲丁酯、异丁酯、戊酯、异戊酯、辛酯、环己酯、苯乙酯等；或烷酰氧基烷基、环烷酰氧基烷基、芳酰氧基烷基或芳烷基羰氧基烷基酯。
本文使用的术语“氨基酸”为本领域术语且是指α-和β-氨基羧酸，包括所谓的天然存在的α-氨基酸和非天然存在的氨基酸。天然存在的α-氨基酸特别包括丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天门冬酰胺(Asn)、天门冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、鸟氨酸(Orn)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、硒代半胱氨酸、丝氨酸(Ser)、牛磺酸、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。极性天然存在的α-氨基酸包括精氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。非极性的天然存在的α-氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。
非天然存在的氨基酸包括但不限于D-氨基酸(即，具有与天然存在形式相反的手性的氨基酸)、N-α-甲基氨基酸、C-α-甲基氨基酸、β-甲基氨基酸、β-丙氨酸(β-Ala)、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、4-氨基丁酸(γ-Abu)、2-氨基异丁酸(Aib)、6-氨基己酸(ε-Ahx)、鸟氨酸(orn)、羟基脯氨酸(Hyp)、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、环己基丙氨酸、α-氨基异丁酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、3-氨基丙酸、2,3-二氨基丙酸(2,3-diaP)、D-或L-苯基甘氨酸、D-或L-2-萘基丙氨酸(2-Nal)、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸(Tic)、D-或L-2-噻吩丙氨酸(Thi)、D-或L-3-噻吩丙氨酸、D-或L-1-、2-、3-或4-芘基丙氨酸、D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸、D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸、D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸、D-或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸、D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸、D-(三氟甲基)-苯丙氨酸、D-对氟苯基丙氨酸、D-或L-对联苯基丙氨酸、D-或L-对甲氧基联苯基丙氨酸、硫氧甲硫氨酸(MSO)和高精氨酸(Har)。其他实例包括D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸和D-或L-烷基丙氨酸，其中烷基为被取代或未被取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基或异戊基；和膦酰基-或硫酸化(例如，-SO3H)非羧化氨基酸。
非天然存在的氨基酸的其他实例包括3-(2-氯苯基)-丙氨酸、3-氯-苯基丙氨酸、4-氯-苯基丙氨酸、2-氟-苯基丙氨酸、3-氟-苯基丙氨酸、4-氟-苯基丙氨酸、2-溴-苯基丙氨酸、3-溴-苯基丙氨酸、4-溴-苯基丙氨酸、高苯基丙氨酸、2-甲基-苯基丙氨酸、3-甲基-苯基丙氨酸、4-甲基-苯基丙氨酸、2,4-二甲基-苯基丙氨酸、2-硝基-苯基丙氨酸、3-硝基-苯基丙氨酸、4-硝基-苯基丙氨酸、2,4-二硝基-苯基丙氨酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸、1,2,3,4-四氢金刚烷-3-甲酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、五氟苯基丙氨酸、2,4-二氯-苯基丙氨酸、3,4-二氯-苯基丙氨酸、3,4-二氟-苯基丙氨酸、3,5-二氟-苯基丙氨酸、2,4,5-三氟-苯基丙氨酸、2-三氟甲基-苯基丙氨酸、3-三氟甲基-苯基丙氨酸、4-三氟甲基-苯基丙氨酸、2-氰基-苯基丙氨酸、3-氰基-苯基丙氨酸、4-氰基-苯基丙氨酸、2-碘-苯基丙氨酸、3-碘-苯基丙氨酸、4-碘-苯基丙氨酸、4-甲氧基苯基丙氨酸、2-氨基甲基-苯基丙氨酸、3-氨基甲基-苯基丙氨酸、4-氨基甲基-苯基丙氨酸、2-氨甲酰基-苯基丙氨酸、3-氨甲酰基-苯基丙氨酸、4-氨甲酰基-苯基丙氨酸、间酪氨酸、4-氨基-苯基丙氨酸、苯乙烯基丙氨酸、2-氨基-5-苯基-戊酸、9-蒽基丙氨酸、4-叔丁基-苯基丙氨酸、3,3-二苯基丙氨酸、4,4’-二苯基丙氨酸、苯甲酰基苯基丙氨酸、α-甲基-苯基丙氨酸、α-甲基-4-氟-苯基丙氨酸、4-噻唑基丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、2-噻吩基丙氨酸、2-(5-溴噻吩基)-丙氨酸、3-噻吩基丙氨酸、2-呋喃基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、烯丙基甘氨酸、2-氨基-4-溴-4-戊烯酸、炔丙基甘氨酸、4-氨基环戊-2-烯甲酸、3-氨基环戊烷甲酸、7-氨基-庚酸、二丙基甘氨酸、哌啶酸、氮杂环丁烷-3-甲酸、环丙基甘氨酸、环丙基丙氨酸、2-甲氧基-苯基甘氨酸、2-噻吩基甘氨酸、3-噻吩基甘氨酸、α-苄基-脯氨酸、α-(2-氟-苄基)-脯氨酸、α-(3-氟-苄基)-脯氨酸、α-(4-氟-苄基)-脯氨酸、α-(2-氯-苄基)-脯氨酸、α-(3-氯-苄基)-脯氨酸、α-(4-氯-苄基)-脯氨酸、α-(2-溴-苄基)-脯氨酸、α-(3-溴-苄基)-脯氨酸、α-(4-溴-苄基)-脯氨酸、α-苯乙基-脯氨酸、α-(2-甲基-苄基)-脯氨酸、α-(3-甲基-苄基)-脯氨酸、α-(4-甲基-苄基)-脯氨酸、α-(2-硝基-苄基)-脯氨酸、α-(3-硝基-苄基)-脯氨酸、α-(4-硝基-苄基)-脯氨酸、α-(1-萘基甲基)-脯氨酸、α-(2-萘基甲基)-脯氨酸、α-(2,4-二氯-苄基)-脯氨酸、α-(3,4-二氯-苄基)-脯氨酸、α-(3,4-二氟-苄基)-脯氨酸、α-(2-三氟甲基-苄基)-脯氨酸、α-(3-三氟甲基-苄基)-脯氨酸、α-(4-三氟甲基-苄基)-脯氨酸、α-(2-氰基-苄基)-脯氨酸、α-(3-氰基-苄基)-脯氨酸、α-(4-氰基-苄基)-脯氨酸、α-(2-碘-苄基)-脯氨酸、α-(3-碘-苄基)-脯氨酸、α-(4-碘-苄基)-脯氨酸、α-(3-苯基-烯丙基)-脯氨酸、α-(3-苯基-丙基)-脯氨酸、α-(4-叔丁基-苄基)-脯氨酸、α-二苯甲基-脯氨酸、α-(4-联苯基甲基)-脯氨酸、α-(4-噻唑基甲基)-脯氨酸、α-(3-苯并[b]硫苯基甲基)-脯氨酸、α-(2-硫苯基甲基)-脯氨酸、α-(5-溴-2-硫苯基甲基)-脯氨酸、α-(3-硫苯基甲基)-脯氨酸、α-(2-呋喃基甲基)-脯氨酸、α-(2-吡啶基甲基)-脯氨酸、α-(3-吡啶基甲基)-脯氨酸、α-(4-吡啶基甲基)-脯氨酸、α-烯丙基-脯氨酸、α-丙炔基-脯氨酸、γ-苄基-脯氨酸、γ-(2-氟-苄基)-脯氨酸、γ-(3-氟-苄基)-脯氨酸、γ-(4-氟-苄基)-脯氨酸、γ-(2-氯-苄基)-脯氨酸、γ-(3-氯-苄基)-脯氨酸、γ-(4-氯-苄基)-脯氨酸、γ-(2-溴-苄基)-脯氨酸、γ-(3-溴-苄基)-脯氨酸、γ-(4-溴-苄基)-脯氨酸、γ-(2-甲基-苄基)-脯氨酸、γ-(3-甲基-苄基)-脯氨酸、γ-(4-甲基-苄基)-脯氨酸、γ-(2-硝基-苄基)-脯氨酸、γ-(3-硝基-苄基)-脯氨酸、γ-(4-硝基-苄基)-脯氨酸、γ-(1-萘基甲基)-脯氨酸、γ-(2-萘基甲基)-脯氨酸、γ-(2,4-二氯-苄基)-脯氨酸、γ-(3,4-二氯-苄基)-脯氨酸、γ-(3,4-二氟-苄基)-脯氨酸、γ-(2-三氟甲基-苄基)-脯氨酸、γ-(3-三氟甲基-苄基)-脯氨酸、γ-(4-三氟甲基-苄基)-脯氨酸、γ-(2-氰基-苄基)-脯氨酸、γ-(3-氰基-苄基)-脯氨酸、γ-(4-氰基-苄基)-脯氨酸、γ-(2-碘-苄基)-脯氨酸、γ-(3-碘-苄基)-脯氨酸、γ-(4-碘-苄基)-脯氨酸、γ-(3-苯基-烯丙基-苄基)-脯氨酸、γ-(3-苯基-丙基-苄基)-脯氨酸、γ-(4-叔丁基-苄基)-脯氨酸、γ-二苯甲基-脯氨酸、γ-(4-联苯基甲基)-脯氨酸、γ-(4-噻唑基甲基)-脯氨酸、γ-(3-苯并噻吩基甲基)-脯氨酸、γ-(2-噻吩基甲基)-脯氨酸、γ-(3-噻吩基甲基)-脯氨酸、γ-(2-呋喃基甲基)-脯氨酸、γ-(2-吡啶基甲基)-脯氨酸、γ-(3-吡啶基甲基)-脯氨酸、γ-(4-吡啶基甲基)-脯氨酸、γ-烯丙基-脯氨酸、γ-丙炔基-脯氨酸、反-4-苯基-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(2-氟-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(3-氟-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(4-氟-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(2-氯-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(3-氯-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(4-氯-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(2-溴-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(3-溴-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(4-溴-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(2-甲基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(3-甲基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(4-甲基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(2-硝基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(3-硝基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(4-硝基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(1-萘基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(2-萘基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(2,5-二氯-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(2,3-二氯-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(2-三氟甲基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(3-三氟甲基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(4-三氟甲基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(2-氰基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(3-氰基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(4-氰基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(2-甲氧基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(3-甲氧基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(4-甲氧基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(2-羟基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(3-羟基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(4-羟基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(2,3-二甲氧基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(3,4-二甲氧基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(3,5-二甲氧基-苯基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(2-吡啶基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(3-吡啶基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(6-甲氧基-3-吡啶基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(4-吡啶基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(2-噻吩基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(3-噻吩基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-(2-呋喃基)-吡咯烷-3-甲酸、反-4-异丙基-吡咯烷-3-甲酸、4-膦酰基甲基-苯基丙氨酸、苄基-磷酸苏氨酸、(1’-氨基-2-苯基-乙基)氧杂环丙烷、(1’-氨基-2-环己基-乙基)氧杂环丙烷、(1’-氨基-2-[3-溴-苯基]乙基)氧杂环丙烷、(1’-氨基-2-[4-(苄氧基)苯基]乙基)氧杂环丙烷、(1’-氨基-2-[3,5-二氟-苯基]乙基)氧杂环丙烷、(1’-氨基-2-[4-氨甲酰基-苯基]乙基)氧杂环丙烷、(1’-氨基-2-[苄氧基-乙基])氧杂环丙烷、(1’-氨基-2-[4-硝基-苯基]乙基)氧杂环丙烷、(1’-氨基-3-苯基-丙基)氧杂环丙烷、(1’-氨基-3-苯基-丙基)氧杂环丙烷和/或其盐和/或保护基团变体。
β-氨基酸包括而不限于β-丙氨酸(3-氨基丙酸)。
本文使用的术语“本发明的化合物”是指式I化合物及其药学上可接受的盐。
本文使用的术语“药学上可接受的盐”包括衍生自例如包括以下各酸的无机或有机酸的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、磷酸、甲酸、乙酸、乳酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、乙醇酸、水杨酸、柠檬酸、甲磺酸、苯磺酸、苯甲酸、丙二酸、三氟乙酸、三氯乙酸、萘-2-磺酸及其他酸。药学上可接受的盐形式可包括其中包括盐的分子的比率不为1:1的形式。例如，该盐可包括多于一个无机或有机酸分子/基础分子，诸如两分子盐酸/分子式I化合物。作为另一实例，该盐可包含小于1分子无机或有机酸/基础分子，诸如两分子式I化合物/分子酒石酸。
本文使用的术语“载体”和“药学上可接受的载体”是指用其施用化合物或配制化合物以便施用的稀释剂、助剂、赋形剂或媒剂。所述药学上可接受的载体的非限制性实例包括液体，诸如水、盐水和油；和固体，诸如阿拉伯胶、明胶、淀粉糊、滑石粉、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。另外，可使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂、调味剂和着色剂。合适药物载体的其他实例描述在E.W. Martin的雷氏药学大全(Remington’s PharmaceuticalSciences)中，其全部内容以引用的方式结合到本文中。
本文使用的术语“治疗”是指预防、中止或减缓受试者的疾病或病状的进展或消除受试者的疾病或病症。在一个实施方案中，“治疗”是指中止或减缓受试者的疾病或病状的进展或消除受试者的疾病或病症。在一个实施方案中，“治疗”是指减少疾病或病状的至少一种目标表现形式。
本文使用的术语“有效量”是指足以产生所希望的生物效应的量。
本文使用的术语“抑制”是指减小可客观测量的量或程度。在各种实施方案中，与相关对照相比较，“抑制”是指减小至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。在一个实施方案中，“抑制”是指减小100%，即中止或消除。
本文使用的术语“受试者”是指哺乳动物。在各种实施方案中，受试者为小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、绵羊、马、奶牛或非人类灵长类动物。在一个实施方案中，受试者为人类。
在某些实施方案中，由式I表示的化合物选自：
、、、、和及其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，由式I表示的化合物选自：
(S)-((2R,3R,4S,5S)-2-氨基-3-甲基丁酸5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基吡咯烷-2-基)甲酯；
(2S,3S)-((2R,3R,4S,5S)-2-氨基-3-甲基戊酸5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基吡咯烷-2-基)甲酯；
(S)-((2R,3R,4S,5S)-2-氨基-4-甲基戊酸5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基吡咯烷-2-基)甲酯；
(2S,2'S)-(2S,3S,4R,5R)-双(2-氨基-3-甲基丁酸)2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-5-(羟基甲基)吡咯烷-3,4-二基酯；
(S)-(2R,3R,4S,5S)-2-氨基-3-甲基丁酸5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-羟基-2-(羟基甲基)吡咯烷-3-基酯；
(S)-(2S,3S,4R,5R)-2-氨基-3-甲基丁酸2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-3-基酯；和
其药学上可接受的盐。
制备本发明的化合物的通用方法：
杂环和杂芳基化合物可由如在文献中报道的已知方法制备(a. 环系手册(Ringsystem handbook)，由美国化学学会1993版和随后增刊出版。b. The Chemistry of Heterocyclic Compounds; Weissberger, A.编；Wiley: New York, 1962. c. Nesynov,E. P.; Grekov, A. P. 1,3,4-噁二唑衍生物的化学(The chemistry of 1,3,4-oxadiazole derivatives). Russ. Chem. Rev. 1964, 33, 508-515. d. Advances in Heterocyclic Chemistry; Katritzky, A. R., Boulton, A. J.编；Academic Press:New York, 1966. e. In Comprehensive Heterocyclic Chemistry; Potts, K. T.编；Pergamon Press: Oxford, 1984. f. Eloy, F. A review of the chemistry of 1,2,4-oxadiazoles (1,3,4-噁二唑化学的综述). Fortschr.Chem. Forsch. 1965, 4, 第807-876页. g. Adv. Heterocycl. Chem. 1976. h. Comprehensive Heterocyclic Chemistry; Potts, K. T.编；Pergamon Press: Oxford, 1984. i. Chem. Rev. 196161, 87-127. j. 1,2,4-Triazoles; John Wiley & Sons: New York, 1981; 第37卷)。官能团在合成期间可能需要受到保护且随后去保护。合适保护基团的实例可见于Greene和Wuts编的有机合成中的保护基团，第4版中。
可用以制备本发明的化合物和用于制备其的中间体的代表性方法在以下流程中表示。
流程1
流程2
流程3
流程4
流程5
流程6
流程7
流程8
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制备(S)-2-(羟甲基)-2,3-二氢-1H-吡咯-1-甲酸叔丁酯(23d)的参考文献：
1. Oliveira, Denilson F.; Miranda, Paulo C. M. L.; Correia, Carlos R.D; Journal of Organic Chemistry (1999), 64(18), 6646-6652；
2. Schumacher, Kelly K.; Jiang, Jianjun; Joullie, Madeleine M;Tetrahedron: Asymmetry (1998), 9(1), 47-53；
3. Dormoy, Jean Robert; Castro, Bertrand; Chappuis, Georges;Fritschi, Ulrich Stefan; Grogg, Peter; Angewandte Chemie (1980), 92(9), 761；
4. Woo, Grace H. C.; Kim, Se-Ho; Wipf, Peter; Tetrahedron (2006), 62(45), 10507-10517；
5. Moro, Angelica Venturini; Rodrigues dos Santos, Marcelo; Correia,Carlos Roque D; European Journal of Organic Chemistry (2011), 2011 (36),7259-7270。
与制备化合物23g和23h相关的Heck偶合的参考文献：
Severino, Elias A.; Costenaro, Edson R.; Garcia, Ariel L. L.;Correia, Carlos Roque D; Organic Letters (2003), 5(3), 305-308。
流程24
流程25
流程26
流程27
流程28
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流程31
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流程33
流程34
流程35
流程36
流程37
流程38
流程39A
流程39B
流程40
制备(3aR,4R,6aR)-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-6-氧代二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(40a)的参考文献：
1. Malladi, Venkata L. A.; Sobczak, Adam J.; Meyer, Tiffany M.; Pei,Dehua; Wnuk, Stanislaw F; Bioorganic & Medicinal Chemistry (2011), 19(18),5507-5519；
2. Fiaux, Helene; Kuntz, Douglas A.; Hoffman, Daniela; Janzer, RobertC.; Gerber-Lemaire, Sandrine; Rose, David R.; Juillerat-Jeanneret; Bioorganic& Medicinal Chemistry (2008), 16(15), 7337-7346；
3. Yokoyama, Masataka; Ikenogami, Taku; Togo, Hideo.Inage-ku, Yayoi-cho; Perkin 1 (2000), (13), 2067-2071；
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使内酯(40a)还原成内半缩醛(40b)的参考文献：
1. Malladi, Venkata L. A.; Sobczak, Adam J.; Meyer, Tiffany M.; Pei,Dehua; Wnuk, Stanislaw F; Bioorganic & Medicinal Chemistry (2011), 19(18),5507-5519；
2. Wang, Xiao-Ling; Huang, Wen-Feng; Lei, Xin-Sheng; Wei, Bang-Guo;Lin, Guo-Qiang; Tetrahedron (2011), 67(26), 4919-4923；
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4. Hulme, Alison N.; Montgomery, Charles H; Tetrahedron Letters(2003), 44(41), 7649-7653。
从内半缩醛到溴化合物(40c)的参考文献：
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6. Castro, Bertrand R. Ecole Nationale Superieure de Chimie deMontpellier, Montpellier, Fr. Organic Reactions (Hoboken, NJ, United States)(1983), 29 Publisher: John Wiley & Sons, Inc。
流程41
在一个实施方案中，所述式I化合物选自：、、、、、、、和及其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，所述式I化合物为
或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，所述式I化合物选自：
、、、、、和及其药学上可接受的盐，其中，在各种情况下，“AA”代表氨基酸的氨酰基，例如丙氨酰基、亮氨酰基、甲硫氨酰基或缬氨酰基。
在一个实施方案中，所述式I化合物选自
和及其药学上可接受的盐，其中，在各种情况下，“AA”代表氨基酸的氨酰基，例如丙氨酰基、亮氨酰基、甲硫氨酰基或缬氨酰基。
在一个实施方案中，所述式I化合物选自和及其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，所述式I化合物选自
、、和及其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，所述式I化合物选自和及其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，所述式I化合物为
或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，所述式I化合物为
或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，所述式I化合物选自
、和及其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，所述式I化合物选自
、和及其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，所述式I化合物选自
和及其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，所述式I化合物为
或其药学上可接受的盐。
本发明的一方面为包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐及药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明的一方面为制备药物组合物的方法。所述方法包括组合本发明的化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体的步骤。
本发明的化合物可用于抑制某些病毒的核酸聚合酶活性。本发明的化合物也可用于抑制病毒复制或治疗病毒感染。
动物RNA病毒基于它们的基因组和复制模式而分为三个不同的组(和基于古老的巴尔的摩分类法(older Baltimore classification)的数字组)：
双链(ds) RNA病毒(巴尔的摩分类III组)含有1-12种不同的RNA分子，每种分子编码一种或多种病毒蛋白。dsRNA病毒的实例包括呼肠孤病毒科(reoviridae)。
正义单链(ss)RNA病毒(巴尔的摩分类IV组)具有就像其为mRNA一样直接利用的基因组，生成单一蛋白，该蛋白通过宿主或病毒蛋白修饰以形成复制所需要的各种蛋白。这些蛋白中的一种包括RNA-依赖性RNA聚合酶，其复制病毒RNA以形成双链复制形式，其继而指导新病毒子的形成。正义ssRNA病毒的实例包括披膜病毒科(togaviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、杯状病毒科(calciviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、小核粮核酸病毒科(picornaviridae)和披膜病毒科(togaviridae)。
负义ssRNA病毒(巴尔的摩分类V组)必须具有通过RNA聚合酶复制的它们的基因组以形成正义RNA。这意味着病毒必须随RNA-依赖性RNA聚合酶。正义RNA分子随后充当病毒mRNA，其通过宿主核糖体转译成蛋白。所得蛋白接着指导诸如衣壳蛋白和RNA复制酶的新病毒子的合成，其用以生成新的负义RNA分子。负义ssRNA病毒包括玻那病毒科(bornaviridae)、丝状病毒科(filoviridae)、正粘病毒科(orthomyxoviridae)、副粘病毒科(paramyxoviridae)、弹状病毒科(rhabdoviridae)、砂粒病毒科(arenaviridae)和布尼亚病毒科(bunyaviridae)。
逆转录病毒(巴尔的摩分类VI组)具有单链RNA基因组，但通常因为它们使用DNA中间体来复制而不被视为RNA病毒。逆转录酶(来自脱外被后的病毒本身的病毒酶)使病毒RNA转化成DNA的互补链，其复制生成病毒DNA的双链分子。在该DNA整合之后，所编码基因的表达可引起形成新病毒子。逆转录病毒包括但不限于HIV-1和HIV-2。
本发明的一方面为抑制病毒的病毒核酸聚合酶活性的方法。所述方法包括使所述病毒的病毒核酸聚合酶与有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐接触的步骤。
在一个实施方案中，所述病毒核酸聚合酶为DNA聚合酶。
在一个实施方案中，所述病毒核酸聚合酶为RNA聚合酶。
在一个实施方案中，所述病毒选自RNA病毒。
在一个实施方案中，所述病毒选自正粘病毒科(orthomyxovirid)、副粘病毒科(paramyxoviridae)、砂粒病毒科(arenaviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、丝状病毒科(filoviridae)、披膜病毒科(togaviridae)、小核粮核酸病毒科(picornaviridae)和冠状病毒科(coronaviridae)。
在一个实施方案中，所述病毒选自腺病毒(adenovirus)、鼻病毒(rhinovirus)、甲型肝炎病毒(hepatitis A virus)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)、脊髓灰质炎病毒(polio virus)、麻疹病毒(measles)、埃博拉病毒(Ebola virus)、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、西尼罗病毒(West Nile virus)、天花病毒(smallpox virus)、黄热病毒(yellowfever virus)、登革热病毒(Dengue Fever virus)、甲型流感病毒(influenza A virus)、乙型流感病毒(influenza B virus)、拉沙病毒(lassa virus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus)、胡宁病毒(Junin virus)、machuppo病毒(machuppo virus)、瓜纳里多病毒(guanarito virus)、汉坦病毒(hantavirus)、立谷热病毒(Rift Valley Fever virus)、拉克罗斯病毒(La Crosse virus)、加利福尼亚脑炎病毒(California encephalitis virus)、克里米亚-刚果病毒(Crimean-Congo virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)、基萨诺尔森林病病毒(Kyasanur Forest virus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitisvirus)、东方马脑炎病毒(eastern equine encephalitis virus)、西方马脑炎病毒(western equine encephalitis virus)、严重急性呼吸综合征(severe acuterespiratory syndrome, SARS)病毒、副流感病毒(parainfluenza virus)、呼吸道融合病毒(respiratory syncytial vitus)、庞塔托鲁病毒(Punta Toro virus)、塔卡里伯病毒(Tacaribe virus)和皮钦德病毒(Pichinde virus)。
在一个实施方案中，所述病毒选自腺病毒(adenovirus)、登革热病毒(DengueFever virus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、甲型流感病毒(influenza A virus)、乙型流感病毒(influenza B virus)、胡宁病毒(Junin virus)、麻疹病毒(measles)、副流感病毒(parainfluenza virus)、皮钦德病毒(Pichinde virus)、庞塔托鲁病毒(Punta Toro virus)、呼吸道融合病毒(respiratory syncytial vitus)、鼻病毒(rhinovirus)、立谷热病毒(Rift Valley Fever virus)、SARS病毒、塔卡里伯病毒(Tacaribe virus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、西尼罗病毒(West Nile virus)和黄热病毒(yellow fever virus)。
在一个实施方案中，所述病毒选自埃博拉病毒(Ebola virus)、黄热病毒(yellowfever virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、甲型流感病毒(influenza A virus)和乙型流感病毒(influenza B virus)。
本发明的一方面为抑制病毒复制的方法。所述方法包括使病毒与有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐接触以抑制所述病毒复制的步骤。
在一个实施方案中，所述病毒选自RNA病毒。
在一个实施方案中，所述病毒选自正粘病毒科(orthomyxovirid)、副粘病毒科(paramyxoviridae)、砂粒病毒科(arenaviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、丝状病毒科(filoviridae)、披膜病毒科(togaviridae)、小核粮核酸病毒科(picornaviridae)和冠状病毒科(coronaviridae)。
在一个实施方案中，所述病毒选自腺病毒(adenovirus)、鼻病毒(rhinovirus)、甲型肝炎病毒(hepatitis A virus)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)、脊髓灰质炎病毒(polio virus)、麻疹病毒(measles)、埃博拉病毒(Ebola virus)、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、西尼罗病毒(West Nile virus)、天花病毒(smallpox virus)、黄热病毒(yellowfever virus)、登革热病毒(Dengue Fever virus)、甲型流感病毒(influenza A virus)、乙型流感病毒(influenza B virus)、拉沙病毒(lassa virus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus)、胡宁病毒(Junin virus)、machuppo病毒(machuppo virus)、瓜纳里多病毒(guanarito virus)、汉坦病毒(hantavirus)、立谷热病毒(Rift Valley Fever virus)、拉克罗斯病毒(La Crosse virus)、加利福尼亚脑炎病毒(California encephalitis virus)、克里米亚-刚果病毒(Crimean-Congo virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)、基萨诺尔森林病病毒(Kyasanur Forest virus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitisvirus)、东方马脑炎病毒(eastern equine encephalitis virus)、西方马脑炎病毒(western equine encephalitis virus)、严重急性呼吸综合征(severe acuterespiratory syndrome, SARS)病毒、副流感病毒(parainfluenza virus)、呼吸道融合病毒(respiratory syncytial vitus)、庞塔托鲁病毒(Punta Toro virus)、塔卡里伯病毒(Tacaribe virus)和皮钦德病毒(Pichinde virus)。
在一个实施方案中，所述病毒选自腺病毒(adenovirus)、登革热病毒(DengueFever virus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、甲型流感病毒(influenza A virus)、乙型流感病毒(influenza B virus)、胡宁病毒(Junin virus)、麻疹病毒(measles)、副流感病毒(parainfluenza virus)、皮钦德病毒(Pichinde virus)、庞塔托鲁病毒(Punta Toro virus)、呼吸道融合病毒(respiratory syncytial vitus)、鼻病毒(rhinovirus)、立谷热病毒(Rift Valley Fever virus)、SARS病毒、塔卡里伯病毒(Tacaribe virus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、西尼罗病毒(West Nile virus)和黄热病毒(yellow fever virus)。
在一个实施方案中，所述病毒选自埃博拉病毒(Ebola virus)、黄热病毒(yellowfever virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、甲型流感病毒(influenza A virus)和乙型流感病毒(influenza B virus)。
本发明的一方面为治疗在受试者中的病毒感染的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐的步骤。
在一个实施方案中，所述病毒选自RNA病毒。
在一个实施方案中，所述病毒选自所述病毒选自正粘病毒科(orthomyxovirid)、副粘病毒科(paramyxoviridae)、砂粒病毒科(arenaviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、丝状病毒科(filoviridae)、披膜病毒科(togaviridae)、小核粮核酸病毒科(picornaviridae)和冠状病毒科(coronaviridae)。
在一个实施方案中，所述病毒选自腺病毒(adenovirus)、鼻病毒(rhinovirus)、甲型肝炎病毒(hepatitis A virus)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)、脊髓灰质炎病毒(polio virus)、麻疹病毒(measles)、埃博拉病毒(Ebola virus)、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、西尼罗病毒(West Nile virus)、天花病毒(smallpox virus)、黄热病毒(yellowfever virus)、登革热病毒(Dengue Fever virus)、甲型流感病毒(influenza A virus)、乙型流感病毒(influenza B virus)、拉沙病毒(lassa virus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus)、胡宁病毒(Junin virus)、machuppo病毒(machuppo virus)、瓜纳里多病毒(guanarito virus)、汉坦病毒(hantavirus)、立谷热病毒(Rift Valley Fever virus)、拉克罗斯病毒(La Crosse virus)、加利福尼亚脑炎病毒(California encephalitis virus)、克里米亚-刚果病毒(Crimean-Congo virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)、基萨诺尔森林病病毒(Kyasanur Forest virus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitisvirus)、东方马脑炎病毒(eastern equine encephalitis virus)、西方马脑炎病毒(western equine encephalitis virus)、严重急性呼吸综合征(severe acuterespiratory syndrome, SARS)病毒、副流感病毒(parainfluenza virus)、呼吸道融合病毒(respiratory syncytial vitus)、庞塔托鲁病毒(Punta Toro virus)、塔卡里伯病毒(Tacaribe virus)和皮钦德病毒(Pichinde virus)。
在一个实施方案中，所述病毒选自腺病毒(adenovirus)、登革热病毒(DengueFever virus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、甲型流感病毒(influenza A virus)、乙型流感病毒(influenza B virus)、胡宁病毒(Junin virus)、麻疹病毒(measles)、副流感病毒(parainfluenza virus)、皮钦德病毒(Pichinde virus)、庞塔托鲁病毒(Punta Toro virus)、呼吸道融合病毒(respiratory syncytial vitus)、鼻病毒(rhinovirus)、立谷热病毒(Rift Valley Fever virus)、SARS病毒、塔卡里伯病毒(Tacaribe virus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、西尼罗病毒(West Nile virus)和黄热病毒(yellow fever virus)。
在一个实施方案中，所述病毒选自埃博拉病毒(Ebola virus)、黄热病毒(yellowfever virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、甲型流感病毒(influenza A virus)和乙型流感病毒(influenza B virus)。
可将本发明的化合物配制为药物组合物并以适合所选的施用路径如经口或肠胃外、静脉内、腹腔内、肌内、局部或皮下路径的各种形式施用到诸如人类患者的哺乳动物宿主。
因此，本发明化合物可与诸如惰性稀释剂或可同化的可食用载体的药学上可接受的媒剂组合例如经口全身性地施用。可将它们密封在硬或软壳明胶胶囊中，可将其压成片剂，或可将其与患者饮食的食物直接合并。对于经口治疗施用，可将所述活性化合物与一种或多种赋形剂组合并以可摄取片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糊剂、压片等形式使用。所述组合物和制剂将含有至少0.1%的活性化合物。所述组合物和制剂的百分比当然可变化且可方便地在指定单位剂型的约2重量%至约60重量%之间。在所述治疗有用组合物中活性化合物的量使得将获得有效剂量水平。
所述片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可含有以下稀释剂和载体：粘合剂，诸如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；和甜味剂，诸如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜；或者可加入调味剂，诸如椒样薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当单位剂型为胶囊时，除了上述类型的材料之外，其还可含有液态载体，诸如植物油或聚乙二醇。各种其他材料可作为衣料存在或另外改性固态单位剂型的实物形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可用明胶、蜡、虫胶或糖等覆衣。糊剂或酏剂可含有所述活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和诸如樱桃或橙子调料的调味剂。当然，在制备任何单位剂型中使用的任何材料都将为药学上可接受的且在所使用的量上基本无毒。另外，可将所述活性化合物合并到缓释制剂和装置中。
所述化合物也可通过输注或注射静脉内或腹腔内施用。所述活性化合物或其盐的溶液可在水或生理学可接受的水溶液中制备，任选将其与无毒的表面活性剂混合。还可在甘油、液态聚乙二醇、三乙酸甘油酯及其混合物中和在油中制备分散体。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
适合注射或输注的药物剂型可包括包含活性成分的无菌水溶液或分散体或无菌粉末，所述无菌粉末适合临时制备无菌可注射或可输注的溶液或分散体，任选封装在脂质体中。在所有情况下，最后剂型在制造和储存条件下应该为无菌、流态并稳定的。该液态载体或媒剂可为溶剂或液态分散介质，例如包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其合适的混合物。恰当的流动性可例如通过形成脂质体、在分散体的情况下通过维持所需要的粒度或通过使用表面活性剂来维持。微生物作用的预防可通过例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等各种抗菌剂和防真菌剂来实现。在很多情况下，将优选包括例如糖的等渗剂、缓冲剂或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用例如单硬脂酸铝和明胶的延迟吸收剂来实现。
无菌可注射溶液可通过将所需要量的活性化合物与上文所列的各种其他成分在适当溶剂中合并、根据需要接着过滤灭菌来制备。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法可包括真空干燥和冻干技术，其产生活性成分加在先前无菌过滤的溶液中的任何另外的所要成分的粉末。
对于局部施用，本发明化合物可以纯形式(即，在它们为液体时)应用。然而，通常将希望将它们作为组合物或制剂与皮肤病学可接受的载体组合施用到皮肤上，该载体可为固体或液体。
有用的固态载体包括细分散的固体，诸如滑石粉、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。有用的液态载体包括水、醇或二醇或水-醇/二醇共混物，本发明的化合物可以有效水平、任选借助于无毒的表面活性剂溶解或分散在其中。可加入诸如香料和其他抗微生物剂的助剂以对于指定用途优化性质。所得液态组合物可从吸收剂垫应用，用以浸渍绷带及其他敷料或使用泵型或气溶胶喷雾器喷雾到受影响区域上。
诸如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物材料的增稠剂也可与液态载体一起使用以形成可涂抹的糊剂、凝胶剂、软膏、皂等，以便直接应用到使用者的皮肤上。
可用以将所述式I化合物传送到皮肤的有用的皮肤学组合物的实例为本领域所知，例如，参见Jacquet等(美国专利4,608,392号，以引用的方式结合到本文中来)、Geria(美国专利4,992,478号，以引用的方式结合到本文中来)、Smith等(美国专利4,559,157号，以引用的方式结合到本文中来)和Wortzman(美国专利4,820,508号，以引用的方式结合到本文中来)。
本发明化合物的有用剂量可通过比较它们在动物模型中的体外活性与体内活性来确定。将在小鼠及其他动物中的有效剂量外推到人类的方法为本领域所知，例如参见美国专利4,938,949号。
用于治疗所需要的化合物或其活性盐或衍生物的量将不仅随所选择的特定化合物或盐而变化，而且随施用路径、治疗的病状的性质和患者的年龄和状况而变化，且最终将按照主治医生或临床医生的医嘱。
然而，通常，合适的剂量将在约0.5-约100mg/kg体重受体/日的范围内，例如为3-约90mg/kg体重/日、约6-约75mg/kg体重/日、约10-约60mg/kg/日或约15-约50mg/kg/日。
本发明的化合物可方便地配制成单位剂型，例如，每单位剂型含有5-1000mg、10-750mg或50-500mg活性成分。在一个实施方案中，本发明提供包含以这种单位剂型配制的本发明化合物的组合物。所要的剂量可方便地以单剂量提供或作为将以适当的间隔施用的分次剂量，例如作为2、3、4或更多的子剂量/日提供。该子剂量本身可例如进一步分成许多离散的松散间隔施用剂，诸如来自吸入器的多次吸入剂或通过将多滴应用到眼睛。
本发明的化合物也可与例如可用于治疗病毒感染的其他药剂的其他治疗剂组合施用。
本发明还提供药盒，其包含本发明的化合物或其药学上接受的盐、至少一种其他治疗剂、包装材料和用于将本发明的化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种所述其他治疗剂施用到哺乳动物以治疗所述哺乳动物的病毒感染的说明书。在一个实施方案中，所述哺乳动物为人类。
现在将通过以下非限制性实施例说明本发明。
实施例
实施例1：(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-5-(羟基甲基)吡咯烷-3,4-二醇二盐酸盐(12i)
(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(28f)分三批如下处理。
将批料1(28f)溶解于盐酸水溶液(1658.8mmol，118mL浓盐酸和293mL水)中。
将批料2(28f)溶解于盐酸水溶液(239.6mmol，169mL浓盐酸和421mL水)中。
将批料3(28f)溶解于盐酸水溶液(263.5mmol，186mL浓盐酸和468mL水)中。
将反应混合物在室温下搅拌30分钟(强烈放出CO2气体)，且随后将各批料真空浓缩至干燥(80-90℃)。将批料2和3汇集以给出226g潮湿的亮黄色产物。批料1给出91.4g暗灰色产物。如下进行结晶：对于批料2和3的湿产物：将226mL水加到产物中，随后加热到50℃，此时缓慢加入热乙醇，直至结晶开始。将混合物在强烈搅拌下保持在50℃下10分钟，随后达到25℃，之后过滤以给出浅黄色粉末(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-5-(羟基甲基)吡咯烷-3,4-二醇(12i)(88g，52%)。将批料1同样地纯化以给出33.0g(59%)浅灰色产物。在55℃下在高真空下干燥之后，总产量为121.0g (53.5%)。将来自批料1和2的重结晶的母液再处理以给出15.0g浅黄色粉末产物(12i)；熔点：238℃。1H NMR (300MHz, DMSO-d 6 ) δ 14.60 (s, 1H), 13.25 (s, 1H), 10.23 (s, 1H), 9.13 (s, 2H),8.84 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.11 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 5.55 (s, 2H), 4.78 (d,J = 4.4 Hz, 1H), 4.44 (dd, J = 8.8, 5.0 Hz, 1H), 4.14-4.02 (m, 1H), 3.73 (d,J = 5.1 Hz, 2H), 3.52 (s, 1H); 1H NMR (300 MHz, D2O) δ 8.33 (s, 1H), 7.94 (s,1H), 4.90 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.65 (s, 1H), 4.37 (dd, J = 4.8, 3.4 Hz, 1H),3.89 (s, 1H), 3.88 (s, 1H), 3.81 (dd, J = 8.1, 4.5 Hz, 1H); MS (ES+) 266.3 (M+1)；旋光度-52.69; (H2O, C=1.15)；分析：C11H15N5O3•2HCl.0.25H2O，计算值：C, 38.55; H,5.15; Cl, 20.44; N, 20.69；实验值：C, 38.67; H, 5.05; Cl, 20.45; N, 20.42。
由(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-(4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)吡咯烷-3,4-二基酯(28c)制备(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-5-(羟基甲基)吡咯烷-3,4-二醇二盐酸盐(12i)的供选方法
在-50℃下将(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-(4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-吡咯烷-3,4-二基酯(28c)(40g，78.29mmol)在乙醇(400mL)中的澄清溶液用氨(相对于乙醇，35体积%)吹扫。将冷冻的溶液小心地倾入高压釡中并在100-105℃下加热16小时。检查TLC以确保反应完成。使混合物冷却到室温。蒸馏溶剂以给出38g作为深褐色粘性物质的(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(28f)。
向(2S,3R,4S,5S)-5-(羟基甲基)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-吡咯烷-3,4-二羟基甲酸叔丁酯(28f) (292g，799.16mmol)在去离子水(584mL)中的搅拌溶液中加入浓盐酸(423mL)。将所得澄清溶液在室温下搅拌30分钟。随后，将其浓缩至干燥(水浴，80-90℃)，以得到潮湿的黄色固体。随后将湿饼用去离子水(475mL)稀释且让其在70℃下加热以得到澄清溶液，并将其冷却到50℃。缓慢加入热乙醇(1.6L)以实现部分沉淀。将混合物在60℃下搅拌10分钟。让混合物冷却到室温并冷却到10℃，且在该温度下搅拌1小时。所获得的固体通过过滤收集，在55-60℃下干燥，直至获得恒定重量，以给出作为浅黄色至灰白色固体的(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-5-(羟基甲基)吡咯烷-3,4-二醇二盐酸盐(12i)(65g)；熔点：255.5℃。1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 14.64(s, 1H), 13.19 (s, 1H), 10.20 (s, 1H), 9.11 (s, 2H), 8.83 (s, 1H), 8.64 (s,1H), 8.11 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 5.99-5.20 (bs, 2H), 4.78 (s, 1H), 4.43 (dd, J= 8.9, 4.9 Hz, 1H), 4.11 (t, J = 4.2 Hz, 1H), 3.73 (d, J = 5.1 Hz, 2H), 3.51(s, 2H); MS (ES+) 266.1 (M+1)；旋光度-51.74 (H2O，C=0.545)；分析：C11H15N5O3•2HCl•0.25H2O，计算值：C, 38.55; H, 5.15; Cl, 20.69; N, 20.44；实验值：C, 38.51; H,5.11; Cl, 20.57; N, 20.31。
制备(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-(4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)吡咯烷-3,4-二基酯(28c)和(2S,3R,4S,5S)-5-(羟基甲基)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-吡咯烷-3,4-二羟基甲酸叔丁酯(28f)
步骤1：制备D-核糖酸内酯(19b)
将装有机械搅拌器、1L压力平衡加料漏斗和高效冷凝器的22-L三颈烧瓶装上D-核酸糖(19a)(2.0kg，13.33mol)、固态碳酸氢钠(2.24kg，26.66mole)和水(12L)。将反应混合物在室温下搅拌1小时，此时大多数固体消失。将反应容器置于内部温度维持在5 ± 1℃下的冰浴中。将加料漏斗用溴(710mL，13.86mol)填充且将溴以约5mL/min的速率加到强烈搅拌的水溶液中，以使得温度维持在5℃-10℃之间。当添加完成时(约2.5小时)，将所得橙色溶液另外搅拌3小时。向反应混合物中以小批量加入固态亚硫酸氢钠(约75g)，直至橙色完全消失。将澄清的水溶液转移到20-L蒸发烧瓶中，并在旋转蒸发器(80℃，10mmHg)上经4小时的时间蒸发至干燥，以留下半固态残留物。向该残留物中加入乙醇(约4L)且在40℃下搅拌1小时。将混合物冷却并经漏斗过滤以除去大多数不溶性无机盐。将固态残留物用乙醇(1L)洗涤。将滤液转移到20-L蒸发烧瓶中并在旋转蒸发器(50℃，10mmHg)上浓缩至干燥以给出固态残留物。向该残留物中加入乙醇(约3L)且将浆料在室温下搅拌12小时。固体通过过滤收集并用乙醇(750mL)洗涤。将产物D-核糖酸内酯(19b)在真空烘箱中在40℃(0.1mmHg)下干燥。产量1.28kg (65%)；熔点：77-80℃；1H NMR (D2O) d 4.72 (d, 1 H),4.57 (t, 1 H), 4.42 (d, 1 H), 3.80 (m, 2 H)。
步骤2：制备2,3-O-异丙叉基D-核糖酸-1,4-内酯(19c)
将50-L夹套式反应容器装上D-核糖酸-1,4-内酯(19b)(3.0kg，20.27mol)和30LACS级丙酮。将反应混合物在室温下搅拌1小时。将反应容器的内部温度降到10℃且将浓硫酸(49mL)缓慢加到反应混合物中。在加入硫酸之后，让内部反应温度缓慢升高。将反应混合物在该温度下搅拌2.5-3小时。反应通过TLC (TLC；9:1二氯甲烷:甲醇，Rf = 0.75)监测。反应混合物通过加入固态碳酸氢钠(约500g)中和，直至pH为中性。反应混合物经漏斗过滤。将含有无机盐的固态残留物用丙酮(3L)洗涤。将滤液转移到20-L蒸发烧瓶中并蒸发至干燥(50℃，10mmHg)以给出半固态化合物。将残留物溶于乙酸乙酯(3L)中且在室温下在旋转蒸发器上搅拌4小时。固态2,3-O-异丙叉基D-核糖酸-1,4-内酯(19c)通过过滤收集并在真空烘箱中在40℃ (0.1mmHg)下干燥16小时。产量：1.819kg (48%)；熔点：136-140℃；1H NMR(CDCl3) d 4.8 (dd, 2 H), 4.6 (s, 1 H), 3.85 (dd, 2 H), 1.5 (s, 3 H), 1.4 (s,3 H)。
步骤3：制备2,3-O-异丙叉基5-O-甲基磺酰基D-核糖酸-1,4-内酯(26a)
将2,3-O-异丙叉基D-核糖酸-1,4-内酯(19c) (4.3kg，22.96mol)在ACS级吡啶(20L)中的溶液在50-L反应容器中在室温下搅拌15分钟，直至完全溶解。将反应容器的内部温度降到-15℃，接着经2小时的时间缓慢加入甲磺酰氯(1.96L，25.26mol)。将内部温度维持在0-5℃下。将反应物在0℃下在惰性气氛下搅拌约2小时，直至反应TLC显示没有SM(TLC；7:3乙酸乙酯:己烷，Rf = 0.85)。在反应完成之后，加入DCM (10L)并用3N HCl萃取(4次，pH = 3) [每次用DCM (5L)反萃取水层]，接着用快速饱和的NaHCO3洗涤。将有机部分在硫酸钠上干燥，过滤并蒸发成糊浆。产量：4.89kg(80%)。产物2,3-O-异丙叉基5-O-甲基磺酰基D-核糖酸-1,4-内酯(26a)用于下一步骤，而无需更进一步的纯化。1H NMR (CDCl3) d 4.8(m, 3H), 4.5 (m, 2H), 3.08 (s, 3H), 1.5 (s, 3H), 1.4 (s, 3H)。
步骤4：制备2,3-O-异丙叉基L-来苏糖-1,4-内酯(26b)
向2,3-O-异丙叉基5-O-甲基磺酰基D-核糖酸-1,4-内酯(26a)(3.04kg，11.37mol)中加入水，接着缓慢加入固态KOH (1.83kg，32.77mol)。(注意：在加入固态KOH时该化合物进入溶液中。在加入KOH的同时，反应放热，因此必须将反应容器置于冰浴中。)至KOH添加完成时，反应温度达到45℃。将反应混合物在约室温(RT)下搅拌3小时。将溶液在冰浴中再次冷却且随后使用浓盐酸溶液酸化到pH = 3(精确)。将反应混合物蒸发以给出固态褐色残留物。将残留物用沸腾的丙酮(约5L)搅拌两次，历时1小时，且滗析出有机物。随后将剩余盐溶解于最少量的水中并使用浓盐酸(约200mL)将pH调节到3。将水溶液浓缩且将固体残留物用丙酮(约5L)萃取。将有机层干燥、过滤并蒸发以给出白色针状物2,3-O-异丙叉基L-来苏糖-1,4-内酯(26b)。结晶可在热丙酮中进行。产量：1.60kg (75%)；1H NMR (D2O) d 5.00 (m,2H), 3.8 (m, 3H), 1.5 (s, 3H), 1.4 (s, 3H)。
步骤5：制备2,3-O-异丙叉基5-O-叔丁基二甲基甲硅烷基L-来苏糖-1,4-内酯(26c)
向装有机械搅拌器的22-L三颈烧瓶中加入2,3-O-异丙叉基L-来苏糖-1,4-内酯(26b)(2.0kg，10.63mol)、DMAP(约25g)、咪唑(1.60kg，23.40mol，2.2当量)，且在ACS级DMF(8L)中搅拌1小时。反应温度使用冰浴降到0℃。经2小时的时间向反应混合物中缓慢加入TBDMSCl (2.08kg，13.81mol，1.3当量)。将反应混合物在室温下在惰性气氛下搅拌14小时。在通过TLC (7:3，EtOAc:己烷，Rf = 0.80)所指示反应完成后，将反应混合物倾入冰水中并用EtOAc(×2)萃取。将有机层分离，干燥并过滤以给出油性残留物。将含有产物的反应容器置于冰浴中，接着加入己烷(约3L)。将化合物在己烷中结晶。过滤晶体并用最少量的己烷洗涤晶体，且将产物置于处于40℃的真空烘箱中过夜以给出2,3-O-异丙叉基5-O-叔丁基二甲基甲硅烷基L-来苏糖-1,4-内酯(26c) 3.01kg (93%)；1H NMR (CDCl3) d 4.8 (s, 2H),4.5 (m, 1H), 3.9 (m, 2H), 1.5 (s, 3H), 1.4 (s, 3H), 0.9 (s, 9H), 0.0 (s, 6H)。
步骤6：制备2-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-1-(5-羟基甲基-2,2-二甲基-[1,3]二氧杂环戊烷-4-基)-乙醇(26d)
将2,3-O-异丙叉基5-O-叔丁基二甲基甲硅烷基L-来苏糖-1,4-内酯(26c)(3.00kg，9.93mol)在THF:MeOH (9:1 v/v混合物，15L)中的溶液在室温下搅拌0.5小时，直至观察到完全溶解。将反应容器的内部温度降到-5℃。分小部分加入硼氢化钠(751g，19.86mol，2当量)，以使得温度不超过15-17℃。经1小时的时间完成该试剂的添加。让反应经3小时的时间达到室温且随后在该温度下持续搅拌18小时。反应混合物通过TLC (3:7，乙酸乙酯:己烷，Rf = 0.15)监测。在反应完成后，将溶液用EtOAc (5L)稀释，并用1N HCl溶液洗涤(2次)。将有机层用水洗涤，干燥并蒸发以给出油性残留物。向其中加入约3L己烷并在冰浴中冷却蒸发烧瓶。晶体将从溶液中粉碎。过滤晶体并用约250mL己烷洗涤。在真空烘箱中在40℃下干燥24小时，以给出2-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-1-(5-羟基甲基-2,2-二甲基-[1,3]二氧杂环戊烷-4-基)-乙醇(26d)。产量：2.32kg (77%)；1H NMR (CDCl3) d 4.2(m, 2H), 3.7 (m, 5H), 1.5 (s, 3H), 1.4 (s, 3H), 0.9 (s, 9H), 0.0 (s, 6H)。
步骤7：制备甲烷磺酸2-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-1-1(5-甲烷磺酰氧基甲基-2,2-二甲基-[1,3]二氧杂环戊烷-4-基)-乙酯(26e)
在0℃下往500mL三颈烧瓶装上无水吡啶(20mL)、催化量的DMAP，接着加入甲磺酰氯(4.98mL，64.4mmol，4.0当量)。将溶解于无水吡啶(20mL)中的2-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-1-(5-羟基甲基-2,2-二甲基-[1,3]二氧杂环戊烷-4-基)-乙醇(26d) (5.0g，16.3mmol)缓慢加到反应容器中。将反应物在惰性气氛下在该温度下搅拌4小时。(TLC；1:9乙酸乙酯:己烷，Rf = 0.85)。在反应完成后，加入1ml水和100mL EtOAc并搅拌。将有机层用水萃取，干燥并蒸发以给出甲烷磺酸2-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-1-1(5-甲烷磺酰氧基甲基-2,2-二甲基-[1,3]二氧杂环戊烷-4-基)-乙酯(26e)的糊浆。产量：8.7g (90%)。粗物质用于下一步骤，而无需任何进一步的纯化。
步骤8：制备5-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-1,4-N-苄基亚氨基-2,3-O-异丙叉基-D-核糖醇(26f)
将甲烷磺酸2-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-1-1(5-甲烷磺酰氧基甲基-2,2-二甲基-[1,3]二氧杂环戊烷-4-基)-乙酯(26e)(8.6g)加到纯苄胺(10mL)中且将反应物加热到70℃历时48小时。TLC (4:1 己烷:EtOAc，R f = 0.68)显示反应已完成。将反应混合物冷却且将盐水加到反应混合物中。用二氯甲烷萃取反应混合物，用水洗涤，干燥并蒸发以给出含有许多胺试剂的糊浆。将残留物溶解于甲苯中且向其中加入干冰屑，以使盐沉淀析出。过滤固体并蒸发滤液以给出所要产物5-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-1,4-N-苄基亚氨基-2,3-O-异丙叉基-D-核糖醇(26f) (5.6g，92%)。其直接用于下一步骤，而在无需任何进一步的纯化。1H NMR (CDCl3) d 7.2-7.4 (m, 5H), 4.65 (m, 1H), 4.55 (dd, 1H), 4.0 (d, 1H),3.6-3.8 (m, 3H), 3.1 (dd, 1H), 3.0 (m, 1H), 2.75 (dd, 1H), 1.5 (s, 3H), 1.34(s, 3H), 0.9 (s, 9H), 0.0 (s, 6H)。
步骤9：制备5-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-1,4-亚氨基-2,3-O-异丙叉基-D-核糖醇(20a)
向在EtOH (15mL)中的5-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-1,4-N-苄基亚氨基-2,3-O-异丙叉基-D-核糖醇(26f) (5.93g，15.74mmol)中加入Pd/C (50mg)且将反应物在80psi下氢化5小时，或直至TLC (3:2，己烷:EtOAc，Rf = 0.18)显示反应已完成。将反应混合物经硅藻土垫过滤且将该硅藻土垫用EtOH (25mL)洗涤。使滤液穿过微孔滤器(0.25μm)以除去痕量的催化剂并蒸发以给出作为糊浆的5-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-1,4-亚氨基-2,3-O-异丙叉基-D-核糖醇(20a)。产量：3.5g (75%-步骤)；1H NMR (CDCl3) d 4.65 (m, 2H), 3.60(dd, 2H), 3.24 (t, 1H), 3.00 (d, 2H), 1.5 (s, 3H), 1.34 (s, 3H), 0.9 (s, 9H),0.0 (s, 6H)。
步骤10：制备(3aR,4R,6aS)-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-4,6a-二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯(20b)
在17-23℃下经60-90分钟的时间将5-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-1,4-亚氨基-2,3-O-异丙叉基-D-核糖醇(20a)(94g，327mmol)在甲苯(470mL)中的溶液中加入N-氯丁二酰亚胺(54.6g，408.8mmol)在甲苯(470mL)中的悬浮液中。将反应混合物在17-23℃下搅拌1小时，冷冻到-3至3℃并另外搅拌1小时。通过过滤除去丁二酰亚胺副产物且将过滤后的溶液直接装入含有四丁基溴化铵(10.53g，32.7mmol)的60%氢氧化钾溶液(458g，8175mmol，在305mL水中)中。将反应混合物在-5℃至5℃下搅拌17小时。随后将水(700mL)加到两相混合物中以溶解无机沉淀物且将甲苯产物溶液用乙酸铵缓冲液(pH约4.5)、缓冲的盐水溶液(700mL)洗涤且用三乙胺稳定，之后通过循环穿过硫酸镁且随后通过将硫酸镁装入反应器中干燥。将在甲苯中的含有(3aR,4R,6aS)-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-4,6a-二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯(20b)的干燥的溶液按原样直接用于下一步骤。
步骤11：制备1S-5-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-1,4-二脱氧-1-C-[(4-甲氧基吡咯并[3,2-d]嘧啶-9-N-(苄氧基甲基)-7-基)]-1,4-亚氨基-2,3-O-异丙叉基-D-核糖醇(26g)
在氮气氛下将6-甲氧基-N-(苄氧基甲基)-9-去氮次黄嘌呤(27f)(271.0g 0.775摩尔)加到含有无水苯甲醚(1.7L)的22L三颈圆底烧瓶中。温和地加热该混合物，直至混合物变成均质的(约45℃)。将该混合物冷却到周围温度并加入无水乙醚(2.9L)。将反应烧瓶置于冷却浴中并使用干冰/丙酮冷却到-70℃。在约-20℃下，溴化物开始作为细白色固体沉淀。经滴液漏斗经1.2小时的时间向悬浮液中加入nBuLi (1.6N，486mL，0.778摩尔)，以使得内部温度维持小于-50℃。在最后添加之后，TLC (30% EtOAc/己烷)分析指示剩余< 2%的溴化物。在维持内部温度低于-50℃的情况下，经加料漏斗经15分钟的时间加入在甲苯中的(3aR,4R,6aS)-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-4,6a-二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯(20b)(183g，0.642摩尔)。该反应混合物为浅琥珀色。将反应烧瓶从冷却浴中除去并使其变暖。使反应混合物温热至-2℃且TLC (40% EtOAc/己烷，用欧利希剂(Ehrlichs reagent)可视化)显示没有剩余(3aR,4R,6aS)-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-4,6a-二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯(20b)。将反应用H2O (2L)猝灭并用乙醚(2×2L)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)并真空浓缩(使用在60℃下的高真空以除去苯甲醚)以给出1S-5-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-1,4-二脱氧-1-C-[(4-甲氧基吡咯并[3,2-d]嘧啶-9-N-(苄氧基甲基)-7-基)]-1,4-亚氨基-2,3-O-异丙叉基-D-核糖醇(26g)的粗深色油，其适合在下一步骤中使用。产量：284g(79%)。少量(5g)的粗混合物通过快速柱色谱法(硅胶，用在己烷中的0-40%乙酸乙酯洗脱)纯化以给出作为橙色糊浆(3.4g)的1S-5-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-1,4-二脱氧-1-C-[(4-甲氧基吡咯并[3,2-d]嘧啶-9-N-(苄氧基甲基)-7-基)]-1,4-亚氨基-2,3-O-异丙叉基-D-核糖醇(26g)；1H NMR (DMSO-d 6 ) d 0.02 (s, 3 H), 0.03 (s, 3 H), 0.8 (s, 9 H),1.25 (s, 3 H), 1.48 (s, 3 H), 3.11-3.20 (m, 1 H), 3.60-3.71 (m, 2 H), 4.05(s, 3 H), 4.26 (d, 1 H, J = 4.7 Hz), 4.49 (s, 2 H), 4.52-4.56 (m, 1 H), 4.81-4.85 (m, 1 H), 5.71 (s, 2 H), 7.21-7.32 (m, 5 H), 7.80 (s, 1 H), 8.40 (s, 1H);13C NMR (CDCl3) d-5.46,-5.43, 18.30, 25.53, 25.88, 27.63, 53.43, 61.59,62.54, 66.14, 70.14, 76.93, 82.32, 86.40, 114.43, 116.22, 116.56, 127.67,127.93, 128.43, 130.55, 136.93, 149.61, 149.82, 156.16; IR 3420, 1610 cm-1; MS(ES+) m/z 555.3；分析：C29H42N4O5Si，计算值：C, 62.79; H, 7.63; N, 10.10；实验值：C,62.95; H, 7.59; N, 9.95。
步骤12：制备1S-N-叔丁氧基羰基-5-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-1,4-二脱氧-1-C-[(4-甲氧基吡咯并[3,2-d]嘧啶-9-N-(苄氧基甲基)-7-基)]-1,4-亚氨基-2,3-O-异丙叉基-D-核糖醇(26h)
将粗1S-5-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-1,4-二脱氧-1-C-[(4-甲氧基吡咯并[3,2-d]嘧啶-9-N-(苄氧基甲基)-7-基)]-1,4-亚氨基-2,3-O-异丙叉基-D-核糖醇(26g)(275g，0.496摩尔)溶解于CH2Cl2 (1.4L)中并在冰/水浴中冷却到5℃。向该冷却的混合物中以4份加入Boc2O (168.5g，0.772摩尔)，以使得反应混合物温度维持小于10℃。在30分钟之后，TLC (40%乙酸乙酯/己烷)显示没有剩余起始材料。将粗混合物吸附在SiO2 (700g)上且通过快速色谱(硅胶，1.5kg，用在己烷中的10%乙酸乙酯洗脱)纯化。将适当级分汇集并真空浓缩以给出作为黄色糊浆的1S-N-叔丁氧基羰基-5-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-1,4-二脱氧-1-C-[(4-甲氧基吡咯并[3,2-d]嘧啶-9-N-(苄氧基甲基)-7-基)]-1,4-亚氨基-2,3-O-异丙叉基-D-核糖醇(26h)(272g，84%)；1H NMR (CDCl3) d 0.02 (s, 3 H), 0.03 (s, 3 H),0.82 (s, 9 H), 1.31-1.58 (m, 15 H) 2.05-2.09 (m, 1 H); 3.58-3.80 (m, 2 H),4.08 (s, 3 H), 4.17-4.32 (m, 1 H), 4.44 (s, 2 H), 4.84-5.71 (m, 4 H), 7.19-7.33 (m, 5 H), 7.46 (s, 1 H), 8.51 (s, 1 H); 13C NMR (CDCl3) d-5.31,-5.20,14.10, 14.20, 18.32, 21.01, 22.64, 25.56, 25.93, 27.46, 28.46, 31.58, 53.44,60.34, 62.48, 70.08, 76.96, 79.84, 111.69, 115.89, 127.67, 127.93, 128.43,136.90, 148.62, 149.90, 154.38, 156.19; IR 1692, 1608 cm-1; MS (ES+) m/z655.3；分析：C34H50N4O7Si，计算值：C, 62.43; H, 7.65; N, 8.56；实验值：C, 62.79; H,7.89; N, 8.47。
步骤13：制备(3aR,4R,6S,6aS)-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-6-(4-甲氧基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(26i)
将在木炭上的氢氧化钯(120g，50%，湿式)装入2L锥形烧瓶中。将甲醇(7.60kg)称量到20L鼓状圆桶(polydrum)中。使用0.80kg的该甲醇转移到装有该氢氧化钯催化剂的锥形烧瓶中并将锥形烧瓶旋动以制备均质混合物。随后将该悬浮液注入已用氮气吹扫的20L氢化容器中。将残留的在木炭上的氢氧化钯用甲醇(25mL)从锥形烧瓶洗到氢化容器中。将1S-N-叔丁氧基羰基-5-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-1,4-二脱氧-1-C-[(4-甲氧基吡咯并[3,2-d]嘧啶-9-N-(苄氧基甲基)-7-基)]-1,4-亚氨基-2,3-O-异丙叉基-D-核糖醇 (26h)(380g)装入10L鼓状圆桶中，接着装入1.32kg来自20L鼓状圆桶的甲醇。将1S-N-叔丁氧基羰基-5-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-1,4-二脱氧-1-C-[(4-甲氧基吡咯并[3,2-d]嘧啶-9-N-(苄氧基甲基)-7-基)]-1,4-亚氨基-2,3-O-异丙叉基-D-核糖醇(26h)的该甲醇溶液装入20L氢化容器中。将在20L鼓状圆桶中的剩余甲醇经10L鼓状圆桶作为漂洗液装入该容器中。将氨在甲醇中的溶液(7.0M，0.68kg)称量到10L鼓状圆桶中并转移到氢化容器中。将容器用氢气加压到5巴且在搅拌下将内含物加热到35℃。将这些反应条件维持20小时，根据需要装满氢气。在此之后，HPLC分析指示剩余约2%起始材料，这暗示反应充分完成。将容器的内含物转移到20L鼓状圆桶中，随后经硅藻土床过滤。在该操作期间经过滤漏斗吹扫氮气，且使用甲醇(1.50kg)洗涤滤饼。将滤液和洗涤液转移到旋转蒸发器中并在减压下浓缩以给出0.48kg的重量。将甲醇(2.50kg)加到旋转蒸发烧瓶中且将溶液浓缩到恒定质量(0.340kg，大致定量产量)。将另外的甲醇(1.0kg)加到产物(3aR,4R,6S,6aS)-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-6-(4-甲氧基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(26i)中以制备在下一步骤中使用的溶液。
步骤14：制备7-((2S,3S,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-2-基)-3H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4(5H)-酮盐酸盐(26j)
将(3aR,4R,6S,6aS)-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-6-(4-甲氧基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(26i)的溶液用甲醇稀释以生成2.5L的总体积且装入装备有机械搅拌器、回流冷凝器和内部温度计的5L多颈圆底烧瓶中。将该溶液使用油浴加热且同时经40分钟装入浓盐酸(37%，2.18L或2.62kg)(在此期间，内部温度从43℃增加到58℃)。再继续加热6小时，内部温度达到68℃，此时使溶液冷却到室温并再搅拌15小时。将褐色溶液在旋转蒸发器上浓缩到1.5-2.0L的体积，随后加入水(0.5L)。将该悬浮液转移回到5L烧瓶中并加热以使固体再溶解。在已经加入另外的水(0.50L)之后，这在50℃下实现。加入木炭(95g)，且将悬浮液在50℃下搅拌1小时。木炭经硅藻土垫过滤，用水(约1.0L)洗涤而除去。将现在部分脱色的滤液和洗涤液在旋转蒸发器上浓缩到0.95L的体积。将周围温度的溶液转移到10L烧瓶中并在搅拌下在冰浴中冷却。将乙醇(7.90L)逐部分装入该溶液中，促使产物结晶。经过另外搅拌2小时，内部温度降到5℃。固态产物通过在氮气覆盖下过滤而收集，并用预冷冻的乙醇洗涤(3×250mL)。将产物在过滤漏斗上沥干(pull dry on)30分钟，随后转移到干燥托盘。将产物在70℃下烘干过夜以提供作为灰白色固体的7-((2S,3S,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-2-基)-3H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4(5H)-酮盐酸盐(26j)(101.2g，58%)。将7-((2S,3S,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-2-基)-3H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4(5H)-酮盐酸盐(26j)(101.2g)装入20L夹套式容器中。加入水(1.52L)并搅拌悬浮液，直至固体溶解。装入浓盐酸(37%，63.6mL)并在25℃下搅拌溶液。一旦均质化，则使溶液流入鼓状圆桶中且将容器用水(506mL)洗干净。作为澄清步骤，将7-((2S,3S,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-2-基)-3H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4(5H)-酮盐酸盐(26j)的溶液经在聚丙烯过滤漏斗上的滤纸过滤且随后装回该容器中。将洗涤液也以此方式过滤，随后装回容器中。将该溶液在约15℃下搅拌45分钟。经15分钟将乙醇(1.0L)加到搅拌溶液中。加入7-((2S,3S,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-2-基)-3H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4(5H)-酮盐酸盐(26j)晶种(2.0g)以诱发结晶。在70分钟之后，加入乙醇(1.0L)并在15℃下再搅拌悬浮液19.5小时。将另外的乙醇(8.0L)加到该悬浮液中，并在15℃下另外继续搅拌5小时。将夹套温度设定为0℃且另外继续搅拌2小时。此时，使悬浮液流入鼓状圆桶中并经在聚丙烯过滤漏斗中的滤纸过滤。将滤饼用冷冻的乙醇(1.0L，随后0.5L)洗涤并在过滤漏斗上沥干历时30分钟。随后将固体转移到干燥托盘上并在70℃下烘干过夜以提供作为灰白色固体的7-((2S,3S,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-2-基)-3H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4(5H)-酮盐酸盐(26j)(176.9g，87%回收率)。
步骤15：制备(2R,3R,4S,5S)-3,4-二羟基-2-(羟基甲基)-5-(4-氧代-4,5-二氢-3H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(28a)
在室温下向7-((2S,3S,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-2-基)-3H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4(5H)-酮(26j)(446.19g，1.47摩尔)在水:甲醇混合物(1:1，10.4L)中的悬浮液中加入三乙胺(621mL，4.42摩尔，3.0当量)，接着加入(Boc)2O (987g，4.53摩尔，3.1当量)。在加入(Boc)2O之后，使内部温度从28℃略微增加到33℃，反应混合物变成透明的着色溶液。在搅拌1小时之后，溶液开始显示一定的混浊度。在室温下将溶液搅拌过夜。固态产物通过过滤收集并用水(5.0L)洗涤，在高真空下在50℃下干燥以给出作为灰白色固体的(2R,3R,4S,5S)-3,4-二羟基-2-(羟基甲基)-5-(4-氧代-4,5-二氢-3H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(28a) (482g，89%)；1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 11.92(s, 2H), 7.81 (s, 1H), 7.32 (d, J = 22.7 Hz, 1H), 5.73-5.20 (m, 1H), 5.05-4.91 (m, 1H), 4.87-4.76 (m, 1H), 4.74-4.49 (m, 1H), 4.33-4.17 (m, 1H), 4.09-3.86 (m, 2H), 3.64-3.48 (m, 2H), 1.39-1.00 (m, 9H); MS (ES+) 755.1 (2M+Na),(ES-) 731.7 (2M-1)；分析：C16H22N4O6，计算值：C, 52.45; H, 6.05; N, 15.29；实验值：C,52.24; H, 6.02; N, 15.05。
步骤16：制备(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-(4-氧代-4,5-二氢-3H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)吡咯烷-3,4-二基酯(28b)
在室温下向(2R,3R,4S,5S)-3,4-二羟基-2-(羟基甲基)-5-(4-氧代-4,5-二氢-3H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(28a)(482g，1.32摩尔，1.0当量)在吡啶(740mL，9.21摩尔，7当量)中的悬浮液中加入DMAP (3.22g，26.32mmol，0.02当量)和乙酸酐(435mL，4.61mmol，3.5当量)。在加入乙酸酐之后，内部温度开始上升，因此需要冰-水浴冷却。在完全加入该酸酐之后，温度升到67℃，随后降到室温。在反应达到25℃之后，除去冰-水浴。该悬浮液没有给出澄清溶液，而是观察到较浅的悬浮液。将反应混合物在室温下搅拌14小时以产生不澄清的溶液。所研究的等分试样显示不再有起始材料且根据TLC (9:1，氯仿:甲醇)，仅有两个主要斑点，MS示出了两个主峰，产物：(493.0，M+1)；和四乙酰化产物(M+1 = 535)。将反应混合物用3.0L氯仿稀释，搅拌10分钟且随后加入2.0L去离子水。在水相-有机相界面形成蜡状白色未知产物。在进行分离之后，该未知产物保留在水相中。将有机相分离并用2.0L水再次洗涤。将合并的水层用1.0L氯仿反萃取。将合并的有机相用水性2.0N HCl (2×1.0L)、水(2×1.0L)、饱和碳酸氢钠(2×1.0L)和盐水(2×1.0L)洗涤。将有机层经MgSO4干燥，过滤并在真空和50-55℃水浴中浓缩至干燥。将真空转到高真空油泵，直至观察到不再有馏出物，以给出致密的糊浆状产物。使圆底烧瓶保持在高真空油泵下14小时以使残留吡啶减至最少。获得(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-(4-氧代-4,5-二氢-3H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)吡咯烷-3,4-二基酯(28b)的固态泡沫的组合(715，110%产率)，其变成好看的白色固体和致密的残留物。该百分数反映四乙酰化化合物的量。该产物的纯度足以按原样用于下一步骤。分析样品通过使用快速柱色谱法(硅胶，用在己烷中的0-100%(9:1)乙酸乙酯/甲醇洗脱)纯化混合物来制备，以给出作为白色固体的(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-(4-氧代-4,5-二氢-3H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)吡咯烷-3,4-二基酯(28b)；1HNMR (300 MHz,DMSO-d 6 ) δ 12.13 (s, 1H, D2O，可交换), 11.98 (s, 1H, D2O，可交换), 7.82 (s, 1H),7.29 (s, 1H), 5.76 (s, 1H), 5.37 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 4.99 (s, 1H), 4.55 (dd,J = 11.3, 6.6 Hz, 1H), 4.34 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 4.03 (q, J = 7.1 Hz, 1H),2.01 (d, J = 12.6 Hz, 9H), 1.23 (dd, J = 39.9, 32.8 Hz, 9H); MS (ES+) 493.0(M+1); (ES-) 526.7 (M+Cl)；分析：C22H28N4O9，计算值：C, 53.65; H, 5.73; N, 11.38；实验值：C, 53.18; H, 5.89; N, 11.10。
步骤17：制备(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-(4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)吡咯烷-3,4-二基酯(28c)
在室温下向(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-(4-氧代-4,5-二氢-3H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)吡咯烷-3,4-二基酯(28b)(622g，1.26摩尔，1.0当量)在乙腈(2.75L)中的溶液中加入苄基三乙基氯化铵(575g，2.5摩尔，2.0当量)、二甲基苯胺(240mL，1.9mol，1.5当量)，接着加入POCl3(706mL，7.58mol，6.0当量)。获得澄清的着色的浅黄色溶液。将该反应混合物缓慢加热到80℃并在该温度下保持10分钟。在9:1氯仿:甲烷中的TLC显示反应完成>98%。将黑色均质溶液冷却到50.0℃并在真空(水浴，70-73℃)下浓缩以除去POCl3；将残留物置于油泵高真空下，直至看到不再有馏出物。将残留物溶解于3.0L氯仿中并用饱和碳酸氢钠水溶液迅速仔细洗涤，直至获得中性pH。将有机层分离，用水(2L)、盐水(2L)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩至干燥(水浴，在50-53℃下)。将(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-(4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)吡咯烷-3,4-二基酯(28c)的黑色产物用于下一步骤，而无需纯化。分析样品通过使用快速柱色谱法(硅胶，12g，用在己烷中的0-50%乙酸乙酯/甲醇(9:1)洗脱)纯化0.5g来制备，将所获得的相关产物溶解于乙醚/己烷中过夜，所形成的晶体(301mg)通过过滤收集以给出作为白色固体的(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-(4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)吡咯烷-3,4-二基酯(28c)；1H NMR (300 MHz,DMSO-d 6 ) δ 12.55 (s, 1H, D2O，可交换), 8.65 (s, 1H), 7.87 (bs, 1H), 5.79 (bs,1H), 5.44 (t, J = 4.0 Hz, 1H), 5.10 (bs, 1H), 4.56 (dd, J = 11.5, 6.8 Hz,1H), 4.38 (dd, J = 11.4, 4.1 Hz, 1H), 4.08 (bs, 1H), 2.07 (s, 3H), 2.00 (s,6H), 1.38 (s, 4H), 1.13 (s, 5H); MS (ES+) 510.865 (M+1), (ES-) 508.717 (M-1)；分析：C22H27ClN4O8，计算值：C, 51.72; H, 5.33; Cl, 6.94; N, 10.97；实验值：C, 51.91;H, 5.32; Cl, 6.76; N, 10.90。
步骤18：制备(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-5-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3,4-二基酯(28d)
向(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-(4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)吡咯烷-3,4-二基酯(28c)(622g，1.26mol，1当量)在DMF(1.5L)中的溶液中加入叠氮化钠(411g，6.32mol，5当量)且在搅拌下在60℃下加热10小时，此时反应完成(TLC，在9:1的氯仿:甲醇和1:1的己烷:乙酸乙酯中)。将反应物冷却到25℃，扔进冰(2L)中并用氯仿(2×1L)萃取。将氯仿层合并，用水(2×2L)、盐水(2L)洗涤，干燥，过滤并在真空(水浴，70-80℃)中浓缩以产生黑色淤渣。通过柱色谱法(987g黑色淤渣，8×30英寸柱，半满硅胶，洗脱曲线：己烷:乙酸乙酯；9:1(40.0L)；7:3 (20.0L)；6:4 (20.0L)；1:1 (20L)；4:6 (20.0L)和2:8 (20.0L)实现淤渣的纯化。将适当级分汇集并在真空(水浴，50.0℃)中浓缩以给出作为致密微红色蜜状产物的(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-5-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3,4-二基酯(28d)(407.05g，62.3%，两步骤的产率)。分析样品通过快速柱色谱法(在己烷中的0-100%乙酸乙酯)纯化混合物来制备，以给出作为橙色固体的(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-5-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3,4-二基酯(28d)。1HNMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 13.08 (d, J = 155.6 Hz, 1H, D2O，可交换), 9.86(s, 1H), 7.61 (d, J = 76.8 Hz, 1H), 5.78 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 5.41 (t, J =4.3 Hz, 1H), 5.21 (s, 1H), 4.55 (dd, J = 11.4, 6.4 Hz, 1H), 4.41 (dd, J =11.4, 3.9 Hz, 1H), 4.07 (d, J = 16.5 Hz, 1H), 2.06 (s, 3H), 2.01 (d, J = 9.9Hz, 6H), 1.23 (dd, J = 39.8, 32.7 Hz, 9H); MS (ES+) 518.0 (M+1), 540 (M+23);(ES-) 516.4 (M-1)；分析：C22H27N7O8，计算值：C, 51.06; H, 5.26; N, 18.95；实验值：C,50.97; H, 5.30; N, 18.62。
步骤19：制备(2R, 3R, 4S, 5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3,4-二基酯(28e)
(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-5-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3,4-二基酯(28d)如下分三个不同的批料还原：
批料1：向2.0L Parr氢化器(带Teflon插件)中加入(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-5-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3,4-二基酯(28d)(108.01g，300mmol，在甲醇中，800mL)、Pd(OH)2(21.6g，20% w/w)。
批料2：向2.0L Parr氢化器(带Teflon插件)中加入(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-5-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3,4-二基酯(28d)(140.70g，271.9mmol，在甲醇中，1.0L)、Pd(OH)2(28.14g，20% w/w)。
批料3：向2.0L Parr氢化器(带Teflon插件)中加入(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-5-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3,4-二基酯(28d)(140.7g，271.9mmol，在甲醇中，1.0L)、Pd(OH)2(28.14g，20% w/w)。
将反应混合物在150psi下氢化15-18小时。将反应混合物经硅藻土过滤以除去催化剂。将滤液在真空(水浴，60-70℃)中浓缩至恒定重量，以给出深色产物(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3,4-二基酯(28e) (328.8g，89%)。该产物的纯度足以按原样用于下一步骤。分析样品通过使用快速柱色谱法(在氯仿中的0-10%甲醇)纯化该混合物来制备。1H NMR (300MHz, DMSO-d 6 ) δ 11.06 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 6.94 (s, 2H), 5.86(s, 1H), 5.44 (t, J = 4.2 Hz, 1H), 5.02 (s, 1H), 4.56 (dd, J = 11.3, 6.9 Hz,1H), 4.40 (dd, J = 11.3, 4.2 Hz, 1H), 4.16-3.98 (m, 1H), 2.09-1.94 (m, 9H),1.48-1.14 (m, 9H); MS (ES+) 492.1 (M+1); (ES-) 526.4 (M+Cl)；分析：C22H29N5O8.1.25H2O，计算值：C, 51.41; H, 6.18; N, 13.62；实验值：C, 51.24; H, 5.92;N, 13.33。
步骤20：制备(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(28f)
批料1. 在室温下向(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3,4-二基酯(28e)(81.5g，165.8mmol)中加入无水甲醇(370mL)，接着加入NaOMe(甲醇钠，25重量%甲醇溶液，4.49g，20.76mmol)。在室温下搅拌反应混合物，直至TLC(氯仿:甲醇，9:1)显示所有起始材料都已反应。
批料2. 在室温下向(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3,4-二基酯(28e)(117.8g，239.6mmol)中加入无水甲醇(530mL)，接着加入NaOMe(甲醇钠，25重量%甲醇溶液，6.58g，30.45mmol)。在室温下搅拌反应混合物，直至TLC(氯仿:甲醇，9:1)显示所有起始材料都已反应。
批料3. 在室温下向(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3,4-二基酯(28e)(129.5g，263.5mmol)中加入无水甲醇(584mL)，接着加入NaOMe(甲醇钠，25重量%甲醇溶液，6.99g，32.35mmol)。在室温下搅拌反应混合物，直至TLC(氯仿:甲醇，9:1)显示所有起始材料都已反应(7-8小时)。
将上述溶液浓缩(水浴，65-75℃)以给出(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(28f)，其纯度足以按原样用于下一步骤。分析样品通过使用快速柱色谱法(在氯仿中的0-10%甲醇)纯化该混合物来制备。1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.77 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.40 (s,1H), 6.82 (s, 3H), 5.04-4.91 (m, 1H), 4.87-4.74 (m, 1H), 4.56-4.35 (m, 2H),4.04-3.90 (m, 2H), 3.72-3.63 (m, 1H), 3.59-3.41 (m, 1H), 1.15 (2s, 9H); MS(ES+) 366.1 (M+1); (ES-) 400.3 (M+Cl)；分析：C16H23N5O5.0.25H2O，计算值：C, 51.33;H , 6.46; N, 18.71；实验值：C, 51.04; H, 6.43; N, 18.48。
制备甲氧基-N-(苄氧基甲基)-9-溴-9-去氮次黄嘌呤(27f)
步骤1：制备3-氨基-1H-吡咯-2,4-二甲酸二甲酯(27b)
在室温下向氨基丙二酸二乙酯(370.4g，1.75mol)在甲醇(3.6L)中的溶液中一次性加入NaOMe的5.4M溶液(975mL，5.25mol)(反应混合物的颜色为浅褐色)。向反应混合物中分三份加入(乙氧基亚甲基)氰基乙酸乙酯(27a)(296g，1.75mol)(在该添加期间观察到没有显著的温度变化，变化约1℃，反应物颜色从浅褐色变为深褐色)。将反应混合物在回流下加热48小时(用在己烷中的50%乙酸乙酯进行TLC分析以检查起始材料的消失)。反应混合物通过加入AcOH (210mL，3.5mole)中和到pH 6。将反应混合物真空浓缩以给出褐色残留物。将残留物用水(3L)湿磨，过滤，用水(500mL)和己烷洗涤。使其风干48小时且在真空烘箱中在60℃下干燥以给出作为褐色固体的3-氨基-1H-吡咯-2,4-二甲酸二甲酯(27b)(287g，83%)。将其按原样用于下一步骤。
步骤2：制备3H,5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-酮(27c)
在回流下加热3-氨基-1H-吡咯-2,4-二甲酸二甲酯(27b)(286g, 1.44mole)和甲脒乙酸酯(451g，4.33mole)在乙醇(2.8L，2mL/mmole)中的混合物加热过夜。最初反应混合物不是均质的，但在回流2小时之后，看上去是均质的且颜色为深褐色(随着固体开始从溶液中出来，搅拌变得困难)。等分试样的TLC分析(在己烷中的50%乙酸乙酯)指示仍然存在一些未反应的起始材料。将反应混合物在回流下再继续加热24小时并冷却到室温。所获得的固体通过过滤收集，用水和己烷洗涤并真空干燥以给出作为浅褐色固体的3H,5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-酮(27c)(223g，80%)。该材料按原样使用，而无需纯化。
步骤3：制备3H,5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-酮(22a)
将3H,5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-酮(27c)(130.4g，0.675mole)在2N KOH (1.35L，2.7mole)中的混合物在温和回流下加热40小时。将反应混合物冷却到60℃并用冰乙酸(162mL，2.7mole)小心地中和到pH 6(观察到由于脱羧引起的起泡且反应混合物的颜色为黑色)。将反应混合物冷却到室温且所获得的固体通过过滤收集，将其用水(x 250mL)洗涤，风干并在高真空中在P2O5上干燥以给出作为黑灰色固体的产物(145g，159%)。产物的NMR指示许多乙酸或其盐，因此产率较高，使用CMA-80作为溶剂体系，TLC显示清洁产物加在基线中的一些产物。将产物用水(400mL)湿磨且用饱和NaHCO3水溶液中和，直至不再冒泡且pH为约7-8。黑灰色固体通过过滤收集且将其用水洗涤以在风干48小时之后给出67.62g (74%)产物。将产物在真空中在乙醇回流温度下进一步干燥以给出作为黑灰色粉末的3H,5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-酮(22a)；分析纯样品的MP >250℃；1HNMR (360 MHz, DMSO-d 6 ) d 12.05(s, D2O，可交换, 1H), 11.82 (s, D2O，可交换, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.36 (s, 1H),6.35 (s, 1H). 13C-NMR (DMSO-d6) 153.88, 144.80, 141.66, 127.51, 117.92,103.10; IR (KBr) 3107, 3030和1674 cm-1; MS (ES+) 136.2 (M+1)；分析：C6H5N3O，计算值：C, 53.33; H, 3.73; N, 31.10；实验值：C, 53.38; H, 3.77; N, 31.11。
步骤4：制备4-氯吡咯并[3,2-d]嘧啶(27d))
在N2下向3H,5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-酮(22a)(31.08g，230mmol)的样品中加入氯氧化磷(60mL，644mol，2.8当量)。将混合物在回流下加热1小时，在此期间反应物变成黑色均质的。将反应物在冰-水浴中冷却，且随后在搅拌下注入碎冰(775mL)中。在继续冷却混合物的情况下，水溶液的pH用浓NH4OH (225mL)缓慢调节到约pH 8。所得沉淀物通过真空过滤收集并用水洗涤。将固体转移到干燥托盘中并在真空中在110℃下干燥以给出作为暗灰色固体的4-氯吡咯并[3,2-d]嘧啶(27d)(31.48g，89%)。分析样品通过柱色谱法(硅胶，EtOAc-己烷，35:65)，接着蒸发相关级分来获得。用EtOAc-MeOH湿磨固体以提供作为灰白色固体的4-氯吡咯并[3,2-d]嘧啶(27d)，MP>150℃(分解)；1H NMR (DMSO-d 6 ) d 12.43 (s,D2O，可交换, 1H), 8.61 (s, 1H), 7.97 (dd, J = 2.8, 2.8 Hz；D2O交换崩解成d，1H),6.72 (dd, J = 1.7, 3.5 Hz; D2O交换崩解成d, 1H). 13C-NMR (DMSO-d6) 151.30,149.58, 142.12, 134.83, 124.32, 102.70; IR(纯) 3128, 3078, 2979, 1621 cm-1; MS(ES+) 154.01 (100%, M+1)和156.01 (33%)；分析：C6H4N3Cl，计算值：C, 46.93; H, 2.63;N, 27.36; Cl, 23.09；实验值：C, 47.10; H, 2.79; N, 27.15; Cl, 22.93。
步骤5：制备6-甲氧基-N-(苄氧基甲基)-9-去氮次黄嘌呤(27e)
在仔细搅拌下在N2下经10-15分钟向预洗涤的NaH (20g，500mmol，1.25当量，60%油分散体，用己烷洗涤两次)在冷却到4℃的无水THF (1.0L)中的悬浮液中逐份加入固态4-氯吡咯并[3,2-d]嘧啶(27d)(61.4g，400mmol)，从而控制H2气逸出。在约1小时之后，气体逸出停止且在4℃下经45分钟逐滴加入苄基氯甲基醚(61mL，440mmol，1.1当量)(观察到另外的气体逸出)。让所得混合物温热至周围温度并搅拌1小时。将反应混合物冷却到4℃并用甲醇钠(93mL，在甲醇中的5.4M溶液，500mmol)小心地猝灭。让混合物温热至周围温度过夜，并用冰乙酸(30mL，500mmol)中和到pH 6。将混合物浓缩并将残留物用水(2×400mL)湿磨。将水层滗析并将残留物在真空中干燥。将残留物溶解于乙酸乙酯(250mL)中并煮沸到回流，并经凹槽滤纸过滤。将残留物与乙酸乙酯(2×100mL)一起煮沸并过滤(留下的残留物为不想要的化合物且在TLC分析在己烷中的50%乙酸乙酯中不移动)。将滤液合并，真空浓缩到250mL并保持在冰箱中过夜。所获得的褐色固体通过过滤收集，用冰冷的乙酸乙酯/己烷(2×100mL)洗涤，且在真空中干燥以给出作为橙褐色固体的6-甲氧基-N-(苄氧基甲基)-9-去氮次黄嘌呤(27e)(46.64g，43%)。分析样品通过从乙酸乙酯中重结晶来制备；MP 123-127℃；1H NMR (DMSO-d 6 ) d 8.44 (s, 1H), 7.86 (d, J = 3.1 Hz, 1 H), 7.31-7.22 (m, 5H), 6.62 (d, J = 3.6 Hz, 1 H), 5.75 (s, 2 H), 4.49 (s, 2 H), 4.05 (s, 3 H);13C-NMR (DMSO-d6) 156.11, 151.59, 150.09, 137.82, 134.80, 128.53, 127.87,127.77, 114.99, 103.08, 77.55, 69.95, 53.73; IR (KBr) 1602 cm-1; MS (ES+)269.97 (M+1)；分析：C15H15N3O2，计算值：C, 66.90; H, 5.61; N, 15.60；实验值：C,67.09; H, 5.60; N, 15.60。
步骤6：制备6-甲氧基-N-(苄氧基甲基)-9-溴-9-去氮次黄嘌呤(27f)
在N2下经30分钟向冷却到4℃的6-甲氧基-N-(苄氧基甲基)-9-去氮次黄嘌呤(27e)(59.81g，222mmol)在二氯甲烷(225mL)中的溶液(均质反应混合物)中逐份加入NBS(40.3g，224mol，1.01当量)，从而将反应温度维持到低于15℃。将混合物在0℃下搅拌15分钟且使其经15分钟温至室温(TLC分析，在己烷中的50%乙酸乙酯)。将反应混合物真空过滤以除去不溶性丁二酰亚胺。将滤液用水(2×250mL)和盐水(200mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并真空浓缩以给出作为浅棕色固体的产物。固体通过在乙酸乙酯(200mL)中沸腾而溶解并用己烷(200mL)稀释。使溶液沸腾到回流并非常迅速地热过滤(以避免固体结晶出来)。随后使滤液沸腾并以200mL的增量加入己烷(己烷的总体积：1600mL)。如果需要，则滗析热溶液以除去不溶性残留物(将产物溶于热的10%乙酸乙酯/己烷溶液中)。让热滤液冷却到室温且随后保持在冰箱中过夜。所获得的固体通过过滤收集并用己烷洗涤，且在真空中在室温下干燥以给出作为浅黄色固体的6-甲氧基-N-(苄氧基甲基)-9-溴-9-去氮次黄嘌呤(27f)(59.6g，77%)：MP 103-108℃；1H NMR (DMSO-d 6 ) d 8.51 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.31-7.22 (m, 5H), 5.74 (s, 2H), 4.52 (s, 2H), 4.07 (s, 3H). 13C-NMR (DMSO-d6)156.19, 150.66, 148.14, 137.59, 133.45, 128.38, 127.80, 127.67, 115.02,90.90, 77.79, 70.25, 54.07; IR (KBr) 3078, 1602, 1542 cm-1; MS (ES+) 348.27(100%), 350.28 (98%)；分析：C15H14N3O2Br，计算值：C, 51.74; H, 4.05; N, 12.07；实验值：C, 51.72; H, 4.04; N, 12.06。
实施例2：(S)-((2R,3R,4S,5S)-2-氨基-3-甲基丁酸5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基吡咯烷-2-基)甲酯盐酸盐(30f)
方法A：
在室温下将(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-(((2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(30e)(600mg，1mmol)在TFA (10mL)中的溶液搅拌1小时并真空浓缩至干燥。将残留物溶解于10mL AcOH中并加入BCl3的溶液(3.6mL，3.6mmol，1M，在二氯甲烷中)，在室温下搅拌4分钟并用水(5mL)猝灭。将反应混合物浓缩至干燥。将残留物冷冻干燥以提供作为白色固体的(S)-((2R,3R,4S,5S)-2-氨基-3-甲基丁酸5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基吡咯烷-2-基)甲酯盐酸盐(30f) (400mg，76%)；1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 /D2O) δ 8.64 (s, 1H), 8.21 (s, 1H),4.83 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.63-4.49 (m, 3H), 4.27-4.19 (m, 1H), 3.94 (d, J =4.8 Hz, 1H), 3.82-3.70 (m, 1H), 2.33-2.18 (m, 1H), 0.99 (d, J = 6.9 Hz, 6H);MS (ES+) 365.1 (M+1)；分析：C16H27Cl3N6O4.3HCl.2.5H2O，计算值：C, 37.17; H, 6.07;Cl, 20.16; N, 16.09；实验值：C, 37.04; H, 6.22; Cl, 20.50; N, 16.20。
方法B：
在室温下向(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-(((2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(30e)(0.151g，0.25mmol)在丙酮(2mL)中的溶液加入浓硫酸(18N，0.139mL，2.5mmol)且在室温下搅拌过夜。将反应混合物滗析并向残留物中加入沸腾的丙酮(10mL)并冷却到室温。所获得的固体通过过滤收集以给出作为白色固体的((2R,3R,4S,5S)-2-氨基-3-甲基丁酸5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基吡咯烷-2-基)甲酯硫酸盐(30f)；1H NMR (300 MHz, D2O) δ 8.42 (s, 1H),8.04 (s, 1H), 5.05 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.79 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 4.62 (dd, J= 12.6, 7.5 Hz, 1H), 4.55 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.20-4.08 (m, 3H), 2.45-2.28(m, 1H), 1.06 (t, J = 7.3 Hz, 6H)。
方法C：
向(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-(((2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(30e)(0.302g，0.5mmol)在MTBE (2.5mL)中的溶液中加入水(0.046mL)和浓硫酸(0.138mL，5.00mmol)，接着在15分钟之后，加入MTBE (2.5mL)且在室温下搅拌4小时。滗析TBDME，加入水(0.5mL)并搅拌以溶解固体，随后加入乙醇(9.5mL)并有力地搅拌2小时。所获得的细固体通过过滤收集，用乙醇洗涤以给出作为白色固体的((2R,3R,4S,5S)-2-氨基-3-甲基丁酸5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基吡咯烷-2-基)甲酯硫酸盐(30f)(0.288g，产率103%)；1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 /D2O) δ8.26 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 4.67 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 4.59-4.41 (m, 3H), 4.27(t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.91 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 3.81-3.69 (m, 1H), 2.28-2.10(m, 1H), 0.97 (d, J = 6.9 Hz, 6H)。
方法D：
向(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-(((2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(30e)(0.302g，0.5mmol)在MTBE (2.5mL)中的溶液中加入水(0.138mL)和浓硫酸(0.138mL，5.00mmol)，接着在15分钟之后，加入MTBE (2.5mL)且在室温下搅拌4小时。滗析TBDME，加入乙醇(9.5mL)并搅拌2小时，通过过滤收集固体，在真空中干燥以给出((2R,3R,4S,5S)-2-氨基-3-甲基丁酸5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基吡咯烷-2-基)甲酯硫酸盐(30f)的白色固体(0.160g，0.285mmol，产率57.1%)。
制备(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-(((2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(30e)
步骤1：制备(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(30a)
在室温下向溶解于甲醇(200mL)中的(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-(4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)吡咯烷-3,4-二基酯(28c)(25.8g，50.5mmol)中加入在甲醇中的25重量%甲醇钠(3.6mL 16.66mmol)。在室温下搅拌反应混合物过夜。将反应混合物浓缩至干燥并用600g柱纯化，以提供作为无色泡沫的(2S,3S,4R,5S)-2-(4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(30a)(17.7g，46mmol，产率91%)；1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 12.34 (s, 1H),8.62 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 5.40-5.02 (m, 2H), 4.96-4.70 (m, 2H), 4.41-4.25(m, 1H), 4.13-3.93 (m, 2H), 3.69-3.51 (m, 2H), 1.35 (s, 3H), 1.01 (s, 6H); MS(ES+) 384.9 (M+1), 792.6 (2M+Na); (ES-) 382.6 (M-1)。
步骤2：制备(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-(羟基甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(30b)
向(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(30a)(16.3g，42.4mmol)在丙酮(400mL)中的溶液中加入2,2-二甲氧基丙烷(11.17mL，89mmol)和4-甲基苯磺酸水合物(0.41g，2.12mmol)。在室温下搅拌反应物过夜。将反应混合物用TEA (590μL，4.24mmol)猝灭并浓缩至干燥。残留物通过快速柱色谱法(硅胶，500g)纯化以给出作为无色泡沫的(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-(羟基甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(30b)(10.7g，25.2mmol，产率59.5%)。1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 12.45 (s, 1H), 8.67 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 5.09 (d, J = 36.7 Hz, 3H),4.82 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 4.00 (s, 1H), 3.53 (s, 1H), 3.34 (s, 1H), 1.47 (s,3H), 1.40 (bs, 4H), 1.29 (bs, 4H), 1.20 (bs, 4H); MS (ES+) 426.9 (M+1); 422.6(M-1)。
步骤3：制备(3aS,4S,6S,6aR)-4-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-(羟基甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(30c)
向(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-(羟基甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(30b)(5.1g，12mmol)在DMF(30mL)中的溶液中加入叠氮化钠(3.9g，60mmol)，将所得溶液在80℃下搅拌4小时。将反应混合物真空浓缩以除去大部分DMF且将所获得的残留物溶解于氯仿中。将有机层用水洗涤，用MgSO4干燥并真空浓缩以给出(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-(羟基甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(30c)(5g，97%)；1HNMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 13.22 (bs,1H), 9.87 (s, 1H), 7.69-7.47 (m, 1H), 5.28 (m, 1H), 5.05 (m, 2H), 4.81 (d, J= 5.9, 1H), 4.06-3.91 (m, 1H), 3.57 (m, 1H), 3.51-3.38 (m, 1H), 1.48 (s, 3H),1.41-1.23 (bs, 9H), 1.30 (s, 3H); MS (ES+) 454 (M+Na), 863.1 (2M+1), 885.2(2M+Na); (ES-) 429.7 (M-1)。
步骤4：制备(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-((((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(30d)
向(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-(羟基甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(30c)(1.088g，2.5mmol)和(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酸(L-Boc缬氨酸，0.543g，2.5mmol)在DMF (20mL)中的溶液中加入EDCI (1.198g，6.25mmol)和DMAP (92mg，0.75mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10天并用水(60mL)猝灭，用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。将有机层合并，用水(2×50mL)、盐水洗涤，干燥并真空浓缩。所获得的残留物通过快速柱色谱法纯化两次以提供作为白色固体的(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-((((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(30d)(0.75g，47%)；1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 13.30 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 7.60 (s, 1H),7.10 (s, 1H), 5.34 (s, 1H), 5.20 (dd, J = 5.7, 1.5 Hz, 1H), 4.82 (d, J = 5.8Hz, 1H), 4.34-4.14 (m, 2H), 3.80 (dd, J = 8.0, 5.9 Hz, 1H), 3.34 (s, 1H),1.97-1.84 (m, 1H), 1.47 (s, 3H), 1.43-1.31(m, 21H), 0.80 (dd, J = 6.9, 5.2Hz, 6H); MS (ES-) 629.1 (M-1); IR (KBr) 2315 cm-1。
步骤5：制备(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-((((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(30e)
向(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-((((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(30d) (0.72g，1.19mmol)在甲醇(20mL)中的溶液中加入Pd/C (200mg，5重量%，在C上)且在氢气氛下氢化2小时。催化剂通过经硅藻土过滤而除去且将滤液真空浓缩。所获得的残留物用柱纯化以给出作为白色固体的(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-((((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(30e)(600mg，83%)。1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 11.97 (s, 1H),10.87 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.36 (s, 1H), 6.78 (s, 2H), 5.30-5.22 (m, 1H),5.19-5.07 (m, 1H), 4.88 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 4.18-4.07 (m, 2H), 3.87-3.79 (m,1H), 3.44 (qd, J = 7.0, 5.1 Hz, 1H), 2.01-1.92 (m, 1H), 1.44-1.32 (m, 21H),1.28 (s, 3H), 0.82 (d, J = 6.7 Hz, 6H); MS (ES+) 605.1 (M+1)。
实施例3：(2S,3S)-((2R,3R,4S,5S)-2-氨基-3-甲基戊酸5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基吡咯烷-2-基)甲酯盐酸盐(31c)
将(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-((((2S,3S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基戊酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(31b)(0.398g，0.643mmol)在三氟乙酸(10mL)中的溶液在室温下搅拌1小时并真空浓缩至干燥。将残留物用甲苯(20mL)湿磨，真空浓缩至干燥。将所获得的残留物溶解于AcOH (10mL)中且向其中加入三氯硼烷溶液(2.32mL，2.32mmol)，在室温下搅拌4分钟且用水(5mL)猝灭。将反应混合物真空浓缩至干燥。将所获得的胶状固体溶解于水(5mL)中并过滤。将滤液冷冻干燥以提供作为白色固体的(2S,3S)-((2R,3R,4S,5S)-2-氨基-3-甲基戊酸5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基吡咯烷-2-基)甲酯(31c)(0.275mg，产率88%)。
1H NMR (300 MHz, D2O) δ 8.24 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 4.89 (d, J = 8.0Hz, 1H), 4.61-4.43 (m, 3H), 4.41 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 4.04 (d, J = 3.9 Hz,1H), 3.98 (dt, J = 6.7, 4.2 Hz, 1H), 2.00-1.88 (m, 1H), 1.41-1.10 (m, 2H),0.88 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.79 (t, J = 7.4 Hz, 3H); 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 /D2O) δ 8.61 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 4.85 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 4.62 (dd, J =12.2, 4.2 Hz, 1H), 4.57-4.46 (m, 2H), 4.24 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 4.01 (d, J =4.1 Hz, 1H), 2.01-1.94 (m, 1H), 1.56-1.39 (m, 1H), 1.36-1.22 (m, 1H), 0.96(d, J = 6.9 Hz, 3H), 0.90 (t, J = 7.3 Hz, 3H); MS (ES+) 379.1 (M+1), (ES-)412.5 (M+Cl); HPLC [Restek Pinnacle DB C18, 150×4.6mm, 5µm，流速：1.0mL/min，在40℃下。“A”缓冲剂=将4.3g 1-辛烷磺酸钠单水合物溶解于900mL HPLC级水中。加入10mL乙酸和100mL乙腈。“B”缓冲剂 = 将4.3g 1-辛烷磺酸钠单水合物溶解于600mL HPLC级水中。加入10mL乙酸和400mL乙腈，UV吸光度 = 260 nM；(A:B, 85/15 (0分钟)至A:B 0/100 (25分钟)至A:B 0/100 (40分钟)至A:B 85/15 (50分钟)) Rt = 22.79 (97.26%)]；分析：C17H26N6O4·3HCl·2.25H2O·2B(OH)3，计算值：C, 31.84; H, 6.21; Cl, 16.59; N,13.11；实验值：C, 31.99; H, 6.13; Cl, 16.33; N, 12.80。
制备(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-((((2S,3S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基戊酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(31b)
步骤1：制备(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-((((2S,3S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基戊酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(31a)
向(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-(羟基甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(30c)(1.079g，2.5mmol)、(2S,3S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基戊酸(Boc-L-异亮氨酸)(0.578g，2.5mmol)在DMF (20mL)中的溶液中加入N1-((乙基亚氨基)亚甲基)-N3,N3-二甲基丙-1,3-二胺盐酸盐(EDCI，1.20g，6.25mmol)和N,N-二甲基吡啶-4-胺(DMAP，0.092g，0.75mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5天，用1N盐酸水溶液(5.00mL)和水(60mL)猝灭。将反应混合物用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。将有机层合并，用水(2×25mL)、盐水洗涤，干燥并真空浓缩。所获得的残留物通过快速柱色谱法(硅胶，25g，用在己烷中的0-100%乙酸乙酯洗脱)纯化以提供作为白色固体的(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-((((2S,3S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基戊酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(31a)(0.683g，产率42%)；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.29 (s, 1H, D2O，可交换), 9.86 (s, 1H), 7.59(s, 1H), 7.11 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 5.32 (s, 1H), 5.20 (d, J = 5.8 Hz, 1H),4.81 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 4.28 (bs, 2H), 4.08-3.93 (m, 1H), 3.90-3.77 (m,1H), 1.62 (s, 1H), 1.52-1.21 (m, 26H), 0.84-0.66 (m, 6H); MS (ES+) 645.2 (M+1), 667.2 (M+Na), (ES-) 643.1 (M-1)。
步骤2：制备(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-((((2S,3S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基戊酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(31b)
向(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-((((2S,3S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基戊酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(31a)在甲醇(20mL)中的溶液中加入(10%)钯/碳(206mg)且在60psi下氢化3.5小时。TLC分析显示(在1:1己烷中的乙酸乙酯/甲醇(9:1))反应完成。催化剂经硅藻土过滤而除去且将滤液真空浓缩。所获得的残留物通过快速柱色谱法(硅胶，12g，用在己烷中的0-100%乙酸乙酯/甲醇(9:1)洗脱)纯化以给出作为白色固体的(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-((((2S,3S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基戊酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(31b)(0.418g，产率70%)；1H NMR (300 MHz,DMSO-d6) δ 10.86 (bs, 1H, D2O，可交换), 8.09 (s, 1H), 7.36 (d, J = 2.8 Hz,1H), 7.14 (s, 1H), 6.77 (s, 2H), 5.25 (s, 1H), 5.14 (bs, 1H), 4.88 (d, J =5.9 Hz, 1H), 4.18 (s, 1H), 4.05 (s, 3H), 3.90 (s, 1H), 1.68 (bs, 1H), 1.42(s, 3H), 1.38 (s, 18H), 1.28 (s, 3H), 1.17 (s, 1H), 0.78 (m, 6H); MS (ES+)619.2 (M+1), (ES-) 653.2 (M+Cl)；分析：C30H46N6O8·0.25H2O，计算值：C, 57.82; H,7.52; N, 13.48，实验值：C, 57.56; H, 7.42; N, 13.40。
实施例4：(S)-((2R,3R,4S,5S)-2-氨基-4-甲基戊酸5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基吡咯烷-2-基)甲酯盐酸盐(32c)
将(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-((((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-甲基戊酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(32b)(0.243g，0.393mmol)在三氟乙酸(10mL)中的溶液在室温下搅拌1小时且真空浓缩至干燥。将残留物用甲苯(20mL)湿磨，且真空浓缩至干燥。将残留物溶解于AcOH (10mL)中且向其中加入三氯硼烷溶液(1.4mL，1.4mmol)，在室温下搅拌4分钟且用水(5mL)骤冷。将反应混合物浓缩至干燥。将所获得的胶状固体用水(5mL)溶解并过滤。将滤液冷冻干燥以获得固体(201mg)。将该固体溶解于0.37mL水中并温和地加热，直至形成澄清溶液，再次加入0.13mL水，随后用9.0mL 2-丙醇(IPA)稀释，随后加入0.25mL水(现在总共0.75mL)，将溶液滗析以除去不溶性物质。在此阶段，溶液为澄清的，将其加热并加入5.5mL IPA，该溶液变混浊且使其静置1小时。所获得的固体通过过滤收集以提供作为白色固体的(S)-((2R,3R,4S,5S)-2-氨基-4-甲基戊酸5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基吡咯烷-2-基)甲酯盐酸盐(32c)(73mg，产率49%)；1H NMR(300 MHz, DMSO-d6) δ 8.47 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 4.77 (d, J = 7.5 Hz, 1H),4.60-4.45 (m, 3H), 4.29 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 4.03 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 3.80-3.71 (m, 1H), 1.83-1.58 (m, 3H), 0.90 (d, J = 5.2 Hz, 6H); MS (ES+) 379.1 (M+1), (ES-) 412.7 (M+Cl); HPLC [Restek Pinnacle DB C18, 150×4.6mm, 5µ管柱，流速：1.0mL/min，在40℃下。“A”缓冲剂 = 将4.3g 1-辛烷磺酸钠单水合物溶解于900mL HPLC级水中。加入10mL乙酸和100mL乙腈。“B”缓冲剂 = 将4.3g 1-辛烷磺酸钠单水合物溶解于600mL HPLC级水中。加入10mL乙酸和400mL乙腈，UV吸光度 = 260nM; (A:B, 85/15 (0分钟)至A:B 0/100 (25分钟)至A:B 0/100 (40分钟)至A:B 85/15 (50分钟)) Rt = 22.79(96.3027%)]；分析：C17H26N6O4 2.75 H2O 2.5HCl，计算值：C, 39.33; H, 6.60; Cl,17.07; N, 16.19；实验值：C, 39.04; H, 6.32; Cl, 17.46; N, 15.96。
制备(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-((((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-甲基戊酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(32b)
步骤1：制备(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-((((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-甲基戊酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(32a)
向(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-(羟基甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(30c)(1.088g，2.52mmol)和(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-甲基戊酸(Boc-L-亮氨酸)(0.583g，2.52mmol)在DMF(20mL)中的溶液中加入N1-((乙基亚氨基)亚甲基)-N3,N3-二甲基丙-1,3-二胺盐酸盐(EDCI，1.21g，6.30mmol)和N,N-二甲基吡啶-4-胺(DMAP，0.092g，0.757mmol)。将反应混合物在室温下搅拌96小时，用水(60mL)猝灭且用EtOAc (3×50mL)萃取。将合并的有机层用水(2×50mL)、盐水(50mL)洗涤，经MgSO4干燥且真空浓缩至干燥。所获得的残留物通过快速柱色谱法(硅胶，25g)纯化以给出作为白色泡沫的(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-((((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-甲基戊酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(32a)(633mg，产率39%)；1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.28 (s, 1H),9.86 (s, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.19 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 5.31 (s, 1H), 5.16 (d,J = 6.8 Hz, 1H), 4.80 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 4.23 (s, 2H), 3.86 (t, J = 11.4Hz, 1H), 1.39 (m, 27H), 0.86 (dd, J = 11.7, 6.0 Hz, 1H), 0.75 (dd, J = 13.6,6.5 Hz, 6H); MS (ES+) 645.19(M+1), 667.17 (M+Na); (ES-) 643.20(M-1), 679.18(M+Cl)。
步骤2：(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-((((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-甲基戊酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(32b)
向(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-((((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-甲基戊酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(32a)(584mg，0.91mmol)在甲醇(20mL)中的溶液中加入10%钯/碳(193mg)且在50psi下氢化2小时。将催化剂经硅藻土垫过滤，且将滤液真空浓缩。所获得的残留物通过快速柱色谱法(硅胶，4g)纯化以给出作为白色固体的(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-6-((((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-甲基戊酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基二氢-3aH-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡咯-5(4H)-甲酸叔丁酯(32b)(300mg，产率53.5%)；1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.86 (s,1H,可交换的), 8.09 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.22 (s,1H), 6.78 (s, 2H,可交换的), 5.23 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 5.14 (s, 1H), 4.87 (d,J = 5.7 Hz, 1H), 4.22-4.05 (m, 3H), 3.99-3.86 (m, 1H), 3.17 (d, J = 5.2 Hz,1H), 1.55 (dd, J = 12.5, 6.0 Hz, 1H), 1.46-1.34 (m, 22H), 1.28 (s, 3H), 0.81(dd, J = 9.1, 6.7 Hz, 6H); MS (ES+) 619.13(M+1), 642.15 (M+Na); (ES-) 617.18(M-1), 653.27 (M+Cl)；分析：C30H44N8O8·0.5H2O，计算值：C, 57.40; H, 7.55; N, 13.39；实验值：C, 57.46; H, 7.53; N, 13.13。
实施例5：(2S,2'S)-(2S,3S,4R,5R)-双(2-氨基-3-甲基丁酸)2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-5-(羟基甲基)吡咯烷-3,4-二基酯(38c)
向(2S,2'S)-(2S,3S,4R,5R)-双(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酸)2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-3,4-二基酯(38b)(715mg，0.711mmol)在丙酮(25mL)中的溶液中加入9 M硫酸(0.395mL，3.55mmol)且在室温下搅拌过夜。将丙酮层滗析且将残留物用丙酮处理并滗析(3次)。所获得的残留物通过快速柱色谱法(硅胶，12g，用在CMA-80中的0-100% CMA-50洗脱)纯化以给出作为白色固体的(2S,2'S)-(2S,3S,4R,5R)-双(2-氨基-3-甲基丁酸)2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-5-(羟基甲基)吡咯烷-3,4-二基酯(38c)(188mg，57%)；1H NMR (300MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.84 (bs, 1H, D2O，可交换), 8.06 (s, 1H), 7.51 (d, J = 2.3 Hz,1H), 6.77 (s, 2H, D2O，可交换), 5.33 (dd, J = 7.6, 5.6 Hz, 1H), 5.24 (dd, J =5.7, 3.8 Hz, 1H), 4.39 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 3.64-3.51 (m, 2H), 3.17 (dd, J =4.5, 2.9 Hz, 2H), 3.06 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 2.01-1.88 (m, 1H), 1.87-1.75 (m,1H), 0.91 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.84 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.79 (d, J = 6.8 Hz,3H), 0.73 (d, J = 6.8 Hz, 3H); MS (ES+) 928.2 (2M+1); (ES-) 462.0 (M-1),925.1(2M-1)。
制备(2S,2'S)-(2S,3S,4R,5R)-双(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酸)2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-3,4-二基酯(38b)
步骤1：(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(34a)
在室温下向(2R,3R,4S,5S)-二乙酸2-(乙酰氧基甲基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-(4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)吡咯烷-3,4-二基酯(28c)(25.8g，50.5mmol)在甲醇(200mL)中的溶液中加入在甲醇中的25重量%甲醇钠(3.6mL，16.66mmol)。在室温下搅拌反应混合物过夜。将反应混合物真空浓缩至干燥且通过快速柱色谱法(硅胶，600g)纯化以给出作为无色泡沫的(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(34a)(17.7g，产率91%)；1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 )δ 12.34 (s, 1H), 8.62 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 5.40-5.02 (m, 2H), 4.96-4.70 (m,2H), 4.41-4.25 (m, 1H), 4.13-3.93 (m, 2H), 3.69-3.51 (m, 2H), 1.35 (s, 3H),1.01 (s, 6H); MS (ES+) 384.9 (M+1), 792.6 (2M+Na); (ES-) 382.6 (M-1)。
步骤2：制备(2S,3S,4R,5R)-2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(34b)
向(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(34a)(4g，10.39mmol)在DMF(80mL)中的溶液中加入叠氮化钠(3.38g，52.0mmol)且在搅拌下在80℃下加热10小时。将反应物冷却到25℃，扔进冰中并用乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯层分离，用水、盐水洗涤，干燥并真空浓缩至干燥(水浴，50℃)。所获得的粗残留物通过快速柱色谱法(硅胶，120g，用在氯仿中的0-100%甲醇洗脱)以给出作为白色固体的(2S,3S,4R,5R)-2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(34b)(1.28g，产率31%)；1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 13.05 (bs, 1H, D2O，可交换), 9.84 (s, 1H), 7.81 (m, 1H), 5.13 (m, 1H),5.05-4.83 (m, 3H, D2O，可交换), 4.24 (m, 1H), 4.09 (m, 1H), 4.03 (m, 1H), 3.59(m, 2H), 1.38 (s, 4H，Boc) and 1.05 (s, 5H，Boc); MS (ES+) 782.8 (2M+1), (ES-)389.6 (M-1)。
步骤3：制备(2S,3S,4R,5R)-2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(35a)
向(2S,3S,4R,5R)-2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(34b)(1.0g，2.55mmol)在吡啶(5.0mL，62.06mmol)中的溶液中加入氯三苯基甲烷(0.85g，3.07mmol)。将所得混合物在50℃下搅拌4小时，此时，反应已经完成(TLC，在9:1 氯仿:甲醇中)。将反应混合物冷却到25℃，扔进冰水(80mL)中并用乙酸乙酯(100mL，2×60mL)萃取。将有机层合并，用水、盐水洗涤，过滤且真空浓缩以产生灰白色固体。将该固体用在正己烷中的5% EtOAc湿磨且通过过滤收集以给出作为浅黄色固体的(2S,3S,4R,5R)-2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(35a)(1.47g，产率90.74%)；1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ,370K) δ 12.82 (s, 1H), 9.48 (s, 1H), 7.44 (s, 1H), 7.36 (d, J = 8.0 Hz,5H), 7.29-7.19 (m,9H), 4.96 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 4.72 (d, J = 5.3 Hz, 1H),4.59 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.54-4.46 (m, 1H), 4.38-4.30 (m, 1H), 4.08-3.99 (m,1H), 3.93-3.84 (m, 1H), 3.46 (dd, J = 9.1, 6.4 Hz, 1H), 3.37 (dd, J = 9.2,4.2 Hz, 1H), 1.19 (s, 9H); MS (ES+) 655.85 (M+Na), (ES-) 632.55 (M-1). IR(KBr) 2133 cm-1。
步骤4：制备(2S,3S,4R,5R)-2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-4-羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39a)；(2S,3S,4R,5R)-2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-3-羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39b)和(2S,2'S)-(2S,3S,4R,5R)-双(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酸)2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-3,4-二基酯(38a)
方法1：
在室温下向(2S,3S,4R,5R)-2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(35a)(1g，1.578mmol)和(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-甲基丁酸(L-Boc缬氨酸，0.343g，1.58mmol)在DMF(10mL)中的溶液中加入N1-((乙基亚氨基)亚甲基)-N3,N3-二甲基丙-1,3-二胺盐酸盐(EDCI，0.756g，3.95mmol)和N,N-二甲基吡啶-4-胺(DMAP，0.193g，1.578mmol)。在室温下搅拌反应混合物过夜。TLC分析(在甲醇中的10%氯仿)，一些未反应的(2S,3S,4R,5R)-2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(35a)。将反应用水(50mL)骤冷且用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。将有机层合并，用水、盐水(100mL)洗涤，干燥，过滤并真空浓缩。所获得的粗残留物通过快速柱色谱法(硅胶，40g)纯化以给出：
作为白色固体的2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸酯(35a) (196mg，19.6%)；
作为白色固体的(2S,3S,4R,5R)-2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-4-羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39a) (511mg，38.9%)；1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 , 370K) δ 12.86(s, 1H), 9.39 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 7.38 (d, J = 7.9 Hz, 6H), 7.31-7.18 (m,9H), 6.57 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 5.46 (s, 1H), 5.05 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 4.94(d, J = 6.3 Hz, 1H), 4.78-4.69 (m, 1H),4.13-4.05 (m, 2H), 3.53-3.36 (m, 2H),2.19-2.04 (m, 1H), 1.42 (s, 9H), 1.17 (s, 9H), 0.92 (t, J = 6.7 Hz, 6H); IR(KBr) 2133 cm-1; MS (ES-) 831.1 (M-1)；
作为白色固体的(2S,3S,4R,5R)-2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-3-羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39b) (250mg，19%)；1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 , 370K) δ 12.84(s, 1H), 9.49 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.36-7.28 (m, 6H), 7.25-7.17 (m, 9H),6.48 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.81-5.71 (m, 1H), 5.22 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 5.00(d, J = 6.0 Hz, 1H), 4.71 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 3.91 (m, 2H), 3.56-3.32 (m,2H), 2.10-2.00 (m, 1H),1.32 (s, 9H), 1.22 (s, 9H), 0.88 (dd, J = 6.6, 3.4 Hz,6H); IR (KBr) 2134cm-1; MS (ES-) 831.1(M-1)；和
作为白色固体的(2S,2'S)-(2S,3S,4R,5R)-双(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酸)2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-3,4-二基酯(38a) (18mg，1.1%)；1H NMR (300 MHz, DMSO, 370K) δ12.94 (s, 1H, N-H), 9.38 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.38-7.14 (m, 15H), 6.51 (s,1H, N-H), 6.37 (s, 1H, N-H), 5.97 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 5.76 (s, 1H), 5.22(t, J = 11.3 Hz, 1H), 4.19-3.98 (m, 2H), 3.91 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 3.55 (d, J= 18.8 Hz, 1H), 3.35 (m, 1H), 2.06 (m, 2H), 1.37 (s,, 9H), 1.24 (s, 9H), 1.21(s, 9H), 0.94-0.78 (m, 12H)。
方法2：
在室温下向(2S,3S,4R,5R)-2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(35a) (1.0g，1.58mmol)和(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-甲基丁酸(L-Boc缬氨酸，0.720g，3.31mmol)在DMF(10mL)中的溶液中加入N1-((乙基亚氨基)亚甲基)-N3,N3-二甲基丙-1,3-二胺盐酸盐(EDCI，0.756g，3.95mmol)和N,N-二甲基吡啶-4-胺(DMAP，0.193g，1.578mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜且用水(30mL)骤冷。将反应混合物用乙酸乙酯(3×60mL)萃取。将有机层合并，用水、盐水(50mL)洗涤，干燥，过滤并真空浓缩。所获得的粗残留物通过快速柱色谱法(硅胶，25g，用在己烷中的0-50%乙酸乙酯洗脱)纯化以给出作为白色泡沫的(2S,2'S)-(2S,3S,4R,5R)-双(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酸)2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-3,4-二基酯(38a)(670mg，产率41.2%)，加作为白色泡沫的含有(2S,3S,4R,5R)-2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-4-羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39a)和(2S,3S,4R,5R)-2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-3-羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39b)的混合物(610mg，47.9%)；MS (ES-) 831.5(M-1)。
步骤5：制备(2S,2'S)-(2S,3S,4R,5R)-双(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酸)2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-3,4-二基酯(38b)
向(2S,2'S)-(2S,3S,4R,5R)-双(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酸)2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-3,4-二基酯(38a)(964mg，0.934mmol)在乙醇(25mL)中的溶液中加入Pd/C(10%)(150mg)且在50psi下氢化过夜。催化剂经硅藻土垫过滤而除去，且将滤液真空浓缩。所获得的残留物通过快速柱色谱法(硅胶，4g，用在己烷中的(乙酸乙酯/甲醇9:1)，0-100%洗脱)纯化以给出作为白色固体的(2S,2'S)-(2S,3S,4R,5R)-双(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酸)2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1-(叔丁氧基羰基)-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-3,4-二基酯(38b)(765mg，产率81%)；1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 , 370K) δ 10.61(s, 1H, N-H), 7.86 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.37-7.17 (m, 16H), 6.38 (m, 2H, N-H), 6.30 (s, 2H, N-H), 6.16 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 5.87 (t, J = 3.8 Hz, 1H),5.06 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 4.12-4.00 (m, 2H), 3.98-3.86 (m, 1H), 3.78 (dd, J =9.7, 6.9 Hz, 1H), 3.20 (m, 1H), 2.05 (m, 2H), 1.40 (s, 9H), 1.31 (s, 9H),1.23 (d, J = 2.0 Hz, 9H), 0.90-0.80 (m, 12H)；分析：C55H71N7O11.H2O，计算值：C,64.50; H, 7.18; N, 9.57；实验值：C, 64.36; H, 7.11; N, 9.38。
实施例6：制备(S)-(2R,3R,4S,5S)-2-氨基-3-甲基丁酸5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-羟基-2-(羟基甲基)吡咯烷-3-基酯(35e)和(S)-(2S,3S,4R,5R)-2-氨基-3-甲基丁酸2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-3-基酯(34f)
方法1：
自(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-4-羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39d)和(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-3-羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39e)
向(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-4-羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39d)和(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-3-羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39e)(744mg，0.922mmol)在丙酮(15mL)中的溶液中加入9M硫酸(0.512mL，4.61mmol)且在室温下搅拌过夜。将溶剂滗析且将白色固体用丙酮洗涤并在再次滗析之前搅拌30分钟。将相同的程序重复3-4次，所获得的固体通过过滤收集，将其用丙酮洗涤且在真空下在35℃下干燥以给出作为白色固体的(S)-(2R,3R,4S,5S)-2-氨基-3-甲基丁酸5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-羟基-2-(羟基甲基)吡咯烷-3-基酯(35e)和作为硫酸盐的(S)-(2S,3S,4R,5R)-2-氨基-3-甲基丁酸2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-3-基酯(34f)的混合物(500mg，1.081mmol，产率97%)。使用快速柱色谱法(233mg样品混合物，硅胶，用在CMA-80中的0-100% CMA-50洗脱)纯化提供作为白色固体的(S)-(2R,3R,4S,5S)-2-氨基-3-甲基丁酸5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-羟基-2-(羟基甲基)吡咯烷-3-基酯(35e)和(S)-(2S,3S,4R,5R)-2-氨基-3-甲基丁酸2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-3-基酯(34f)的混合物(74mg，48%)；1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ [8.08 (s, 0.65H), 8.07 (s,0.35H) 1H], [7.49 (s, 0.35H), 7.48 (s, 0.65H) 1H], [5.09 (t, J = 6.4 Hz,0.35H), 5.01 (dd, J = 5.7, 3.7 Hz, 0.65H) 1H], [4.35 (d, J = 6.7 Hz, 0.35H),4.21 (d, J = 5.6 Hz, 0.35H), 4.18 (d, J = 5.7 Hz, 0.65H), 4.14-4.09 (m,1.65H) 3H], [3.63-3.48 (m, 1H) 1H], [3.25 (d, J = 5.1 Hz, 0.7H), 3.20-3.10(m, 1.3H) 2H], [2.05-1.82 (m, 1H)], [0.93 (d, J = 6.8 Hz, 1.95H), 0.88 (d, J= 6.8 Hz, 1.95H), 0.81 (d, J = 6.9 Hz, 1.05H), 0.77 (d, J = 6.8 Hz, 1.05H)6H]; MS (ES+) 365.0 (M+1)。
方法2：
自(6aR,8S,9S,9aR)-8-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-9-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-2,2,4,4-四异丙基四氢-[1,3,5,2,4]三氧杂二硅杂环辛二烯并[7,6-b]吡咯-7(8H)-甲酸叔丁酯(34e)
在室温下向(6aR,8S,9S,9aR)-8-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-9-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-2,2,4,4-四异丙基四氢-[1,3,5,2,4]三氧杂二硅杂环辛二烯并[7,6-b]吡咯-7(8H)-甲酸叔丁酯(34e)(0.843g，1.04mmol)在丙酮(10mL)中的搅拌溶液中加入浓硫酸(50%水溶液，1.16mL，10.44mmol)且搅拌18小时。将反应混合物用丙酮(30mL)稀释并搅拌。滗析丙酮并重复该操作两次。分离出的固体通过过滤收集，真空干燥以给出作为白色固体的(S)-(2R,3R,4S,5S)-2-氨基-3-甲基丁酸5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-羟基-2-(羟基甲基)吡咯烷-3-基酯(35e)和(S)-(2S,3S,4R,5R)-2-氨基-3-甲基丁酸2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-3-基酯硫酸盐(34f)的混合物(0.4g，68%)。该固体通过快速柱色谱法(硅胶，4g，用在CMA-80中的0-100% CMA-50洗脱)纯化以给出(S)-(2R,3R,4S,5S)-2-氨基-3-甲基丁酸5-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-羟基-2-(羟基甲基)吡咯烷-3-基酯(35e)和(S)-(2S,3S,4R,5R)2-氨基-3-甲基丁酸-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-3-基酯(34f)的混合物；NMR分析显示化合物35e和34f的混合物；MS (ES+) 365.1 (M+1), (ES-) 362.9 (M-1)。
制备(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-4-羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39d)和(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-3-羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39e)
方法1：
自(2S,3S,4R,5R)-2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-4-羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39a)
向(2S,3S,4R,5R)-2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-4-羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39a)(1.319g，1.584mmol)在乙醇(50mL)中的溶液中加入10% Pd/C(200mg)并在50psi下氢化8小时。催化剂通过经硅藻土垫过滤反应混合物而除去。将滤液真空浓缩且所获得的残留物通过快速柱色谱法纯化以给出作为白色固体的(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-4-羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39d)和(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-3-羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39e)的3:2混合物(通过NMR分析)(945mg，1.171mmol，产率74.0%)；MS(ES+) 806.9 (M+1); (ES-) 805.0(M-1), 841.2(M+Cl)。
方法2：
自(2S,3S,4R,5R)-2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-3-羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39b)
向(2S,3S,4R,5R)-2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-3-羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39b)(634mg，0.761mmol)在乙醇(25mL)中的溶液中加入10% Pd/C(100mg)且在50psi下氢化8小时。催化剂通过经硅藻土垫过滤反应混合物而除去。将滤液真空浓缩且所获得的残留物通过快速柱色谱法纯化以给出作为白色固体的(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-4-羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39d)和(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-4-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-3-羟基-5-((三苯甲基氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39e)的3:2混合物(474mg，0.587mmol，产率77%)；NMR光谱与使用从化合物39a的程序获得的产物相匹配；MS(ES+)806.9 (M+1); (ES-) 805.7 (M-1)。
制备(6aR,8S,9S,9aR)-8-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-9-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-2,2,4,4-四异丙基四氢-[1,3,5,2,4]三氧杂二硅杂环辛二烯并[7,6-b]吡咯-7(8H)-甲酸叔丁酯(34e)
步骤1：制备(6aR,8S,9S,9aR)-8-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-9-羟基-2,2,4,4-四异丙基四氢-[1,3,5,2,4]三氧杂二硅杂环辛二烯并[7,6-b]吡咯-7(8H)-甲酸叔丁酯(34c)
向(2S,3S,4R,5R)-2-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(34b)(5g，12.78mmol)在DMF (25mL)中的搅拌溶液中加入N,N-二甲基吡啶-4-胺(DMAP，0.078g，0.639mmol)、1H-咪唑(3.48g，51.1mmol)和1,3-二氯-1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷(4.63mL，14.05mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜且用水(300mL)稀释。分离的固体通过过滤收集并用水洗涤。该固体通过快速柱色谱法(硅胶，用在己烷中的0-35%乙酸乙酯洗脱)纯化以给出作为白色固体的(6aR,8S,9S,9aR)-8-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-9-羟基-2,2,4,4-四异丙基四氢-[1,3,5,2,4]三氧杂二硅杂环辛二烯并[7,6-b]吡咯-7(8H)-甲酸叔丁酯(34c)(5.02g，产率62.0%)；1H NMR(300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 13.26 (s, 1H, D2O，可交换), 9.85 (s, 1H), 7.49 (s, 1H),5.52 (d, J = 3.2 Hz, 1H, D2O，可交换), 5.10 (s, 1H), 4.63-4.24 (m, 2H), 4.18-3.82 (m, 1H), 3.67 (dt, J = 8.2, 2.9 Hz, 1H), 1.37 (d, J = 45.1 Hz, 10H),1.08-0.99 (m, 14H), 0.86 (m, 14H); MS (ES+) 633.9 (M+1); (ES-) 632.2 (M-1)；分析：C28H47N7O6Si2，计算值：C, 53.05; H, 7.47; N, 15.47；实验值：C, 53.00; H, 7.55;N, 15.15。
步骤2：制备(6aR,8S,9S,9aR)-8-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-9-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-2,2,4,4-四异丙基四氢-[1,3,5,2,4]三氧杂二硅杂环辛二烯并[7,6-b]吡咯-7(8H)-甲酸叔丁酯(34d)
向(6aR,8S,9S,9aR)-8-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-9-羟基-2,2,4,4-四异丙基四氢-[1,3,5,2,4]三氧杂二硅杂环辛二烯并[7,6-b]吡咯-7(8H)-甲酸叔丁酯(34c)(2g，3.16mmol)在DMF (20mL)中的搅拌溶液中加入(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-甲基丁酸(L-Boc缬氨酸，1.03g，4.73mmol)并冷却到0℃。在0℃下，加入N1-((乙基亚氨基)亚甲基)-N3,N3-二甲基丙-1,3-二胺盐酸盐(EDCI，1.51g，7.89mmol)和N,N-二甲基吡啶-4-胺(DMAP，0.385g，3.16mmol)并让反应物达到室温过夜。将反应物用水(100mL)稀释并用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。将乙酸乙酯层合并，用水(2×50mL)、盐水(50mL)洗涤，干燥，过滤且真空浓缩。所获得的残留物通过快速柱色谱法(硅胶，80g，用在己烷中的0-35%乙酸乙酯洗脱)纯化以提供作为白色固体的(6aR,8S,9S,9aR)-8-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-9-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-2,2,4,4-四异丙基四氢-[1,3,5,2,4]三氧杂二硅杂环辛二烯并[7,6-b]吡咯-7(8H)-甲酸叔丁酯(34d)(2.1g，80%)；1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 13.40 (s, 1H, D2O，可交换), 9.85 (d, J = 5.7Hz, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.23 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.84 (d, J = 3.7 Hz, 1H),5.24 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.82-4.58 (m, 1H), 4.41 (d, J = 12.4 Hz, 1H),4.03-3.93 (m, 2H), 3.67 (s, 1H), 2.08 (dt, J = 13.5, 6.8 Hz, 1H), 1.49-1.33(m, 18H), 1.15-0.67 (m, 35H); MS (ES+) 856.0 (M+Na), 832.4 (M-1)。分析：C38H64N8O9Si2，计算值：C, 54.77; H, 7.74; N, 13.45；实验值：C, 54.86; H, 7.78; N,13.13。
步骤3：制备(6aR,8S,9S,9aR)-8-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-9-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-2,2,4,4-四异丙基四氢-[1,3,5,2,4]三氧杂二硅杂环辛二烯并[7,6-b]吡咯-7(8H)-甲酸叔丁酯(34e)
向钯/碳(10%，0.262g)在乙醇(50mL)中的悬浮液中加入(6aR,8S,9S,9aR)-8-(4-叠氮基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-9-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-2,2,4,4-四异丙基四氢-[1,3,5,2,4]三氧杂二硅杂环辛二烯并[7,6-b]吡咯-7(8H)-甲酸叔丁酯(34d)(2.05g，2.46mmol)且在60psi下氢化12小时。催化剂通过经硅藻土垫过滤而除去，且将滤液真空浓缩。所获得的残留物通过快速柱色谱法(硅胶，25g，用在氯仿中的0-100% CMA 80洗脱)纯化以给出作为无色固体的(6aR,8S,9S,9aR)-8-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-9-(((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)氧基)-2,2,4,4-四异丙基四氢-[1,3,5,2,4]三氧杂二硅杂环辛二烯并[7,6-b]吡咯-7(8H)-甲酸叔丁酯(34e) (1.9g，产率96%)；1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.94 (s, 1H, D2O，可交换), 8.05 (s, 1H), 7.46-7.30 (m, 1H), 7.17 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.82 (s, 2H,D2O，可交换), 5.86 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.16 (d, J = 25.0 Hz, 1H, D2O，可交换),5.00 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 12.2, 5.1 Hz, 1H), 3.98-3.88 (m, 1H),3.61 (s, 1H), 2.16-1.92 (m, 1H), 1.41 (bs, 18H), 1.01-0.83 (m, 35H); MS (ES+)806.921 (M+1), 830.1 (M+Na), (ES-) 805.289 (M-1), 842.0 (M+Cl)。
实施例7：在口服施用给大鼠之后化合物30f的药物动力学
将健康的8至10周龄雄性Sprague-Dawley大鼠随机分到对照组和实验组，N = 4只/组。将所有动物以标准方式收容并饲养。在实验的当天，给药之前大约15小时在代谢笼中将所有动物分开并禁食。在用对照物和实验剂给药后2小时对动物恢复给食。随意进水。在临施用前将对照化合物(2S,3S,4R,5R)-2-(4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-5-(羟基甲基)吡咯烷-3,4-二醇二盐酸盐(12i)溶解于水中以获得1mg/mL的浓度。将实验化合物30f类似地溶解于水中以获得当量浓度(1mg/mL，就化合物12i而言)。在将各动物称重之后，在时间0下通过经口管饲法对所有对照动物施用10mg/kg体重的化合物12i，同时在时间0下通过经口管饲法对所有实验动物施用10mg/kg体重的化合物30f。在时间0、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时和24小时获得系列血液样品。将所有样品转移到微离心管中并在14,000rpm下离心3分钟。将来自各管的血浆移出并转移到预标记的微离心管中并置于干冰上，直至将样品转移到-80℃冰箱中以便储存，直至分析。随后针对化合物12i来分析单个样品。使用WinNonlin软件程序通过无隔法分析随时间而变的血浆浓度数据。获得药物动力学参数Tmax、Cmax、T½、AUC(0-last)、AUC(0-inf), MRT(0-inf)和血浆和肝浓度随时间而变概况的曲线。结果示于图1中。
如在图1中所绘，实验组和对照组在药物动力学方面表现出明显差别。虽然两组的Tmax是相同的(0.5小时)，但实验组的Cmax为527ng/mL，而对照组的Cmax仅为123ng/mL；实验组的AUC(0-inf)为1076ng·h，而对照组的AUC(0-inf)仅为219ng·h。基于这些结果，与化合物12i相比，化合物30f具有大约4倍的生物利用度，且血浆酯酶使化合物30f迅速水解成化合物12i。
实施例8：病毒RNA聚合酶抑制剂(化合物12i)对在非洲绿猴肾细胞中的麻疹病毒复制的影响
材料和方法：Vero-76细胞(非洲绿猴肾细胞)从美国典型菌种保藏中心(ATCC,Manassas, VA)获得。使这些细胞常规地穿过补充有5%胎牛血清(FBS, Hyclone)的最低必需培养基(具有0.15% NaHCO3的MEM；Hyclone Laboratories，Logan, UT, USA)。在评价化合物时，使血清降到2.5%的最后浓度，且将庆大霉素加到试验培养基中，达到50μg/mL的最后浓度。麻疹病毒(MV)菌株(芝加哥)自疾病控制中心(Atlanta，GA)获得。
抗病毒试验程序：
细胞病理效应抑制测定(视觉测定)
将细胞以恰当细胞浓度以0.2mL/孔接种到96孔平底组织培养板(Corning GlassWorks, Corning, NY)中，且在37℃下培育过夜以建立细胞单层。在建立该单层时，将生长培养基滗析并将各种稀释度的试验化合物加到各孔中(3孔/稀释度，0.1mL/孔)。将化合物稀释培养基加到细胞和病毒对照孔(0.1mL/孔)中。将在试验培养基中稀释的病毒以0.1mL/孔加到化合物试验孔(3孔/化合物的稀释度)和病毒对照孔(6孔)。在化合物之后大约5分钟加入病毒(病毒MOI = 0.001)。将没有病毒的试验培养基以0.1mL/孔加到所有毒性对照孔(2孔/各试验化合物的稀释度)和细胞对照孔(6孔)。将板在37℃下在具有5% CO2、95%空气气氛的湿润培育箱中培育，直至病毒对照孔具有足够的细胞病理效应(CPE)读数(80-100%细胞破坏)。根据病毒，这在使细胞暴露病毒之后4-11天实现。随后，显微检查细胞的CPE，将其以0(正常细胞)到4 (最大，100% CPE)评分。显微观察在毒性对照孔中的细胞的由细胞毒性引起的形态改变。该细胞毒性(细胞破坏和/或形态改变)也以100%毒性、80%细胞毒性、60%细胞毒性、40%细胞毒性、20%细胞毒性和0(正常细胞)分级。50%有效剂量(EC50)和50%细胞毒性剂量(IC50)通过分别回归分析病毒CPE数据和毒性对照数据来计算。所测试的各化合物的选择指数(SI)使用下式计算：
SI = CC50/EC50。
CPE抑制的中性红(NR)摄取测定
基于Smee等的发现(Virol. Methods 2002, 106 : 71-79；整体通过引用结合到本文中来)选择NR摄取作为评价抗病毒药物的染色定量方法。对于如上所述的CPE抑制试验板进行该测定以证实通过目测观察到的抑制活性和细胞毒性。NR测定使用如由Barnard等(Antiviral Chem. Chernother. 2001, 12:220-231；整体通过引用结合到本文中来)所述的Cavenaugh等(Invest. New Drugs 1990, 8:347-354；整体通过引用结合到本文中来)的改进方法进行。简要地讲，将培养基从用于由CPE抑制测定对CPE评分的板的各孔中移出，将0.034% NR加到该板的各孔中并将该板在37℃下在暗处培育2小时。随后将NR溶液从孔中移出。在漂洗(有时细胞从板上脱落导致错误的中性红变低(low up))并抽气至干燥之后，剩余染料在室温下在暗处使用用Sorenson柠檬酸盐缓冲液缓冲的无水乙醇从细胞中提取30分钟。用微板阅读器(Opsys MRTM，Dynex Technologies, Chantilly, VA, USA)读出在540nm/405nm下的吸光度。吸光度值用未处理对照物的%表示，且如上所述计算EC50、CC50和SI值。
病毒产量减少测定：
基本如先前所述(Antimicrob. Agents Chemother.1992, 3:1837-1842；整体通过引用结合到本文中来)使用细胞培养50%感染剂量(cell culture 50% infectiousdose，CCID50)测定进行病毒产量减少测定。简要地，将来自各孔的上清液在96孔板的含有Vero-76细胞的三个重复孔中连续稀释。将板培育6天且随后检查病毒诱发的CPE。病毒产量滴度的定量通过Reed和Muench的终点法(Am. J. Hyg. 1938, 27:493-498；整体通过引用结合到本文中来)进行。EC90值使用线性回归计算以评估抑制病毒产量90%或病毒滴度减小1 log10所需要的浓度。
结果和论述：
麻疹病毒被化合物12i有效地抑制(表1)。针对麻疹病毒的EC50值通过视觉测定和NR测定分别为0.6μg/mL和1.4μg/mL。该化合物在视觉测定或NR测定中均没有任何细胞毒性(IC50 >100)。因此，两种测定的选择指数暗示化合物12i高效抗麻疹病毒(MV)。抗MV的有效抑制活性通过病毒产量减少测定证实，其中EC90 = 0.36μg/mL，这代表在受感染细胞中生成的病毒降低1 log10。
结论：
化合物12i证明有效且选择性的抑制活性。通过病毒产量减少测定，化合物12i也是MV的有效抑制剂(EC90 = 0.37μg/mL)。因此，已经发现化合物12i为许多RNA病毒的有效抑制剂，且暗示在体外和体内评价中化合物12i被进一步证明为所选择的RNA病毒的广谱抑制剂。
实施例9：病毒RNA聚合酶抑制剂(化合物12i)对各种RNA病毒复制的作用
材料和方法
细胞和病毒
非洲绿猴肾细胞(MA-104)自Whitaker MA Bioproducts, Walkersville, MD,USA)获得。所有Vero细胞(非洲绿猴肾细胞、人喉癌细胞(A-549)和Madin-Darby犬肾细胞)均自美国典型菌种保藏中心(ATCC, Manassas, VA)获得。将A-549细胞在补充有0.15%NaHCO3 (Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA)和10%胎牛血清(FBS, Hyclone)的Dulbecco’s最低必需培养基(DMEM)中培养。使剩余细胞常规地穿过补充有5%胎牛血清(FBS, Hyclone)的最低必需培养基(具有0.15% NaHCO3的MEM；Hyclone Laboratories，Logan, UT, USA)。
在评价化合物时，使血清降到2.5%的最后浓度，且将庆大霉素加到试验培养基中，达到50μg/mL的最后浓度。用于流感测定的试验培养基由没有血清的MEM、0.18% NaHCO3、20μg胰蛋白酶/mL、2.0μg EDTA/mL和50μg庆大霉素/mL组成。
为了评价在积极生长的细胞中的毒性，通过确定由暴露于数种浓度的化合物3天之后的NR摄取测定所反映的总细胞数来评价细胞毒性。为了定量在存在和不存在药物的情况下在72小时的细胞生长，将板用1×103个MDCK细胞接种，且在4小时之后(允许所有细胞粘附到板孔上)使其暴露于在MEM中的所选浓度的药物或MEM中。在72小时之后，如上所述处理板以便用于NR测定。吸光度值表示为未处理对照物的%，且CC50值通过回归分析计算。
登革热病毒2 (DV-2)、新几内亚C株、呼吸道融合病毒(RSV) A2、鼻病毒2 (RV-2)、HOP株、塔卡里伯病毒(TCV)、TRVL 11573菌株、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)和黄热病毒(YFV)、17D株全部自美国典型微生物菌种保藏中心(ATCC; Manassas, VA)购买。所有流感病毒、麻疹病毒(MV)、芝加哥株、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、Urbani株和西尼罗病毒(WNV)、命名为996625株的原型New York 1999分离菌自疾病控制中心(Atlanta, GA)获得。PuntaToro病毒(PTV)、亚当株(Adames strain)自美国陆军传染病医疗研究所，Ft. Detrick的Dr. Dominique Pifat (Frederick, MD)获得。立谷热病毒(RVFV)疫苗株、MP-12和Junin病毒(JUNV)疫苗株、Candid 1由Dr. Robert Tesh (World Reference Center for Emergingand Viruses and Arboviruses, University of Texas Medical Branch, Galveston,TX)友情提供。皮钦德病毒(PICV)(An 4763株)由Dr. David Gangemi (ClemsonUniversity, Clemson, South Carolina)提供。3型副流感病毒(PIV-3)14702/5/95株自Jacquelin Boivin (Hospitale St. Justin, Montreal, Canada)获得。1型腺病毒(AV-1)Chicago/95株自儿科患者的气管洗涤液分离且由M.F. Smaron (Department ofMedicine, University of Chicago, Chicago IL)提供。
抗病毒试验程序：
细胞病理效应抑制测定(视觉测定)
将细胞以恰当细胞浓度以0.2mL/孔接种到96孔平底组织培养板(Corning GlassWorks, Corning, NY)中，且在37℃下培育过夜以建立细胞单层。在确立该单层时，将生长培养基滗析并将各种稀释度的试验化合物加到各孔中(3孔/稀释度，0.1mL/孔)。将化合物稀释培养基加到细胞和病毒对照孔(0.1mL/孔)中。将在试验培养基中稀释的病毒以0.1mL/孔加到化合物试验孔(3孔/化合物的稀释度)和病毒对照孔(6孔)。在化合物之后大约5分钟加入病毒(病毒MOI = 0.001)。将没有病毒的试验培养基以0.1mL/孔加到所有毒性对照孔(2孔/各试验化合物的稀释度)和细胞对照孔(6孔)。将板在37℃下在具有5% CO2、95%空气气氛的湿润培育箱中培育，直至病毒对照孔具有足够的细胞病理效应(CPE)读数(80-100%细胞破坏)。根据病毒，这在使细胞暴露病毒之后4-11天实现。随后，显微检查细胞的CPE，将其以0(正常细胞)到4 (最大，100%)CPE评分。显微观察在毒性对照孔中的细胞的由细胞毒性引起的形态改变。该细胞毒性(细胞破坏和/或形态改变)也以100%毒性、80%细胞毒性、60%细胞毒性、40%细胞毒性、20%细胞毒性和0(正常细胞)分级。50%有效剂量(EC50)和50%细胞毒性剂量(IC50)通过分别回归分析病毒CPE数据和毒性控制数据来计算。所试验的各化合物的选择指数(SI)使用下式计算：SI = CC50/EC50。
CPE抑制和化合物细胞毒性的中性红(NR)摄取测定
基于Smee等(上述)的发现选择NR摄取作为评价抗病毒药物的染色定量方法。对于如上所述的CPE抑制试验板进行该测定以证实通过目测观察到的抑制活性和细胞毒性。该NR测定使用如由Barnard等(上述)所述的Cavenaugh等(上述)的改进方法进行。简要地讲，将培养基从用于由CPE抑制测定对CPE评分的板的各孔中移出，将0.034% NR加到该板的各孔中并将该板在37℃下在暗处培育2小时。随后将NR溶液从孔中移出。在漂洗(有时细胞从板上脱落导致错误的中性红变低(low up))并抽气至干燥之后，剩余染料在室温下在暗处使用用Sorenson柠檬酸盐缓冲液缓冲的绝对乙醇从细胞中提取30分钟。用微板阅读器(Opsys MRTM，Dynex Technologies, Chantilly, VA, USA)读出在540nm/405nm下的吸光度。吸光度值用未处理对照物的%表示，且如上所述计算EC50、CC50和SI值。
认为被化合物12i显著抑制 (SI >10)的其它病毒有DV-2 (EC50 = 15，13μg/mL)、JUNV (EC50 =29，16μg/mL)、YFV (EC50 = 8.3，8.3μg/mL)(表1)。以下病毒被化合物12i略微抑制(3<SI<10)：PIV-3 (EC50 = 7.1，10μg/mL)、SARS-CoV (EC50 = 14，16μg/mL)、PICV(EC50 = 61，28μg/mL)和RVFV (EC50 = 75，64μg/mL)。针对流感病毒株的亚组对化合物12i进行试验(表2)，且表现出抗多种菌株的广谱抗流感活性。
表2. 化合物12i的广谱抗流感活性。
结论
化合物12i表现出抗所试验的所有流感病毒的有效活性。发现化合物12i为流感病毒复制的有效抑制剂且暗示化合物12i有效地作为包括所有流感病毒的所选RNA病毒的广谱抑制剂。
实施例10：化合物12i的体外抗病毒活性
体外评价化合物12i对几种病毒的抗病毒活性。抗Marburg (丝状病毒科)、JuninCandid 1 (砂粒病毒科)、皮钦德病毒(砂粒病毒科)、Chikungunya 181/25 (披膜病毒科)和牛痘NYCBH (痘病毒科)的EC50值为约10μg/mL至约>300μg/mL。
实施例11：化合物12i和神经氨糖酸苷酶抑制剂在MDCK细胞中的协同抗病毒活性
使Madin Darby犬肾(Madin Darby Canine Kidney，MDCK)细胞被流感病毒H3N2(A/Victoria/3/75)病毒感染并用化合物12i和帕拉米韦(peramivir)的各种联合治疗72小时。细胞病理效应使用中性红染料摄取测定来确定。数据示于表3中。
表3. 在流感感染的细胞中细胞病理效应的抑制百分数
实验数据通过使用Mac Synergy IITM软件程序(Prichard和Shipman，1990；整体通过引用结合到本文中来)进行三维分析来评价。该软件计算来自各个药物的剂量-应答曲线的理论相加相互作用。随后从实验表面减去代表预测相加相互作用的所计算的增加表面以揭示比预期相互作用大(协同)或小(消效)的区域。在细胞培养研究中证明了帕拉米韦和化合物12i联用的协同抗病毒作用，协同量等于92μM2单位%。
实施例12：在鼠科流感模型中肌内(IM)注射化合物12i的功效
使6-8周龄的BALB/c小鼠适应H3N2病毒(A/Victoria/3/75)。在感染之前1小时开始通过肌内(IM)注射5天每日给予0、30、100和300mg/kg/d的剂量。N = 50只动物。跟踪所有动物16天。终点包括致死率、平均死亡天数和体重损失。
在小鼠流感模型病毒中的化合物12i (IM)的结果示于表4中。IM给予的化合物12i改善被流感病毒感染的小鼠的存活率和体重损失。
表4. 在小鼠流感模型病毒-H3N2 A/Vic/3/75中的化合物12i(IM)
*P<0.001，与媒剂感染的组相比较(对数秩和检验(log Rank test))
**P<0.001，与媒剂感染的组相比较(t检验(t-test))
实施例13：在鼠流感模型中口服化合物12i的功效
使6-8周龄的BALB/c小鼠适应H3N2病毒(A/Victoria/3/75)。口服每日一次给予0、30、100和300mg/kg/d的剂量和口服每天两次给予100mg/kg/d的剂量。N = 60只动物。跟踪所有动物16天。终点包括致死率、死亡的平均天数和体重损失。口服施用的化合物12i对被H3N2 A/Vic/3/75感染的小鼠的体重损失的影响示于表5中。口服给予的化合物12i改善了被流感病毒感染的小鼠的存活率和体重损失。
表5. 在小鼠流感模型病毒-H3N2 A/Vic/3/75中的化合物12i(口服)
*P<0.001，与媒剂感染的组相比较(对数秩和检验(log rank test))
**P<0.001，与媒剂感染的组相比较(t检验(t-test))
实施例14：小鼠的药物动力学研究
对雌性BALB/c小鼠(N = 30)以100mg/kg口服给予化合物12i。在t = 0.17小时、0.5小时、1.0小时、3小时、6小时和24小时(各5只小鼠/时间点)经眼眶后静脉窦对小鼠抽血，将其离心且将血浆储存在-80℃下。经LC/MS/MS分析测量血浆药物水平。
在口服之后化合物12i的小鼠血浆水平示于表6中。
表6. 在口服之后小鼠的化合物12i血浆水平
实施例15：埃博拉病毒小鼠预防研究
将化合物12i腹腔内、肌内和口服(300mg/kg/天，一天两次)施用到8-12周龄C57BL/6小鼠(N = 10只/组，四组：一组，盐水；三组，药物治疗)。在感染前4小时开始8天治疗。腹腔内施用小鼠适应的埃博拉病毒(Zaire)激发。监测感染后的死亡率和体重持续14天。
感染埃博拉病毒的盐水治疗的小鼠到第8天全部死亡。用化合物12i腹腔内或肌内治疗的所有小鼠在研究终点(第14天)都存活。80%用化合物12i口服治疗的小鼠在研究终点(第14天)存活。
感染埃博拉病毒的盐水治疗的小鼠直至第8天才表现出总体体重损失(所有对照小鼠都在第8天死亡)。用化合物12i腹腔内或肌内治疗的小鼠在第12天保持大于95%的初始体重。用化合物12i口服治疗的小鼠在第12天保持大于80%的初始体重。所有药物治疗的小鼠在第12天之后体重继续增加。
实施例16：埃博拉病毒小鼠预防研究
对8-12周龄C57BL/6小鼠肌内和口服施用化合物12i。将该研究受试者分成6组(N= 10只/组)。组1为盐水对照组，组2用150mg/kg化合物12i (p.o. BID)给药；组3用250mg/kg化合物12i (p.o.，BID)给药；组4用150mg/kg化合物12i (i.m.，BID)给药。组5为用盐水治疗的未感染的小鼠(p.o.，BID)，且组6为用250mg/kg化合物12i(p.o.，BID)治疗的未感染的小鼠。在感染之前4小时开始，治疗9天。腹腔内施用小鼠适应的埃博拉病毒(Zaire)激发(1,000pfu)。监测感染后的死亡率和体重持续14天。
感染埃博拉病毒的盐水治疗的小鼠到第8天全部死亡。用化合物12i肌肉内注射治疗的所有小鼠在研究终点存活，表明化合物12i的该肌内剂量是完全预防的。80%或以上的用化合物12i口服治疗的小鼠在研究终点存活。
感染埃博拉病毒的盐水治疗的小鼠直至第7天才表现出总体体重损失(所有对照小鼠都在第8天死亡)。用化合物12i肌内治疗的小鼠在第11天表现出与未感染的对照组类似的体重增加。用化合物12i口服治疗的小鼠表现出可逆的体重损失，且在第11天保留大于100%的初始体重。
实施例17：黄热病毒(YFV)时窗金色仓鼠研究
将黄热病毒(Jimenez株)以20 CCID50/仓鼠(约6.25×LD50)腹腔内注射到雌性叙利亚金色仓鼠(99g)中。如下分组：1) 在-4小时开始施用化合物12i (N = 15)；2) 在1dpi(感染后天数)开始施用化合物12i (N = 10)；3) 在2dpi开始施用化合物12i (N = 10)；4)在3dpi施用化合物12i (N = 10)；5) 在4dpi施用化合物12i (N = 10)；6) 在-4小时开始施用利巴韦林(Ribavirin)(N = 10)；7) 在-4小时开始盐水媒剂(N = 16)；8) 在-4小时开始对未感染的仓鼠施用化合物12i (N = 3)；9) 在-4小时开始对未感染的仓鼠施用盐水媒剂(N = 3)；和10) 未感染未治疗的正常对照组(N = 3)。治疗剂量为100mg/kg，腹腔内，一日两次，7天。出于人道，研究终点为21天，在第0天、第3天、第5天和第6天称体重；血清和肝病毒滴度(第4天，在-4小时化合物12i；和在-4小时媒剂)及在第6天ALT和AST。
结果显示，与安慰剂相比较，在延迟治疗的情况下，用化合物12i的存活率增强(图2)。表明了感染YFV且在病毒激发之后各种时间下开始用化合物12i每日两次治疗7天的仓鼠的存活率(***P<0.001，**P<0.1，与安慰剂相比较)。在感染前开始，对于化合物12i的存活率为100%，且在感染后的延迟治疗高达3天。在感染后4天开始，对于化合物12i的存活率为80%，这表明，与安慰剂相比，在用延迟治疗的组中的显著改善。相比之下，在感染前开始，利巴韦林提供90%的存活率，且在感染前开始，媒剂提供12.5%的存活率。大多数死亡在感染10天内发生。存活的动物将在感染后第21天用YFV再次激发。
感染YFV并从感染前到感染后4天用化合物12i治疗的仓鼠显示与安慰剂和在感染前施用的利巴韦林相比的体重增加。
实施例18：化合物12i的马尔堡病毒(Marburg Virus)研究
在用1000pfu小鼠适应的MARV-Ravn激发(腹腔内)的10-12周龄BALB/c小鼠中肌内给予化合物12i。将该研究分成10组(N = 10只/组)。给药流程、路径和剂量示于表7中。在施用之前，将化合物12i溶解于0.9%盐水中，且监测感染后的健康和体重14天。
表7. 用化合物12i预防和治疗马尔堡病毒感染的研究设计
*除了组6之外，第0天治疗在感染之前4小时开始。
组6治疗在第0天感染后4小时开始。
PI = 感染后。
在该研究中到第12天10组的存活率%包括在表8中。在第7天，仅用媒剂(0.9%盐水)治疗的小鼠的存活率为60%，且在第8-12天，仅用媒剂治疗的小鼠的存活率为30%。显示化合物12I在所有剂量下使第7天的存活率增加到至少90%，且在第8-12天增加到至少80%。
表8. 用化合物12i预防和治疗马尔堡病毒感染的存活率%
实施例19：药物剂型
以下说明用于人类的治疗或预防用途的代表性药物剂型，其含有本发明的化合物(“化合物X”)。
(i)
(ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
上述制剂可通过药物领域中公知的常规程序获得。
所有公告、专利和专利文献都通过引用结合到本文中来，就像通过引用单个地结合到本文中一样。本发明已参考各种具体且优选的实施方案和技术来描述。然而，应理解可在使其保持在本发明的精神和范围内的同时进行各种变化和修改。

Claims (25)

1.由式(I)表示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
L1、L2和L3各自为键；
L4、L5和L6各自为键；
R1、R2和R3各自独立地选自H和氨酰基；
R4、R5和R6各自为H；
R7为H；
条件是由式(I)表示的化合物不是
。
2.权利要求1的化合物，其中L1-R1和L2-R2相同。
3.权利要求2的化合物，其中L1-R1和L2-R2各自为H。
4.权利要求2的化合物，其中L3-R3为H。
5.权利要求1的化合物，其中L2-R2和L3-R3相同。
6.权利要求5的化合物，其中L2-R2和L3-R3各自为H。
7.权利要求5的化合物，其中L1-R1为H。
8.权利要求1的化合物，其中L1-R1和L3-R3相同。
9.权利要求8的化合物，其中L1-R1和L3-R3各自为H。
10.权利要求8的化合物，其中L2-R2为H。
11.权利要求1的化合物，其中L1-R1、L2-R2和L3-R3相同。
12.权利要求1-11中任一项的化合物，其中氨酰基在每次出现时独立地为-C(=O)CH(NH2)(CH2)nCHR30R31，其中
n为0或1；且
R30和R31各自独立地选自H、(C1-C6)烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基。
13.权利要求12的化合物，其中R30和R31各自独立地选自H和(C1-C6)烷基。
14.权利要求13的化合物，其中R30和R31各自独立地为(C1-C6)烷基。
15.权利要求14的化合物，其中n为0；且R30和R31各自独立地为甲基。
16.权利要求1的化合物，其选自：
、、
、、和及其药学上可接受的盐。
17.权利要求1的化合物，其由下式表示：
，
或其药学上可接受的盐。
18.药物组合物，其包含权利要求1-17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。
19.抑制病毒复制的体外方法，其包括：
使病毒与有效量的权利要求1-17中任一项的化合物或其药学上可接受的盐接触。
20.权利要求1-17中任一项的化合物在制备用于治疗病毒感染的药物中的用途。
21.权利要求20的用途，其中所述病毒选自RNA病毒。
22.权利要求21的用途，其中所述病毒选自正粘病毒科(orthomyxovirid)、副粘病毒科(paramyxoviridae)、砂粒病毒科(arenaviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、丝状病毒科(filoviridae)、披膜病毒科(togaviridae)、小核糖核酸病毒科(picornaviridae)和冠状病毒科(coronaviridae)。
23.权利要求20的用途，其中所述病毒选自腺病毒(adenovirus)、鼻病毒(rhinovirus)、甲型肝炎病毒(hepatitis A virus)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)、脊髓灰质炎病毒(polio virus)、麻疹病毒(measles virus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、柯萨奇病毒(Coxsackie virus)、西尼罗病毒(West Nile virus)、天花病毒(smallpoxvirus)、黄热病毒(yellow fever virus)、登革热病毒(Dengue Fever virus)、甲型流感病毒(influenza A virus)、乙型流感病毒(influenza B virus)、拉沙病毒(lassa virus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus)、胡宁病毒(Juninvirus)、machuppo病毒(machuppo virus)、瓜纳里多病毒(guanarito virus)、汉坦病毒(hantavirus)、立谷热病毒(Rift Valley Fever virus)、拉克罗斯病毒(La Crossevirus)、加利福尼亚脑炎病毒(California encephalitis virus)、克里米亚-刚果病毒(Crimean-Congo virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、日本脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus)、基萨诺尔森林病病毒(Kyasanur Forest virus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、东方马脑炎病毒(eastern equineencephalitis virus)、西方马脑炎病毒(western equine encephalitis virus)、严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)病毒、副流感病毒(parainfluenza virus)、呼吸道融合病毒(respiratory syncytial vitus)、庞塔托鲁病毒(Punta Toro virus)、塔卡里伯病毒(Tacaribe virus)和皮钦德病毒(Pichindevirus)。
24.权利要求23的用途，其中所述病毒选自腺病毒(adenovirus)、登革热病毒(DengueFever virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、甲型流感病毒(influenza A virus)、乙型流感病毒(influenza B virus)、胡宁病毒(Junin virus)、麻疹病毒(measles virus)、副流感病毒(parainfluenza virus)、皮钦德病毒(Pichinde virus)、庞塔托鲁病毒(PuntaToro virus)、呼吸道融合病毒(respiratory syncytial vitus)、鼻病毒(rhinovirus)、立谷热病毒(Rift Valley Fever virus)、SARS病毒、塔卡里伯病毒(Tacaribe virus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、西尼罗病毒(West Nilevirus)和黄热病毒(yellow fever virus)。
25.权利要求23的用途，其中所述病毒选自埃博拉病毒(Ebola virus)、黄热病毒(yellow fever virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、甲型流感病毒(influenza Avirus)和乙型流感病毒(influenza B virus)。
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