CN104334582A - St2抗原结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明中描述了与包括抗体在内的结合人ST2的抗原结合蛋白相关的组合物和方法。在具体的实施方案中，本发明提供了完全人抗ST2抗体和其衍生物和变异体。进一步提供了编码此类抗体和抗体片段、变异体和衍生物的核酸。还提供了制备和使用此类抗体的方法，包括治疗和预防自体免疫和炎性病症的方法。

Description

ST2抗原结合蛋白
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请No.61/792,619和2012年5月18日提交的美国临时专利申请No.61/649,147的优先权，所述临时专利申请以引用的方式整体并入本文中。
关于序列表
本申请与电子格式的序列表一道通过EFS网提交。序列表作为2013年5月17日生成的标题为A1712WOPCT_ST25.txt的文本文件提供，其大小是189,804字节。序列表电子格式中的信息以引用的方式整体并入本文中。
发明背景
ST2是白介素33(IL-33)的一种结合受体，白介素33是一种与IL-1和IL-18相关的细胞因子且又被称为NF-HEV或IL-1F11。ST2被表达成可溶的非信号转导变异体(可溶性ST2或sST2)与全长的跨膜形式(FL ST2、ST2或ST2L)，介导细胞对IL-33的响应。后一形式在与许多疾病背景下的病理性炎症相关的各类细胞类型上表达。这些细胞包括淋巴细胞、尤其是表达IL-5和IL-13的辅助性T细胞、天然杀伤(NK)和天然杀伤-T(NKT)细胞，以及很多所谓的先天免疫细胞，例如肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和先天辅助性细胞(又名新免疫细胞(nuocyte)(Neill,Wong等人 2010))。IL-33结合于这些细胞上的ST2会引起被称为IL-1R辅助蛋白(AcP)的广泛表达的共受体募集和促炎性的信号转导活化，类似于IL-1和IL-18。因此，IL-33能够直接活化表达ST2的细胞或在其它活化刺激存在下时增强其活化。IL-33诱导的细胞反应的实例包括诸如IL-5、IL-6、IL-13、TNF、IFN-γ和GM-CSF的炎性细胞因子的产生，以及诸如CXCL8、CCL17和CCL24的趋化因子的产生。IL-33还展示通过加强由IgE受体信号转导或其它肥大细胞和嗜碱性粒细胞活化剂引发的肥大细胞和嗜碱性粒细胞的活化而增强急性过敏反应。IL-33还会增强表达ST2的免疫细胞的募集、存活和粘附特性，因此在激发和维持局部组织中的细胞炎症方面具有重要意义。
IL-33对先天性和适应性免疫细胞的促炎症作用最终会引起许多病理过程。在肺中，这些病理过程包括增加的气道炎症、产生粘液、气道过度反应以及纤维化重塑。IL-33还可以通过促进促炎症细胞因子的产生而引起关节中的局部炎症以及皮肤和关节的过度伤害感受(Verri,Guerrero等人2008；Xu,Jiang等人2008)。过度的IL-33已经与病理性胶原蛋白沉积和纤维化有关，且还在炎性肠病的情况下引起上皮的损伤。通过其对嗜碱性粒细胞和IgE敏化的肥大细胞的有效作用，IL-33还可以引发过敏性休克(Pushparaj,Tay等人2009)并可能在过敏性疾病中起到一定的促进作用。许多的这些疾病实际上都是慢性和渐进性的且难以治疗，因此需要更有效的治疗。
与其已经证明的生物效应一致的是，若干条证据证明IL-33/ST2通路对人类疾病有影响。举例来说，发现在涉及粘膜组织炎症和关节炎症的疾病中IL-33的表达异常地高。这些疾病包括哮喘(Prefontaine, Lajoie-Kadoch等人2009；Prefontaine,Nadigel等人2010)、炎性肠病(Beltran,Nunez等人2010；Pastorelli,Garg等人2010；Sponheim, Pollheimer等人2010)和类风湿性关节炎(Palmer,Talabot-Ayer等人 2009；Matsuyama,Okazaki等人2010)。IL-33表达在牛皮癣皮肤(Theoharides,Zhang等人2010)和异位性皮炎患者皮肤(Pushparaj, Tay等人2009)中升高，并在诸如系统性硬化症(Yanaba,Yoshizaki 等人2011)(Manetti,Ibba-Manneschi等人2009)和肝纤维化(Marvie, Lisbonne等人2009)的病理性纤维化情况下也增加。循环的可溶性ST2的浓度在许多疾病情况下也升高，进一步表明了此细胞因子通路与这些疾病之间的关系。实例包括哮喘(Kuroiwa,Arai等人2001；Oshikawa,Kuroiwa等人2001；Ali,Zhang等人2009)、慢性阻塞性肺病(Hacker,Lambers等人2009)、肺纤维化(Tajima,Oshikawa等人 2003)、败血症和外伤(Brunner,Krenn等人2004)、HIV感染(Miyagaki, Sugaya等人2011)、全身性红斑狼疮(Mok,Huang等人2010)、炎性肠病(Beltran,Nunez等人2010)以及类风湿性关节炎、硬化症、韦格纳氏肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)和贝赛特氏病(Behchetdisease)(Kuroiwa,Arai等人2001)和心血管疾病(Shah和Januzzi 2010)。IL-33强化嗜酸性粒细胞炎症，且有证据证明此通路与诸如鼻窦炎和鼻息肉(Plager,Kahl等人2010)和嗜酸粒细胞性支气管炎(Oshikawa,Kuroiwa等人2001)的嗜酸性粒细胞相关疾病有关。
遗传研究提供了证明IL-33/ST2通路与人类疾病有关的额外证据，这些遗传研究已经鉴别出在普通人群中IL-33和/或ST2基因多态性，此与疾病风险增加或疾病严重程度参数显著相关。若干大的全基因组关联研究已经将ST2(IL1RL1)或IL-33的遗传变异与增加的哮喘风险相关联(Gudbjartsson,Bjornsdottir等人2009；Moffatt,Gut 等人2010；Wu,Romieu等人2010)，且其它研究已经将此通路与增加的哮喘严重程度(Ali,Zhang等人2009)和支气管过度反应(Reijmerink,Postma等人2008)在遗传学上相关联。类似的发现已经将此通路与诸如异位性皮炎(Shimizu,Matsuda等人2005)、鼻窦炎(Sakashita,Yoshimoto等人2008；Castano R 2009)以及鼻息肉(Buysschaert,Grulois等人2010)的过敏性病症在遗传学上相关联。
总的说来，这些与若干人类疾病的关联以及此细胞因子轴引起很多形式有害炎症的能力表明其是适用于治疗介入的一个靶标。
发明概要
本发明提供了抗ST2抗原结合蛋白，例如抗体和其功能性片段，其具有可以进行商业化生产并在人类中作治疗应用的特性。抗ST2抗原结合蛋白尤其适用于治疗与IL-33/ST2轴相关联的疾病和病症的方法。本文提供了ST2结合抗体，其以高亲和力结合ST2并有效地阻断IL-33的结合，由此降低了细胞中IL-33介导的信号转导。
在第一方面，ST2抗原结合蛋白包含a)与SEQ ID NO:95、SEQID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ IDNO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ IDNO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164或SEQ IDNO:165所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域；b)与EQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域；或c)a)的轻链可变域和b)的重链可变域。
第一方面的优选的抗原结合蛋白包括：包含与SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ ID NO:97所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列至具有少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQID NO:37所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQID NO:105所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ ID NO:163所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:145所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ ID NO:164所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ IDNO:146所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；以及包含与SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白。
在第二方面，ST2抗原结合蛋白包含：a)在SEQ ID NO:95、SEQID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ IDNO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ IDNO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164或SEQ IDNO:165所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域；b)在SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域；或c)a)的轻链可变域和b)的重链可变域。
第二方面的优选的抗原结合蛋白包括：包含在SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQID NO:30所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ IDNO:97所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQID NO:37所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ IDNO:104所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ ID NO:105所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ ID NO:163所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:145所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ ID NO:164所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:146所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；以及包含在SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白。
在第三方面，ST2抗原结合蛋白含有这样的轻链可变域，其包含：a)在SEQ ID NO:106所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:117所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQ IDNO:128所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；b)在SEQ ID NO:107所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:118所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQ ID NO:129所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；c)在SEQ ID NO:108所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ IDNO:119所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQ ID NO:130所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；d)在SEQ ID NO:109所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:120所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQ ID NO:131所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；e)在SEQ ID NO:110所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:121所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQ IDNO:132所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；f)在SEQ ID NO:111所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:122所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQ ID NO:133所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；g)在SEQ ID NO:112所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ IDNO:123所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQ ID NO:134所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；h)在SEQ ID NO:113所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:124所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQ ID NO:135所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；i)在SEQID NO:114所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:125所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQ ID NO:136所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；j)在SEQ ID NO:115所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:126所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQ ID NO:137所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；k)在SEQ ID NO:116所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ IDNO:127所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQ ID NO:138所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；l)在SEQ ID NO:166所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:169所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQ ID NO:172所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；m)在SEQ ID NO:167所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:170所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQ IDNO:173所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；或n)在SEQ ID NO:168所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:171所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQ ID NO:174所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；以及这样的重链可变域，其包含：o)在SEQ ID NO:40所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:51所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:62所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；p)在SEQ ID NO:41所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:52所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ ID NO:63所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；q)在SEQ ID NO:42所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:53所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ ID NO:64所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；r)在SEQ ID NO:43所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:54所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ ID NO:65所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；s)在SEQ ID NO:44所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:55所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ ID NO:66所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；t)在SEQ ID NO:45所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:56所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:67所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；u)在SEQ ID NO:46所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:57所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ ID NO:68所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；v)在SEQ ID NO:47所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:58所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ ID NO:69所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；w)在SEQ IDNO:48所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:59所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ ID NO:70所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；x)在SEQ ID NO:49所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:60所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ IDNO:71所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；y)在SEQ ID NO:50所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:61所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ ID NO:72所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；z)在SEQ ID NO:148所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:151所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ ID NO:154所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；aa)在SEQID NO:149所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:152所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ ID NO:155所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；或bb)在SEQ ID NO:150所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:153所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ ID NO:156所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3。
第三方面的优选的ST2抗原结合蛋白包括：包含a)的轻链可变域和o)的重链可变域的ST2抗原结合蛋白；包含b)的轻链可变域和p)的重链可变域的ST2抗原结合蛋白；包含c)的轻链可变域和q)的重链可变域的ST2抗原结合蛋白；包含d)的轻链可变域和r)的重链可变域的ST2抗原结合蛋白；包含e)的轻链可变域和s)的重链可变域的ST2抗原结合蛋白；包含f)的轻链可变域和t)的重链可变域的ST2抗原结合蛋白；包含g)的轻链可变域和u)的重链可变域的ST2抗原结合蛋白；包含h)的轻链可变域和v)的重链可变域的ST2抗原结合蛋白；包含i)的轻链可变域和w)的重链可变域的ST2抗原结合蛋白；包含j)的轻链可变域和x)的重链可变域的ST2抗原结合蛋白；包含k)的轻链可变域和y)的重链可变域的ST2抗原结合蛋白；包含l)的轻链可变域和z)的重链可变域的ST2抗原结合蛋白；包含m)的轻链可变域和aa)的重链可变域的ST2抗原结合蛋白；以及包含n)的轻链可变域和bb)的重链可变域的ST2抗原结合蛋白。
在本发明的第四方面，第一、第二或第三方面的ST2抗原结合蛋白以小于或等于1×10-10M的亲和力结合人ST2。
在本发明的第五方面，第一、第二、第三或第四方面的ST2抗原结合蛋白抑制人ST2与人IL-33的结合。
在本发明的第六方面，第一、第二、第三、第四或第五方面的ST2抗原结合蛋白减少表达人ST2的细胞中人IL-33介导的ST2信号转导。
在本发明的第七方面，第六方面的ST2抗原结合蛋白减少表达食蟹猴(cynomolgous monkey)ST2的细胞中IL-33介导的食蟹猴ST2信号转导。
在本发明的第八方面，第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七方面的ST2抗原结合蛋白是抗体，例如人抗体。优选抗体包括：包含具有SEQ ID:84所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链的抗体；包含具有SEQ ID:85所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的重链的抗体；包含具有SEQ ID:86所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的重链的抗体；包含具有SEQ ID:87所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的重链的抗体；包含具有SEQ ID:88所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的重链的抗体；包含具有SEQ ID:89所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的重链的抗体；包含具有SEQ ID:90所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的重链的抗体；包含具有SEQ ID:91所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的重链的抗体；包含具有SEQ ID:92所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的重链的抗体；包含具有SEQ ID:93所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的重链的抗体；包含具有SEQ ID:94所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的重链的抗体；包含具有SEQ ID:160所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列的重链的抗体；包含具有SEQ ID:161所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ IDNO:143所示的氨基酸序列的重链的抗体；和包含具有SEQ ID:162所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:144所示的氨基酸序列的重链的抗体。
在第九方面，本发明提供了分离的核酸，其编码ST2抗原结合蛋白的一种或多种多肽组分，例如抗体轻链或抗体重链。在优选的实施方案中，核酸编码这样的多肽，其包含：
a)与SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ IDNO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ IDNO:163、SEQ ID NO:164或SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的轻链可变域；
b)与SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:145、SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的重链可变域；
c)在SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ IDNO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ IDNO:163、SEQ ID NO:164或SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列中具有不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域；
d)在SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:145、SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列中具有不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域；
e)轻链可变域，其包含：
i)在SEQ ID NO:106所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:117所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:128所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
ii)在SEQ ID NO:107所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:118所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:129所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
iii)在SEQ ID NO:108所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:119所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:130所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
iv)在SEQ ID NO:109所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:120所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:131所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
v)在SEQ ID NO:110所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:121所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:132所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
vi)在SEQ ID NO:111所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:122所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:133所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
vii)在SEQ ID NO:112所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:123所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:134所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
viii)在SEQ ID NO:113所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:124所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:135所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
ix)在SEQ ID NO:114所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:125所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:136所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
x)在SEQ ID NO:115所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:126所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:137所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
xi)在SEQ ID NO:116所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:127所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:138所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
xii)在SEQ ID NO:166所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:169所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:172所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
xiii)在SEQ ID NO:167所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:170所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:173所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；或
xiv)在SEQ ID NO:168所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:171所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:174所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；或
f)重链可变域，其包含：
i)在SEQ ID NO:40所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:51所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:62所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
ii)在SEQ ID NO:41所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:52所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:63所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
iii)在SEQ ID NO:42所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:53所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:64所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
iv)在SEQ ID NO:43所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:54所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:65所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
v)在SEQ ID NO:44所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:55所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:66所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
vi)在SEQ ID NO:45所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:56所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:67所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
vii)在SEQ ID NO:46所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:57所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:68所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
viii)在SEQ ID NO:47所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:58所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:69所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
ix)在SEQ ID NO:48所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:59所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:70所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
x)在SEQ ID NO:49所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:60所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:71所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
xi)在SEQ ID NO:50所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:61所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:72所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
xii)在SEQ ID NO:148所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:151所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ ID NO:154所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
xiii)在SEQ ID NO:149所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:152所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ ID NO:155所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；或
xiv)在SEQ ID NO:150所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:153所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ ID NO:156所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3。
在第九方面的某些实施方案中，多肽编码抗体轻链并与SEQ IDNO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:157、SEQ IDNO:158或SEQ ID NO:159所示的核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性。在第九方面的其它实施方案中，多肽编码抗体重链并与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:139、SEQ ID NO:140或SEQ ID NO:141所示的核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性。
在第十方面，本发明提供了一种表达载体，其包含第八方面的一种或多种分离的核酸。在某些实施方案中，表达载体编码抗体轻链、抗体重链或抗体轻链与重链两者。
在第十一方面，本发明提供了一种包含可操作地连接于启动子的一种或多种第九方面的分离的核酸的重组宿主细胞，包括包含本发明的第十方面的一种或多种表达载体的重组宿主细胞。在优选的实施方案中，重组宿主细胞分泌结合ST2的抗体。优选的宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，包括CHO细胞系。
在第十二方面，本发明提供了治疗自体免疫或炎性病症的方法，所述方法包括向有需要的患者给予治疗有效量的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八方面中任一者的ST2抗原结合蛋白。在优选的实施方案，ST2抗原结合蛋白是包含如SEQ ID NO:95所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:29所示的重链可变域氨基酸序列的抗体(例如Ab1)、包含如SEQ ID NO:96所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:30所示的重链可变域氨基酸序列的抗体(例如Ab2)、包含如SEQ ID NO:97所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:31所示的重链可变域氨基酸序列的抗体(例如Ab3)、包含如SEQ ID NO:98所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ IDNO:32所示的重链可变域氨基酸序列的抗体(例如Ab4)、包含如SEQID NO:99所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:33所示的重链可变域氨基酸序列的抗体(例如Ab5)、包含如SEQ ID NO:100所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:34所示的重链可变域氨基酸序列的抗体(例如Ab6)、包含如SEQ ID NO:101所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:35所示的重链可变域氨基酸序列的抗体(例如Ab7)、包含如SEQ ID NO:102所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:36所示的重链可变域氨基酸序列的抗体(例如Ab8)、包含如SEQ ID NO:103所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQID NO:37所示的重链可变域氨基酸序列的抗体(例如Ab9)、包含如SEQ ID NO:104所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:38所示的重链可变域氨基酸序列的抗体(例如Ab10)、包含如SEQ IDNO:105所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:39所示的重链可变域氨基酸序列的抗体(例如Ab11)；包含如SEQ ID NO:163所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:145所示的重链可变域氨基酸序列的抗体(例如Ab30)；包含如SEQ ID NO:164所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:146所示的重链可变域氨基酸序列的抗体(例如Ab32)；或包含如SEQ ID NO:165所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:147所示的重链可变域氨基酸序列的抗体(例如Ab33)。在优选的实施方案中，ST2抗原结合蛋白抑制IL-33与ST2的结合。在尤其优选的实施方案中，自体免疫或炎性病症是哮喘、炎性肠病、类风湿性关节炎、牛皮癣、异位性皮炎、纤维化、慢性阻塞性肺病、全身性红斑狼疮、硬化症、韦格纳氏肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)、贝赛特氏病(Behchet disease)、鼻窦炎、鼻息肉、嗜酸粒细胞性支气管炎和心血管疾病。
在第十三方面，本发明提供了制备第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八方面中任一者的ST2抗原结合蛋白的方法，所述方法是通过培养第十一方面的重组宿主细胞并从所述培养物分离ST2抗原结合蛋白来进行。
在第十四方面，本发明提供了第一、第二、第三、第四、第五、第六、第六、第七或第八方面中任一者的ST2抗原结合蛋白，其与选自以下抗体的抗体交叉竞争：
a)含有包含SEQ ID:84所示的氨基酸序列的轻链和包含SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列的重链的抗体；
b)含有包含SEQ ID:85所示的氨基酸序列的轻链和包含SEQ IDNO:19所示的氨基酸序列的重链的抗体；
c)含有包含SEQ ID:86所示的氨基酸序列的轻链和包含SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列的重链的抗体；
d)含有包含SEQ ID:87所示的氨基酸序列的轻链和包含SEQ IDNO:21所示的氨基酸序列的重链的抗体；
e)含有包含SEQ ID:88所示的氨基酸序列的轻链和包含SEQ IDNO:22所示的氨基酸序列的重链的抗体；
f)含有包含SEQ ID:89所示的氨基酸序列的轻链和包含SEQ IDNO:23所示的氨基酸序列的重链的抗体；
g)含有包含SEQ ID:90所示的氨基酸序列的轻链和包含SEQ IDNO:24所示的氨基酸序列的重链的抗体；
h)含有包含SEQ ID:91所示的氨基酸序列的轻链和包含SEQ IDNO:25所示的氨基酸序列的重链的抗体；
i)含有包含SEQ ID:92所示的氨基酸序列的轻链和包含SEQ IDNO:26所示的氨基酸序列的重链的抗体；
j)含有包含SEQ ID:93所示的氨基酸序列的轻链和包含SEQ IDNO:27所示的氨基酸序列的重链的抗体；
k)含有包含SEQ ID:94所示的氨基酸序列的轻链和包含SEQ IDNO:28所示的氨基酸序列的重链的抗体；
l)含有包含SEQ ID:160所示的氨基酸序列的轻链和包含SEQID NO:142所示的氨基酸序列的重链的抗体；
m)含有包含SEQ ID:161所示的氨基酸序列的轻链和包含SEQID NO:143所示的氨基酸序列的重链的抗体；以及
n)含有包含SEQ ID:162所示的氨基酸序列的轻链和包含SEQID NO:144所示的氨基酸序列的重链的抗体。
在第十五方面，本发明提供了一种分离的ST2抗原结合蛋白，优选地是抗体或其抗原结合片段，其结合包含人ST2结构域1和结构域2的多肽(SEQ ID NO:175)，其中当单个突变被引入多肽的人ST2结构域1或结构域2中时结合被显著地抑制，其中所述单个突变选自：L14R、I15R、S33R、E43R、V47R、A62R、G65R、T79R、D92R、D97R、V104R、G138R、N152R和V176R。“显著地抑制”意指测量到的结合差异是统计上显著的。在优选的实施方案中，对于所述组的两个或两个以上成员，包括所述组的所有成员，结合被显著地抑制。在第十五方面的某些实施方案中，当单个突变被引入多肽的人ST2结构域1或结构域2中时结合也被显著地活化，其中单个突变选自：L53R、R72A和S73R。“显著地活化”意指测量到的结合差异是统计上显著的。在优选的实施方案中，对于所述组的所有成员，结合被显著地活化。在第十五方面的某些实施方案中，ST2结合蛋白与含有包含SEQ ID:85所示的氨基酸序列的轻链和包含SEQ IDNO:19所示的氨基酸序列的重链的抗体交叉竞争结合人ST2。在尤其优选的实施方案中，抗原结合蛋白是第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八方面的抗原结合蛋白。
在第十六方面，本发明提供了第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第十四或第十五方面的抗原结合蛋白，其中如通过氢/氘交换分析所确定，所述ST2结合蛋白，优选地是抗体或其抗原结合片段，结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸33-44和/或88-94的ST2部分。
在第十七方面，本发明提供了第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第十四、第十五或第十六方面的抗原结合蛋白，优选地是抗体或其抗原结合片段，其结合ST2而产生界面，其中由所述结合产生的所述界面包含选自以下残基的ST2残基：K1、F2、P19、R20、Q21、G22、K23、Y26、I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79和Y81。在第十七方面的优选的实施方案中，由所述结合产生的界面包含：ST2残基P19、R20、Q21、G22、K23和/或Y26，ST2残基I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79和/或Y81，或ST2残基P19、R20、Q21、G22、K23、Y26、I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79和Y81。界面可以通过结合与未结合的ST2之间的溶剂暴露差异来确定，且界面残基被定义为差异超过10％的氨基酸和与所述抗体形成水介导的氢键的氨基酸，或被确定为在抗体的内具有至少一个原子的氨基酸。
在第十八方面，本发明提供了一种分离的ST2抗原结合蛋白，优选地是抗体或其抗原结合片段，其包含：a)与SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列具有至少90％或至少95％同一性的轻链可变域；b)与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列具有至少90％或至少95％同一性的重链可变域；c)a)的轻链可变域和b)的重链可变域；d)在SEQ IDNO:96所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域；e)在SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域；f)d)的轻链可变域和e)的重链可变域；g)包含在SEQ IDNO:107所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1、在SEQ ID NO:118所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2和在SEQ ID NO:129所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3的轻链可变域；h)包含在SEQ ID NO:41所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1、在SEQ ID NO:52所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2和在SEQ ID NO:63所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3的重链可变域；或i)g)的轻链可变域和h)的重链可变域。
在第十八方面的优选的实施方案中，轻链可变区包含D28或其保守性取代、I29或其保守性取代、S30或其保守性取代、N31或其保守性取代、Y32或其保守性取代、Y49或其保守性取代、D50或其保守性取代、N53或其保守性取代、E55或其保守性取代、T56或其保守性取代、D91或其保守性取代、D92或其保守性取代、N93或其保守性取代、F94或其保守性取代或L96或其保守性取代。在其它优选的实施方案中，轻链可变区包含D28或其保守性取代、N31或其保守性取代、D50或其保守性取代、N53或其保守性取代、E55或其保守性取代、D91或其保守性取代和D92或其保守性取代。在其它优选的实施方案中，轻链可变区包含D28、N31、D50、N53、E55、D91和D92。
第十八方面还包括ST2结合蛋白，优选地是抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区包含W33或其保守性取代、I50或其保守性取代、D57或其保守性取代、R59或其保守性取代、H99或其保守性取代、G100或其保守性取代、T101或其保守性取代、S102或其保守性取代、S103或其保守性取代、D104或其保守性取代、Y105或其保守性取代或Y106或其保守性取代；其中重链可变区包含S102或其保守性取代、S103或其保守性取代、D104或其保守性取代和Y105或其保守性取代；且其中重链可变区包含S102、S103、D104和Y105。
在第十八方面的某些实施方案中，ST2抗原结合蛋白以小于或等于1×10-10M的亲和力特异性地结合人ST2，抑制人ST2与人IL-33的结合，减少表达人ST2的细胞中人IL-33介导的ST2信号转导，抑制食蟹猴ST2与食蟹猴IL-33的结合，减少表达食蟹猴ST2的细胞中IL-33介导的食蟹猴ST2信号转导，和/或是抗体如人抗体。
附图简述
图1：在支气管肺泡灌洗液(BALF)Balb/c和C57Bl/6小鼠中，ST2 mAb处理显著地抑制IL-33诱导的IL-5。
图2：ST2 mAb处理在蟑螂过敏原(CRA)诱发的哮喘模型中是有效的。经过ST2抗体处理的小鼠与经过同型对照Ig处理的小鼠相比，具有显著较少的BALF嗜酸性粒细胞。
图3：ST2 mAb抑制来自各种供体的CD4+T细胞中人IL-33诱导的IL-5产生。(—)线描绘人IL-33与人IL-2组合的阳性对照值，没有抑制。(++++)描绘人IL-2的阳性对照值。(--)线描绘培养基对照值。
图4：人IL-33在人NK细胞分析中的剂量反应。
图5：在人NK细胞分析中，相比市售的ST2抗体，由Ab2引起的IL-33活性的降低。克隆HB12、FB9和2A5从MBL InternationalCorporation获得。克隆B4E6从MD Biosciences获得。克隆97203从R & D Systems获得。
图6：如通过HDX确定，被Ab2结合的ST2的区域的位置(参见实例12)。对应于ST2的细胞外结构域的氨基酸15-26的区域用红色突出显示，且对应于ST2细胞外结构域的氨基酸70-76的区域用洋红色突出显示。
图7：ST2/Ab2 sc-dsFv复合物的整体结构。两个Ab2 sc-dsFv分子用动画图示展示，并针对轻链(LC)/重链(HC)对分别用青色/蓝色或淡黄色/金色涂色。两个ST2分子用洋红色和绿色动画展示。
图8：结合界面。ST2用黄色略图展示。Ab2的重链和轻链用灰色和小麦色略图展示。重链和轻链的CDR环按以下次序涂色：CDR1：红色(HC)或淡红色(LC)；CDR2：绿色(HC)或淡绿色(LC)；以及CDR3：蓝色(HC)或淡蓝色(LC)。
图9：ST2和Ab2 sc-dsFv的静电表面电势图。图9A)：ST2和Ab2 sc-dsFv的电荷和表面互补性。用圆圈突出显示结合界面。图9B)：左：Ab2(灰色/小麦色略图)结合于ST2(表面)上的带正电块(patch)；右：ST2(黄色略图)结合于Ab2 sc-dsFv(表面)上的酸性块。对于静电势图，红色表面表示负电荷，且蓝色表面表示正电荷。
图10：当结合抗原时，Ab2可变域内与ST2形成界面的残基。CDR区用框表示。界面内的残基用粗体展示。与ST2内的氨基酸形成氢键或盐桥的残基用斜体表示。
发明详述
本文中使用的章节标题仅仅是出于组织的目的，且不应看作是限制所描述的主题。本说明书内引用的所有参考文献都是明确地以引用的方式整体并入本文中。
标准技术可以用于重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养和转化、蛋白质纯化等等。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书或如本领域中通常实现或如本文中描述来进行。以下程序和技术可以大体上根据本领域中众所周知的常规方法并如说明书通篇引用和论述的各种一般和更具体参考文献中所描述进行。参见例如Sambrook等人,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manuel,第3版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,cold Spring Harbor,N.Y.，其以引用的方式并入本文中以达成任何目的。除非提供具体的定义，否则本文中描述的结合分析化学、有机化学和医学与药物化学使用的命名法和实验程序与技术都是本领域中众所周知和常用的。标准技术可以用于化学合成、化学分析、药物的制备、配制和递送，以及患者的治疗。
ST2
本文中描述的抗原结合蛋白结合ST2。ST2被表达成可溶的非信号转导变异体(可溶性ST2或sST2)和全长的跨膜形式(FL ST2、ST2或ST2L)。一种例示性人ST2L氨基酸序列提供于本文表1中。所述蛋白质由若干结构域组成：氨基酸1-18对应于前导序列，其可以在哺乳动物细胞中蛋白质加工期间裂解；氨基酸19-331对应于细胞外结构域；氨基酸332-350对应于跨膜结构域；且氨基酸351-556对应于细胞内结构域。在优选的实施方案中，抗原结合蛋白结合ST2L的细胞外结构域并防止ST2与IL-33相互作用。一种例示性人IL-33氨基酸序列提供于表1中。
IL-33通过包含ST2L和AcP的异二聚体受体进行信号转导。一种例示性人AcP氨基酸序列提供于表1中。此蛋白质也由若干结构域组成：氨基酸1-20对应于前导序列，其可以在哺乳动物细胞中蛋白质加工期间裂解；氨基酸21-367对应于细胞外结构域；氨基酸368-388对应于跨膜结构域；且氨基酸389-570对应于细胞内结构域。在例示性实施方案中，ST2抗原结合蛋白结合ST2L并在表达ST2L和AcP的细胞中防止IL-33介导的信号转导。
表1
本发明的例示性实施方案以高亲和力结合人与食蟹猴ST2，包括以高亲和力结合并阻断食蟹猴IL-33与食蟹猴ST2相互作用的实施方案。这些特征允许在非人灵长类动物中进行信息型毒理学研究。
食蟹猴ST2L的一种例示性氨基酸序列提供于表2中。所述蛋白质由若干结构域组成：氨基酸1-18对应于前导序列，其可以在哺乳动物细胞中蛋白质加工期间裂解；氨基酸19-331对应于细胞外结构域；氨基酸332-350对应于跨膜结构域；且氨基酸351-556对应于细胞内结构域。
食蟹猴AcP的一种例示性氨基酸序列提供于表2中。所述蛋白质由若干结构域组成：氨基酸1-20对应于前导序列，其可以在哺乳动物细胞中蛋白质加工期间裂解；氨基酸21-367对应于细胞外结构域；氨基酸368-388对应于跨膜结构域；且氨基酸389-570对应于细胞内结构域。
食蟹猴IL-33的一种例示性氨基酸序列提供于表2中。
表2
ST2抗原结合蛋白
本发明提供了特异性地结合ST2的抗原结合蛋白。抗原结合蛋白的实施方案包含特异性地结合ST2的肽和/或多肽。此类肽或多肽可以任选地包括一种或多种翻译后修饰。抗原结合蛋白的实施方案包括如本文中不同地定义的特异性地结合ST2的抗体和其片段。这些抗体包括特异性地结合人ST2的抗体，包括抑制IL-33结合和/或活化ST2的抗体。
本发明的抗原结合蛋白特异性地结合ST2。如本文所用，“特异性地结合”意指抗原结合蛋白比其它蛋白质优先结合ST2。在一些实施方案中，“特异性地结合”意指ST2抗原结合蛋白对ST2的亲和力高于其它蛋白质。特异性地结合ST2的ST2抗原结合蛋白对人ST2的结合亲和力可以小于或等于1×10-7M、小于或等于2×10-7M、小于或等于3×10-7M、小于或等于4×10-7M、小于或等于5×10-7M、小于或等于6×10-7M、小于或等于7×10-7M、小于或等于8×10-7M、小于或等于9×10-7M、小于或等于1×10-8M、小于或等于2×10-8M、小于或等于3×10-8M、小于或等于4×10-8M、小于或等于5×10-8M、小于或等于6×10-8M、小于或等于7×10-8M、小于或等于8×10-8M、小于或等于9×10-8M、小于或等于1×10-9M、小于或等于2×10-9M、小于或等于3×10-9M、小于或等于4×10-9M、小于或等于5×10-9M、小于或等于6×10-9M、小于或等于7×10-9M、小于或等于8×10-9M、小于或等于9×10-9M、小于或等于1×10-10M、小于或等于2×10-10M、小于或等于3×10-10M、小于或等于4×10-10M、小于或等于5×10-10M、小于或等于6×10-10M、小于或等于7×10-10M、小于或等于8×10-10M、小于或等于9×10-10M、小于或等于1×10-11M、小于或等于2×10-11M、小于或等于3×10-11M、小于或等于4×10-11M、小于或等于5×10-11M、小于或等于6×10-11M、小于或等于7×10-11M、小于或等于8×10-11M、小于或等于9×10-11M、小于或等于1×10-12M、小于或等于2×10-12M、小于或等于3×10-12M、小于或等于4×10-12M、小于或等于5×10-12M、小于或等于6×10-12M、小于或等于7×10-12M、小于或等于8×10-12M或小于或等于9×10-12M。
测量抗原结合蛋白的结合亲和力的方法是本领域众所周知的。常用于亲和力测定的方法包括：表面等离子体子共振(SPR)(Morton和Myszka“Kinetic analysis of macromolecular interactions usingsurface plasmon resonance biosensors”Methods in Enzymology(1998)295,268-294)、生物膜层干涉技术(Abdiche等人“DeterminingKinetics and Affinities of Protein Interactions Using a Parallel Real-timeLabel-free Biosensor,the Octet”Analytical Biochemistry(2008)377,209-217)、动力学排阻分析(KinExA)(Darling和Brault“Kineticexclusion assay technology:characterization of molecular interactions”Assay and Drug Dev Tech(2004)2,647-657)、等温量热术(Pierce等人“Isothermal Titration Calorimetry of Protein-Protein Interactions”Methods(1999)19,213-221)和分析超离心(Lebowitz等人“Modernanalytical ultracentrifugation in protein science:A tutorial review”Protein Science(2002),11:2067-2079)。实施例3提供了例示性方法。
应了解，当本文中提到ST2结合抗体的各种实施方案时，其还涵盖其ST2结合片段。ST2结合片段包含本文中描述的保留特异性地结合ST2的能力的任何抗体片段或结构域。ST2结合片段可以呈本文中描述的任何骨架。
在某些治疗实施方案中，ST2抗原结合蛋白抑制ST2与IL-33的结合和/或抑制一种或多种与ST2结合IL-33相关联的生物活性，例如IL-33介导的信号转导。此类抗原结合蛋白被称为具有“中和性”。在某些实施方案中，中和性ST2抗原结合蛋白特异性地结合ST2并将ST2与IL-33的结合从任何地方抑制10％到100％，例如至少约20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大。举例来说，可以通过测定抗原结合蛋白阻断IL-33与ST2或IL-33与共受体ST2和AcP结合的能力，来测试ST2抗原结合蛋白的中和能力，参见例如实施例6的IL-33阻断分析。或者，在测量IL-33介导的生物功能的分析中，ST2抗原结合蛋白可以在测量ST2抗原结合蛋白的存在的作用的分析中测试中和能力。举例来说，IL-33诱导生物反应的能力，例如细胞内信号转导或介体的mRNA表达或介体的分泌增加，例如来自以下细胞的介体如细胞因子和趋化因子：例如嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、T细胞、肥大细胞、NK细胞、NKT细胞、嗜中性白细胞或先天性辅助细胞。或者，IL-33促进诸如嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、T细胞、肥大细胞、NK细胞、NKT细胞、嗜中性白细胞或先天性辅助细胞的细胞分化、增殖、存活、趋化性、形变或粘附特性的能力。或者，IL-33诱导诸如嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、T细胞、肥大细胞、NK细胞、NKT细胞、嗜中性白细胞或先天性辅助细胞的细胞上某些细胞活化标记物如CD11b的细胞表面表达的能力。例示性方法提供于实施例7-10中。
抗原结合蛋白的实施方案包含具有一个或多个互补决定区(CDR)的如本文中不同地定义的骨架结构。实施方案进一步包括包含具有一个或多个抗体可变域(重链或轻链)的骨架结构的抗原结合蛋白。实施方案包括包含以下各者的抗体：轻链可变域，其选自Ab1轻链可变域(LCv)、Ab2 LCv、Ab3 LCv、Ab4 LCv、Ab5 LCv、Ab6LCv、Ab7 LCv、Ab8 LCv、Ab9 LCv、Ab10LCv、Ab11 LCv、Ab30 LCv、Ab32 LCv和Ab33 LCv(分别SEQ ID NO:95-105、163-165)；和/或重链可变域，其选自Ab1重链可变域(HCv)、Ab2 HCv、Ab3 HCv、Ab4 HCv、Ab5 HCv、Ab6 HCv、Ab7 HCv、Ab8 HCv、Ab9 HCv、Ab10 HCv、Ab11HCv、Ab30HCv、Ab32HCv和Ab33HCv(分别SEQID NO:29-39、145-147)，以及其片段、衍生物、突变蛋白质和变异体。
包含Ab1 LCv的一种例示性轻链是包含SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab2 LCv的一种例示性轻链是包含SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab3 LCv的一种例示性轻链是包含SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab4 LCv的一种例示性轻链是包含SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab5 LCv的一种例示性轻链是包含SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab6 LCv的一种例示性轻链是包含SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab7 LCv的一种例示性轻链是包含SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab8 LCv的一种例示性轻链是包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab9 LCv的一种例示性轻链是包含SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab10 LCv的一种例示性轻链是包含SEQ ID NO:93所示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab11 LCv的一种例示性轻链是包含SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab30 LCv的一种例示性轻链是包含SEQ ID NO:160所示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab32 LCv的一种例示性轻链是包含SEQ ID NO:161所示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab33 LCv的一种例示性轻链是包含SEQ ID NO:162所示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab1 HCv的一种例示性重链是包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链。
包含Ab2 HCv的一种例示性重链是包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的重链。
包含Ab3 HCv的一种例示性重链是包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的重链。
包含Ab4 HCv的一种例示性重链是包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的重链。
包含Ab5 HCv的一种例示性重链是包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的重链。
包含Ab6 HCv的一种例示性重链是包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的重链。
包含Ab7 HCv的一种例示性重链是包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的重链。
包含Ab8 HCv的一种例示性重链是包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的重链。
包含Ab9 HCv的一种例示性重链是包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的重链。
包含Ab10 HCv的一种例示性重链是包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的重链。
包含Ab11 HCv的一种例示性重链是包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的重链。
包含Ab30 HCv的一种例示性重链是包含SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列的重链。
包含Ab32 HCv的一种例示性重链是包含SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列的重链。
包含Ab33 HCv的一种例示性重链是包含SEQ ID NO:144所示的氨基酸序列的重链。
预期的骨架的额外实例包括：纤连蛋白、新制癌菌素CBM4-2、脂质运载蛋白、T细胞受体、蛋白质A结构域(蛋白质Z)、Im9、TPR蛋白质、锌指结构域、pVIII、鸟胰多肽、GCN4、WW结构域Src同源性结构域3、PDZ结构域、TEM-1β-内酰胺酶、硫氧还原蛋白、葡萄球菌核酸酶、PHD-指结构域、CL-2、BPTI、APPI、HPSTI、大肠杆菌素、LACI-D1、LDTI、MTI-II、蝎毒素、昆虫防御素-A肽、EETI-II、Min-23、CBD、PBP、细胞色素b-562、Ldl受体结构域、γ-晶体蛋白、泛素、转铁蛋白和或C型类凝集素结构域。非抗体骨架和其作为治疗剂的用途评述于Gebauer和Skerra,Curr.Opin.Chem.Biol.,13:245-255(2009)和Binz等人,Nat.Biotech.,23(10):1257-1268(2005)，其以引用的方式整体并入本文中。
本发明的方面包括包含以下可变域的抗体：Ab1 LCv/Ab1 HCv(SEQ ID NO:95/SEQ ID NO:29)、Ab2 LCv/Ab2 HCv(SEQ IDNO:96/SEQ ID NO:30)、Ab3 LCv/Ab3 HCv(SEQ ID NO:97/SEQ IDNO:31)、Ab4 LCv/Ab4 HCv(SEQ ID NO:98/SEQ ID NO:32)、Ab5LCv/Ab5 HCv(SEQ ID NO:99/SEQ ID NO:33)、Ab6 LCv/Ab6 HCv(SEQ ID NO:100/SEQ ID NO:34)、Ab7 LCv/Ab7 HCv(SEQ IDNO:101/SEQ ID NO:35)、Ab8 LCv/Ab8 HCv(SEQ ID NO:102/SEQ IDNO:36)、Ab9 LCv/Ab9 HCv(SEQ ID NO:103/SEQ ID NO:37)、Ab10LCv/Ab10 HCv(SEQ ID NO:104/SEQ ID NO:38)、Ab11 LCv/Ab11HCv(SEQ ID NO:105/SEQ ID NO:39)、Ab30 LCv/Ab30 HCv(SEQ IDNO:163/SEQ ID NO:145)、Ab32 LCv/Ab32 HCv(SEQ ID NO:164/SEQID NO:146)、Ab33 LCv/Ab33 HCv(SEQ ID NO:165/SEQ ID NO:147)和其组合，以及其片段、衍生物、突变蛋白质和变异体。
本发明的例示性抗体包括Ab1(SEQ ID NO:84/SEQ ID NO:18)、Ab2(SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:19)、Ab3(SEQ ID NO:86/SEQ IDNO:20)、Ab4(SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:21)、Ab5(SEQ IDNO:88/SEQ ID NO:22)、Ab6(SEQ ID NO:89/SEQ ID NO:23)、Ab7(SEQ ID NO:90/SEQ ID NO:24)、Ab8(SEQ ID NO:91/SEQ IDNO:25)、Ab9(SEQ ID NO:92/SEQ ID NO:26)、Ab10(SEQ IDNO:93/SEQ ID NO:27)、Ab11(SEQ ID NO:94/SEQ ID NO:28)、Ab30(SEQ ID NO:160/SEQ ID NO:142)、Ab32(SEQ ID NO:161/SEQ IDNO:143)和Ab33(SEQ ID NO:162/SEQ ID NO:144)。
通常，抗体轻链或重链的每个可变域都包含3个CDR。重链可变域包含重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)和重链CDR3(HCDR3)。轻链可变域包含轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)和轻链CDR3(LCDR3)。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含在本文中描述的优选可变域内所含有的一个或多个CDR。
此类CDR的实施例包括(但不限于)：
Ab1 LCv的CDR：LCDR1(SEQ ID NO:106)、LCDR2(SEQ IDNO:117)和LCDR3(SEQ ID NO:128)；
Ab2 LCv的CDR：LCDR1(SEQ ID NO:107)、LCDR2(SEQ IDNO:118)和LCDR3(SEQ ID NO:129)；
Ab3 LCv的CDR：LCDR1(SEQ ID NO:108)、LCDR2(SEQ IDNO:119)和LCDR3(SEQ ID NO:130)；
Ab4 LCv的CDR：LCDR1(SEQ ID NO:109)、LCDR2(SEQ IDNO:120)和LCDR3(SEQ ID NO:131)；
Ab5 LCv的CDR：LCDR1(SEQ ID NO:110)、LCDR2(SEQ IDNO:121)和LCDR3(SEQ ID NO:132)；
Ab6 LCv的CDR：LCDR1(SEQ ID NO:111)、LCDR2(SEQ IDNO:122)和LCDR3(SEQ ID NO:133)；
Ab7 LCv的CDR：LCDR1(SEQ ID NO:112)、LCDR2(SEQ IDNO:123)和LCDR3(SEQ ID NO:134)；
Ab8 LCv的CDR：LCDR1(SEQ ID NO:113)、LCDR2(SEQ IDNO:124)和LCDR3(SEQ ID NO:135)；
Ab9 LCv的CDR：LCDR1(SEQ ID NO:114)、LCDR2(SEQ IDNO:125)和LCDR3(SEQ ID NO:136)；
Ab10 LCv的CDR：LCDR1(SEQ ID NO:115)、LCDR2(SEQ IDNO:126)和LCDR3(SEQ ID NO:137)；
Ab11 LCv的CDR：LCDR1(SEQ ID NO:116)、LCDR2(SEQ IDNO:127)和LCDR3(SEQ ID NO:138)；
Ab30 LCv的CDR：LCDR1(SEQ ID NO:166)、LCDR2(SEQ IDNO:169)和LCDR3(SEQ ID NO:172)；
Ab32 LCv的CDR：LCDR1(SEQ ID NO:167)、LCDR2(SEQ IDNO:170)和LCDR3(SEQ ID NO:173)；
Ab33 LCv的CDR：LCDR1(SEQ ID NO:168)、LCDR2(SEQ IDNO:171)和LCDR3(SEQ ID NO:174)；
Ab1 HCv的CDR：HCDR1(SEQ ID NO:40)、HCDR2(SEQ IDNO:51)和HCDR3(SEQ ID NO:62)；
Ab2 HCv的CDR：HCDR1(SEQ ID NO:41)、HCDR2(SEQ IDNO:52)和HCDR3(SEQ ID NO:63)；
Ab3 HCv的CDR：HCDR1(SEQ ID NO:42)、HCDR2(SEQ IDNO:53)和HCDR3(SEQ ID NO:64)；
Ab4 HCv的CDR：HCDR1(SEQ ID NO:43)、HCDR2(SEQ IDNO:54)和HCDR3(SEQ ID NO:65)；
Ab5 HCv的CDR：HCDR1(SEQ ID NO:44)、HCDR2(SEQ IDNO:55)和HCDR3(SEQ ID NO:66)；
Ab6 HCv的CDR：HCDR1(SEQ ID NO:45)、HCDR2(SEQ IDNO:56)和HCDR3(SEQ ID NO:67)；
Ab7 HCv的CDR：HCDR1(SEQ ID NO:46)、HCDR2(SEQ IDNO:57)和HCDR3(SEQ ID NO:68)；
Ab8 HCv的CDR：HCDR1(SEQ ID NO:47)、HCDR2(SEQ IDNO:58)和HCDR3(SEQ ID NO:69)；
Ab9 HCv的CDR：HCDR1(SEQ ID NO:48)、HCDR2(SEQ IDNO:59)和HCDR3(SEQ ID NO:70)；
Ab10 HCv的CDR：HCDR1(SEQ ID NO:49)、HCDR2(SEQ IDNO:60)和HCDR3(SEQ ID NO:71)；
Ab11 HCv的CDR：HCDR1(SEQ ID NO:50)、HCDR2(SEQ IDNO:61)和HCDR3(SEQ ID NO:72)；
Ab30 HCv的CDR：HCDR1(SEQ ID NO:148)、HCDR2(SEQ IDNO:151)和HCDR3(SEQ ID NO:154)；
Ab32 HCv的CDR：HCDR1(SEQ ID NO:149)、HCDR2(SEQ IDNO:152)和HCDR3(SEQ ID NO:155)；以及
Ab33 HCv的CDR：HCDR1(SEQ ID NO:150)、HCDR2(SEQ IDNO:153)和HCDR3(SEQ ID NO:156)。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含：A)这样的多肽，例如轻链，其包含具有选自SEQ ID NO:106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、166、167和168的氨基酸序列的LCDR1；具有选自SEQ ID NO:117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、169、170和171的氨基酸序列的LCDR2；和/或具有选自SEQ ID NO:128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、172、173和174的氨基酸序列的LCDR3；和/或B)这样的多肽，例如重链，其包含具有选自SEQ ID NO:40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、148、149和150的氨基酸序列的HCDR1；具有选自SEQ ID NO:51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、151、152和153的氨基酸序列的HCDR2；和/或具有选自SEQ IDNO:62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、154、155和156的氨基酸序列的HCDR3。
在其它实施方案中，抗原结合蛋白包含：A)轻链氨基酸序列，其包含Ab1 LCv、Ab2 LCv、Ab3 LCv、Ab4 LCv、Ab5 LCv、Ab6 LCv、Ab7 LCv、Ab8 LCv、Ab9 LCv、Ab10 LCv、Ab11 LCv、Ab30 LCv、Ab32 LCv和Ab33 LCv中任一者的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和B)重链氨基酸序列，其包含Ab1 HCv、Ab2 HCv、Ab3 HCv、Ab4 HCv、Ab5 HCv、Ab6 HCv、Ab7 HCv、Ab8 HCv、Ab9 HCv、Ab10 HCv、Ab11 HCv、Ab30 HCv、Ab32 HCv和Ab33 HCv中任一者的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在某些实施方案中，CDR包括在本文中阐述的例示性CDR中的不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个或不超过6个氨基酸添加、缺失或取代。
本发明的方面包括包含选自SEQ ID NO:95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、163、164和165的轻链可变域的抗体。本发明的方面包括包含选自SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、145、146和147的重链可变域的抗体。本发明的其它方面包括这样的抗体，其包含：A)选自SEQ ID NO:95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、163、164和165的轻链可变域；和B)选自SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、145、146和147的重链可变域。
本发明的抗体可以包含本领域中已知的任何恒定区。轻链恒定区可以是例如κ或λ型轻链恒定区，例如人κ或λ型轻链恒定区。重链恒定区可以是例如α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区，例如人α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区。在一个实施方案中，轻链或重链恒定区是天然存在的恒定区的片段、衍生物、变异体或突变蛋白质。
本发明的方面包括这样的抗体，其包含：选自SEQ ID NO:95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、163、164和165的轻链可变区，具有不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个或不超过10个氨基酸添加、缺失或取代。本发明的方面包括这样的抗体，其包含：选自SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、145、146和147的重链可变区，具有不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个或不超过10个氨基酸添加、缺失或取代。本发明的其它方面包括这样的抗体，其包含：A)选自SEQ ID NO:95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、163、164和165的轻链可变区，具有不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个或不超过10个氨基酸添加、缺失或取代；和B)选自SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、145、146和147的重链可变区，具有不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个或不超过10个氨基酸添加、缺失或取代。
在一个变体中，抗原结合蛋白包含与选自SEQ ID NO:95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、163、164和165的轻链可变区氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在另一变体中，抗原结合蛋白包含与选自SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、145、146和147的重链可变区氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在又一实施方案中，抗原结合蛋白包含：A)与选自SEQ ID NO:95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、163、164和165的轻链可变区氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列；和B)与选自SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、145、146和147的重链可变区氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含轻链和/或重链CDR3。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO:128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、172、173、174、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、154、155和156所示的序列组的氨基酸序列。在某些实施方案中，氨基酸序列包括在SEQID NO:128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、172、173、174、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、154、155和156所示的例示性序列中的不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个或不超过6个氨基酸添加、缺失或取代。因此，本发明的实施方案包括包含与选自SEQ ID NO:128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、172、173、174、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、154、155和156所示的序列组的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的抗原结合蛋白。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含轻链和/或重链CDR2。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO:117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、169、170、171、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、151、152和153所示的序列组的氨基酸序列。在某些实施方案中，氨基酸序列包括在SEQID NO:117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、169、170、171、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、151、152和153所示的例示性序列中的不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个或不超过6个氨基酸添加、缺失或取代。因此，本发明的实施方案包括包含与选自SEQ ID NO:117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、169、170、171、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、151、152和153所示的序列组的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的抗原结合蛋白。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含轻链和/或重链CDR1。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO:106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、166、167、168、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、148、149和150所示的序列组的氨基酸序列。在某些实施方案中，氨基酸序列包括在SEQID NO:106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、166、167、168、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、148、149和150所示的例示性序列中的不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个或不超过6个氨基酸添加、缺失或取代。因此，本发明的实施方案包括包含与选自SEQ ID NO:106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、166、167、168、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、148、149和150所示的序列组的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的抗原结合蛋白。
本发明的抗原结合蛋白包含传统抗体的骨架，包括人抗体和单克隆抗体、双特异性抗体、二聚体抗体、微型抗体、域抗体、合成抗体(有时本文中称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、抗体融合物(有时称为“抗体缀合物”)及各自的片段。包括各种CDR组合的上述CDR可以移植到任何以下骨架中。
如本文所用，术语“抗体”是指包含特异性地结合抗原的一个或多个多肽链的各种形式的单体或多聚体蛋白质，如本文中不同地描述。在某些实施方案中，抗体是通过重组DNA技术产生。在其它实施方案中，抗体是通过天然存在的抗体的酶促或化学裂解产生。在另一方面，抗体选自：a)人抗体；b)人源化抗体；c)嵌合抗体；d)单克隆抗体；e)多克隆抗体；f)重组抗体；g)抗原结合片段；h)单链抗体；i)二聚体抗体；j)三聚体抗体；k)四聚体抗体；l)Fab片段；m)F(ab’)2片段；n)IgA抗体；o)IgD抗体；p)IgE抗体；q)IgG1抗体；r)IgG2抗体；s)IgG3抗体；t)IgG4抗体；和u)IgM抗体。
可变区或可变域包含嵌入构架区(称为构架区FR1、FR2、FR3和FR4)内的至少3个重链或轻链CDR。Kabat等人,1991,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,Public Health Service N.I.H.,Bethesda,MD。传统的抗体结构单元通常包含四聚体。每个四聚体通常由两对相同的多肽链构成，每一对具有一条“轻链”和一条“重链”。每条链的氨基末端部分包括约100-110个或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。每条链的羧基末端部分界定恒定区，主要负责效应功能。人轻链分成κ或λ轻链。重链分成μ、δ、γ、α或ε，并将抗体同型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干子类，包括(但不限于)IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有子类，包括(但不限于)IgM1和IgM2。本发明的实施方案包括并入了如本文中描述的抗原结合蛋白的可变域或CDR的抗体的所有这些类别和子类。
一些天然存在的抗体，例如在骆驼和美洲驼中发现的抗体，是由两条重链组成的二聚体且不包括轻链。本发明涵盖可以结合ST2的两条重链或其片段的二聚抗体。
重链和轻链的可变区通常显示出相对保守构架区(FR)相同的通用结构，这些构架区由3个高变区，即互补决定区或CDR连接。CDR主要负责抗原识别和结合。来自每一对的两条链的CDR通过构架区对齐，使得能够结合特定的抗原决定基。从N端到C端，轻链和重链都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个结构域的氨基酸分配是根据Kabat的定义。
CDR构成抗原结合主要的表面接触点。轻链的CDR3和尤其重链的CDR3可能构成轻链和重链可变区内在抗原结合上最重要的决定子。在一些抗体中，重链CDR3显现出构成抗原与抗体之间的主要接触区域。仅CDR3变化的体外选择方案可以用于改变抗体的结合特性或确定哪些残基促进抗原的结合。
天然存在的抗体通常包括信号序列，信号序列将抗体指引到用于蛋白质分泌的细胞通路中并通常不存在于成熟抗体中。编码本发明的抗体的聚核苷酸可以编码天然存在的信号序列或如下所述的异源信号序列。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白是包含本文中描述的例示性CDR中1-6个的抗体。本发明的抗体可以是任何类型，包括IgM、IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgD、IgA或IgE抗体。在一个特定实施方案中，抗原结合蛋白是IgG类型抗体，例如IgG1抗体。
在一些实施方案中，例如当抗原结合蛋白是具有完整重链和轻链的抗体时，CDR都来自相同的物种，例如人。或者，例如在其中抗原结合蛋白含有来自上文概述的序列的少于6个CDR的实施方案中，额外的CDR可以来自其它物种或者可以是与例示性序列中描述的CDR不同的人CDR。举例来说，来自本文中鉴别的适当序列的HCDR3和LCDR3区可以与任选地选自替代物种或不同的人抗体序列或其组合的HCDR1、HCDR2、LCDR1和LCDR2一起使用。举例来说，本发明的CDR可以替换商业上相关的嵌合或人源化抗体的CDR区。
特定实施方案利用作为人组分的抗原结合蛋白的骨架组分。然而，在一些实施方案中，骨架组分可以是来自不同物种的混合物。因而，如果抗原结合蛋白是抗体，那么此类抗体可以是嵌合抗体和/或人源化抗体。一般说来，“嵌合抗体”与“人源化抗体”是指将来自超过一种物种的区域组合的抗体。举例来说，“嵌合抗体”传统上包含来自小鼠(或在一些情况下是大鼠)的可变区和来自人的恒定区。
“人源化抗体”一般是指可变域构架区已经被交换为在人抗体中发现的序列的非人抗体。一般地，在人源化抗体中，除了一个或多个CDR，整个抗体都由人来源的聚核苷酸编码，或除了在一个或多个CDR中，与此类抗体都相同。一些或所有由来源于非人生物体的核酸编码的CDR被移植到人抗体可变区的β-折叠构架中，以产生其特异性由所移植的CDR决定的抗体。此类抗体的产生描述于例如WO92/11018；Jones 1986,Nature 321:522-525；Verhoeyen等人,1988,Science 239:1534-1536中。人源化抗体还可以使用具有基因工程免疫系统的小鼠产生。Roque等人,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654。在本文中描述的例示性实施方案中，鉴别的CDR是人的，因此在此情况下人源化与嵌合抗体都包括一些非人CDR；举例来说，可以产生包含HCDR3和LCDR3区的人源化抗体，其中其它CDR区中的一个或多个是不同物种来源的。
在一个实施方案中，ST2抗原结合蛋白是多特异性抗体，并尤其是双特异性抗体，有时还称为“二聚体抗体”。这些双特异性抗体是结合两种或两种以上不同的抗原或单个抗原上的不同抗原决定基的抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体结合ST2和人效应细胞(例如T细胞)上的抗原。此类抗体适用于靶向针对表达ST2的细胞(例如表达ST2的肿瘤细胞)的效应细胞反应。在优选的实施方案中，人效应细胞抗原是CD3。美国专利No.7,235,641。制备双特异性抗体的方法是本领域中已知的。一种此类方法包括将重链的Fc部分工程化，例如以产生“杵状结构”和“臼状结构”，这些结构当在细胞中共同表达时促进重链的异二聚体形成。U.S.7,695,963。另一方法也包括将重链的Fc部分工程化，但使用静电牵引以便当在细胞中共同表达时促使重链的异二聚体形成，同时阻止同二聚体形成。WO09/089,004，其以引用的方式整体并入本文中。
在一个实施方案中，ST2抗原结合蛋白是微型抗体。微型抗体是最小化的抗体样蛋白，其包含与CH3结构域连接的scFv。Hu等人,1996,Cancer Res.56:3055-3061。
在一个实施方案中，ST2抗原结合蛋白是域抗体；参见例如美国专利No.6,248,516。域抗体(dAb)是抗体的功能性结合结构域，对应于人抗体的重链(VH)或轻链(VL)的可变区。dAB具有近13kDa的分子量，或小于全抗体尺寸的十分之一。dAB在包括细菌、酵母和哺乳动物细胞系统在内的各种宿主中良好地表达。另外，dAb是高度稳定的且甚至在经受诸如冻干或热变性的苛刻条件后也保留活性。参见例如美国专利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；美国序号2004/0110941；欧洲专利0368684；美国专利6,696,245、WO04/058821、WO04/003019和WO03/002609。
在一个实施方案中，ST2抗原结合蛋白是抗体片段，该片段是保留ST2结合特异性的本文中概述的任何抗体的片段。在各种实施方案中，抗体结合蛋白包括(但不限于)F(ab)、F(ab')、F(ab')2、Fv或单链Fv片段。至少，如本文中所意指，抗体包含可以特异性地结合ST2的多肽，该ST包含所有或一部分轻链或重链可变区，例如一个或多个CDR。
ST2结合抗体片段的其它实例包括(但不限于)：(i)Fab片段，其由VL、VH、CL和CH1结构域组成；(ii)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(iii)Fv片段，其由单个抗体的VL和VH结构域组成；(iv)dAb片段(Ward等人,1989,Nature 341:544-546)，其由单个可变区组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，其是包含两条连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域与VL结构域通过肽连接子连接，所述肽连接子允许两个结构域缔合而形成抗原结合位点(Bird等人,1988,Science 242:423-426；Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-5883)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)；和(ix)通过基因融合构建的“二聚体抗体”或“三聚体抗体”、多价或多特异性片段(Tomlinson等人,2000,Methods Enzymol.326:461-479；WO94/13804；Holliger等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448)。可以对抗体片段进行修饰。举例来说，可以通过并入连接VH与VL结构域的二硫桥来使分子稳定(Reiter等人,1996,Nature Biotech.14:1239-1245)。本发明的方面包括其中这些片段的非CDR组分是人序列的实施方案。
在一个实施方案中，ST2抗原结合蛋白是完全人抗体。在此实施方案中，如上文所概述，特定结构包含所描绘的包含CDR区的完整重链和轻链。额外的实施方案利用一个或多个本发明的CDR，以及来自其它人抗体的其它CDR、构架区、J和D区、恒定区等等。举例来说，本发明的CDR可以替换任何数目的人抗体、尤其是商业上相关的抗体的CDR。
单链抗体可以通过将重链和轻链可变域(Fv区)片段经由氨基酸桥(短肽连接子)连接，产生单个多肽链而形成。此类单链Fv(scFv)已经通过将编码肽连接子的DNA融合在编码两个可变域多肽(VL和VH)的DNA之间来制备。所得多肽可以自身折叠形成抗原结合单体，或其可以形成多聚体(例如二聚体、三聚体或四聚体)，取决于两个可变域之间的柔性连接子的长度(Kortt等人,1997,Prot.Eng.10:423；Kortt等人,2001,Biomol.Eng.18:95-108)。通过将不同的包含VL和VH的多肽组合，可以形成结合不同的抗原决定基的多聚体scFv(Kriangkum等人,2001,Biomol.Eng.18:31-40)。发展用于产生单链抗体的技术包括以下文献中描述的技术：美国专利No.4,946,778；Bird,1988,Science 242:423；Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879；Ward等人,1989,Nature 334:544；de Graaf等人,2002,Methods Mol Biol.178:379-87。本发明涵盖衍生自本文中所提供的抗体的单链抗体，包括(但不限于)，包含Ab1 LCv/Ab1 HCv(SEQ ID NO:95/SEQ ID NO:29)、Ab2 LCv/Ab2 HCv(SEQ IDNO:96/SEQ ID NO:30)、Ab3 LCv/Ab3 HCv(SEQ ID NO:97/SEQ IDNO:31)、Ab4 LCv/Ab4 HCv(SEQ ID NO:98/SEQ ID NO:32)、Ab5LCv/Ab5 HCv(SEQ ID NO:99/SEQ ID NO:33)、Ab6 LCv/Ab6 HCv(SEQ ID NO:100/SEQ ID NO:34)、Ab7 LCv/Ab7 HCv(SEQ IDNO:101/SEQ ID NO:35)、Ab8 LCv/Ab8 HCv(SEQ ID NO:102/SEQ IDNO:36)、Ab9 LCv/Ab9 HCv(SEQ ID NO:103/SEQ ID NO:37)、Ab10LCv/Ab10 HCv(SEQ ID NO:104/SEQ ID NO:38)和Ab11 LCv/Ab11HCv(SEQ ID NO:105/SEQ ID NO:39)、Ab30 LCv/Ab30 HCv(SEQ IDNO:163/SEQ ID NO:145)、Ab32 LCv/Ab32 HCv(SEQ ID NO:164/SEQID NO:146)、Ab33 LCv/Ab33 HCv(SEQ ID NO:165/SEQ ID NO:147)和其组合的可变域组合的scFv。
在一个实施方案中，ST2抗原结合蛋白是抗体融合蛋白(本文中有时称为“抗体缀合物”)。缀合物伴侣可以是蛋白质或非蛋白质；后者一般是使用抗原结合蛋白上和缀合物伴侣上的官能基产生。在某些实施方案中，抗体结合非蛋白质化学品(药物)以形成抗体药物缀合物。
在一个实施方案中，ST2抗原结合蛋白是抗体类似物，有时称为“合成抗体”。举例来说，各种研究成果利用替代性蛋白质骨架或者具有移植CDR的人工骨架。此类骨架包括(但不限于)引入用来稳定化结合蛋白的三维结构的突变以及例如由生物相容聚合物组成的整体合成骨架。参见例如Korndorfer等人,2003,Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,第53卷,第1期:121-129。Roque等人,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654。另外，可以使用肽抗体模拟物(“PAM”)，以及基于利用纤连蛋白组分作为骨架的抗体模拟物的研究成果。
如本文所用，“蛋白质”意指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。在一些实施方案中，两个或两个以上共价连接的氨基酸通过肽键连接。蛋白质可以由天然存在的氨基酸和肽键组成，例如当蛋白质使用如下文概述的表达系统和细胞重组制备时。或者，蛋白质可以包括对蛋白酶或其它生理和/或储存条件具有抗性的合成氨基酸(例如高苯丙氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和正亮氨酸)或肽模拟结构，即“肽或蛋白质类似物”，例如类肽(参见Simon等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:9367，以引用的方式并入本文中)。此类合成氨基酸可以尤其在抗原结合蛋白在体外通过本领域中众所周知的常规方法合成时并入。另外，可以使用肽模拟、合成和天然存在的残基/结构的任何组合。“氨基酸”还包括亚氨基酸残基，例如脯氨酸和羟脯氨酸。氨基酸“R基团”或“侧链”可以呈(L)或(S)-构型。在一个特定实施方案中，氨基酸呈(L)或(S)-构型。
在某些方面，本发明提供了结合ST2的重组抗原结合蛋白，且在一些实施方案中，提供了重组人ST2或其一部分。在此背景下，“重组蛋白质”是使用重组技术，使用本领域中已知的任何技术和方法，即通过表达如本文中描述的重组核酸来制备的蛋白质。用于产生重组蛋白质的方法和技术是本领域众所周知的。本发明的实施方案包括结合野生型ST2和其变异体的重组抗原结合蛋白。
“基本上由……组成”意指氨基酸序列可以相对于所叙述的SEQID NO:序列变化约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％并仍然保留生物活性，如本文中描述。
在一些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白是分离的蛋白质或基本上纯的蛋白质。“分离的”蛋白质缺乏至少一些处于自然状态时其通常缔合的物质，例如在既定样品中按总蛋白质重量计占到至少约5％或至少约50％的物质。应了解，视情况而定按总蛋白质内含物的重量计，分离的蛋白质可以占到5％-99.9％。举例来说，通过使用可诱导的启动子或高表达启动子，使得蛋白质以增加的浓度水平制备，可以制备显著较高浓度的蛋白质。所述定义包括在本领域中已知的多种生物体和/或宿主细胞中产生抗原结合蛋白。
对于氨基酸序列，序列同一性和/或相似性通过使用本领域中已知的标准技术，包括(但不限于)Smith和Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482的局部序列同一性算法、Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443的序列同一性比对算法、Pearson和Lipman,1988,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.85:2444的相似性搜索法、这些算法的计算机化实现方式(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wis.)、Devereux等人,1984,Nucl.Acid Res.12:387-395描述的Best Fit序列程序，优选地使用缺省设置或通过检查来确定。优选地，同一性百分比是通过FastDB，基于以下参数计算：错配罚分1；空位罚分1；空位大小罚分0.33；以及接合罚分30，"Current Methods in SequenceComparison and Analysis,"Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications,第127-149页(1988),Alan R.Liss,Inc.。
适用算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐进的成对比对从一组相关序列产生多重序列比对。其还可以绘出树枝状图，展示用于产生所述比对的聚类关系。PILEUP使用Feng和Doolittle,1987,J.Mol.Evol.35:351-360的渐进性比对方法的简化形式；所述方法类似于Higgins和Sharp,1989,CABIOS 5:151-153描述的方法。适用的PILEUP参数包括缺省空位权重3.00、缺省空位长度权重0.10以及加权末端空位。
适用算法的另一个实例是BLAST算法，描述于以下文献中：Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410；Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402；以及Karin等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873-5787。一个尤其适用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序，其获自Altschul等人,1996,Methods inEnzymology 266:460-480。WU-BLAST-2使用若干搜索参数，大部分搜索参数设定为缺省值。可调节参数设为以下值：重叠间隔＝1，重叠分数＝0.125，字阈值(T)＝II。HSP S和HSP S2参数是动态值，并通过程序本身建立，取决于具体序列的组成和正在其中搜索感兴趣的序列的具体数据库的组成；然而，所述值可以调节以增加灵敏度。
另一适用的算法是空位BLAST，如Altschul等人,1993,Nucl.Acids Res.25:3389-3402报导。空位BLAST使用BLOSUM-62替代得分；阈值T参数设定为9；两命中点方法，来触发无空位扩展，将空位长度k的值定为10+k；Xu设定为16，且对于数据库搜索阶段Xg设定为40，而对于算法的输出阶段设定为67。空位比对由对应于约22比特的得分触发。
一般地，单个变异CDR与本文中描述的序列之间的氨基酸同源性、相似性或同一性为至少80％，且更通常优选地是至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和几乎100％的渐增同源性或同一性。按类似方式，关于本文中鉴别的结合蛋白的核酸序列的“核酸序列同一性百分比(％)”定义为候选序列中与抗原结合蛋白的编码序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。一种特定方法利用设定为缺省参数的WU-BLAST-2的BLASTN模块，其中重叠间隔和重叠分数分别设定为1和0.125。
一般地，编码单个变异CDR的核苷酸序列与本文中描述的核苷酸序列之间的核苷酸序列同源性、相似性或同一性为至少80％，且更通常优选地是至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和几乎100％的渐增同源性或同一性。
因此，“变异CDR”是与本发明的亲本CDR具有指定同源性、相似性或同一性的CDR，且共享生物功能，包括(但不限于)亲本CDR的特异性和/或活性的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
虽然用于引入氨基酸序列变化的位点或区域是预定的，但突变本身不需要预定。举例来说，为了优化在既定位点突变的性能，可以在靶标密码子或区域进行随机的诱变，并针对期望的活性的最优组合筛选所表达的抗原结合蛋白CDR变异体。用于在具有已知序列的DNA中的预定位点进行取代突变的技术是众所周知的，例如M13引物诱变和PCR诱变。使用例如ST2结合等抗原结合蛋白活性的分析来筛选突变体。
氨基酸取代通常是单个残基；插入通常是约一个(1)到约二十个(20)氨基酸残基，尽管可以容许明显大得多的插入物。缺失在约一个(1)到约二十个(20)氨基酸残基范围内，尽管在一些情况下，缺失可以大得多。
取代、缺失、插入或其任何组合可以用于获得最终的衍生物或变异体。一般地，这些改变在几个氨基酸上进行以使分子的改变最小，尤其是抗原结合蛋白的免疫原性和特异性。然而，在某些情况下可以容许较大的改变。保守性取代一般根据以下描绘成表3的图表进行。
表3
通过选择不如表3中所示取代保守的取代，使功能或免疫同一性发生实质的变化。举例来说，可以进行更显著地影响以下方面的取代：改变的区域内的多肽主链结构，例如α-螺旋或β-折叠结构；分子在靶标位点的电荷或疏水性；或侧链的体积。一般预期会引起多肽特性最大变化的取代是如下取代，其中(a)诸如丝氨酰基或苏氨酰基的亲水性残基取代诸如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基的疏水性残基(或被其取代)；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其它残基(或被其取代)；(c)诸如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基的具有正电性侧链的残基取代诸如谷氨酰基或天冬氨酰基的负电性残基(或被其取代)；或(d)诸如苯丙氨酸的具有大体积侧链的残基取代诸如甘氨酸的不具有侧链的残基(或被其取代)。
变异体通常显示出与天然存在的类似物相同的定性生物活性并将引起与其相同的免疫反应，尽管还会根据需要选择改变抗原结合蛋白的特征的变异体。或者，变异体可以被设计成使抗原结合蛋白的生物活性发生改变。举例来说，糖基化位点可以如本文中所论述来改变或去除。
在本发明的范围内ST2抗体的其它衍生物包括ST2抗体或其片段与其它蛋白质或多肽的共价或聚集缀合物，这些缀合物例如通过表达包含与ST2抗体多肽的N-末端或C-末端融合的异源多肽的重组融合蛋白来产生。举例来说，缀合的肽可以是异源信号(或前导序列)多肽，诸如酵母α-因子前导序列，或诸如抗原决定基标签的肽。含有ST2抗体的融合蛋白可以包含为了促进ST2抗体的纯化或鉴别而添加的肽(例如聚-His)。ST2抗体多肽还可以连接于FLAG肽，如Hopp等人,Bio/Technology 6:1204,1988和美国专利5,011,912中所描述。FLAG肽具有高度抗原性，并且提供了被特定的单克隆抗体(mAb)可逆地结合的抗原决定基，使得能够快速地分析所表达的重组蛋白并使其易于纯化。可用于制备其中FLAG肽与既定多肽融合的融合蛋白的试剂可商购(Sigma,St.Louis,MO)。
在一个实施方案中，使用衍生自免疫球蛋白的多肽制备寡聚物。例如Ashkenazi等人,1991,PNAS USA 88:10535；Byrn等人,1990,Nature 344:677；以及Hollenbaugh等人,1992"Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins",Current Protocols in Immunology,增刊4,第10.19.1-10.19.11页已经描述了包含与抗体衍生的多肽的各个部分(包括Fc结构域)融合的某些异源多肽的融合蛋白的制备。
本发明的一个实施方案是针对一种包含两种融合蛋白的二聚体，所述融合蛋白通过将ST2抗体的ST2结合片段与一种抗体的Fc区融合来产生。所述二聚体可以通过例如以下来产生：将编码融合蛋白的基因融合物插入适当的表达载体中，在经重组表达载体转化的宿主细胞中表达所述基因融合物，且允许所表达的融合蛋白组装许多相似的抗体分子，因此在Fc部分之间形成链间二硫键而产生二聚体。
如本文所用，术语“Fc多肽”包括衍生自抗体的Fc区的多肽的天然和突变蛋白形式。还包括含有促进二聚化的铰链区的此类多肽的截短形式。包含Fc部分(和由此而形成的寡聚物)的融合蛋白提供了通过亲和色谱法在蛋白质A或蛋白质G柱上易于纯化的优点。
PCT申请WO 93/10151(以引用的方式并入本文中)中描述的一种适合的Fc多肽是从人IgG抗体的N末端铰链区延伸到Fc区的天然C末端的单链多肽。另一适用的Fc多肽是美国专利5,457,035中和Baum等人,1994,EMBO J.13:3992-4001中描述的Fc突变蛋白质。除了氨基酸19已经从Leu变成Ala，氨基酸20已经从Leu变成Glu，并且氨基酸22已经从Gly变成Ala，此突变蛋白质的氨基酸序列与WO 93/10151中呈现的天然Fc序列都相同。所述突变蛋白质显示出降低的对Fc受体的亲和力。
在其它实施方案中，ST2抗体的重链和/或轻链的可变部分可以取代一种抗体的重链和/或轻链的可变部分。
另一种用于制备寡聚ST2抗体衍生物的方法包括使用亮氨酸拉链。亮氨酸拉链域是促进发现存在其的蛋白质的寡聚的肽。亮氨酸拉链最初是在若干DNA结合蛋白中鉴别的(Landschulz等人,1988,Science 240:1759)，并且此后，在各种不同的蛋白质中发现。已知的亮氨酸拉链是二聚化或三聚化的天然存在的肽和其衍生物。适于产生可溶性寡聚蛋白质的亮氨酸拉链域的实例描述于PCT申请WO94/10308中，且衍生自肺表面活性蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链描述于Hoppe等人,1994,FEBS Letters 344:191中，其以引用的方式并入本文中。Fanslow等人,1994,Semin.Immunol.6:267-78中描述了经修饰的亮氨酸拉链的使用，从而允许与其融合的异源蛋白的稳定三聚化。在一种方法中，包含与亮氨酸拉链肽融合的ST2抗体片段或衍生物的重组融合蛋白在适合的宿主细胞中表达，并从培养物上清液回收所形成的可溶性寡聚ST2抗体片段或衍生物。
抗原结合蛋白的共价修饰包括在本发明的范围内，且一般地但并不是总是在翻译后进行。举例来说，通过使抗原结合蛋白的特定氨基酸残基与能够与选择的侧链或N或C末端残基反应的有机衍生化剂反应，将抗原结合蛋白几种类型的共价修饰引入分子中。
半胱氨酰基残基最通常是与诸如氯乙酸或氯乙酰胺的α-卤乙酸酯(和相应胺)反应，得到羧甲基或羧酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰基残基还通过与溴代三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑酰基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基顺丁烯二酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑反应来衍生化。
组氨酰基残基是通过与焦碳酸二乙酯在pH5.5-7.0下反应而衍生化，因为此试剂对组氨酰基侧链具有相对特异性。对溴苯甲酰甲基溴也是适用的；反应优选地在0.1M二甲胂酸钠中在pH6.0下进行。
赖氨酰基和氨基末端残基与琥珀酸或其它羧酸酐反应。用这些试剂衍生化具有逆转赖氨酰基残基的电荷的作用。其它适用于衍生化含有α-氨基的残基的试剂包括亚胺酸酯，例如吡啶甲酰亚胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯代硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2,4-戊二酮；和转氨酶催化的与乙醛酸酯的反应。
精氨酰基残基是通过与一种或若干种常规试剂尤其是苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮和茚三酮反应来修饰。精氨酸残基的衍生化需要所述反应在碱性条件下进行，因为胍官能团具有高pKa。此外，这些试剂可以与赖氨酸基团以及精氨酸ε-氨基反应。
可以对酪氨酰基残基进行特定修饰，其中特别有兴趣通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记引入酪氨酰基残基中。最通常地，N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别用以形成O-乙酰基酪氨酰基物质和3-硝基衍生物。酪氨酰基残基使用125I或131I碘化以制备标记的蛋白质用于放射免疫分析，上述的氯胺T方法是适合的。
羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳化二亚胺(R'-N＝C＝N--R'，其中R和R'是任选地不同的烷基)，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4,4-二甲基戊基)碳化二亚胺反应而选择性地修饰。此外，天冬氨酰基和谷氨酰基残基通过与铵离子反应而转变成天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基。
用双官能试剂衍生化可用于将抗原结合蛋白与不溶于水的支持基质或表面交联以用于各种方法中。常用的交联剂包括：例如1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷；戊二醛；N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如与4-叠氮基水杨酸的酯；高双官能团亚胺酸酯，包括双琥珀酰亚胺酯，例如3,3'-二硫基双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)；和双官能顺丁烯二酰亚胺，例如双-N-顺丁烯二酰亚胺基-1,8-辛烷。诸如甲基-3-[(对叠氮基苯基)二硫基]丙酰亚胺酸酯的衍生化试剂产生能够在光存在下形成交联的可光活化的中间物。或者，诸如溴化氰活化的碳水化合物的反应性不溶于水的基质和描述于美国专利No.3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537和4,330,440中的反应性底物用于蛋白质固定。
谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基经常脱去酰胺基，分别形成相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。或者，这些残基在适度酸性条件下脱去酰胺基。这些残基的任一种形式都在本发明的范围内。
其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman和Co.,San Francisco,1983,第79-86页)；N端胺的乙酰化和任何C端羧基的酰胺化。
包括在本发明的范围内的抗原结合蛋白的另一类型共价修饰包含改变蛋白质的糖基化模式。如本领域中已知，糖基化模式可能取决于蛋白质序列(例如存在或不存在以下论述的具体糖基化氨基酸残基)或产生蛋白质的宿主细胞或生物体。以下论述具体的表达系统。
多肽的糖基化通常是N-连接或者O-连接的。N-连接是指碳水化物部分连接于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是碳水化物部分酶促连接于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中任一这些三肽序列的存在都会产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一者连接于羟基氨基酸，最通常是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列，使得其含有上述三肽序列中的一者或多者，可便利地实现将糖基化位点添加到抗原结合蛋白中(对于N-连接的糖基化位点)。也可以通过一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基向起始序列添加或取代进行改变(对于O-连接的糖基化位点)。简单起见，抗原结合蛋白的氨基酸序列优选地通过在DNA水平上的改变，尤其是通过在预选的碱基使编码靶标多肽的DNA突变而产生将翻译成期望的氨基酸的密码子来改变。
增加抗原结合蛋白上碳水化合物部分的数目的另一方式是，通过以化学或酶促方式将糖苷偶合于蛋白质。这些程序的优点在于它们不需要在宿主细胞中产生具有用于N-和O-连接的糖基化的糖基化能力的蛋白质。根据使用的偶合方式，糖可以被连接到(a)精氨酸和组氨酸、(b)游离羧基、(c)游离硫氢基(例如半胱氨酸的硫氢基)、(d)游离羟基(例如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的游离羟基)、(e)芳香族残基(例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香族残基)或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于1987年9月11日公布的WO87/05330中以及Aplin和Wriston,1981,CRC Crit.Rev.Biochem.,第259-306页中。
起始抗原结合蛋白上存在的碳水化合物部分的去除可以通过化学或酶促方式实现。化学脱糖基化需要将蛋白质暴露于化合物三氟甲烷磺酸或同等化合物。此处理导致除了连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外的大部分或所有糖裂解，而留下多肽是完整的。化学脱糖基化描述于Hakimuddin等人,1987,Arch.Biochem.Biophys.259:52和Edge等人,1981,Anal.Biochem.118:131。多肽上碳水化合物部分的酶促裂解可以通过利用各种内切型和外切型糖苷酶实现，如Thotakura等人,1987,Meth.Enzymol.138:350所描述。潜在的糖基化位点上的糖基化可以通过利用化合物衣霉素(tunicamycin)来预防，如Duskin等人,1982,J.Biol.Chem.257:3105所描述。衣霉素阻断了蛋白质-N-糖苷键的形成。
抗原结合蛋白的另一类型共价修饰包括以美国专利No.4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中阐述的方式将抗原结合蛋白连接于各种非蛋白质聚合物，包括(但不限于)各种多元醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。另外，如本领域中已知，为了促进诸如PEG的聚合物的添加，可以在抗原结合蛋白内的各个位置进行氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白的共价修饰包含添加一个或多个标记。
术语“标记基团”意指任何可检测的标记。适合的标记基团的实例包括(但不限于)以下：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如FITC、若丹明、镧系元素磷光体)、酶基团(例如辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基或由第二报导序列(例如亮氨酸拉链配对序列、二次抗体的结合位点、金属结合结构域、抗原决定基标签)识别的预定多肽抗原决定基。在一些实施方案中，为了减少潜在的位阻，标记基团通过各种长度的间隔臂与抗原结合蛋白偶合。用于标记蛋白质的各种方法是本领域中已知的并可以用于进行本发明。
一般说来，标记分成各种类别，取决于将要检测其的分析：a)同位素标记，其可以是放射性的或重同位素；b)磁性标记(例如磁性粒子)；c)氧化还原活性部分；d)光学染料；酶基团(例如辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；e)生物素标记基团；和f)由第二报导序列(例如亮氨酸拉链配对序列、二次抗体的结合位点、金属结合结构域、抗原决定基标签等)识别的预定多肽抗原决定基。在一些实施方案中，为了减少潜在的位阻，标记基团通过各种长度的间隔臂与抗原结合蛋白偶合。用于标记蛋白质的各种方法是本领域中已知的并可以用于进行本发明。
特定标记包括光学染料，包括(但不限于)发色团、磷光体和荧光团，其中后者在很多情况下都是特定的。荧光团可以是“小分子”荧光团或者蛋白质荧光团。
“荧光标记”意指可以通过其固有的荧光特性检测到的任何分子。适合的荧光标记包括(但不限于)荧光素、若丹明(rhodamine)、四甲基若丹明、曙红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿(Malacite green)、芪、荧光黄(Lucifer Yellow)、级联蓝J(CascadeBlueJ)、得克萨斯红(Texas Red)、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC红640、Cy 5、Cy 5.5、LC红705、俄勒冈绿(Oregon green)、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、级联蓝、级联黄和R-藻红蛋白(PE)(Molecular Probes,Eugene,OR)、FITC、若丹明和得克萨斯红(Pierce,Rockford,IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science,Pittsburgh,PA)。包括荧光团在内的适合的光学染料描述于Richard P.Haugland的Molecular Probes Handbook中，此参考文献以引用的方式明确地并入本文中。
适合的蛋白质荧光标记还包括(但不限于)绿色荧光蛋白，包括海肾(Renilla)、海笔(Ptilosarcus)或水母(Aequorea)物种的GFP(Chalfie等人,1994,Science 263:802-805)、EGFP(ClontechLaboratories,Inc.,Genbank寄存编号U55762)、蓝色荧光蛋白(BFP,Quantum Biotechnologies,Inc.1801 de Maisonneuve Blvd.West,8thFloor,Montreal,Quebec,Canada H3H 1J9；Stauber,1998,Biotechniques24:462-471；Heim等人,1996,Curr.Biol.6:178-182)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP,Clontech Laboratories,Inc.)、荧光素酶(Ichiki等人,1993,J.Immunol.150:5408-5417)、β-半乳糖苷酶(Nolan等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2603-2607)和海肾(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美国专利No.5292658、5418155、5683888、5741668、5777079、5804387、5874304、5876995、5925558)。所有以上引用的参考文献都以引用的方式明确地并入本文中。
本文中描述的例示性抗原结合蛋白具有基于抗原结合蛋白所结合的ST2上不同抗原决定基的特性。术语“抗原决定基”意指当诸如抗体的抗原结合蛋白结合靶标分子时，抗原结合蛋白接触的靶标分子的氨基酸。抗原决定基可以是邻近或不邻近的，例如(i)在单链多肽中，在多肽序列中彼此不邻近但在靶标分子的背景内的氨基酸残基由抗原结合蛋白结合，或(ii)在包含诸如ST2和AcP的两种或两种以上单个组分的多聚体受体中，氨基酸残基存在于单个组分中的一者或多者上，但仍然由抗原结合蛋白结合。抗原决定基的决定子可以包括诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的分子的化学活性表面分组，并可以具有特定的三维结构特性和/或荷质比特征。一般地，对具体的靶标分子具有特异性的抗原结合蛋白将优先识别蛋白质及/或高分子的复杂混合物中靶标分子上的抗原决定基。
表征抗原结合蛋白结合的抗原决定基的方法是本领域众所周知的，包括(但不限于)分箱(binning)(交叉竞争)(Miller等人“Epitopebinning of murine monoclonal antibodies by a multiplexed pairing assay”J Immunol Methods(2011)365,118-25)、肽定位(例如PEPSPOTTM)(Albert等人“The B-cell Epitope of the Monoclonal Anti-Factor VIII  Antibody ESH8 Characterized by Peptide Array Analysis”2008 ThrombHaemost 99,634-7)、诸如嵌合体的诱变方法(Song等人“EpitopeMapping of Ibalizumab,a Humanized Anti-CD4 Monoclonal Antibodywith Anti-HIV-1 Activity in Infected Patients”J.Virol.(2010)84,6935-6942)、丙氨酸扫描(Cunningham和Wells“High-resolutionepitope mapping of HGH-receptor interactions by alanine-scanningmutagenesis”Science(1989)244,1081-1085)、精氨酸扫描(Lim等人“A diversity of antibody epitopes can induce signaling through theerythropoietin receptor”Biochemistry(2010)49,3797-3804)、HD交换方法(Coates等人“Epitope mapping by amide hydrogen/deuteriumexchange coupled with immobilization of antibody,on-line proteolysis,liquid chromatography and mass spectrometry”Rapid Commun.MassSpectrom.(2009)23 639-647)、NMR交叉饱和方法(Morgan等人“Precise epitope mapping of malaria parasite inhibitory antibodies byTROSY NMR cross-saturation”Biochemistry(2005)44,518-23)和结晶学(Gerhardt等人“Structure of IL-17A in complex with a potent,fullyhuman neutralizing antibody”J.Mol.Biol(2009)394,905-21)。所述方法在它们提供的关于包含抗原决定基的氨基酸的细节程度方面不同。
本发明的抗原结合蛋白包括与本文中描述的例如Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab30、Ab32或Ab33等例示性抗原结合蛋白具有重叠的抗原决定基的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，抗原结合蛋白具有与例示性抗原结合蛋白相同的抗原决定基。在其它实施方案中，抗原结合蛋白仅仅结合与例示性抗原结合蛋白相同的氨基酸的子集。
在某些实施方案中，ST2抗原结合蛋白具有与Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab30、Ab32或Ab33相同或重叠的抗原决定基，并包含：a)与SEQ ID NO:95、SEQID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ IDNO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ IDNO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164或SEQ IDNO:165所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域；b)与SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域；或c)a)的轻链可变域和b)的重链可变域。
在某些实施方案中，ST2抗原结合蛋白具有与Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab30、Ab32或Ab33相同或重叠的抗原决定基，并包含与SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域；包含与SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ IDNO:97所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQID NO:34所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQID NO:102所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ ID NO:105所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ ID NO:163所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:145所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；包含与SEQ ID NO:164所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ ID NO:146所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白；以及包含与SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变域和与SEQ IDNO:147所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变域的抗原结合蛋白。
在某些实施方案中，ST2抗原结合蛋白具有与Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab30、Ab32或Ab33相同或重叠的抗原决定基，并包含：a)在SEQ ID NO:95、SEQID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ IDNO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ IDNO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164或SEQ IDNO:165所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域；b)在SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域；或c)a)的轻链可变域和b)的重链可变域。
在某些实施方案中，ST2抗原结合蛋白具有与Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab30、Ab32或Ab33相同或重叠的抗原决定基，并包含：在SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域；包含在SEQID NO:96所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ ID NO:97所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQID NO:36所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ IDNO:103所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ ID NO:105所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ ID NO:163所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:145所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白；包含在SEQ ID NO:164所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ IDNO:146所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域；以及包含在SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域和在SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列中具有不超过10个或不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域的抗原结合蛋白。
在某些实施方案中，ST2抗原结合蛋白具有与Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab30、Ab32或Ab33相同或重叠的抗原决定基，并包含：轻链可变域，其包含a)在SEQ ID NO:106所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:117所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2和在SEQ ID NO:128所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；b)在SEQ ID NO:107所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:118所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2和在SEQ ID NO:129所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；c)在SEQ ID NO:108所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ IDNO:119所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2和在SEQ ID NO:130所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；d)在SEQ ID NO:109所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:120所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2和在SEQ ID NO:131所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；e)在SEQ IDNO:110所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:121所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2和在SEQ ID NO:132所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；f)在SEQ ID NO:111所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:122所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2和在SEQ IDNO:133所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；g)在SEQ ID NO:112所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:123所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2和在SEQ ID NO:134所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；h)在SEQ ID NO:113所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ IDNO:124所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2和在SEQ ID NO:135所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；i)在SEQ ID NO:114所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:125所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2和在SEQ ID NO:136所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；j)在SEQ ID NO:115所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:126所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2和在SEQ ID NO:137所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；k)在SEQ ID NO:116所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:127所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2和在SEQ ID NO:138所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；l)在SEQ ID NO:166所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:169所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2和在SEQ ID NO:172所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；m)在SEQ ID NO:167所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ IDNO:170所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2和在SEQ ID NO:173所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；或n)在SEQ ID NO:168所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:171所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2和在SEQ ID NO:174所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；以及重链可变域，其包含o)在SEQ ID NO:40所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:51所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2和在SEQ ID NO:62所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；p)在SEQ ID NO:41所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQID NO:52所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2和在SEQ ID NO:63所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；q)在SEQ ID NO:42所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:53所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2和在SEQ ID NO:64所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；r)在SEQ ID NO:43所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:54所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2和在SEQ ID NO:65所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；s)在SEQ ID NO:44所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:55所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2和在SEQ ID NO:66所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；t)在SEQ ID NO:45所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ IDNO:56所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2和在SEQ ID NO:67所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；u)在SEQ ID NO:46所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:57所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2和在SEQ ID NO:68所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；v)在SEQ ID NO:47所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:58所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2和在SEQ ID NO:69所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；w)在SEQ ID NO:48所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:59所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2和在SEQ ID NO:70所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；x)在SEQ ID NO:49所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:60所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2和在SEQ ID NO:71所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；y)在SEQ ID NO:50所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ IDNO:61所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2和在SEQ ID NO:72所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；z)在SEQ ID NO:148所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:151所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2和在SEQ ID NO:154所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；aa)在SEQ IDNO:149所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:152所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2和在SEQ ID NO:155所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；或bb)在SEQ ID NO:150所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:153所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2和在SEQ ID NO:156所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3。
上文刚描述的优选的ST2抗原结合蛋白包括：包含a)的轻链可变域和o)的重链可变域的抗原结合蛋白；包含b)的轻链可变域和p)的重链可变域的抗原结合蛋白；包含c)的轻链可变域和q)的重链可变域的抗原结合蛋白；包含d)的轻链可变域和r)的重链可变域的抗原结合蛋白；包含e)的轻链可变域和s)的重链可变域的抗原结合蛋白；包含f)的轻链可变域和t)的重链可变域的抗原结合蛋白；包含g)的轻链可变域和u)的重链可变域的抗原结合蛋白；包含h)的轻链可变域和v)的重链可变域的抗原结合蛋白；包含i)的轻链可变域和w)的重链可变域的抗原结合蛋白；包含j)的轻链可变域和x)的重链可变域的抗原结合蛋白；包含k)的轻链可变域和y)的重链可变域的抗原结合蛋白；包含l)的轻链可变域和z)的重链可变域的抗原结合蛋白；包含m)的轻链可变域和aa)的重链可变域；和包含n)的轻链可变域和bb)的重链可变域的抗原结合蛋白。
具有相同抗原决定基或重叠抗原决定基的抗原结合蛋白经常交叉竞争结合抗原。因此，在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白与Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab30、Ab32或Ab33交叉竞争。“交叉竞争(cross-compete)”或“交叉竞争(cross-competition)”意指抗原结合蛋白竞争靶标上相同的抗原决定基或结合位点。此类竞争可以通过如下分析来确定，在所述分析中参考抗原结合蛋白(例如抗体或其抗原结合部分)阻止或抑制测试抗原结合蛋白的特异性结合，反之亦然。许多类型的竞争性结合分析可以用于确定是否测试分子与参考分子竞争结合。可以采用的分析的实例包括固相直接或间接放射免疫分析(RIA)、固相直接或间接酶免疫分析(EIA)、夹心式竞争分析(参见例如Stahli等人(1983)Methods in Enzymology 9:242-253)、固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Kirkland等人,(1986)J.Immunol.137:3614-3619)、固相直接标记分析、固相直接标记夹心式分析、Luminex(Jia等人“Anovel method of Multiplexed Competitive Antibody Binning for thecharacterization of monoclonal antibodies”J.Immunological Methods(2004)288,91-98)和表面等离子体子共振((Song等人“EpitopeMapping of Ibalizumab,a Humanized Anti-CD4 Monoclonal Antibodywith Anti-HIV-1 Activity in Infected Patients”J.Virol.(2010)84,6935-6942)。确定交叉竞争的一种例示性方法描述于实施例5中。通常，当竞争性抗原结合蛋白过量存在时，其将抑制参考抗原结合蛋白与共同抗原的结合至少50％、55％、60％、65％、70％或75％。在一些情况下，结合被抑制至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。
Ab2以高亲和力结合人和食蟹猴ST2，并阻断IL-33结合ST2，从而阻断IL-33介导的ST2信号转导。抗原决定基与Ab2相同、类似或重叠的的抗体可以共享这些独特的特征。在优选的实施方案中，ST2抗原结合蛋白与Ab2交叉竞争结合ST2。与Ab2交叉竞争的例示性ST2抗原结合蛋白包括Ab1、Ab3、Ab5、Ab7、Ab8和Ab30(参见实施例5)。如果企图寻找结合与Ab2重叠、类似或相同的抗原决定基的抗体，那么可以筛选一种或多种与Ab2交叉竞争的抗体。此外，当制备与Ab2交叉反应的抗体的变异体时，可以筛选此类抗体以确定在变异后交叉竞争是否得以维持，表明了变异体的抗原决定基未从母体分子显著地改变。因此，在某些实施方案中，本发明提供了与Ab2交叉竞争结合ST2的抗体变异体。
除了互相交叉竞争外，可以类似地通过ST2的诱变来影响具有重叠、类似或相同的抗原决定基的抗体。某些突变可以抑制抗体的结合；其它突变可以增强或活化结合。在实施例11中，在ST2的一部分细胞外结构域上进行扫描精氨酸/丙氨酸诱变，并测定对例示性抗体的作用。本发明的范围内包括具有使其以与例示性抗体类似的方式受影响而进行诱变的特征的ST2结合蛋白。
在某些实施方案中，ST2抗原结合蛋白的结合被ST2中的单个突变抑制，其中所述单个突变选自下组：L14R、I15R、S33R、E43R、V47R、A62R、G65R、T79R、D92R、D97R、V104R、G138R、N152R和V176R。在优选的实施方案中，所述组的单个突变中的任两个或两个以上、3个或3个以上、4个或4个以上、5个或5个以上、6个或6个以上、7个或7个以上、8个或8个以上、9个或9个以上、10个或10个以上或者所有均独立地抑制ST2结合蛋白的结合。在其它实施方案中，ST2抗原结合蛋白的结合被ST2中的单个突变活化，其中单个突变选自下组：L53R、R72A和S73R。在优选的实施方案中，所述组的所有单个突变独立地活化ST2结合蛋白的结合。在优选的实施方案中，ST2抗原结合蛋白共享Ab2的属性，并被L14R、I15R、S33R、E43R、V47R、A62R、G65R、T79R、D92R、D97R、V104R、G138R、N152R和V176R中任一者抑制且被L53R、R72A、S73R中的任一者活化。
基于其抗原决定基表征抗体的另一种方法是酰胺氢/氘交换(HDX)。HDX已经广泛地用于研究蛋白质构象和动力学、蛋白质-配体相互作用和蛋白质-蛋白质相互作用(Zhang和Smith 1993、Engen和Smith 2001)。质谱检测提供了一种有效地测定交换程度的方法，因为单个氢被氘替换会导致每次交换会有1Da的质量增加。HDX的程度可以容易地在肽水平于控制条件下通过利用液相色谱法结合串联质谱分析来分析蛋白质的水解消化进行测量。(Engen和Smith 2001,Baerga-Ortiz,Hughes等人2002,Codreanu,Ladner等人2002,Hamuro,Coales等人2006,Coales,Tuske等人2009,Zhang,Zhang等人2012)。
在缺乏和存在抗体(游离对比结合状态)下ST2的蛋白质水解消化之间抗原HDX谱图(profile)的比较可以揭示相互作用位点。确切地说，当抗体结合ST2时，游离ST2中溶剂可及酰胺氢可以被保护，结果观测到交换速率较慢。因此，在抗体存在下获得的氘比在其缺乏下获得的氘要少的区域是潜在的结合抗原决定基。当确定抗原决定基时，考虑到其它因素，包括游离状态下的交换速率、对抗原蛋白结构的认识以及来自其它抗原决定基定位工作的结果。
如实施例12中所描述，通过HDX分析Ab2与ST2的结合。分析证明Ab2结合ST2结构的包含SEQ ID NO:1的氨基酸19-322的氨基酸33-44和88-94(分别是成熟ST2的氨基酸15-26和70-76)的部分/改变其交换速率。具有与Ab2重叠的抗原决定基、类似或相同的抗原决定基的抗体也将结合SEQ ID NO:1的33-44和88-94内的氨基酸/改变其交换速率。在某些实施方案中，当结合ST2并通过HDX分析时，诸如抗体的ST2结合蛋白保护SEQ ID NO:1的氨基酸33-44中的任一者。在其它实施方案中，保护氨基酸88-94中的任一者。两者都表明结合抗原决定基与Ab2部分重叠。在优选的实施方案中，保护33-44中的任一者和88-94中的任一者。在某些实施方案中，当结合ST2并通过HDX分析时，诸如抗体的ST2结合蛋白保护SEQ IDNO:1的所有氨基酸33-44。在其它实施方案中，保护所有氨基酸88-94。两者都表明结合抗原决定基与Ab2类似。在优选的实施方案中，所有33-44与所有88-94都保护，表明了抗原决定基与Ab2相同或几乎相同。
进一步使用X射线结晶学分析Ab2与ST2的结合。X射线结晶学与HDX分析一致。Ab与抗原之间的界面可以通过许多方式确定/界定。在实施例13中，使用溶剂暴露差异并通过距离确定界面。如通过溶剂暴露差异或小于的距离所确定的，在与Ab2的界面内的ST2残基是：(对应于成熟ST2(缺乏前导序列)中的位置)K1、F2、P19、R20、Q21、G22、K23、Y26、I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79和Y81。在某些实施方案中，ST2结合蛋白与ST2形成与Ab2重叠的界面，包括其中K1、F2、P19、R20、Q21、G22、K23、Y26、I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79或Y81中的任一者在界面内的界面。在一些实施方案中，ST2结合蛋白与ST2形成界面，其中P19、R20、Q21、G22、K23和/或Y26在界面内。在其它实施方案中，I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79和/或Y81在界面内。在优选的实施方案中，K1、F2、P19、R20、Q21、G22、K23、Y26、I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79和Y81在界面内。
晶体结构表明某些氨基酸残基与Ab2的氨基酸形成氢键或盐桥。那些残基包括K1、R20、K23、Y26、T75、N77、R78和T79。在某些实施方案中，ST2抗原结合蛋白与K1、R20、K23、Y26、T75、N77、R78和T79中的一者或多者形成氢键或盐桥。
晶体结构进一步提供了关于哪些Ab2的残基与ST2形成界面的信息。图10标示了与ST2形成界面的轻链可变区和重链可变区中的残基。还标示了与ST2中的氨基酸形成氢键或盐桥的残基。可以使用此信息来设计Ab2的变异体，包括含有与Ab2的轻链或重链可变域具有90％同一性、95％同一性并在Ab2的轻链或重链可变域内具有10个或低于10个插入、缺失和/或取代的可变域的变异体。可能会希望维持氨基酸在界面内，同时改变非界面残基。因此，可以设计并制备在Ab2的一个或多个CDR内具有一个或多个氨基酸添加、取代和/或缺失并维持结合ST2的Ab2的变异体。
在一些实施方案中，ST2结合蛋白包含：Ab2轻链可变区(SEQID NO:96)的变异体，其中D28、I29、S30、N31、Y32、Y49、D50、N53、E55、T56、D91、D92、N93、F94和/或L96保持未改变或包含其保守性取代；和/或Ab2重链可变区(SEQ ID NO:30)的变异体，其中W33、I50、D57、R59、H99、G100、T101、S102、S103、D104、Y105和/或Y106保持未改变或包含保守性突变。在优选的实施方案中，轻链可变区的D28、N31、D50、N53、E55、D91和D92保持未改变，且重链的S102、S103、D104和Y105保持未改变。
编码ST2抗原结合蛋白的聚核苷酸
本发明涵盖编码如本文所定义的包括抗体在内的ST2抗原结合蛋白的核酸。优选的核酸包括编码本文所述的例示性轻链和重链的核酸。
编码Ab1 LC的一种例示性核酸是包含SEQ ID NO:73所示的序列的核酸。
编码Ab2 LC的一种例示性核酸是包含SEQ ID NO:74所示的序列的核酸。
编码Ab3 LC的一种例示性核酸是包含SEQ ID NO:75所示的序列的核酸。
编码Ab4 LC的一种例示性核酸是包含SEQ ID NO:76所示的序列的核酸。
编码Ab5 LC的一种例示性核酸是包含SEQ ID NO:77所示的序列的核酸。
编码Ab6 LC的一种例示性核酸是包含SEQ ID NO:78所示的序列的核酸。
编码Ab7 LC的一种例示性核酸是包含SEQ ID NO:79所示的序列的核酸。
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编码Ab11 LC的一种例示性核酸是包含SEQ ID NO:83所示的序列的核酸。
编码Ab30 LC的一种例示性核酸是包含SEQ ID NO:157所示的序列的核酸。
编码Ab32 LC的一种例示性核酸是包含SEQ ID NO:158所示的序列的核酸。
编码Ab33 LC的一种例示性核酸是包含SEQ ID NO:159所示的序列的核酸。
编码Ab1 HC的一种例示性核酸是包含SEQ ID NO:7所示的序列的核酸。
编码Ab2 HC的一种例示性核酸是包含SEQ ID NO:8所示的序列的核酸。
编码Ab3 HC的一种例示性核酸是包含SEQ ID NO:9所示的序列的核酸。
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编码Ab30 HC的一种例示性核酸是包含SEQ ID NO:139所示的序列的核酸。
编码Ab32 HC的一种例示性核酸是包含SEQ ID NO:140所示的序列的核酸。
编码Ab33 HC的一种例示性核酸是包含SEQ ID NO:141所示的序列的核酸。
本发明的方面包括编码本文所述的氨基酸序列的聚核苷酸变异体(例如归因于简并性)。
本发明的方面包括多个实施方案，包括(但不限于)以下例示性实施方案。
一种分离的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸编码一种或多种包含选自下组的氨基酸序列的多肽：
A.1.轻链可变域序列，其与SEQ ID NO:95-105、163-165所示的轻链可变域序列具有至少90％同一性；
2.重链可变域序列，其与SEQ ID NO:29-39、145-147所示的重链可变域序列具有至少90％同一性；
3.(1)的轻链可变域和(2)的重链可变域；和
B.包含CDR1、CDR2、CDR3的轻链可变域序列和/或包含CDR1、CDR2、CDR3的重链可变域序列，其在来自以下序列的每个CDR中的相同或不同之处总计不超过3个氨基酸添加、取代和/或缺失：
1.Ab1的轻链CDR1(SEQ ID NO:106)、CDR2(SEQ ID NO:117)、CDR3(SEQ ID NO:128)或重链CDR1(SEQ ID NO:40)、CDR2(SEQID NO:51)、CDR3(SEQ ID NO:62)；
2.Ab2的轻链CDR1(SEQ ID NO:107)、CDR2(SEQ ID NO:118)、CDR3(SEQ ID NO:129)或重链CDR1(SEQ ID NO:41)、CDR2(SEQID NO:52)、CDR3(SEQ ID NO:63)；
3.Ab3的轻链CDR1(SEQ ID NO:108)、CDR2(SEQ ID NO:119)、CDR3(SEQ ID NO:130)或重链CDR1(SEQ ID NO:42)、CDR2(SEQID NO:53)、CDR3(SEQ ID NO:64)；
4.Ab4的轻链CDR1(SEQ ID NO:109)、CDR2(SEQ ID NO:120)、CDR3(SEQ ID NO:131)或重链CDR1(SEQ ID NO:43)、CDR2(SEQID NO:54)、CDR3(SEQ ID NO:65)；
5.Ab5的轻链CDR1(SEQ ID NO:110)、CDR2(SEQ ID NO:121)、CDR3(SEQ ID NO:132)或重链CDR1(SEQ ID NO:44)、CDR2(SEQID NO:55)、CDR3(SEQ ID NO:66)；
6.Ab6的轻链CDR1(SEQ ID NO:111)、CDR2(SEQ ID NO:122)、CDR3(SEQ ID NO:133)或重链CDR1(SEQ ID NO:45)、CDR2(SEQID NO:56)、CDR3(SEQ ID NO:67)；
7.Ab7的轻链CDR1(SEQ ID NO:112)、CDR2(SEQ ID NO:123)、CDR3(SEQ ID NO:134)或重链CDR1(SEQ ID NO:46)、CDR2(SEQID NO:57)、CDR3(SEQ ID NO:68)；
8.Ab8的轻链CDR1(SEQ ID NO:113)、CDR2(SEQ ID NO:124)、CDR3(SEQ ID NO:135)或重链CDR1(SEQ ID NO:47)、CDR2(SEQID NO:58)、CDR3(SEQ ID NO:69)；
9.Ab9的轻链CDR1(SEQ ID NO:114)、CDR2(SEQ ID NO:125)、CDR3(SEQ ID NO:136)或重链CDR1(SEQ ID NO:48)、CDR2(SEQID NO:59)、CDR3(SEQ ID NO:70)；
10.Ab10的轻链CDR1(SEQ ID NO:115)、CDR2(SEQ IDNO:126)、CDR3(SEQ ID NO:137)或重链CDR1(SEQ ID NO:49)、CDR2(SEQ ID NO:60)、CDR3(SEQ ID NO:71)；
11.Ab11的轻链CDR1(SEQ ID NO:116)、CDR2(SEQ IDNO:127)、CDR3(SEQ ID NO:138)或重链CDR1(SEQ ID NO:50)、CDR2(SEQ ID NO:61)、CDR3(SEQ ID NO:72)；
12.Ab30的轻链CDR1(SEQ ID NO:166)、CDR2(SEQ IDNO:169)、CDR3(SEQ ID NO:172)或重链CDR1(SEQ ID NO:148)、CDR2(SEQ ID NO:151)、CDR3(SEQ ID NO:154)；
13.Ab32的轻链CDR1(SEQ ID NO:167)、CDR2(SEQ IDNO:170)、CDR3(SEQ ID NO:173)或重链CDR1(SEQ ID NO:149)、CDR2(SEQ ID NO:152)、CDR3(SEQ ID NO:155)；和
14.Ab33的轻链CDR1(SEQ ID NO:168)、CDR2(SEQ IDNO:171)、CDR3(SEQ ID NO:174)或重链CDR1(SEQ ID NO:150)、CDR2(SEQ ID NO:153)、CDR3(SEQ ID NO:156)。
在优选的实施方案中，分离的核酸所编码的多肽是结合ST2的抗原结合蛋白的组分。
对应于本文中描述的氨基酸序列且有待用作核酸分离的探针或引物或数据库搜索的查询序列的核苷酸序列，可以通过从氨基酸序列“反向翻译”，或通过确认与已经鉴别出编码DNA序列的多肽的氨基酸同一性区域来获得。可使用众所周知的聚合酶链反应(PCR)程序来分离和扩增编码ST2抗原结合蛋白或期望的ST2抗原结合蛋白多肽片段组合的DNA序列。将界定DNA片段组合的期望末端的寡核苷酸用作5'和3'引物。寡核苷酸可以另外含有限制内切核酸酶的识别位点，以促进将扩增的DNA片段组合插入表达载体中。PCR技术描述于Saiki等人,Science 239:487(1988)；Recombinant DNAMethodology,Wu等人编辑,Academic Press,Inc.,San Diego(1989),第189-196页；和PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innis等人编辑,Academic Press,Inc.(1990)中。
本发明的核酸分子包括单链和双链形式的DNA和RNA以及相应的互补序列。DNA包括例如cDNA、基因组DNA、化学合成的DNA、通过PCR扩增的DNA和其组合。本发明的核酸分子包括全长基因或cDNA分子以及其片段的组合。本发明的核酸优选地来源于人来源，但本发明也包括来源于非人物种的核酸。
在核酸从天然存在的来源分离的情况下，“分离的核酸”是一种已经与在分离所述核酸的生物体基因组中存在的相邻基因序列分离的核酸。在核酸从模板通过酶促方式或通过化学方式合成的情况下，例如PCR产物、cDNA分子或寡核苷酸，应了解，由此类过程产生的核酸是分离的核酸。分离的核酸分子是指呈分开的片段形式或作为较大核酸构建体的组分的核酸分子。在一个优选的实施方案中，核酸基本上不含污染性的内源性物质。核酸分子优选地来源于至少曾经呈基本上纯的形式分离且量或浓度能够通过标准生物化学法(例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1989)中概述的方法)鉴别、操作和回收其组分核苷酸序列的DNA或RNA。此类序列优选地以未被内部非翻译序列或通常存在于真核基因中的内含子中断的开放阅读框架形式提供和/或构建。非翻译DNA序列可以在开放阅读框架的5'或3'存在，其中其不干扰编码区域的操纵或表达。
本发明还包括在适度严格条件下，且更优选地在高度严格条件下与编码如本文中描述的ST2抗原结合蛋白的核酸杂交的核酸。影响杂交条件的选择的基本参数和设计适合条件的指导由Sambrook、Fritsch和Maniatis阐述(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,第9和11章；和Current Protocols in Molecular Biology,1995,Ausubel等人编辑,John Wiley & Sons,Inc.,第2.10和6.3-6.4章节)，并容易由本领域技术人员基于例如DNA的长度和/或碱基组成确定。一种实现适度严格条件的方式包含使用含有5xSSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的预洗溶液、约50％甲酰胺的杂交缓冲液、6xSSC和约55℃的杂交温度(或其它类似的杂交溶液，例如含有约50％甲酰胺的杂交溶液，以及约42℃的杂交温度)，和约60℃、在0.5xSSC、0.1％SDS中的洗涤条件。一般地，高度严格条件定义为如上的杂交条件，但在约68℃、0.2xSSC、0.1％SDS下洗涤。在杂交和洗涤缓冲液中，SSPE(1xSSPE是0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA pH7.4)可以替代SSC(1xSSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；在杂交结束后洗涤15分钟。应了解，通过应用如本领域技术人员已知和下文进一步描述的控制杂交反应和双螺旋体稳定性的基本原则，可以根据需要调节洗涤温度和洗涤盐浓度以实现期望的严格度(参见例如Sambrook等人,1989)。当核酸与未知序列的目标核酸杂交时，杂交体长度假定为杂交核酸的长度。当已知序列的核酸杂交时，杂交体长度可以通过比对核酸的序列并鉴别最佳序列互补性的区域来确定。预期长度小于50个碱基对的杂交体的杂交温度应该比杂交体的熔融温度(Tm)小5-10℃，其中Tm根据以下方程式确定。对于长度小于18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝2(A+T碱基的数目)+4(G+C碱基的数目)。对于长度大于18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂交体中碱基的数目，且[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度(对于1xSSC，[Na+]＝0.165M)。优选地，每个此类杂交核酸的长度为至少15个核苷酸(或更优选地，至少18个核苷酸，或至少20个核苷酸，或至少25个核苷酸，或至少30个核苷酸，或至少40个核苷酸，或最优选地，至少50个核苷酸)，或其杂交的本发明核酸长度的至少25％(更优选地，至少50％或至少60％或至少70％，且最优选地，至少80％)，并具有与其杂交的本发明的核酸具有至少60％序列同一性(更优选地，至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，且最优选地，至少99.5％)，如以上更详细的描述，其中序列同一性是通过在进行比对时比较杂交核酸的序列，以便最大化重叠和同一性的同时最小化序列空位来确定。
根据本发明的变异体通常通过在编码抗原结合蛋白的DNA中进行核苷酸的位点特异性诱变、使用盒式或PCR诱变或本领域中众所周知的其它技术，产生编码变异体的DNA，并此后如本文中所概述，在细胞培养物中表达重组DNA来制备。然而，包含具有多达约100-150个残基的变异CDR的抗原结合蛋白片段可以通过使用成熟的技术体外合成来制备。变异体通常显示出与天然存在的类似物相同的定性的生物活性，例如结合ST2，尽管也可以选择具有改变的特征的变异体，如下文将更充分地概述。
如本领域技术人员应了解，归因于遗传密码的简并性，可以制备非常大量的核酸，所有核酸都编码本发明的CDR(和重链和轻链或抗原结合蛋白的其它组分)。因此，在已经鉴别具体的氨基酸序列下，本领域技术人员可以通过用不改变所编码的蛋白质氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的序列来制备许多不同的核酸。
本发明还提供了表达系统和构建体，呈质粒、表达载体、转录或表达盒的形式，其包含至少一种如上的聚核苷酸。另外，本发明提供了包含此类表达系统或构建体的宿主细胞。
通常，用于任何宿主细胞中的表达载体将含有用于质粒维护和用于克隆和表达外源性核苷酸序列的序列。此类序列在某些实施方案中统称为“侧接序列”，将通常包括一种或多种以下核苷酸序列：启动子、一种或多种增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码待表达的多肽的核酸的聚连接子区域和可选择的标记物元件。以下论述这些序列中的每一种。
任选地，载体可以含有编码“标签”的序列，即位于ST2抗原结合蛋白编码序列的5'或3'末端的寡核苷酸分子；所述寡核苷酸序列编码多聚组氨酸(例如六组氨酸)或另一“标签”，例如存在市售抗体的FLAG、HA(血球凝集素流感病毒)或myc。此标签通常在多肽表达时与多肽融合，并可以用作将ST2抗原结合蛋白从宿主细胞进行亲和力纯化或检测的手段。亲和力纯化可以例如通过柱色谱法使用针对标签的抗体作为亲和基质来实现。任选地，标签可以随后通过各种方式，例如使用某些肽酶进行裂解，从纯化的ST2抗原结合蛋白去除。
侧接序列可以是同源的(即来自与宿主细胞相同的物种和/或株系)、异源的(即来自除宿主细胞物种或株系以外的物种)、混杂的(即来自一种以上来源的侧接序列的组合)、合成的或天然的。因而，侧接序列的来源可以是任何原核或真核生物体、任何脊椎动物或无脊椎动物生物体或任何植物，条件为侧接序列在宿主细胞机构中是功能性的并可以通过宿主细胞机构活化。
适用于本发明的载体中的侧接序列可以通过本领域中众所周知的若干方法中的任一者获得。通常，适用于本文中的侧接序列先前已经通过定位和/或通过限制性核酸内切酶消化被鉴别，并因此可以使用适当的限制性核酸内切酶从适当的组织来源分离。在一些情况下，侧接序列的完整核苷酸序列可能是已知的。此处，侧接序列可以使用本文中描述的用于核酸合成或克隆的方法合成。
无论已知侧接序列的所有还是仅仅一部分，其都可以使用聚合酶链反应(PCR)和/或通过用诸如寡核苷酸和/或来自相同或另一物种的侧接序列片段的合适探针筛选基因组文库来获得。在不知侧接序列的情况下，含有侧接序列的DNA的片段可以从可能含有例如编码序列乃至其它基因的较大片的DNA分离。可以通过限制性核酸内切酶消化实现分离以产生适当的DNA片段，接着使用琼脂糖凝胶纯化、柱色谱法(Chatsworth,CA)或本领域技术人员已知的其它方法分离。实现此目的的合适酶的选择是本领域技术人员显而易见的。
复制起点通常是市售的那些原核表达载体的一部分，且该起点有助于在宿主细胞中扩增载体。如果所选的载体不含复制起点位点，那么可以基于已知的序列通过化学方法合成，并连接到载体中。举例来说，来自质粒pBR322的复制起点(New England Biolabs,Beverly,MA)适合于大部分革兰氏阴性细菌，且各种病毒性起点(例如SV40、多形瘤、腺病毒、疱疹性口炎病毒(VSV)或诸如HPV或BPV的乳头瘤病毒)可用于在哺乳动物细胞中克隆载体。一般地，复制元件的起点不是哺乳动物表达载体所必需的(例如经常使用SV40起点，只是因为其还含有病毒早期启动子)。
转录终止序列通常位于多肽编码区域的末端3'并用以终止转录。通常，原核细胞中的转录终止序列是富含G-C的片段，接着是聚-T序列。虽然此序列容易从文库克隆或者甚至作为载体的一部分购得，但其还可以使用例如本文中描述的核酸合成方法容易地合成。
可选择的标记物基因编码在选择性培养基中生长的宿主细胞存活和生长所必需的蛋白质。典型的选择标记物基因编码这样的蛋白质，其：(a)赋予原核宿主细胞对诸如氨苄西林(ampicillin)、四环素(tetracycline)或卡那霉素(kanamycin)的抗生素或其它毒素的抗性；(b)补充细胞的营养缺乏；或(c)供应无法从复合物或确定的培养基获得的重要养分。特定的可选择的标记物是卡那霉素抗性基因、氨苄西林抗性基因和四环素抗性基因。有利地，新霉素抗性基因也可以用于在原核与真核宿主细胞中进行选择。
其它可选择的基因可以用于扩增将要表达的基因。扩增是对于生长或细胞存活来说关键的蛋白质产生所需的基因在重组细胞的连续世代的染色体内串列重复的过程。适用于哺乳动物细胞的可选择的标记物的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和无启动子的胸苷激酶基因。将哺乳动物细胞转化体放在选择压力下，其中仅仅转化体借助于载体中存在的可选择的基因独特地存活。通过在接连增加选择试剂在培养基中的浓度的条件下培养转化细胞来施加选择压力，由此扩增可选择的基因和编码另一基因的DNA(例如结合ST2多肽的抗原结合蛋白抗体)两者。结果，从扩增的DNA合成了增加量的多肽(例如ST2抗原结合蛋白)。
核糖体结合位点通常为rnRNA翻译起始所必需的，且特征是夏因-达尔加诺序列(Shine-Dalgarno sequence)(原核生物)或科扎克序列(Kozak sequence)(真核生物)。所述元件通常位于启动子3'和有待表达的多肽的编码序列5'。在某些实施方案中，一个或多个编码区域可以可操作地连接于内部核糖体结合位点(IRES)，允许来自单个RNA转录本的两个开放阅读框架翻译。
在一些情况下，例如在糖基化是真核宿主细胞表达系统中所期望的情况下，可以操纵各种前序列或原序列以改善糖基化或产率。举例来说，可以改变具体的信号肽的肽酶裂解位点，或添加原序列，此也可以影响糖基化。最终的蛋白质产物在-1位置(相对于成熟蛋白质的第一个氨基酸)可以具有一个或多个易表达的额外的氨基酸，所述氨基酸可能尚未完全去除。举例来说，最终的蛋白质产物可以具有一个或两个存在于肽酶裂解位点并连接到氨基末端的氨基酸残基。或者，如果酶在成熟多肽内的此类区域切割，那么使用一些酶裂解位点可以产生期望的多肽的略微截短形式。
本发明的表达和克隆载体通常将含有由宿主生物体识别并可操作地连接于编码ST2抗原结合蛋白的分子的启动子。启动子是位于结构基因的起始密码子上游(即5')的未转录的序列(一般约100到1000bp内)，其控制结构基因的转录。启动子照惯例分成两种类型之一：诱导性启动子和组成性启动子。诱导性启动子响应培养条件的一些变化(例如存在或不存在养分或温度变化)，引发在其控制下从DNA转录的水平增加。另一方面，组成性启动子均一地转录其可操作地连接的基因，也就是说，极少或不控制基因表达。许多由各种潜在宿主细胞识别的启动子是众所周知的。通过利用限制酶消化以去除来源DNA的启动子并将期望的启动子序列插入载体中，将适合的启动子可操作地连接于编码包含本发明的ST2抗原结合蛋白的重链或轻链的DNA。
适用于酵母宿主的启动子也是本领域中众所周知的。酵母增强子宜与酵母启动子一起使用。适用于哺乳动物宿主细胞的启动子是众所周知的，并包括(但不限于)从以下病毒的基因组中获得的启动子：诸如多形瘤病毒、传染性上皮瘤病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、鸟类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和最优选地猿猴病毒40(SV40)。其它适合的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热休克启动子和肌动蛋白启动子。
可能感兴趣的额外的启动子包括(但不限于)：SV40早期启动子(Benoist和Chambon,1981,Nature 290:304-310)；CMV启动子(Thornsen等人,1984,Proc.Natl.Acad.U.S.A.81:659-663)；劳氏肉瘤病毒的3'长末端重复序列中含有的启动子(Yamamoto等人,1980,Cell22:787-797)；疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1444-1445)；来自金属硫蛋白基因的启动子和调控序列(Prinster等人,1982,Nature 296:39-42)；和原核启动子，例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727-3731)；或tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25)。还感兴趣的是以下动物转录控制区域，其显示出组织特异性并已经用于转基因动物中：在胰腺腺泡细胞中具有活性的弹性蛋白酶I基因控制区域(Swift等人,1984,Cell38:639-646；Ornitz等人,1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409；MacDonald,1987,Hepatology 7:425-515)；在胰腺β-细胞中具有活性的胰岛素基因控制区域(Hanahan,1985,Nature315:115-122)；在淋巴样细胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制区域(Grosschedl等人,1984,Cell 38:647-658；Adames等人,1985,Nature318:533-538；Alexander等人,1987,Mol.Cell.Biol.7:1436-1444)；在睾丸、乳房、淋巴样和肥大细胞中具有活性的小鼠乳腺瘤病毒控制区域(Leder等人,1986,Cell 45:485-495)；在肝中具有活性的白蛋白基因控制区域(Pinkert等人,1987,Genes and Devel.1:268-276)；在肝中具有活性的甲胎蛋白基因控制区域(Krumlauf等人,1985,Mol.Cell.Biol.5:1639-1648；Hammer等人,1987,Science 253:53-58)；在肝中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区域(Kelsey等人,1987,Genes andDevel.1:161-171)；在骨髓细胞中具有活性的β-球蛋白基因控制区域(Mogram等人,1985,Nature 315:338-340；Kollias等人,1986,Cell46:89-94)；在脑的少突神经胶质细胞中具有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区域(Readhead等人,1987,Cell 48:703-712)；在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区域(Sani,1985,Nature314:283-286)；和在下丘脑中具有活性的促性腺释放激素基因控制区域(Mason等人,1986,Science 234:1372-1378)。
增强子序列可以插入载体中以增加高等真核细胞对编码包含本发明的ST2抗原结合蛋白的轻链或重链的DNA的转录。增强子是起顺式作用的DNA元件，长度通常是约10-300bp，其作用于启动子以增加转录。增强子的取向和位置是相对独立的，已经在转录单元的5'和3'位置发现。可以从哺乳动物基因中获得的若干增强子序列(例如球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)为已知的。然而，通常使用来自病毒的增强子。本领域中已知的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多形瘤增强子和腺病毒增强子是用于活化真核启动子的例示性增强元件。虽然增强子可以位于载体中编码序列的5'或3'，但其通常位于启动子的位点5'。编码适当的天然或异源信号序列(前导序列或信号肽)的序列可以并入表达载体中，以促进抗体的细胞外分泌。信号肽或前导序列的选择取决于将产生抗体的宿主细胞的类型，且异源信号序列可以替换天然信号序列。在哺乳动物宿主细胞中具有功能的信号肽的实例包括以下信号肽：美国专利No.4,965,195中描述的白介素-7(IL-7)的信号序列；Cosman等人,1984,Nature 312:768中描述的白介素-2受体的信号序列；欧洲专利No.0367566中描述的白介素-4受体信号肽；美国专利No.4,968,607中描述的I型白介素-1受体信号肽；欧洲专利No.0 460 846中描述的II型白介素-1受体信号肽。
载体可以含有一种或多种在载体整合到宿主细胞基因组中时促进表达的元件。实例包括EASE元件(Aldrich等人2003 BiotechnolProg.19:1433-38)和基质连接区(MAR)。MAR介导染色质的结构组织并可以将整合的载体与“位置”效应隔绝。因此，MAR尤其适用于载体用以产生稳定的转化体时。许多天然和合成的含有MAR的核酸是本领域中已知的，例如美国专利No.6,239,328；7,326,567；6,177,612；6,388,066；6,245,974；7,259,010；6,037,525；7,422,874；7,129,062。
本发明的表达载体可以从诸如市售载体的起始载体构建。此类载体可以含有或可以不含有所有期望的侧接序列。在本文中描述的侧接序列中的一个或多个已不存在于载体中的情况下，其可以单独地获得并连接到载体中。用于获得每个侧接序列的方法是本领域技术人员众所周知的。
在已经构建载体且编码包含ST2抗原结合序列的轻链、重链或轻链与重链的核酸分子已经插入载体的适当位点中后，完整的载体可以插入适合的宿主细胞中用于扩增和/或多肽表达。将用于ST2抗原结合蛋白的表达载体转化到选择的宿主细胞中，可以通过众所周知的方法实现，包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其它已知的技术。所选择的方法在某种程度上将随所使用的宿主细胞类型而变。这些方法和其它适合的方法是本领域技术人员众所周知的，并阐述于例如Sambrook等人,2001,同上。
当在适当的条件下培养时，宿主细胞合成ST2抗原结合蛋白，随后可以从培养基(如果宿主细胞将它分泌到培养基中)或直接从产生它的宿主细胞(如果未分泌它)收集。适当的宿主细胞的选择将取决于各种因素，例如期望的表达水平、活性所期望或需要的多肽修饰(例如糖基化或磷酸化)以及容易折叠成生物学上的活性分子。宿主细胞可以是真核或原核的。
可以用作宿主供表达的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，并包括(但不限于)可以从美国典型菌种保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC)中获得的永生化细胞系，且本领域中已知的用于表达系统的任何细胞系都可以用于制备本发明的重组多肽。一般说来，宿主细胞用包含编码期望的抗ST2抗体多肽的DNA的重组表达载体来转化。在所述宿主细胞中，可以采用原核生物、酵母或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌(E.coli)或杆菌。高等真核细胞包括昆虫细胞和哺乳动物来源的确立细胞系。适合的哺乳动物宿主细胞系的实例包括：猴肾细胞的COS-7细胞系(ATCC CRL 1651)(Gluzman等人,1981,Cell23:175)、L细胞、293细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物(例如Veggie CHO)和生长在无血清培养基中的相关细胞系(Rasmussen等人,1998,Cytotechnology 28:31)、海拉细胞(HeLa cell)、BHK(ATCC CRL 10)细胞系，以及来源于非洲绿猴肾细胞系CVI(ATCC CCL 70)的CVI/EBNA细胞系(如McMahan等人,1991,EMBO J.10:2821所述)、人胚肾细胞(例如293、293 EBNA或MSR 293)、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其它转化的灵长类动物细胞系、正常二倍体细胞、来源于初生组织体外培养的细胞系、初级外植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。任选地，当希望在各种信号转导或报告基因分析中使用多肽时，诸如HepG2/3B、KB、NIH 3T3或S49的哺乳动物细胞系可以用于表达所述多肽。或者，可以在诸如酵母的低等真核生物或诸如细菌的原核生物中产生多肽。适合的酵母包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、克卢费氏酵母属(Kluyveromyces)菌株、念珠菌属(Candida)或能够表达异源多肽的任何酵母菌株。适合的菌株包括大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或能够表达异源多肽的任何菌株。如果多肽在酵母或细菌中制备，那么可能希望例如通过适当位点的磷酸化或糖基化，修饰其中产生的多肽，以获得功能性多肽。此类共价连接可以使用已知的化学或酶促方法实现。还可以通过在一种或多种昆虫表达载体中，将本发明的分离的核酸可操作地连接于适合的控制序列，并采用昆虫表达系统来产生多肽。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料与方法可以从例如Invitrogen,San Diego,Calif.,U.S.A.以试剂盒的形式购得(试剂盒)，且此类方法是本领域众所周知的，如Summers和Smith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)，和Luckow和Summers,Bio/Technology 6:47(1988)中所描述。无细胞的翻译系统还可以用以使用来源于本文公开的核酸构建体的RNA产生多肽。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的适当的克隆和表达载体由Pouwels等人描述(Cloning Vectors:ALaboratory Manual,Elsevier,New York,1985)。包含本发明的分离的核酸，优选可操作地连接于至少一种表达控制序列的宿主细胞是“重组宿主细胞”。
在某些实施方案中，细胞系可以通过确定哪个细胞系具有高表达水平并组成性地产生具有ST2结合特性的抗原结合蛋白来选择。在另一个实施方案中，可以选择来自不产生其自己的抗体但能够产生和分泌异源抗体的B细胞谱系的细胞系。
细胞消耗性ST2抗原结合蛋白
在优选的实施方案中，ST2抗原结合蛋白结合ST2并抑制IL-33结合，由此减少表达ST2的细胞中IL-33介导的信号转导。然而，在某些实施方案中，ST2抗原结合蛋白结合ST2并靶向表达ST2的细胞以进行消耗。当然，ST2抗原结合蛋白可以抑制IL-33结合并靶向ST2细胞以进行消耗。
细胞消耗性ST2抗原结合蛋白尤其可用于治疗与ST2过度表达相关联的疾病，例如炎性疾病或表达ST2的肿瘤。用诸如抗体的抗原结合蛋白靶向细胞的方法是本领域中众所周知的。以下论述例示性实施方案。
抗体药物缀合物
本发明的实施方案包括抗体药物缀合物(ADC)。一般地，ADC包含与诸如细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、毒素或放射性试剂的化学治疗剂结合的抗体。连接子分子可以用于将药物与抗体缀合。本领域中已知适用于ADC技术的多种连接子和药物，并可以用于本发明的实施方案中。(参见US20090028856；US2009/0274713；US2007/0031402；WO2005/084390；WO2009/099728；US5208020；US5416064；US5475092；5585499；6436931；6372738；和6340701，都以引用的方式并入本文中)。
连接子
在某些实施方案中，ADC包含由一种或多种连接子组分组成的连接子。例示性连接子组分包括：6-顺丁烯二酰亚胺基己酰基、顺丁烯二酰亚胺基丙酰基、缬氨酸-瓜氨酸、丙氨酸-苯丙氨酸、对氨基苯甲氧羰基和由与包括(但不限于)以下的连接子试剂结合所产生的连接子组分：N-丁二酰亚胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(“SPP”)、N-丁二酰亚胺基4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1羧酸酯(“SMCC”，本文中也称为“MCC”)和N-丁二酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。
连接子可以是“可裂解的”连接子或“不可裂解的”连接子(Ducry和Stump,Bioconjugate Chem.2010,21,5-13；以引用的方式整体并入本文中)。可裂解的连接子被设计成能在经受某些环境因素时，例如在内在化到靶标细胞中时释放药物。可裂解的连接子包括酸不稳定的连接子、蛋白酶敏感的连接子、光不稳定的连接子、二甲基连接子或含有二硫化物的连接子。在被靶标细胞内在化并在其内降解后，不可裂解的连接子往往仍然与抗体的至少一个氨基酸和药物共价缔合。一种例示性不可裂解的连接子是MCC。
药物
在某些实施方案中，抗体结合于化学治疗剂。化学治疗剂的实例包括烷基化剂，例如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)(CYTOXAN.TM.)；烷基磺酸盐，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)，例如苄替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺(ethylenimine)和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenin)(尤其布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓虫素(bryostatin)；海绵他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；自念珠藻环肽(cryptophycin)(尤其自念珠藻环肽1和自念珠藻环肽8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CBI-TMI)；软珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustard)(例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、氮芥氧化物盐酸盐(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比星(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)；硝基脲(nitrosurea)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯尿霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如加里刹霉素(calicheamicin)、尤其加里刹霉素γ1和加里刹霉素θI，参见例如Angew Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、奥曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)；色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代基-L-正亮氨酸)、阿霉素(doxorubicin)(包括吗啉基-阿霉素、氰基吗啉基-阿霉素、2-吡咯啉基-阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾达霉素(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、尼托霉素(nitomycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲佐菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，例如环胞苷(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫佛(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿核苷(floxuridine)、5-FU；雄激素，例如二甲睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸盐(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺，例如胺鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；比曲比新(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；德佛法明(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾佛米星(elfomithine)；依利醋铵乙酸盐(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；乙环氧啶(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；类美登素(maytansinoid)，例如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他汀(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；足叶草酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK.RTM.；丙亚胺(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；思佐呋喃(sizofuran)；螺旋锗(spirogermanium)；细格孢氮杂酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2″-三氯三乙基胺；单端孢霉烯(trichothecene)(尤其T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；双溴丙基哌嗪(pipobroman)；加胞嘧啶(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；噻替派(thiotepa)；紫杉烷(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL.TM.,Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)和多烯紫杉醇(doxetaxel)(TAXOTERE.RTM.,Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂(cisplatin)和卡铂(boplatin)；长春花碱(vinblastine)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C(mitomycin C)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylomithine，DMFO)；视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；和以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。此定义内还包括用以调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷诺昔芬(raloxifene)、抑制芳香酶的4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、凯奥昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(法乐通(Fareston))；和抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮脯利特(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；siRNA和以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。可以用于本发明的其它化学治疗剂在美国公布No.20080171040或美国公布No.20080305044中公开，并以引用的方式整体并入。
预期抗体可以结合两种或两种以上不同的化学治疗剂，或药物组合物可以包含抗体的混合物，其中抗体组分除了结合不同的化学治疗剂外都相同。此类实施方案可用于靶向多条具有靶标细胞的生物通路。
在优选的实施方案中，ADC包含结合一种或多种类美登素(maytansinoid)分子的抗体，类美登素分子是通过抑制微管蛋白聚合而起作用的有丝分裂抑制剂。包括各种修饰的类美登素描述于美国专利No.3896111、4151042、4137230、4248870、4256746、4260608、4265814、4294757、4307016、4308268、4309428、4313946、4315929、4317821、4322348、4331598、4361650、4364866、4424219、4450254、4362663、4371533和WO 2009/099728中。类美登素药物部分可以从天然来源分离，使用重组技术产生，或以合成方法制备。例示性类美登素包括：C-19-脱氯(美国专利No.4256746)、C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利No.4307016和4361650)、C-20-脱甲氧基(或C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-脱氯(美国专利No.4294757)、C-9-SH(美国专利No.4,424,219)、C-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH2OR)(美国专利No.4,331,598)、C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利No.4,450,254)、C-15-羟基/酰氧基(美国专利No.4,364,866)、C-15-甲氧基(美国专利No.4,313,946和4,315,929)、C-18-N-脱甲基(美国专利No.4,362,663和4,322,348)和4,5-脱氧基(美国专利No.4,371,533)。
类美登素化合物上的各个位置都可以用作连接位置，取决于期望的连接类型。举例来说，为了形成酯键，具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置都是适合的(美国专利No.5208020、RE39151和6913748；美国专利申请公布No.20060167245和20070037972以及WO2009099728)。
优选的类美登素包括本领域中称为DM1、DM3和DM4的类美登素(美国专利申请公布No.2009030924和20050276812，以引用的方式并入本文中)。
含有类美登素的ADC、此类ADC的制备方法和其治疗用途公开在美国专利No.5208020和5416064、美国专利申请公布No.20050276812和WO 2009099728(都以引用的方式并入本文中)中。本领域中已知可用于制备类美登素ADC的连接子(美国专利No.5208020和美国专利申请公布No.2005016993和20090274713；都以引用的方式并入本文中)。包含SMCC连接子的类美登素ADC可以如美国专利公布No.2005/0276812中所公开来制备。
效应功能增强的抗体
抗体Fc部分的一种功能是当抗体结合其靶标时与免疫系统沟通。此被视为“效应功能”。沟通使得产生抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞噬菌作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。ADCC和ADCP是通过Fc结合于免疫系统细胞表面上的Fc受体而介导的。CDC是通过Fc与补体系统的蛋白质(例如C1q)结合而介导的。
IgG子类介导效应功能的能力不同。举例来说，IgG1在介导ADCC和CDC上比IgG2和IgG4强得多。因此，在靶向表达ST2的细胞以进行破坏的实施方案中，抗ST2 IgG1抗体将是优选的。
抗体的效应功能可以通过将一种或多种突变引入Fc中来增加或降低。本发明的实施方案包括具有经工程化以增加效应功能的Fc的抗原结合蛋白，例如抗体(U.S.7,317,091和Strohl,Curr.Opin.Biotech.,20:685-691,2009；都以引用的方式整体并入本文中)。具有增加的效应功能的例示性IgG1 Fc分子包括(基于Kabat编号方案)具有以下取代的Fc分子：S239D/I332E
S239D/A330S/I332E
S239D/A330L/I332E
S298A/D333A/K334A
P247I/A339D
P247I/A339Q
D280H/K290S
D280H/K290S/S298D
D280H/K290S/S298V
F243L/R292P/Y300L
F243L/R292P/Y300L/P396L
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L
G236A/S239D/I332E
K326A/E333A
K326W/E333S
K290E/S298G/T299A
K290N/S298G/T299A
K290E/S298G/T299A/K326E
K290N/S298G/T299A/K326E
本发明的其它实施方案包括具有经工程化以降低效应功能的Fc的抗原结合蛋白，例如抗体。具有降低的效应功能的例示性Fc分子包括(基于Kabat编号方案)具有以下取代的Fc分子：
N297A(IgG1)
L234A/L235A(IgG1)
V234A/G237A(IgG2)
L235A/G237A/E318A(IgG4)
H268Q/V309L/A330S/A331S(IgG2)
C220S/C226S/C229S/P238S(IgG1)
C226S/C229S/E233P/L234V/L235A(IgG1)
L234F/L235E/P331S(IgG1)
S267E/L328F(IgG1)。
另一种增加含有IgG Fc的蛋白质的效应功能的方法是通过减少Fc的岩藻糖基化。将核心岩藻糖从连接到Fc的双触角复合物类型的寡糖去除极大地增加了ADCC效应功能，而不改变抗原结合或CDC效应功能。已知若干方式用于减少或消除诸如抗体的含有Fc的分子的岩藻糖基化。这些方式包括在某些哺乳动物细胞系中重组表达，这些哺乳动物细胞系包括FUT8剔除细胞系、变异CHO细胞系Lec13、大鼠融合瘤细胞系YB2/0、包含特异性地针对FUT8基因的小干扰RNA的细胞系以及共表达β-1，4-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III和高尔基体α-甘露糖苷酶II的细胞系。或者，含有Fc的分子可以在诸如植物细胞、酵母或原核细胞(例如大肠杆菌)的非哺乳动物细胞中表达。因此，在本发明的某些实施方案中，组合物包含具有减少的岩藻糖基化或整体上缺乏岩藻糖基化的抗体，例如Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10或Ab11。
药物组合物
在一些实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的一种或多种本发明的抗原结合蛋白以及药学上有效的稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。在某些实施方案中，抗原结合蛋白是抗体。本发明的药物组合物包括(但不限于)液体、冷冻和冻干的组合物。
优选地，配制材料在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的。在特定实施方案中，提供了包含治疗有效量的ST2抗原结合蛋白(例如ST2结合抗体)的药物组合物。
在某些实施方案中，药物组合物可以含有用于改性、维持或保持例如组合物的pH值、摩尔渗透压浓度、粘度、透明度、颜色、等张性、气味、无菌、稳定性、分解或释放速率、吸附或渗透的配制材料。在此类实施方案中，适合的配制材料包括(但不限于)氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、脯氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)；膨胀剂(例如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；双糖；和其它碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐平衡离子(例如钠)；防腐剂(例如氯化苯甲烃铵(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、双氯苯、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(例如普洛尼克(pluronics)、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨酸酯(例如聚山梨酸酯20)、聚山梨酸酯、去利通(triton)、缓血酸胺、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；稳定性增强剂(例如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(例如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾、甘露糖醇、山梨糖醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。参见REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES,第18"版,(A.R.Genrmo编辑),1990,Mack Publishing Company。
在某些实施方案中，最佳药物组合物将由本领域技术人员根据例如预定的给药途径、递送方式和期望的剂量来确定。参见例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,同上。在某些实施方案中，此类组合物可以影响本发明的抗原结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。在某些实施方案中，药物组合物中的主要媒介物或载剂可以实际上是水性或非水性的。举例来说，适合的媒介物或载剂可以是注射用水、生理盐水溶液或人造的脑脊髓液，可能补充有用于肠胃外给药的组合物中常见的其它物质。中性的缓冲生理盐水或与血清白蛋白混合的生理盐水是其它例示性媒介物。在特定实施方案中，药物组合物包含约pH7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，并可以进一步包括山梨糖醇或其适合的替代物。在本发明的某些实施方案中，ST2抗原结合蛋白组合物可以通过将具有期望的纯度的所选择组合物与任选的配制试剂混合而制成冻干块或水溶液形式以供储存(REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES,同上)。此外，在某些实施方案中，ST2抗原结合蛋白产品可以使用适当的赋形剂(例如蔗糖)配制成冻干物。
本发明的药物组合物可以选择用于肠胃外递送。或者，组合物可以选择用于吸入或通过消化道，例如经口递送。本领域技术人员能够制备此类药学上可接受的组合物。制剂(formulation)组分优选地以给予部位可接受的浓度存在。在某些实施方案中，缓冲液用以维持组合物在生理学pH值下或者在略微较低的pH值下，典型地在约5到约8的pH范围内。
当涵盖肠胃外给药时，用于本发明的治疗组合物可以呈包含于药学上可接受的媒介物中的期望的ST2抗原结合蛋白的无热原、肠胃外可接受的水溶液形式提供。尤其适合肠胃外注射的媒介物是无菌蒸馏水，其中ST2抗原结合蛋白被配制成无菌、等张溶液，适当地保存。在某些实施方案中，制备可包括用诸如可注射的微球体、生物可腐蚀的粒子、聚合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体的试剂配制期望的分子，此可以提供能够通过储槽式注射来递送的产物的受控或持续释放。在某些实施方案中，也可以使用透明质酸，其具有促进在循环中的持续时间的作用。在某些实施方案中，可植入的药物递送装置可以用于引入期望的抗原结合蛋白。
本发明的药物组合物可以配制为用于吸入。在这些实施方案中，ST2抗原结合蛋白宜配制成干燥的可吸入粉末。在特定实施方案中，ST2抗原结合蛋白吸入溶液也可以用推进剂配制用于气溶胶递送。在某些实施方案中，溶液可以雾化。因此经肺给药和配制方法进一步描述于国际专利申请No.PCT/US94/001875中，此申请以引用的方式并入，并描述了经肺递送化学上修饰的蛋白质。
还涵盖调配物可以经口给予。用这种方式给予的ST2抗原结合蛋白可以在有或无通常用于例如片剂和胶囊等固体剂型混配中的载剂下配制。在某些实施方案中，胶囊可以被设计成能在胃肠道中生物利用率最大化且全身前降解作用最小化时释放制剂的活性部分。可以包括额外的试剂以促进ST2抗原结合蛋白的吸收。也可以采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
额外的药物组合物对本领域技术人员来说是显然的，包括包含于持续或受控递送的制剂中的ST2抗原结合蛋白制剂。本领域技术人员还已知用于配制各种其它持续或受控递送方式的技术，例如脂质体载剂、生物可腐蚀的微粒或多孔珠粒和储槽式注射。参见例如国际专利申请No.PCT/US93/00829，其以引用的方式并入并描述了多孔聚合物微粒的受控释放以递送药物组合物。持续释放制剂可以包括成形物品形式的半渗透性的聚合物基质，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚交酯(如美国专利No.3,773,919和欧洲专利申请公布No.EP 058481中公开，每一者以引用的方式并入)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人,1983,Biopolymers 2:547-556)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人,1981,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277和Langer,1982,Chem.Tech.12:98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人,1981,上文)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公布No.EP 133,988)。持续释放组合物也可以包括可以通过本领域中已知的若干方法中的任一者制备的脂质体。参见例如Eppstein等人,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:3688-3692；欧洲专利申请公布No.EP 036,676；EP 088,046和EP143,949，以引用的方式并入。
用于体内给予的药物组合物通常以无菌制剂形式提供。杀菌可以通过用无菌过滤膜过滤来实现。当冻干组合物时，使用此方法的杀菌可以在冻干和复原前或后进行。用于肠胃外给药的组合物可以呈冻干形式或呈溶液储存。肠胃外组合物一般放于具有无菌进入孔的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
本发明的方面包括自我缓冲的ST2抗原结合蛋白制剂，其可以用作药物组合物，如国际专利申请WO 06138181A2(PCT/US2006/022599)中所描述，此申请以引用的方式整体并入本文中。
如以上所讨论，某些实施方案提供了ST2抗原结合蛋白组合物、尤其药物ST2抗原结合蛋白组合物，其除了ST2抗原结合蛋白外还包含一种或多种赋形剂，例如本章节和本文中别处例示性描述的赋形剂。在这方面，赋形剂可以用于本发明中以达成多种目的，例如调节制剂的物理、化学或生物特性，例如调节粘度，和或调节本发明的工艺以提高效率，和或稳定此类制剂和工艺，以免于因例如在制备、装运、储存、使用前制备、给药和此后的期间出现的应力而降解和损坏。
可以获得在此方面适用的有关蛋白质稳定化以及配制材料和方法的各种说明，例如Arakawa等人,"Solvent interactions inpharmaceutical formulations,"Pharm Res.8(3):285-91(1991)；Kendrick等人,"Physical stabilization of proteins in aqueous solution,"RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS:THEORY AND PRACTICE,Carpenter和Manning编辑,PharmaceuticalBiotechnology.13:61-84(2002)；以及Randolph等人,"Surfactant-protein interactions,"Pharm Biotechnol.13:159-75(2002)，每一者以引用的方式整体并入本文中，尤其是在关于赋形剂和其用于根据本发明的自我缓冲的蛋白质制剂的工艺的部分中，特别是关于用于兽医学和/或人类医学用途的蛋白质药品和工艺。
根据本发明的某些实施方案可以使用盐，以例如调节制剂的离子强度和/或等张性和/或提高根据本发明的组合物的蛋白质或其它成分的溶解性和/或物理稳定性。
众所周知，离子可以通过结合于蛋白质表面上的带电残基和通过遮蔽蛋白质中带电的和极性基团并降低其静电相互作用、吸引和排斥相互作用的强度来稳定蛋白质的天然状态。离子也可以通过结合尤其蛋白质的变性肽键(--CONH)来稳定蛋白质的变性状态。此外，离子与蛋白质中带电的和极性基团的相互作用也可以降低分子间静电相互作用，并由此阻止或减少蛋白质聚集和不可溶性。
离子物质对蛋白质的作用显著不同。已经研发了离子和其对蛋白质的作用的许多分类等级，其可以用于配制根据本发明的药物组合物。一个实例是霍夫梅斯特序列(Hofmeister series)，其通过对溶液中蛋白质的构象稳定性的作用将离子和极性非离子溶解物分等级。使溶解物稳定称为“离液序列低的”。使溶解物不稳定称为“离液序列高的”。离液序列低的物质通常以高浓度(例如>1摩尔硫酸铵)使用以使蛋白质从溶液沉淀(“盐析”)。离液序列高的物质通常用以使蛋白质变性和/或溶解(“盐溶”)。离子“盐溶”和“盐析”的相对效率确定了其在霍夫梅斯特序列中的位置。
游离氨基酸可以作为膨胀剂、稳定剂和抗氧化剂以及其它标准用途，用于根据本发明各种实施方案的ST2抗原结合蛋白制剂中。赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸可以用于使制剂中的蛋白质稳定。甘氨酸适用于冻干以确保正确的块体结构和特性。精氨酸可以用于抑制液体和冻干制剂中的蛋白质聚集。甲硫氨酸适用作抗氧化剂。
多元醇包括糖，例如甘露糖醇、蔗糖和山梨糖醇；和多元醇，例如甘油和丙二醇，以及出于本文中讨论的目的，聚乙二醇(PEG)和相关物质。多元醇是离液序列低的。它们是液体和冻干制剂中适用的稳定剂，以保护蛋白质免于物理和化学降解过程。多元醇也适用于调节制剂的张力。
适用于本发明的精选实施方案的多元醇是甘露糖醇，通常用于确保冻干制剂中块体的结构稳定性。其确保块体的结构稳定性。其一般与例如蔗糖等低温保护剂一起使用。山梨糖醇和蔗糖是优选的用于调节张力和作为稳定剂的试剂，以抵御在运输期间或制备工艺期内的整体制剂的冻融应力。诸如葡萄糖和乳糖的还原糖(其含有游离醛或酮基)能够与表面赖氨酸和精氨酸残基发生反应。因此，其一般不是根据本发明所使用的优选多元醇。另外，诸如蔗糖的形成此类反应性物质的糖在酸性条件下水解成果糖和葡萄糖，从而引起糖化反应，所以在这方面也不是本发明优选的多元醇。PEG适用于稳定蛋白质并作为低温保护剂，且在这方面可以用于本发明。
ST2抗原结合蛋白制剂的实施方案进一步包含表面活性剂。蛋白质分子容易吸附在表面上且变性，并随后聚集在空气-液体、固体-液体和液体-液体界面。这些作用一般与蛋白质浓度成反比。这些有害的相互作用一般与蛋白质浓度成反比，并通常因诸如在产品装运和处置期间产生的搅动而加重。
表面活性剂通常用以防止、最小化或减少表面吸附。在这方面适用于本发明中的表面活性剂包括聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80、脱水山梨糖醇聚乙氧基化物的其它脂肪酸酯和泊洛沙姆188(poloxamer188)。
表面活性剂也通常用于控制蛋白质构象稳定性。在这方面表面活性剂的使用是蛋白质特异性的，因为任何给定的表面活性剂通常将使一些蛋白质稳定，而使其它蛋白质不稳定。
聚山梨酸酯容易氧化降解，并在供应时，经常含有足够量的过氧化物，从而引起蛋白质残基侧链的氧化，尤其是甲硫氨酸。因此，聚山梨酸酯应该小心地使用，并在使用时，应该以其最低有效浓度使用。在这方面，聚山梨酸酯示范了赋形剂应该以其最低有效浓度使用的一般规则。
ST2抗原结合蛋白制剂的实施方案进一步包含一种或多种抗氧化剂。在某种程度上，可以通过维持周围氧和温度的适当水平，并通过避免暴露于光来防止药物制剂中蛋白质的有害氧化。也可以使用抗氧化赋形剂来防止蛋白质的氧化降解。在这方面适用的抗氧化剂是还原剂、氧/自由基清除剂和螯合剂。用于根据本发明的治疗性蛋白质制剂中的抗氧化剂优选地是水溶性的，并在产品的保存期内维持其活性。根据本发明在这方面EDTA是优选的抗氧化剂。
抗氧化剂可能损害蛋白质。举例来说，尤其诸如谷胱甘肽的还原剂可能破坏分子内的二硫键。因此，用于本发明的抗氧化剂经过选择，以尤其消除或足够地降低其自身损害制剂中的蛋白质的可能性。
根据本发明的制剂可以包括金属离子，这些金属离子是蛋白质辅因子且是形成蛋白质配位络合物所必需的，例如形成某些胰岛素悬浮液所必需的锌。金属离子还可以抑制一些降解蛋白质的过程。然而，金属离子还催化降解蛋白质的物理和化学过程。
镁离子(10-120mM)可以用于抑制天冬氨酸到异天冬氨酸的异构化。Ca+2离子(高达100mM)可以增加人脱氧核糖核酸酶的稳定性。然而，Mg+2、Mn+2和Zn+2可以使rhDNase不稳定。类似地，Ca+2和Sr+2可以使凝血因子VIII稳定，而Mg+2、Mn+2和Zn+2、Cu+2和Fe+2使其不稳定，且其聚集可以通过Al+3离子增加。
ST2抗原结合蛋白制剂的实施方案进一步包含一种或多种防腐剂。当形成包含从同一容器提取一次以上的多剂量肠胃外制剂时需要防腐剂。其主要功能是在药品存放期或使用期限内抑制微生物生长和确保产品无菌。常用防腐剂包括苯甲醇、苯酚和间甲酚。虽然防腐剂具有悠久的小分子肠胃外药品使用史，但包括防腐剂的蛋白质制剂的发展一直存在挑战。防腐剂通常对蛋白质具有失稳作用(聚集)，且这成为限制其用于多剂量蛋白质制剂的主要因素。迄今为止，大部份蛋白质药物配制用于仅单次使用。然而，当多剂量制剂是可能的时候，其具有方便患者和增加可销售性的额外优点。一个很好的实例是人生长激素(hGH)，其中防腐制剂的发展已经使得更方便的多用途注射笔形式商业化。目前至少四种含有hGH防腐制剂的此类笔装置在销售。Norditropin(液体，Novo Nordisk)、Nutropin AQ(液体，Genentech)和Genotropin(冻干--双室笔筒，Pharmacia & Upjohn)含有苯酚，而Somatrope(Eli Lilly)用间甲酚配制。
在配制和发展防腐剂型期间需要考虑若干方面。药品中有效的防腐剂浓度必须最佳化。此需要在赋予抗微生物有效性而不损害蛋白质稳定性的浓度范围下测试剂型中的给定防腐剂。
正如所料，含有防腐剂的液体制剂的发展比冻干制剂更具挑战。冷冻干燥的产物可以在无防腐剂下冻干并在使用时用含有防腐剂的稀释剂复原。此缩短了防腐剂与蛋白质接触的时间，显著地将相关的稳定性风险降到最低。在液体制剂下，防腐剂有效性和稳定性应该在整个产品存放期(约18到24个月)内维持。一个重要的注意点是，应该在含有活性药物和所有赋形剂组分的最终制剂中证明防腐剂的有效性。
ST2抗原结合蛋白制剂一般将尤其针对特定的给药途径和方法、针对特定的给予剂量和给药频率、针对特定疾病的特定治疗，在一系列生物可利用度和持久性等下来设计。因此制剂可以根据本发明针对通过任何适合途径的递送，包括(但不限于)经口、经耳、经眼、经直肠和经阴道以及通过肠胃外途径，包括静脉内和动脉内注射、肌肉内注射和皮下注射来设计。
一旦药物组合物已经配制，它就可以呈溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或呈脱水或冻干粉末形式储存在无菌的小瓶中。此类制剂可以呈即用形式或者呈在给予前复原的形式(例如冻干)储存。本发明还提供了用于产生单剂量给予单元的试剂盒。本发明的试剂盒可以各自含有具有干燥蛋白质的第一容器和具有水性制剂的第二容器。在本发明的某些实施方案中，提供了含有单室和多室预先填充的注射器(例如液体注射器和药粉注射器(lyosyringe))的试剂盒。
有待采用的含有ST2抗原结合蛋白的药物组合物的治疗有效量将例如取决于治疗背景和目的。本领域技术人员将了解，适当的治疗剂量水平将部分地取决于递送的分子、ST2抗原结合蛋白正应用的适应证、给药途径和患者的体型(体重、体表或器官大小)和/或条件(年龄和整体健康)。在某些实施方案中，临床医师可以滴定剂量并修改给药途径以获得最佳治疗效果。典型的剂量可以在约0.1μg/kg到多达约30mg/kg或更大的范围内，取决于如上所述的因素。在特定实施方案中，剂量可以在1.0μg/kg到多达约20mg/kg、任选地10μg/kg到多达约10mg/kg，或100μg/kg到多达约5mg/kg的范围内。
治疗有效量的ST2抗原结合蛋白优选地使疾病症状的严重程度降低，无疾病症状时期的频率或持续时间增加，或预防因患病而引起的损伤或残疾。
药物组合物可以使用医学装置给予。用于给予药物组合物的医学装置的实例描述于美国专利No.4,475,196、4,439,196、4,447,224、4,447,233、4,486,194、4,487,603、4,596,556、4,790,824、4,941,880、5,064,413、5,312,335、5,312,335、5,383,851和5,399,163中，这些专利都以引用的方式并入本文中。
诊断或治疗ST2相关的疾病或病症的方法
本发明的ST2抗原结合蛋白尤其可用于检测生物样品中的ST2。在某些实施方案中，将从患者中获得的生物样品与ST2抗原结合蛋白接触。接着检测ST2抗原结合蛋白与ST2的结合，以确定样品中ST2的存在或相对量。此类方法适用于诊断或确定可以用ST2抗原结合蛋白治疗的患者。
在某些实施方案中，本发明的ST2抗原结合蛋白用以诊断、检测或治疗自体免疫或炎性病症。在治疗自体免疫或炎性病症时，ST2抗原结合蛋白可以靶向免疫系统的表达ST2的细胞，以破坏和/或可以阻断ST2与IL-33的相互作用。
与IL-33介导的信号转导相关的病症尤其可以用一种或多种本文公开的ST2抗原结合蛋白治疗。此类病症包括(但不限于)：炎症、自体免疫疾病、副肿瘤性自体免疫疾病、软骨炎症、纤维化疾病和/或骨蚀、关节炎、类风湿性关节炎、幼年型关节炎、幼年型类风湿性关节炎、少关节性幼年型类风湿性关节炎、多关节性幼年型类风湿性关节炎、全身性发作型幼年型类风湿性关节炎、幼年型强直性脊柱炎、幼年型肠源性关节炎、幼年型反应性关节炎、幼年型莱特氏综合征(juvenile Reter's Syndrome)、SEA综合征(血清阴性、肌腱端病、关节病综合征)、幼年型皮肌炎、幼年型牛皮癣性关节炎、幼年型硬皮病、幼年型全身性红斑狼疮、幼年型血管炎、少关节性类风湿性关节炎、多关节性类风湿性关节炎、全身性发作型类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、肠源性关节炎、反应性关节炎、莱特氏综合征、SEA综合征(血清阴性、肌腱端病、关节病综合征)、皮肌炎、牛皮癣性关节炎、硬皮病、全身性红斑狼疮、血管炎、肌炎、多发性肌炎、皮肌炎(dermatomyolitis)、结节性多动脉炎、韦格纳氏肉芽肿、动脉炎、风湿性多肌痛、结节病、硬皮病、硬化症、原发性胆汁硬化症、硬化性胆管炎、修格连氏综合征(Sjogren's syndrome)、牛皮癣、斑块性牛皮癣、滴状牛皮癣、反转型牛皮癣、脓疱性牛皮癣、红皮病型牛皮癣、皮炎、异位性皮炎、动脉粥样硬化、狼疮、斯替尔氏病(Still'sdisease)、全身性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎、乳糜泻、多发性硬化症(MS)、哮喘、COPD、鼻窦炎、具有息肉的鼻窦炎、嗜酸性粒细胞性食道炎、嗜酸粒细胞性支气管炎、古力安-巴利病(Guillain-Barredisease)、I型糖尿病、甲状腺炎(例如格雷夫氏病(Graves'disease))、阿狄森氏病(Addison's disease)、雷诺氏现象(Raynaud's phenomenon)、自体免疫肝炎、GVHD、移植排斥反应、肾损害等等。
在优选的实施方案中，自体免疫或炎性病症是哮喘、异位性皮炎、慢性阻塞性肺病、肺纤维化、败血症和外伤、HIV感染、全身性红斑狼疮、炎性肠病、类风湿性关节炎、硬化症、韦格纳氏肉芽肿、贝赛特氏病、心血管疾病、鼻窦炎、鼻息肉和嗜酸粒细胞性支气管炎。
在某些实施方案中，本发明的ST2抗原结合蛋白用以诊断、检测或治疗癌症或致瘤病症。在治疗癌症或致瘤病症时，ST2抗原结合蛋白可以靶向表达ST2的细胞，以破坏和/或可以阻断ST2与IL-33的相互作用，由此减少IL-33介导的信号转导。举例来说，高可溶性ST2表达与乳癌患者中存活提高有关。(Prechtel等人,Lab Invest(2001)81:159-165)。因为可溶性ST2结合并阻断IL-33介导的信号转导，所以预期阻断IL-33介导的信号转导的ST2抗原结合蛋白将适用于促进乳癌患者中存活提高。可以用ST2抗原结合蛋白诊断、检测或治疗的癌症或致瘤病症包括(但不限于)：实体肿瘤，一般是肺癌、卵巢癌、乳癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肾癌、食道癌、胰腺癌、鳞状细胞癌、葡萄膜黑色素瘤、子宫颈癌、结肠直肠癌、膀胱癌、脑癌、胰腺癌、头部癌、颈部癌、肝癌、白血病、淋巴瘤和霍金氏病(Hodgkin’sdisease)、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、胃癌、星形细胞癌、胃腺癌和肺腺癌。
抗原结合蛋白可以用于抑制肿瘤生长、进展和/或转移。此类抑制可以使用各种方法监测。举例来说，抑制可以减小肿瘤大小和/或降低肿瘤内的代谢活性。这两个参数都可以通过例如MRI或PET扫描测量。抑制还可以通过活检监测以确定坏死水平、肿瘤细胞死亡和肿瘤内血管供应水平。转移程度可以使用已知的方法监测。
实施例
以下实际和预示性实施例是为了说明本发明的特定实施方案或特征的目的而提供，而无意限制其范畴。
实施例1：ST2抗体在哮喘动物模型中是有效的
此实施例证明了给予结合ST2并抑制IL-33介导的信号转导的抗体在炎性疾病(即哮喘)的动物模型中是有效的。中和性小鼠ST2 mAb(ST2替代mAb)在体内抑制外部给予的IL-33的活性。在静脉内注射100ug抗ST2 mAb两小时后，向小鼠经鼻内给予200ng重组小鼠IL-33。第二天，通过ELISA测量支气管肺泡灌洗液(BALF)IL-5浓度。基线IL-5浓度是在生理盐水激发前从用生理盐水处理的小鼠的BALF中获得的。最大BALF IL-5浓度是从用IL-33激发的同型对照Ig处理的小鼠中获得的。与同型对照Ig处理相比，ST2 mAb处理显著地抑制BALB/c和C57BL/6小鼠株系的BALF中IL-33诱导的IL-5(图1)。
ST2替代mAb在蟑螂过敏原(CRA)诱发的哮喘模型中是有效的，其中与同型对照Ig处理的小鼠相比，经ST2抗体处理的小鼠具有显著更少的BALF嗜酸性粒细胞。在第1、3、6、8、10和13天用100μg CRA激发BALB/c小鼠。在第0、7和13天，向小鼠注射250μg抗ST2 mAb或者同型对照Ig，其中在最终鼻内CRA激发前进行第13天的抗体注射。在第14天，将小鼠麻醉并经受洗肺。计数BALF细胞群体，且用抗ST2 mAb处理导致存在显著较少的总BALF细胞，其中嗜酸性粒细胞包含显著受影响的细胞群体(图2)。
实施例2：使用 平台产生抗ST2抗体
针对人ST2的完全人抗体的产生使用技术进行(美国专利No.6,114,598、6,162,963、6,833,268、7,049,426、7,064,244，其以引用的方式整体并入本文中；Green等人,1994,Nature Genetics7:13-21；Mendez等人,1997,Nature Genetics 15:146-156；Green和Jakobovitis,1998,J.Ex.Med.188:483-495；Kellermann和Green,2002,Current Opinion in Biotechnology,13:593-597)。
用包含与人抗体Fc结构域融合的人ST2的细胞外结构域的多肽或用与人IL-33复合的人ST2-Fc融合蛋白对XMG2K、XMG4K和XMG4KL动物进行免疫接种。根据1996年12月3日提交的美国专利申请序列号08/759,620和1998年6月11日公布的国际专利申请No.WO 98/24893和2000年12月21日公布的WO00/76310(公开内容以引用的方式并入本文中)中公开的方法，适合量的免疫原(即每只小鼠10μg可溶性ST2)用于动物的初始免疫接种。初始免疫接种后，按照时程和在需要诱导抗ST2抗体在小鼠中适合滴度的持续时间内给予免疫原的后续加强免疫接种(每只小鼠5μg可溶性ST2或ST2/IL33复合物)。滴度通过适合的方法，例如ELISA，或者通过荧光活化的细胞分选术(FACs)测定。
鉴别显示出适合滴度的动物，并从引流淋巴结中获得淋巴细胞并在必要时汇集各细胞群。通过在适合的培养基(例如达贝克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)；DMEM；可从Invitrogen,Carlsbad,CA获得)中研磨将淋巴细胞与淋巴组织分离，以将细胞从组织释放，并悬浮在DMEM中。选择B细胞和/或使用适合的方法扩展，并使用本领域中已知的技术与例如非分泌性骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞(美国典型菌种保藏中心CRL 1580；Kearney等人J.Immunol.123,1979,1548-1550)等适合的融合伴侣融合。
在一种融合方法中，将淋巴细胞与融合伴侣细胞以1:4的比率混合。通过在400×g下离心4分钟将细胞混合物轻轻粒化，倾析上清液，并轻轻混合细胞混合物(例如通过使用1mL吸移管)。用PEG/DMSO(聚乙二醇/二甲亚砜；可从Sigma-Aldrich,St.Louis MO获得；每一百万淋巴细胞1mL)诱导融合。在轻轻搅动下经一分钟缓慢添加PEG/DMSO，接着混合一分钟。接着在轻轻搅动下经2分钟添加IDMEM(没有谷氨酰胺的DMEM；每一百万B细胞2mL)，接着经3分钟添加额外的IDMEM(每一百万B细胞8mL)。
将融合细胞轻轻粒化(400×g6分钟)并再悬浮于每一百万B细胞20mL选择培养基(含有重氮丝氨酸和次黄嘌呤[HA]和其它根据需要补充的物质的DMEM)中。细胞在37℃下培育20-30分钟并接着再悬浮在200mL选择培养基中，且在T175烧瓶中培养3-4天，接着进行96孔涂铺。
使用标准技术将细胞分配到96孔板中，以最大化所得集落的克隆性。在培养若干天后，收集上清液并进行筛选分析。从用ST2-Fc/IL33复合物免疫接种的小鼠产生的杂交瘤上清液用基于ELISA的分析来筛选，此项分析是使用96孔聚苯乙烯ELISA板进行，所述板在4℃下用与人IL-33复合的0.5ug/mL ST2-Flag/his被动包被过夜。为了确定ST-2特异性结合，使用96孔聚苯乙烯板进行第二次ELISA筛选，所述板在4℃下用10ug/mL中性抗生物素蛋白被动包被过夜。接着洗涤板并负载0.5μg/mL生物素标记的人IL33。此ELISA筛选鉴别出超过1200种抗ST2特异性结合剂。
利用荧光微体积分析技术(FMAT)，通过针对用全长人ST2短暂转染的重组HEK293T细胞筛选并针对假转染的HEK293T细胞反向筛选，针对ST2抗原特异性抗体来筛选从用可溶性ST2-Fc免疫接种的小鼠产生的杂交瘤上清液。简单地说，将细胞于40微升/孔的体积中以每孔6,000个ST2阳性细胞和每孔14,000个假转染的ST2阴性细胞的密度接种到384孔FMAT板中。接着添加杂交瘤上清液并允许在室温下结合1小时，接着使用抗人Fc-Cy5二次抗体进行洗涤和第二次检测。此FMAT筛选从由用ST2的细胞外结构域免疫接种的小鼠产生的杂交瘤中鉴别出超过2200种抗ST2特异性结合剂。
接着使用干扰素-γ细胞因子释放分析，针对功能性拮抗ST2信号转导的能力，进一步表征3400种抗ST2特异性杂交瘤上清液的此组合群体。简单地说，将纯化的人外周血单核细胞(PBMNC)或纯化的人NK细胞接种到96孔组织培养板中，并用人IL-33和IL-12刺激，诱导干扰素-γ释放到上清液中。定量上清液中干扰素-γ水平，并直接与Il-33/ST2依赖性信号转导相关联。使用此生物分析，测试杂交瘤样品通过阻断ST2信号转导通路来阻断干扰素-γ释放的能力。此筛选鉴别出从ST2-Fc免疫接种产生的578种杂交瘤上清液，其抑制干扰素-γ释放超过80％。另外，鉴别出从ST2Fc/IL-33复合物免疫接种产生的505种杂交瘤上清液，其抑制干扰素-γ释放超过70％。
接着针对与小鼠和食蟹猴ST2的交叉反应性结合，通过限制性抗原ELISA针对相对亲和力等级，通过ELISA针对生物化学受体/配体阻断，以及通过FACs使用细胞系针对内源性结合，进一步表征此组1083种杂交瘤上清液。在这些二次分析中产生的数据用以将大的组多样化成2组40种杂交瘤细胞系，进一步将其进行亚克隆、按比例扩大和纯化。
实施例3：K D 测定
在此实施例中，确定ST2结合抗体的亲和力。使用装备有GLC传感器芯片(Bio-Rad)的Proteon XPR-36光生物传感器进行表面等离子体共振评估。在25℃下在HBS-EP+(1X)缓冲系统(10mM HEPESpH7.4、150mM NaCl、3.0mM EDTA、0.05％表面活性剂P20，GEHeathcare)中进行生物传感器分析。所有试剂在注射前都保持在8℃下。
在垂直方向上经由与泳道1-6(约4000RU)的标准胺偶合，将山羊抗人IgG(Fc片段特异性，Jackson ImmunoResearch)固定到传感器表面，并接着用乙醇胺阻断。在垂直方向上抗体被捕捉(约40-100RU)到泳道1-5。留下垂直的泳道6空白，并用于参考目的。在15个抗体的群组(三组各组5个)中收集数据。
ST2试剂(人或食蟹猴)用运行缓冲液制备成25nM的浓度，并接着3倍稀释到309pM。沿着水平方向的单次注射递送每种ST2分子的完整浓度系列，使用缓冲液完成一行6个样品并提供线内空白，用于反应数据的双重参考。缔合(3分钟)和解离(30分钟)速率在100uL/min的流动速率下监测。
在100uL/min的流动速率下，用10mM甘氨酸(pH1.5，30uL)再生所述表面。
数据经过基线校正、切尾、对比、减去参考值(点间)，并接着使用ProteOn Manager(2.1.2.05版)拟合1:1结合模型。结果展示于表4中。
表4
使用略微修改的等离子体共振方案测定另外的抗体的亲和力。在25℃下使用装备有CM5传感器芯片的Biacore 3000仪器(BiacoreInternational AB,Uppsala,Sweden)对抗体Ab1、Ab2、Ab3和Ab4进行表面等离子体共振评估。使用标准胺偶合化学，以HBS-EP(10mMHEPES pH7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，GE Heathcare)作为运行缓冲液，将抗Fcγ特异性捕捉抗体共价固定于CM4芯片上的两个流动池。简单地说，每个流动池都用0.1M NHS与0.4M EDC的1:1(v/v)混合物活化。于10mM乙酸钠(pH5.0)中将30ug/ml的AffiniPure山羊抗人IgG Fcγ片段特异性抗体(JacksonImmunoResearch Inc.West Grove,PA)以3,000RU的目标水平固定在两个流动池上。残余反应表面用1M乙醇胺的注射液去活化。接着对于所有剩余的步骤，运行缓冲剂换成HBS-EP+0.1mg/ml BSA。
所有抗体都在运行缓冲液中一式三份制备并3倍稀释，并注射以便以10μl/min在测试流动池上注射3分钟引起抗体的约75-90个反应单元被捕捉在测试流动池表面上。无抗体被捕捉在对照流动池表面上。接着各种浓度(200nM-0.0914nM)的人或食蟹猴ST2与空白缓冲液一道流过两个流动池。使用50ul/min的流动速率，并进行两分钟缔合期，接着是4分钟的解离期。每个循环后，用10mM甘氨酸pH1.5的50uL注射液使所述表面再生。接着新制抗体被捕捉在测试流动池上，以准备用于下一个循环。在200nM浓度下一式三份进行分开的长解离实验(60分钟)。
数据通过减去对照表面反应以去除整体折射率改变，并接着减去平均的缓冲液空白反应以从实验流动池去除系统人为因素，进行双重参考。在BIA评估软件4.1版中，使用局部Rmax，将ST2数据进行加工并整体拟合1:1相互作用模型。(Biacore International AB,Uppsala,Sweden)。确定缔合(ka)和解离(kd)速率常数，并用于计算解离平衡常数(KD)。Ab1、Ab2、Ab3和Ab4的解离速率常数和解离平衡常数概述于表5中。
表5
抗体 ST2 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(pM)
Ab1 人 1.43E+06 1.11E-04 77.7
Ab1 食蟹猴 1.69E+06 1.97E-04 117
Ab2 人 3.33E+05 1.13E-05 33.9
Ab2 食蟹猴 3.60E+05 1.16E-05 32.2
Ab3 人 4.00E+05 9.50E-05 238
Ab3 食蟹猴 6.74E+05 8.55E-05 127
Ab4 人 2.35E+06 7.06E-04 301
Ab4 食蟹猴 2.50E+06 1.29E-03 516
实施例4：抗体的pH值敏感性结合
在低pH值下以降低亲和力结合于其靶标的治疗抗体可以具有增强的PK特性，此将允许它们以较低频率或以较低剂量递送(Nat  Biotechnol.2010 28(11)：1203-7 T.Igawa等人Antibody recycling byengineered pH-dependent antigen binding improves the duration ofantigen neutralization)。此归因于抗体在溶酶体的低pH值下释放靶标，接着随后靶标降解和抗体再循环。
抗体Ab1、Ab2、Ab3和Ab4的pH值敏感性结合的生物传感器分析是在Biacore 4000上进行。设置类似于实施例3，其中进行这些抗体的KD测量，除了针对重复注射2.46nM单个浓度的α-ST2抗体来拟合数据。在30uL/min的流动速率下监测pH7.4下的缔合(5分钟)速率以及pH5.5和7.4下的解离(10分钟)速率。将减去参考的数据用来拟合Scrubber中的1∶1模型。若干种抗体显示在降低pH值下解离速率显著更快，如表6中所示。
表6
实施例5：抗体交叉竞争
一种常用于表征抗原决定基的方式是通过竞争实验。彼此竞争的抗体可以看作是结合靶标上相同的位点。本实施例描述了一种确定竞争结合ST2的方法和所述方法在应用于本文中描述的许多抗体时的结果。
分箱实验可以用许多方式进行，且使用的方法可能对分析结果产生影响。这些方法通用的是ST2通常被一种参考抗体结合并被另一种抗体探测。如果参考抗体阻止探针抗体的结合，那么就说所述抗体在相同的箱中。采用抗体的次序是重要的。如果抗体A用作参考抗体并阻断抗体B的结合，那么反过来不总是对的：用作参考抗体的抗体B将不一定阻断抗体A。这里有许多因素在起作用：抗体的结合可能引起靶标的构象变化，此阻止第二抗体的结合，或重叠但彼此不完全咬合的抗原决定基可能允许第二抗体仍然具有足够高的亲和力与靶标相互作用，从而允许结合。一般说来，如果以任一种次序都观测到竞争，那么就说所述抗体分箱在一起，且如果两种抗体可以彼此阻断，那么可能抗原决定基更完全地重叠。
对于本实施例，使用Jia等人(J.Immunological Methods,288(2004)91-98)描述的多路分箱方法的修改。使用可溶性ST2-FLAGHis。将包被链霉亲和素的Luminex珠粒(Luminex，#L100-L1XX-01，XX说明珠粒编码)的每个珠粒编码，在100ul 6皮克/珠粒生物素标记的单价小鼠抗人IgG捕捉抗体(BD Pharmingen,#555785)中于室温下黑暗中培育1小时，接着用PBSA、磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)加1％牛血清白蛋白(BSA)洗涤3次。每个珠粒编码分别与100ul抗ST2抗体(包被的抗体)1:10稀释液一起培育1小时，接着洗涤。汇集珠粒，接着分配到96孔滤板(Millipore,#MSBVN1250)。将100ul的2ug/ml ST2添加到一半孔中，并添加缓冲液到另一半孔中，且培育1小时，接着洗涤。100ul抗ST2抗体(检测抗体)1:10稀释液添加到具有ST2的一个孔和没有ST2的一个孔中，培育1小时，接着洗涤。不相关的人-IgG(Jackson,#009-000-003)以及无抗体条件(空白)作为阴性对照来操作。20ul PE结合的单价小鼠抗人IgG(BDPharmingen,#555787)添加到每一孔中，并培育1小时，接着洗涤。珠粒再悬浮于75ul PBSA中，并在BioPlex仪器(BioRad)上收集至少100个事件/珠粒编码。
将没有ST2的抗体对的中值荧光强度(MFI)从含有ST2的相应反应的信号中减去。对于被视为同时结合的抗体对，且因此在不同的箱中，反应值必须符合两个标准：1)所述值必须是与本身配对的包被抗体、不相关或空白(最高者)的2倍；和2)所述值必须超过在不相关或空白的包被珠粒下存在的检测抗体的信号。找到最少3个箱，如以下表7中所示。
表7
实施例6：IL-33阻断分析
ST2抗体的作用机制使用两个AlphaScreen探测。组合之下，所述分析用以确定抗体是否可以抑制IL-33与ST2的缔合，或相比之下，抗体是否可以特异性地阻断共受体ST2与AcP的缔合，同时仍允许IL-33与ST2缔合。AlphaScreen是扩增发光接近同源分析筛选的缩写。
在第一次筛选中，评估抗体阻断IL-33与ST2之间的缔合的能力。本分析测量抗ST2抗体阻断生物素标记的人IL-33(与链霉亲和素供体珠粒偶合)与6x组氨酸作标签的人ST2(与Ni-螯合物受体珠粒偶合)缔合的能力。IL-33/ST2 AlphaScreen是使用40ul反应物在96孔半区域板(Perkin Elmer)中进行。用于两个AlphaScreen的分析缓冲液都含有40mM HEPES(pH＝7.4)、1mM CaCl2、0.1％BSA、0.05％Tween-20和100mM NaCl。每个分析孔都含有0.3nM生物素标记的人IL-33、0.3nM人ST2-FH(FH代表FLAG和6x组氨酸标签)、10ug/ml链霉亲和素包被的供体珠粒(Perkin Elmer,Waltham,MA)、10ug/ml Ni-螯合物包被的受体珠粒(Perkin Elmer)和12.5ug/ml抗ST2Ab。添加所有分析组分后，所述板在室温下黑暗中培育过夜。第二天，在2103 Envision多标记读出器(Perkin Elmer)上读取板。在680nm下激光激发供体珠粒以产生活性氧，其可以因珠粒偶合蛋白质的相互作用而引发紧密接近的受体珠粒中的发光/荧光级联，导致发光，在570nm下检测所述发光。
在第二次分析中，评估抗体抑制IL-33介导的ST2与共受体AcP缔合的能力。本分析测量抗ST2抗体阻断IL-33介导的生物素标记的人ST2-Fc(与链霉亲和素供体珠粒偶合)与6x组氨酸作标签的人AcP(与Ni-螯合物受体珠粒偶合)缔合的能力。ST2/AcP AlphaScreen是在8ul反应物中在384孔optiplate(Perkin Elmer)中进行。每个分析孔都含有5nM人IL-33、5nM生物素标记的人ST2-Fc、5nM人AcP-FH、10ug/ml链霉亲和素包被的供体珠粒、10ug/ml Ni-螯合物包被的受体珠粒和12.5ug/ml抗ST2 Ab。添加所有分析组分后，所述板在室温下黑暗中培育过夜。第二天，在2103 Envision多标记读出器(Perkin Elmer)上，使用与以上第一分析相同的参数读取板。
两个AlphaScreen的结果呈现于以下表8中。将每一抗体的抑制呈现为，相对于分析中没有抗体包括在分析孔中时的信号，使用12.5ug/ml浓度的给定抗体在AlphaScreen中的信号抑制百分比。一些抗体抑制ST2与IL-33相互作用比其抑制ST2/IL-33/AcP相互作用更完全，且一些抗体抑制ST2/IL-33/AcP相互作用比抑制ST2与IL-33相互作用更完全。所有抗体都抑制IL-33与ST2的相互作用至少50％。
表8
实施例7：体外人IL-33生物分析
在一项人生物分析中测试例示性ST2人mAb，此项生物分析利用从各种经人IL-33和人IL-2刺激的供体中获得的纯化的CD4+T细胞。分析程序如下。细胞于60ul体积中以每孔250,000个细胞接种于96孔圆底板中。预培育后，添加30ul huIL-2+huIL-33的4x混合物到每一孔中。96孔圆底板中的总体积是120ul。抗体以20ug/ml开始，并进行1:3稀释以产生10点曲线。在30ul中制成4x。抗体与细胞一起预培育后，添加30ul huIL-2+huIL-33的4x混合物到每一孔中。37℃、5％CO2下48小时。收获上清液。通过huIL-5 ELISA分析IL-5的抑制。
图3展示ST2 mAb抑制来自各种供体的CD4+T细胞中人IL-33诱导的IL-5产生。(—)线描绘人IL-33与人IL-2组合的阳性对照值，没有抑制。(++++)描绘人IL-2的阳性对照值。(--)线描绘培养基对照值。人CD4+T细胞与抗ST2 mAb一起预培育30分钟，并接着用人IL-33(4ng/ml)和人IL-2(10ng/ml)刺激48小时。图3展示如通过CD4+T细胞中IL-5产生所确定，ST2抗体能够抑制人IL-33诱导的ST2活化。ST2抗体能够拮抗CD4+T细胞中IL-33诱导的IL-5产生，IC50近乎<100nM。表9展示代表性的IC50值。
表9
实施例8：食蟹猴CD4+T细胞IFNγ释放分析
通过ISOLYMPH(Gallard-Schlesinger Industries,Plainview,NY)梯度离心，从酸式柠檬酸盐右旋糖(ACD)处理的正常供体外周血中富集食蟹猴外周血单核细胞(PBMC)。随后使用Miltenyi Biotec的食蟹猴CD4+T细胞分离试剂盒分离食蟹猴CD4+T细胞。分离的食蟹猴CD4+T细胞(96孔板中2×105个细胞/孔)与各种浓度的纯化的单克隆抗体在室温下一起培育30分钟，并接着用IL-33(10ng/mL)、IL-2(10ng/mL)和IL-12p70(50ng/mL)刺激84小时。接着通过ELISA，针对食蟹猴IFNγ的存在，分析所得无细胞的食蟹猴CD4+T细胞培养上清液(实施例数据提供于表10中)。在来自3个分别的供体的食蟹猴CD4+T细胞IFNγ释放分析中确定纯化的单克隆抗体的效力。
表10
IC-50值 pM
Ab1 15.82
Ab2 79.5
Ab3 15.15
Ab4 4.03
Ab5 12.9
Ab6 47.1
Ab7 40.01
Ab8 158.07
实施例9：人嗜酸性粒细胞IL-8释放分析
通过ISOLYMPH(Gallard-Schlesinger Industries，Plainview，NY)梯度离心，将人红血球和粒细胞从肝素化的正常供体外周血富集。使用ACK细胞溶解缓冲液(Gibco，Carlsbad，CA)去除红血球。随后使用Miltenyi Biotec的嗜酸性粒细胞分离试剂盒分离嗜酸性粒细胞。分离的嗜酸性粒细胞(96孔板中2×105个细胞/孔)与若干次稀释下的未克隆或克隆的上清液或各种浓度的纯化的单克隆抗体在室温下一起培育30分钟，并接着用IL-33(2ng/mL)和IL-3(100ng/mL)刺激3天。接着通过ELISA，针对IL-8的存在，分析所得无细胞的嗜酸性粒细胞培养上清液。实施例数据展示于表11中。在来自3个分别的供体的嗜酸性粒细胞IL-8释放分析中确定纯化的单克隆抗体的效力。
表11
实施例10：与市售抗体相比的抗ST2抗体的效力
人IL-33在人NK细胞分析中的剂量反应
将初级CD56阳性人NK细胞(5×10e4个细胞)用人IL-12(1ng/mL)加递增量的人IL-33处理，如图4中所示。22小时后，收集无细胞的上清液并使用商业分析(R & D Systems)测量IFN-γ浓度。10ng/mL IL-33用作ST2抗体抑制的刺激剂量。
IL-33活性的抗体抑制
如上所述，刺激人NK细胞。在IL-33和IL-12添加前30分钟，ST2抗体以如图5中指示的浓度添加到细胞中。IL-33处理后22小时，收集无细胞的上清液并使用商业分析(R & D Systems)测量IFN-γ浓度。克隆名称针对市售抗体来指示。仅仅Ab2完全地抑制IL-33依赖性IFN-γ反应，且其比任何市售huST2抗体显著有效。对应于每一抗体的IC50值展示于表12中。
表12
抗体 IC50(ug/ml)
2A5 约608
HB12 7.700
B4E6 约43.54
FB9 约498.4
97203 0.3851
Ab2 0.04123
实施例11：ST2的丙氨酸/精氨酸扫描诱变
本实施例基于ST2诱变对其结合靶标的能力的影响来表征ST2抗体。先前的结合数据指示，对于通过本实施例中ST2扫描诱变分析的抗体组，ST2结构域1和2主要是负责抗体结合。因而，在全长ST2情况下，设计突变位点时在结构上仅仅考虑ST2的结构域1和2(D1D2)。
ST2和IL-33复合物模型坐标是从Lingel等人，Structure(London，England：1993).Elsevier Ltd 17，1398-410中获得。在MolecularOperating Environment中计算ST2的每一残基侧链的溶剂可及性(Molecular Operating Environment(MOE)，2011.10；ChemicalComputing Group Inc.，1010 Sherbooke St.West，Suite#910，Montreal，QC，Canada，H3A 2R7，2011.)。然后将这些溶剂可及性值用于选择D1D2表面残基进行诱变，其是通过首先选择侧链暴露为至少的所有D1D2残基或总暴露为至少的甘氨酸残基。去除具有正角度的甘氨酸残基，脯氨酸残基也一样，因为此类位置上的突变具有较高的扭曲局部蛋白质结构的机率。还从选择中去除半胱氨酸残基以维持二硫键。肉眼检查后去除残基A82。此方法产生140个残基的清单用于诱变。所有残基都突变成精氨酸，除了精氨酸和赖氨酸残基突变成丙氨酸。
pTT5载体中亲本His-Avi作为标签的ST2细胞外结构域(ECD)的所有突变构建体，在24孔板中的短暂转染的293-6E悬浮细胞(NRCC)中表达。通过在pTT5载体中BiR A的共同转染实现体内生物素标记。用PBS透析上清液以去除过量的生物素。
BioPlex结合分析用以测量抗ST2抗体与ST2点突变的结合。生物素标记的突变体结合到链霉亲和素包被的珠粒(Luminex，#L100-L1XX-01，XX说明珠粒编码)的80个珠粒编码上。80个珠粒编码允许两组70个突变体总共140个突变体的多路进行。每一组包括6个亲本对照、3个不相关的蛋白质对照和1个空白。将抗体结合突变蛋白质与抗体结合亲本蛋白质相比。
100ul ST2突变体的1:7稀释液、亲本蛋白质和对照或无预先结合珠粒的蛋白质，用PBS+1％BSA洗涤5次，汇集并等分到96孔滤板(Millipore)中，接着再次洗涤。3倍稀释的100ul抗ST2抗体添加到一式三份的孔中，在室温下培育1小时并洗涤。100ul PE结合的抗人IgG Fc(Jackson，#109-116-170)的1:500稀释液，添加到每一孔中，培育0.5小时并洗涤。珠粒再悬浮于75uL中，震荡至少3分钟，并在BioPlex上读取。
在进行结合分析前，进行一项验证实验以评估“珠粒区域”到“珠粒区域”(B-B)的变化性。在所述验证实验中，所有珠粒都用相同的野生型对照蛋白结合。因此，珠粒区域之间的差异归因于纯粹B-B变化，且不与野生型与突变蛋白质之间的差异混淆。在不同的孔中，用12个复制品进行抗体滴定。
此统计分析的目的是为了评估结合曲线的估计EC50的B-B变化性。接着在曲线比较实验期间，用估计的B-B标准偏差(SD)建立野生型与突变蛋白质的EC50置信区间。
将四参数逻辑模型拟合每个珠粒区域的结合数据。所得“sumout.xls”文件用作分析的原始数据，其含有曲线质量控制(QC)结果和曲线的顶部(max)、底部(min)、希尔斜率(Hillslope)(斜率)和EC50的自然对照(xmid)的参数估计值。接着通过使用SASPROC MIXED程序拟合混合作用模型来估计每个参数的B-B变化性。仅仅具有“优良”QC状态的曲线包括在分析中。最终混合作用模型仅仅包括残余(即单个的珠粒区域)作为随机作用。每个参数的最小平方平均数(LS-平均数)也是通过混合作用模型估计。B-B SD是通过取B-B变化的平方根来计算。还计算LS-平均数+2SD与LS-平均数-2SD之间的改变倍数，其代表了群体约97.5上下的百分位数。
为了鉴别出对于每种抗体，相对于野生型对照未产生许多反应的突变体，鉴别出max(MFI)小于野生型对照max(MFI)的30％的突变体并标记为Hitmax。
比较突变体结合曲线和野生型结合曲线的EC50。统计上显著的差异鉴别为命中(hit)以用于进一步考虑。从此分析中排除具有“不拟合”或“坏拟合”标记的曲线。
在比较EC50估计值时考虑两个变化来源：来自曲线拟合的变化和珠粒-珠粒变化。野生型和突变体连接于不同的珠粒，因此其差异与珠粒-珠粒差异相混淆。曲线拟合变化通过log EC50估计值的标准误差来估计。使用野生型对照连接于每个珠粒的实验，在实验上确定珠粒-珠粒变化。将来自此实验的野生型结合曲线的EC50估计值的珠粒变化用于估计实际定位实验中的珠粒-珠粒变化。
两个EC50(呈对数标度)的比较是使用史都登氏t检验(Student’st-test)进行。T-统计量计算为Δ(EC50估计值之间的绝对差别)与Δ的标准偏差之间的比率。Δ的变化通过将以下3个组分求和来估计：非线性回归中突变体和野生型曲线的EC50的变化估计值和两次从分别的实验中估计的珠粒-珠粒变化值。珠粒-珠粒变化的两重值是归因于突变体和野生型珠粒具有相同的变化的假设。
Δ的标准偏差的自由度是使用Satterthwaite(1946)近似值计算。
单个的p值和置信区间(95％和99％)是基于每次比较的史都登氏t分布得到。
在多个野生型对照的情况下，通过挑选最类似于突变体的野生型对照，即挑选具有最大p值者，来采取保守方法。
多重性调整对于在进行大量的测试的同时控制假阳性来说是重要的。对此分析进行两种形式的多重性调整：族系误差(FWE)控制和假发现率(FDR)控制。FWE方法控制一个或多个命中非真的机率；FDR方法控制在选择的命中中假阳性的预期比例。前一方法比后一方法更保守且不如其有效。很多方法可用于两种方法，对于此分析，选择Hochberg(1988)方法用于FWE分析和Benjamini-Hochberg(1995)FDR方法用于FDR分析。针对每种抗体或者整个分析，计算两种方法的调整的p值。
通过以下标准，将突变体选择为具有作用，如果：1)所述突变体得到坏拟合或无拟合结果；2)针对hitmax标准选择突变体；3)族系误差p值小于0.01；或4)Bmax值超过亲本的200％。如果所述作用减小Bmax或增加EC50值，那么命中称为抑制剂；如果其增加Bmax或降低EC50值，那么命中称为活化剂。因为8个突变对测试抗体中>90％有作用，所以从命中清单中排除它们，它们是：K37A、R46A、D63R、V71R、G106R、K112A、N132R、Q137R和Y141R。
分析结果提供于表13和14中。
表13
表14
实施例12：氢/氘交换(HDX)分析
在本实施例中，Ab2结合ST2并确定结合对HDX的作用。
将C末端具有FLAG-标签和His-标签的可溶性ST2蛋白质(含有SEQ ID NO:1的氨基酸19-322的结构域1-3)在哺乳动物293-6E细胞中短暂地表达并用IMAC(固定化金属离子亲和色谱法)纯化，且通过制备型SEC(尺寸排阻色谱法)进一步纯化。接着使用超过滤将蛋白质浓缩到3.5mg/mL。ST2抗体Ab2在工程化的CHO-CS9细胞中表达，并先后用蛋白质A亲和色谱法和制备型SEC纯化。分析型SEC用以确定抗体:抗原0.75:1.00的摩尔比是最佳的，以确保ST2蛋白质充分地结合抗体。游离ST2蛋白质与抗原抗体复合物都储存在pH7.2的PBS缓冲液中。
HDX实验在自动化HDX系统(Zhang,Zhang等人2012)上进行。简单地说，H/D交换法是从用25μL的100mM PBS中D2O缓冲液(pH7.2)稀释5μL游离ST2蛋白质溶液(3.5mg/mL)或者ST2-抗体复合物(jST2浓度为3.5mg/mL，抗原:抗体比率为1:0.75)开始，所述缓冲液是通过在25℃下将PBS片溶解于D2O水中来制备。使每个HDX实验的交换反应培育各种标记时长(30秒、2、8、30分钟以及2、8小时)，且标记反应通过在1℃下将20μL标记溶液与80μL淬灭/变性/还原缓冲液(7.25M尿素和625mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)、0.45M甘氨酸，pH2.7)混合来淬灭。
将淬灭的溶液的40μL等分试样转移到120μL 0.4mg/mL猪胃蛋白酶(Sigma,St.Louis,MO)溶液中。立刻将消化溶液注射到1℃下样品环管中，并静置6分钟以完全消化。此外，消化物通过C18柱(3串联柱，BEH C18，2.1mm×5mm，Waters Corp.(Milford,MA))分离。在1℃下以1％-40％的5分钟ACN梯度进行HPLC分离。在数据相关的LC-MS/MS实验中，通过Orbitrap Elite质谱仪(ThermoScientific,San Jose,CA)分析LC洗脱剂。
氘标记、淬灭、蛋白水解消化和注射是在由LEAP Shells控制的LEAP HD-X PAL系统(LEAP Technologies,Carrboro,NC)上进行。
重复实验3次，并在每一个实验中重复每个时间点两次。将标准的肽混合物添加到样品中以追踪和校正逆交换的变化性。混合物含有这三种肽：血管舒缓激肽、血管紧张素I和亮氨酸脑啡肽。特别设计的四肽PPPI(由AnaSpec(Fremont,CA)合成)用作第二内标以最小化操作之间的变化性。还分析没有H/D交换的ST2蛋白质的消化作为对照。
所得数据文件用MassAnalyzer程序(Zhang,Zhang等人2012)处理。所述软件将肽从抗原消化物中鉴别出，计算每一种肽的交换速率，针对从内标获得的逆交换信息进行校正，并将数据拟合成给与每一个残基保护因素的模型。
游离ST2与抗体结合的ST2蛋白质之间的交换型态的比较揭示了两个感兴趣的区域且可能是潜在的抗原决定基。通过多个重叠肽，将ST2序列中的两个区域细化到IVRCPRQGKPSY(对应于成熟ST2的氨基酸15-26的SEQ ID NO:1氨基酸33-44)和IVRSPTF(对应于成熟ST2的氨基酸70-76的SEQ ID NO:1氨基酸88-94)。当ST2处于游离状态时，这些区域较少被保护，而在ST2结合抗体时交换速率显著降低。此外，基于图6中所示的ST2同源结构模式，这两个序列段占据蛋白质的外表面上类似的空间位置。这些结果得出如下结论：两种肽与Ab2和ST2蛋白质之间的结合有关。
实施例13：X射线结晶学
在本实施例中，Ab2的sc-dsFv片段与ST2的复合物的晶体结构提供了在相互作用界面中的特定氨基酸残基。
Ab2 sc-dsFv在BL21(DE3)星形细胞中表达。简单地说，Ab2sc-dsFv含有通过连接子(G4S)3与轻链可变域连接的重链可变域。为了进一步使分子稳定，通过对重链可变区的半胱氨酸位置44和轻链可变区的位置101进行突变将二硫键工程化到分子中。蛋白质表达为包涵体。包涵体溶解并再折叠。蛋白质在尺寸排阻柱(SEC)和离子交换MonoQ柱上进一步纯化，接着在SEC上精加工。
ST2在293S细胞中表达。蛋白质通过Ni亲和柱纯化并用EndoH脱糖基化。蛋白质在SEC上进一步纯化。
Ab2 sc-dsFv与ST2的复合物通过将Ab2 sc-dsFv和过量ST2混合来形成。复合物在SEC上纯化并浓缩到12mg/ml以进行结晶。使用沉滴蒸气扩散方法，在16℃下，蛋白复合物在32％-36％PEG400和0.1M Hepes pH7.5-8.5中结晶。
在Advanced Light Source,Lawrence Berkeley National Lab(Berkeley,CA)收集分辨率数据集。所述数据用MOSFLM(Leslie,1992)处理并通过CCP4程序组(Collaborative ComputationalProject,第4期(1994))中的SCALA换算。通过分子置换法，在程序PHASER(McCoy等人,2007)下，使用IL-1RII公布结构的D1D2结构域(pdb代码：3O4O)和Ab2 Fab结构的可变域作为搜索模型来解答出结构。结合REFMAC5(Murshudov等人,1997)和COOT(Emsley和Cowtan,2004)，进行迭代结构细化和模型建立。
利用CCP4程序包中的程序PISA、AREAMOL和NCONTACT进行界面分析。用Pymol(The PyMOL Molecular Graphics System.)制图。
ST2/Ab2 sc-dsFv复合物的晶体结构求解到的分辨率。在不对称单元中存在两对独立的ST2/Ab2 sc-dsFv复合物(图7)。每一复合物由一个ST2分子和一个Ab2 sc-dsFv片段组成。ST2分子由两个IgG样结构域(D1和D2结构域)组成。Ab2 Fv结构域利用重链和轻链的所有6个CDR环与ST2分子相互作用(图8)。对于ST2，两个环(环BC和环FG)和ST2的N末端直接与抗体相互作用。ST2与Ab2 sc-dsFv之间隐含的溶剂可及总表面积是
ST2与Ab2之间的界面高度带电。ST2在D1结构域中具有一串碱性残基(Lys和Arg)。此带正电的表面块与Ab2上通过CDR区中一串酸性残基(Asp和Glu)形成的带负电的块互补(图9)。
两种不同的方法用以界定界面残基。在第一种方法中，使用溶剂暴露差异界定界面残基。计算复合物中ST2(或Ab2 sc-dsFv)中每一残基的溶剂可及表面积，并与从复合物剥离的ST2(或Ab2 sc-dsFv)中相应残基的溶剂可及表面积相比。ST2和Ab2中差异超过10％的所有氨基酸分别在表15和表16中列出。ST2的Arg72和Tyr81的表面暴露差异小于10％。然而，对复合物结构的检查揭示，两种残基都与Ab2重链残基形成水介导的氢键，由此其包括在列表中。
表15.如通过溶剂暴露差异所界定的抗原决定基残基：ST2。残基编号对应于成熟ST2中氨基酸的位置，即氨基酸1对应于SEQ IDNO:1的氨基酸19。
表16.如通过溶剂暴露差异界定的抗体结合部位残基：Ab2
在第二种方法中，选择具有至少一个在到其搭配蛋白质的预定距离内的原子的界面残基。基于不同的距离截止值，界定两层壳。
核心壳包括距离达到的所有残基。
边界壳包括距离超过但短于的所有残基。
ST2、Ab2的重链和轻链的每层壳中氨基酸残基的完整清单分别展示于表17、18和19中。对于与其搭配蛋白质形成氢键或盐桥的残基，特定相互作用的类型在残基后的括号中表示(HB为氢键，且SB为盐桥)。
表17.通过距离截止值界定的抗原决定基残基：ST2。残基编号对应于成熟ST2中氨基酸的位置，即氨基酸1对应于SEQ ID NO:1的氨基酸19。
表18.通过距离截止值界定的抗体结合部位残基：Ab2重链。
表19.通过距离截止值界定的抗体结合部位残基：Ab2轻链。
通过溶剂暴露差异界定的抗原决定基残基与通过距离截止值界定的核心相互作用群组的残基匹配。表20列出界面内的所有氢键和盐桥对。
表20界面中的相互作用对
通过结晶学数据证实了从实施例12的HDX-MS分析中获得的ST2抗原决定基区域。在较高的分辨率结晶学数据中，来自HDX的两个抗原决定基(15-26和70-76)被确定为抗原决定基。确切地说，Arg20、Gly22、Lys23和Tyr26以及Thr75被确定为以小于的距离接近抗体。HDX抗原决定基中还涵盖被确定离抗体的距离在3.4与之间的其它残基(Pro19、Gln21、Ile70、Val71、Arg72、Ser73、Pro74和Phe76)。
总的来说，结果证实从HDX-MS和结晶学中获得的ST2抗原决定基区域是一致的。结构域1中的BC环和FG环(参见结晶学数据)是主要的相互作用位点。
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Claims (154)

1.一种分离的ST2抗原结合蛋白，其包含：
a)与SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ IDNO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ IDNO:163、SEQ ID NO:164或SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的轻链可变域；
b)与SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:145、SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的重链可变域；或
c)a)的轻链可变域和b)的重链可变域。
2.如权利要求1所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变域与SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164或SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列具有至少95％同一性。
3.如权利要求1或2所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述重链可变域与SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:145、SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列具有至少95％同一性。
4.一种分离的ST2抗原结合蛋白，其包含：
a)在SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ IDNO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ IDNO:163、SEQ ID NO:164或SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列中具有不超过10个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域；
b)在SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:145、SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列中具有不超过10个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域；或
c)a)的所述轻链可变域和b)的所述重链可变域。
5.如权利要求4所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变域在SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164或SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列中具有不超过5个氨基酸添加、缺失或取代。
6.如权利要求4或5所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述重链可变域在SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:145、SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列中具有不超过5个氨基酸添加、缺失或取代。
7.如权利要求1-6所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变域包含SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ IDNO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ IDNO:163、SEQ ID NO:164或SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列。
8.如权利要求1-7所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述重链可变域包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:145、SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列。
9.一种分离的ST2抗原结合蛋白，其包含：
轻链可变域，其包含：
a)在SEQ ID NO:106所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:117所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:128所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
b)在SEQ ID NO:107所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:118所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:129所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
c)在SEQ ID NO:108所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:119所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:130所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
d)在SEQ ID NO:109所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:120所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:131所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
e)在SEQ ID NO:110所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:121所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:132所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
f)在SEQ ID NO:111所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:122所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:133所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
g)在SEQ ID NO:112所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:123所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:134所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
h)在SEQ ID NO:113所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:124所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:135所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
i)在SEQ ID NO:114所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:125所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:136所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
j)在SEQ ID NO:115所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:126所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:137所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
k)在SEQ ID NO:116所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:127所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:138所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
l)在SEQ ID NO:166所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:169所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:172所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
m)在SEQ ID NO:167所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:170所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:173所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；或
n)在SEQ ID NO:168所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:171所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:174所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
和
重链可变域，其包含：
o)在SEQ ID NO:40所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:51所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:62所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
p)在SEQ ID NO:41所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:52所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:63所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
q)在SEQ ID NO:42所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:53所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:64所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
r)在SEQ ID NO:43所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:54所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:65所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
s)在SEQ ID NO:44所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:55所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:66所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
t)在SEQ ID NO:45所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:56所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:67所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
u)在SEQ ID NO:46所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:57所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:68所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
v)在SEQ ID NO:47所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:58所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:69所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
w)在SEQ ID NO:48所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:59所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:70所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
x)在SEQ ID NO:49所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:60所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:71所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；或
y)在SEQ ID NO:50所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:61所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:72所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
z)在SEQ ID NO:148所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:151所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:154所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
aa)在SEQ ID NO:149所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:152所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ ID NO:155所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；或
bb)在SEQ ID NO:150所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:153所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ ID NO:156所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3。
10.如权利要求9所述的ST2抗原结合蛋白，其包含a)的所述轻链可变域和o)的所述重链可变域。
11.如权利要求10所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变域包含如SEQ ID NO:106所示的LCDR1；如SEQ ID NO:117所示的LCDR2序列；和如SEQ ID NO:128所示的LCDR3序列；且所述重链可变域包含如SEQ ID NO:40所示的HCDR1；如SEQ ID NO:51所示的HCDR2序列；和如SEQ ID NO:62所示的HCDR3序列。
12.如权利要求9所述的ST2抗原结合蛋白，其包含b)的所述轻链可变域和p)的所述重链可变域。
13.如权利要求12所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变域包含如SEQ ID NO:107所示的LCDR1；如SEQ ID NO:118所示的LCDR2序列；和如SEQ ID NO:129所示的LCDR3序列；且所述重链可变域包含如SEQ ID NO:41所示的HCDR1；如SEQ ID NO:52所示的HCDR2序列；和如SEQ ID NO:63所示的HCDR3序列。
14.如权利要求9所述的ST2抗原结合蛋白，其包含c)的所述轻链可变域和q)的所述重链可变域。
15.如权利要求14所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变域包含如SEQ ID NO:108所示的LCDR1；如SEQ ID NO:119所示的LCDR2序列；和如SEQ ID NO:130所示的LCDR3序列；且所述重链可变域包含如SEQ ID NO:42所示的HCDR1；如SEQ ID NO:53所示的HCDR2序列；和如SEQ ID NO:64所示的HCDR3序列。
16.如权利要求9所述的ST2抗原结合蛋白，其包含d)的所述轻链可变域和r)的所述重链可变域。
17.如权利要求16所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变域包含如SEQ ID NO:109所示的LCDR1；如SEQ ID NO:120所示的LCDR2序列；和如SEQ ID NO:131所示的LCDR3序列；且所述重链可变域包含如SEQ ID NO:43所示的HCDR1；如SEQ ID NO:54所示的HCDR2序列；和如SEQ ID NO:65所示的HCDR3序列。
18.如权利要求9所述的ST2抗原结合蛋白，其包含e)的所述轻链可变域和s)的所述重链可变域。
19.如权利要求18所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变域包含如SEQ ID NO:110所示的LCDR1；如SEQ ID NO:121所示的LCDR2序列；和如SEQ ID NO:132所示的LCDR3序列；且所述重链可变域包含如SEQ ID NO:44所示的HCDR1；如SEQ ID NO:55所示的HCDR2序列；和如SEQ ID NO:66所示的HCDR3序列。
20.如权利要求9所述的ST2抗原结合蛋白，其包含f)的所述轻链可变域和t)的所述重链可变域。
21.如权利要求20所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变域包含如SEQ ID NO:111所示的LCDR1；如SEQ ID NO:122所示的LCDR2序列；和如SEQ ID NO:133所示的LCDR3序列；且所述重链可变域包含如SEQ ID NO:45所示的HCDR1；如SEQ ID NO:56所示的HCDR2序列；和如SEQ ID NO:67所示的HCDR3序列。
22.如权利要求9所述的ST2抗原结合蛋白，其包含g)的所述轻链可变域和u)的所述重链可变域。
23.如权利要求22所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变域包含如SEQ ID NO:112所示的LCDR1；如SEQ ID NO:123所示的LCDR2序列；和如SEQ ID NO:134所示的LCDR3序列；且所述重链可变域包含如SEQ ID NO:46所示的HCDR1；如SEQ ID NO:57所示的HCDR2序列；和如SEQ ID NO:68所示的HCDR3序列。
24.如权利要求9所述的ST2抗原结合蛋白，其包含h)的所述轻链可变域和v)的所述重链可变域。
25.如权利要求24所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变域包含如SEQ ID NO:113所示的LCDR1；如SEQ ID NO:124所示的LCDR2序列；和如SEQ ID NO:135所示的LCDR3序列；且所述重链可变域包含如SEQ ID NO:47所示的HCDR1；如SEQ ID NO:58所示的HCDR2序列；和如SEQ ID NO:69所示的HCDR3序列。
26.如权利要求9所述的ST2抗原结合蛋白，其包含i)的所述轻链可变域和w)的所述重链可变域。
27.如权利要求26所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变域包含如SEQ ID NO:114所示的LCDR1；如SEQ ID NO:125所示的LCDR2序列；和如SEQ ID NO:136所示的LCDR3序列；且所述重链可变域包含如SEQ ID NO:48所示的HCDR1；如SEQ ID NO:59所示的HCDR2序列；和如SEQ ID NO:70所示的HCDR3序列。
28.如权利要求9所述的ST2抗原结合蛋白，其包含j)的所述轻链可变域和x)的所述重链可变域。
29.如权利要求28所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变域包含如SEQ ID NO:115所示的LCDR1；如SEQ ID NO:126所示的LCDR2序列；和如SEQ ID NO:137所示的LCDR3序列；且所述重链可变域包含如SEQ ID NO:49所示的HCDR1；如SEQ ID NO:60所示的HCDR2序列；和如SEQ ID NO:71所示的HCDR3序列。
30.如权利要求9所述的ST2抗原结合蛋白，其包含k)的所述轻链可变域和y)的所述重链可变域。
31.如权利要求30所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变域包含如SEQ ID NO:116所示的LCDR1；如SEQ ID NO:127所示的LCDR2序列；和如SEQ ID NO:138所示的LCDR3序列；且所述重链可变域包含如SEQ ID NO:50所示的HCDR1；如SEQ ID NO:61所示的HCDR2序列；和如SEQ ID NO:72所示的HCDR3序列。
32.如权利要求9所述的ST2抗原结合蛋白，其包含l)的所述轻链可变域和z)的所述重链可变域。
33.如权利要求32所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变域包含如SEQ ID NO:166所示的LCDR1；如SEQ ID NO:169所示的LCDR2序列；和如SEQ ID NO:172所示的LCDR3序列；且所述重链可变域包含如SEQ ID NO:148所示的HCDR1；如SEQ ID NO:151所示的HCDR2序列；和如SEQ ID NO:154所示的HCDR3序列。
34.如权利要求9所述的ST2抗原结合蛋白，其包含m)的所述轻链可变域和aa)的所述重链可变域。
35.如权利要求34所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变域包含如SEQ ID NO:167所示的LCDR1；如SEQ ID NO:170所示的LCDR2序列；和如SEQ ID NO:173所示的LCDR3序列；且所述重链可变域包含如SEQ ID NO:149所示的HCDR1；如SEQ ID NO:152所示的HCDR2序列；和如SEQ ID NO:155所示的HCDR3序列。
36.如权利要求9所述的ST2抗原结合蛋白，其包含n)的所述轻链可变域和bb)的所述重链可变域。
37.如权利要求36所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变域包含如SEQ ID NO:168所示的LCDR1；如SEQ ID NO:171所示的LCDR2序列；和如SEQ ID NO:174所示的LCDR3序列；且所述重链可变域包含如SEQ ID NO:150所示的HCDR1；如SEQ ID NO:153所示的HCDR2序列；和如SEQ ID NO:156所示的HCDR3序列。
38.如权利要求1-37中任一项所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以小于或等于1×10-10M的亲和力特异性地结合人ST2。
39.如权利要求1-38中任一项所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白抑制人ST2与人IL-33的结合。
40.如权利要求1-39中任一项所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白减少表达人ST2的细胞中人IL-33介导的ST2信号转导。
41.如权利要求39所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白抑制食蟹猴ST2与食蟹猴IL-33的结合。
42.如权利要求41所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白减少表达食蟹猴ST2的细胞中IL-33介导的食蟹猴ST2信号转导。
43.如权利要求1-42中任一项所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是抗体。
44.如权利要求43所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述抗体是人抗体。
45.如权利要求44所述的ST2抗原结合蛋白，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含SEQ ID:84所示的氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
46.如权利要求44所述的ST2抗原结合蛋白，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含SEQ ID:85所示的氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
47.如权利要求44所述的ST2抗原结合蛋白，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含SEQ ID:86所示的氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
48.如权利要求44所述的ST2抗原结合蛋白，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含SEQ ID:87所示的氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
49.如权利要求44所述的ST2抗原结合蛋白，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含SEQ ID:88所示的氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
50.如权利要求44所述的ST2抗原结合蛋白，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含SEQ ID:89所示的氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
51.如权利要求44所述的ST2抗原结合蛋白，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含SEQ ID:90所示的氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
52.如权利要求44所述的ST2抗原结合蛋白，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含SEQ ID:91所示的氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
53.如权利要求44所述的ST2抗原结合蛋白，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含SEQ ID:92所示的氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
54.如权利要求44所述的ST2抗原结合蛋白，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含SEQ ID:93所示的氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
55.如权利要求44所述的ST2抗原结合蛋白，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含SEQ ID:94所示的氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
56.如权利要求44所述的ST2抗原结合蛋白，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含SEQ ID:160所示的氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列。
57.如权利要求44所述的ST2抗原结合蛋白，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含SEQ ID:161所示的氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列。
58.如权利要求44所述的ST2抗原结合蛋白，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含SEQ ID:162所示的氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO:144所示的氨基酸序列。
59.一种编码多肽的分离的核酸，所述多肽包含：
a)与SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ IDNO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ IDNO:163、SEQ ID NO:164或SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的轻链可变域；
b)与SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:145、SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的重链可变域；
c)在SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ IDNO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ IDNO:163、SEQ ID NO:164或SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列中具有不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域；
d)在SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:145、SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列中具有不超过5个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域；
e)轻链可变域，其包含：
i)在SEQ ID NO:106所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:117所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:128所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
ii)在SEQ ID NO:107所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:118所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:129所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
iii)在SEQ ID NO:108所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:119所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:130所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
iv)在SEQ ID NO:109所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:120所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:131所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
v)在SEQ ID NO:110所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:121所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:132所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
vi)在SEQ ID NO:111所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:122所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:133所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
vii)在SEQ ID NO:112所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:123所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:134所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
viii)在SEQ ID NO:113所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:124所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:135所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
ix)在SEQ ID NO:114所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:125所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:136所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
x)在SEQ ID NO:115所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:126所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:137所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
xi)在SEQ ID NO:116所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:127所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:138所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
xii)在SEQ ID NO:166所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:169所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:172所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
xiii)在SEQ ID NO:167所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:170所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:173所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；或
xiv)在SEQ ID NO:168所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ ID NO:171所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQID NO:174所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；或
f)重链可变域，其包含：
i)在SEQ ID NO:40所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:51所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:62所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
ii)在SEQ ID NO:41所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:52所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:63所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
iii)在SEQ ID NO:42所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:53所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:64所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
iv)在SEQ ID NO:43所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:54所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:65所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
v)在SEQ ID NO:44所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:55所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:66所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
vi)在SEQ ID NO:45所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:56所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:67所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
vii)在SEQ ID NO:46所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:57所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:68所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
viii)在SEQ ID NO:47所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:58所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:69所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
ix)在SEQ ID NO:48所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:59所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:70所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
x)在SEQ ID NO:49所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:60所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:71所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
xi)在SEQ ID NO:50所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:61所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQID NO:72所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
xii)在SEQ ID NO:148所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:151所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ ID NO:154所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
xiii)在SEQ ID NO:149所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:152所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ ID NO:155所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；或
xiv)在SEQ ID NO:150所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ ID NO:153所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ ID NO:156所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3。
60.如权利要求59所述的分离的核酸，其中所述多肽包含抗体轻链。
61.如权利要求60所述的分离的核酸，其中所述轻链由包含与SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:157、SEQ IDNO:158或SEQ ID NO:159所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列的核酸编码。
62.如权利要求61所述的分离的核酸，其中所述轻链由包含与SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:157、SEQ IDNO:158或SEQ ID NO:159所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列的核酸编码。
63.如权利要求62所述的分离的核酸，其中所述轻链由包含与SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:157、SEQ IDNO:158或SEQ ID NO:159所示的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列的核酸编码。
64.如权利要求63所述的分离的核酸，其中所述轻链由包含SEQID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:157、SEQ IDNO:158或SEQ ID NO:159所示的核苷酸序列的核酸编码。
65.如权利要求59所述的分离的核酸，其中所述多肽包含抗体重链。
66.如权利要求65所述的分离的核酸，其中所述重链由包含与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:139、SEQ IDNO:140或SEQ ID NO:141所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列的核酸编码。
67.如权利要求66所述的分离的核酸，其中所述重链由包含与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:139、SEQ IDNO:140或SEQ ID NO:141所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列的核酸编码。
68.如权利要求67所述的分离的核酸，其中所述重链由包含与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:139、SEQ IDNO:140或SEQ ID NO:141所示的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列的核酸编码。
69.如权利要求68所述的分离的核酸，其中所述重链由包含SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140或SEQID NO:141所示的核苷酸序列的核酸编码。
70.一种表达载体，其包含如权利要求59-69中任一项所述的分离的核酸。
71.如权利要求70所述的表达载体，其中所述分离的核酸编码抗体轻链。
72.如权利要求70所述的表达载体，其中所述分离的核酸编码抗体重链。
73.如权利要求71所述的表达载体，其进一步包含编码抗体重链的分离的核酸。
74.一种重组宿主细胞，其包含可操作地连接于启动子的如权利要求59-69中任一项所述的分离的核酸。
75.一种重组宿主细胞，其包含如权利要求70-73中任一项所述的表达载体。
76.如权利要求75所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含如权利要求71和72所述的表达载体。
77.如权利要求76所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞分泌结合ST2的抗体。
78.如权利要求74-77中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述细胞是哺乳动物来源的。
79.如权利要求78所述的重组宿主细胞，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
80.一种治疗自体免疫或炎性病症的方法，所述方法包括向有需要的患者给予治疗有效量的如权利要求1-58中任一项所述的ST2抗原结合蛋白。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述ST2抗原结合蛋白是抗体。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:95所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:29所示的重链可变域氨基酸序列。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:84所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO:18所示的重链氨基酸序列。
84.如权利要求81所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:96所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:30所示的重链可变域氨基酸序列。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:85所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO:19所示的重链氨基酸序列。
86.如权利要求81所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:97所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:31所示的重链可变域氨基酸序列。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:86所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO:20所示的重链氨基酸序列。
88.如权利要求81所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:98所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:32所示的重链可变域氨基酸序列。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:87所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO:21所示的重链氨基酸序列。
90.如权利要求81所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:99所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:33所示的重链可变域氨基酸序列。
91.如权利要求90所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:88所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO:22所示的重链氨基酸序列。
92.如权利要求81所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:100所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:34所示的重链可变域氨基酸序列。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:89所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO:23所示的重链氨基酸序列。
94.如权利要求81所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:101所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:35所示的重链可变域氨基酸序列。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:90所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO:24所示的重链氨基酸序列。
96.如权利要求81所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:102所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:36所示的重链可变域氨基酸序列。
97.如权利要求96所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:91所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO:25所示的重链氨基酸序列。
98.如权利要求81所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:103所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:37所示的重链可变域氨基酸序列。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:92所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO:26所示的重链氨基酸序列。
100.如权利要求81所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:104所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:38所示的重链可变域氨基酸序列。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:93所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO:27所示的重链氨基酸序列。
102.如权利要求81所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:105所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:39所示的重链可变域氨基酸序列。
103.如权利要求102所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:94所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO:28所示的重链氨基酸序列。
104.如权利要求81所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:163所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:145所示的重链可变域氨基酸序列。
105.如权利要求104所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:160所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO:142所示的重链氨基酸序列。
106.如权利要求81所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:164所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:146所示的重链可变域氨基酸序列。
107.如权利要求106所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:161所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO:143所示的重链氨基酸序列。
108.如权利要求81所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:165所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:147所示的重链可变域氨基酸序列。
109.如权利要求108所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:162所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO:144所示的重链氨基酸序列。
110.如权利要求80-109中任一项所述的方法，其中所述抗原结合蛋白抑制IL-33与ST2的结合。
111.如权利要求110所述的方法，其中所述自体免疫或炎性病症是哮喘、异位性皮炎、慢性阻塞性肺病、肺纤维化、败血症和外伤、HIV感染、全身性红斑狼疮、炎性肠病、类风湿性关节炎、硬化症、韦格纳氏肉芽肿、贝赛特氏病、心血管疾病、鼻窦炎、鼻息肉或嗜酸粒细胞性支气管炎。
112.一种制备ST2抗原结合蛋白的方法，所述方法包括：
a)培养如权利要求74-79中任一项所述的重组宿主细胞；以及
b)从所述培养物分离所述ST2抗原结合蛋白。
113.一种分离的ST2抗原结合蛋白，其中所述ST2抗原结合蛋白与以下抗体交叉竞争：
a)含有包含SEQ ID:85所示的氨基酸序列的轻链和包含SEQ IDNO:19所示的氨基酸序列的重链的抗体；或
b)含有包含SEQ ID:93所示的氨基酸序列的轻链和包含SEQ IDNO:27所示的氨基酸序列的重链的抗体。
114.如权利要求113所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述ST2结合蛋白是如权利要求1-58中任一项所述的ST2结合蛋白。
115.如权利要求113或114所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述ST2抗原结合蛋白与含有包含SEQ ID:85所示的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的重链的抗体交叉竞争。
116.一种分离的ST2抗原结合蛋白，其结合包含人ST2结构域1和结构域2的多肽(SEQ ID NO:175)，其中当单个突变被引入所述多肽的人ST2结构域1或结构域2中时结合被显著地抑制，其中所述单个突变是L14R、I15R、S33R、E43R、V47R、A62R、G65R、T79R、D92R、D97R、V104R、G138R、N152R或V176R。
117.如权利要求116所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中对于两个或两个以上所述单个突变，结合被显著地抑制。
118.如权利要求117所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中对于所有所述单个突变，结合被显著地抑制。
119.如权利要求116所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中当单个突变被引入所述多肽的人ST2结构域1或结构域2中时结合被显著地活化，其中所述单个突变是L53R、R72A或S73R。
120.如权利要求119所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中对于所述组的所有成员，结合被显著地活化。
121.如权利要求116所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中所述ST2结合蛋白与含有包含SEQ ID:85所示的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的重链的抗体交叉竞争结合人ST2。
122.如权利要求116到121中任一项所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中所述ST2结合蛋白是如权利要求1-58中任一项所述的ST2结合蛋白。
123.一种分离的ST2抗原结合蛋白，其中如通过氢/氘交换分析所确定，所述ST2抗原结合蛋白在SEQ ID NO:1的氨基酸33-44或88-94内结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸19-322的ST2。
124.如权利要求123所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中如通过氢/氘交换分析所确定，所述ST2结合蛋白在SEQ ID NO:1的氨基酸33-44和88-94内结合。
125.如权利要求124所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中所述ST2结合蛋白是如权利要求1-58中任一项所述的ST2结合蛋白。
126.一种分离的ST2抗原结合蛋白，其结合ST2而产生界面，其中由所述结合产生的所述界面包含ST2残基K1、F2、P19、R20、Q21、G22、K23、Y26、I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79或Y81。
127.如权利要求126所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中由所述结合产生的所述界面包含ST2残基P19、R20、Q21、G22、K23或Y26。
128.如权利要求127所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中由所述结合产生的所述界面包含ST2残基P19、R20、Q21、G22、K23和Y26。
129.如权利要求126所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中由所述结合产生的所述界面包含ST2残基I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79或Y81。
130.如权利要求129所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中由所述结合产生的所述界面包含ST2残基I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79和Y81。
131.如权利要求126所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中由所述结合产生的所述界面包含ST2残基P19、R20、Q21、G22、K23、Y26、I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79和Y81。
132.如权利要求131所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中由所述结合产生的所述界面包含ST2残基K1、F2、P19、R20、Q21、G22、K23、Y26、I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79和Y81。
133.如权利要求126-131中任一项所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中所述界面通过结合与未结合的ST2之间的溶剂暴露差异来确定，其中界面残基被定义为差异超过10％的氨基酸，和与所述抗体形成水介导的氢键的氨基酸。
134.如权利要求126-131中任一项所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中所述界面残基被定义为在所述抗体的内具有至少一个原子的氨基酸。
135.一种分离的ST2抗原结合蛋白，其包含：
a)与SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的轻链可变域；
b)与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的重链可变域；或
c)a)的轻链可变域和b)的重链可变域。
136.如权利要求135所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变域与SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列具有至少95％同一性。
137.如权利要求135或136所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中所述重链可变域与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列具有至少95％同一性。
138.一种分离的ST2抗原结合蛋白，其包含：
a)在SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列中具有不超过10个氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变域；
b)在SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列中具有不超过10个氨基酸添加、缺失或取代的重链可变域；或
c)a)的轻链可变域和b)的所述重链可变域。
139.如权利要求138所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变域在SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列中具有不超过5个氨基酸添加、缺失或取代。
140.如权利要求138或139所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中所述重链可变域在SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列中具有不超过5个氨基酸添加、缺失或取代。
141.一种分离的ST2抗原结合蛋白，其包含：
a)轻链可变域，其包含在SEQ ID NO:107所示的LCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；在SEQ IDNO:118所示的LCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；和在SEQ ID NO:129所示的LCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
b)重链可变域，其包含在SEQ ID NO:41所示的HCDR1序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；在SEQ IDNO:52所示的HCDR2序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；和在SEQ ID NO:63所示的HCDR3序列中具有不超过3个氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；或
c)a)的轻链可变域和b)的所述重链可变域。
142.如权利要求135-141中任一项所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变区包含D28或其保守性取代、I29或其保守性取代、S30或其保守性取代、N31或其保守性取代、Y32或其保守性取代、Y49或其保守性取代、D50或其保守性取代、N53或其保守性取代、E55或其保守性取代、T56或其保守性取代、D91或其保守性取代、D92或其保守性取代、N93或其保守性取代、F94或其保守性取代或者L96或其保守性取代。
143.如权利要求142所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变区包含D28或其保守性取代、N31或其保守性取代、D50或其保守性取代、N53或其保守性取代、E55或其保守性取代、D91或其保守性取代和D92或其保守性取代。
144.如权利要求143所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中所述轻链可变区包含D28、N31、D50、N53、E55、D91和D92。
145.如权利要求135-144中任一项所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中所述重链可变区包含W33或其保守性取代、I50或其保守性取代、D57或其保守性取代、R59或其保守性取代、H99或其保守性取代、G100或其保守性取代、T101或其保守性取代、S102或其保守性取代、S103或其保守性取代、D104或其保守性取代、Y105或其保守性取代或者Y106或其保守性取代。
146.如权利要求145所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中所述重链可变区包含S102或其保守性取代、S103或其保守性取代、D104或其保守性取代和Y105或其保守性取代。
147.如权利要求146所述的分离的ST2抗原结合蛋白，其中所述重链可变区包含S102、S103、D104和Y105。
148.如权利要求113-147中任一项所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以小于或等于1×10-10M的亲和力特异性地结合人ST2。
149.如权利要求113-148中任一项所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白抑制人ST2与人IL-33的结合。
150.如权利要求113-149中任一项所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白减少表达人ST2的细胞中人IL-33介导的ST2信号转导。
151.如权利要求149所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白抑制食蟹猴ST2与食蟹猴IL-33的结合。
152.如权利要求151所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白减少表达食蟹猴ST2的细胞中IL-33介导的食蟹猴ST2信号转导。
153.如权利要求113-152中任一项所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是抗体。
154.如权利要求153所述的ST2抗原结合蛋白，其中所述抗体是人抗体。
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