TW201350506A

TW201350506A - Ｓｔ２抗原結合蛋白質

Info

Publication number: TW201350506A
Application number: TW102117604A
Authority: TW
Inventors: Dirk E Smith; Ian Foltz; Chadwick T King; Ai Ching Lim; Rutilio Clark; Michael R Comeau; Randal R Ketchem; Donghui Shi; xiao-shan Min; Zhulun Wang
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2012-05-18
Filing date: 2013-05-17
Publication date: 2013-12-16
Also published as: IL267599A; JP6382260B2; CN116333114A; ES2818571T3; EP2850103B1; TN2014000434A1; US11965029B2; US20190359720A1; EA035160B1; ZA201407937B; KR20230043229A; IL267599B; PE20150023A1; MX356557B; JP2016180001A; AU2013262593A1; IL282226B2; MX2014013894A; PE20191408A1; US9382318B2

Abstract

本文闡述與包括抗體在內之結合人類ST2之抗原結合蛋白質有關的組合物及方法。在特定實施例中，本發明提供完全人類抗ST2抗體以及其衍生物及變體。進一步提供編碼此等抗體及抗體片段、變體及衍生物之核酸。此外，提供製備及使用此等抗體之方法，包括治療及預防自體免疫及發炎性病症之方法。

Description

ST2抗原結合蛋白質

ST2係介白素-33(IL-33)之結合受體，介白素-33係與IL-1及IL-18有關之細胞介素且亦稱為NF-HEV或IL-1F11。ST2表現為介導對IL-33之細胞反應之可溶性非信號傳導變體(可溶性ST2或sST2)與全長跨膜形式(FL ST2、ST2或ST2L)二者。後一形式在與諸多病症環境中之病理發炎有關之寬範圍之細胞類型上表現。該等包括淋巴球，尤其表現IL-5及IL-13之T輔助細胞、天然殺傷(NK)細胞及天然殺傷-T(NKT)細胞，以及許多所謂的先天免疫細胞，例如肥大細胞、嗜鹼性球、嗜伊紅性白血球、巨噬細胞及先天輔助細胞(亦稱為v球(nuocyte)(Neill、Wong等人2010))。與IL-1及IL-18相似，IL-33結合該等細胞上之ST2導致廣泛表現之稱為IL-1R輔助蛋白質(AcP)之共受體之募集及促發炎性信號傳導之活化。因此，IL-33能夠直接活化ST2表現細胞或當存在其他活化刺激物時，增強其活化。IL-33誘導之細胞反應之實例包括產生發炎性細胞介素，例如IL-5、IL-6、IL-13、TNF、IFN-γ及GM-CSF，以及產生趨化激素，例如CXCL8、CCL17及CCL24。亦已顯示，IL-33藉由增大由IgE受體信號傳導或其他肥大細胞及嗜鹼性球活化物觸發之肥大細胞及嗜鹼性球活化來增強急性過敏反應。IL-33亦可增強表現ST2之免疫細胞之募集、存活及黏著性質且因此在刺激及維持局部組織中之細胞發炎方面較為重要。

IL-33對先天性及適應性免疫細胞之促發炎作用最終促進諸多病理過程。在肺中，該等包括增加之氣道發炎、黏液產生、氣道過度反應性及纖維化重塑。IL-33亦可藉由促進促發炎性細胞介素產生而造成關節局部發炎以及皮膚及關節高傷害感受(Verri、Guerrero等人2008；Xu、Jiang等人2008)。已將過量IL-33與病理性膠原沈積及纖維化關聯且其在發炎性腸病之環境下亦造成上皮損傷。經由對嗜鹼性球及IgE-敏化肥大細胞之有效效應，IL-33亦可觸發過敏性休克(Pushparaj、Tay等人2009)且可在過敏性疾病中起到重要作用。該等疾病中之許多本質上為慢性且逐漸惡化並且難以治療且需要更有效之治療。

與其所記錄生物學效應一致，有若干條證據表明，IL-33/ST2途徑導致人類疾病。例如，在涉及黏膜組織發炎及關節發炎之疾病中發現IL-33異常高地表現。該等包括哮喘(Prefontaine、Lajoie-Kadoch等人2009；Prefontaine、Nadigel等人2010)、發炎性腸病(Beltran、Nunez等人2010；Pastorelli、Garg等人2010；Sponheim、Pollheimer等人2010)及類風濕性關節炎(Palmer、Talabot-Ayer等人2009；Matsuyama、Okazaki等人2010)。IL-33表現在牛皮癬皮膚(Theoharides、Zhang等人2010)及異位性皮炎患者之皮膚中升高(Pushparaj、Tay等人2009)且亦在纖維化之病理性環境(例如全身性硬化(Yanaba、Yoshizaki等人2011)(Manetti、Ibba-Manneschi等人2009)及肝纖維化(Marvie、Lisbonne等人2009))中增加。循環可溶性ST2之濃度亦在諸多疾病狀況中升高，從而進一步指示此細胞介素途徑與該等疾病之間之關聯。實例包括哮喘(Kuroiwa、Arai等人2001；Oshikawa、Kuroiwa等人2001；Ali、Zhang等人2009)、慢性阻塞性肺病(Hacker、Lambers等人2009)、肺纖維化(Tajima、Oshikawa等人2003)、敗血症及外傷(Brunner、Krenn等人2004)、HIV感染(Miyagaki、Sugaya等人2011)、全身性紅斑狼瘡(Mok、Huang等人 2010)、發炎性腸病(Beltran、Nunez等人2010)以及類風濕性關節炎、硬化、華格納氏肉芽腫(Wegener’s granulomatosis)及貝歇病(Behchet disease)(Kuroiwa,Arai等人2001)及心血管疾病(Shah及Januzzi 2010)。IL-33可能引起嗜伊紅性發炎且有證據表明，此途徑參與嗜伊紅性白血球相關疾病，例如鼻竇炎及鼻息肉(Plager、Kahl等人2010)及嗜伊紅性枝氣管炎(Oshikawa、Kuroiwa等人2001)。

遺傳研究提供將IL-33/ST2途徑與人類疾病關聯之額外證據，該等遺傳研究已在一般群體中鑑別與疾病風險增加或疾病嚴重程度之參數顯著相關的IL-33及/或ST2基因多態性。若干大基因組範圍的相關研究已將ST2(IL1RL1)或IL-33之遺傳變異與哮喘風險增加關聯(Gudbjartsson、Bjornsdottir等人2009；Moffatt、Gut等人2010；Wu、Romieu等人2010)及其他研究已在遺傳學上將此途徑與哮喘嚴重程度增加關聯(Ali、Zhang等人2009)及枝氣管過度反應性(Reijmerink、Postma等人2008)。相似發現已在遺傳學上表明，此途徑與諸如異位素皮膚炎等過敏性病症(Shimizu、Matsuda等人2005)、鼻竇炎(Sakashita、Yoshimoto等人2008；Castano R 2009)以及鼻息肉(Buysschaert、Grulois等人2010)相關。

總之，此細胞介素軸與若干人類疾病之該等關聯及其促進許多形式之有害發炎之能力暗示此係可用於治療幹預之靶標。

本發明提供具有適於商業生產及人類治療應用之性質的抗ST2抗原結合蛋白質，例如，抗體及其功能片段。抗ST2抗原結合蛋白質尤其可用於治療與IL-33/ST2軸相關之疾病及病症之方法。本文提供以高親和力結合ST2且有效地阻斷IL-33-結合藉此減少細胞中由IL-33介導之信號傳導的ST2-結合抗體。

在第一態樣中，ST2抗原結合蛋白質包含a)與SEQ ID NO：95、 SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164或SEQ ID NO：165中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域；b)與SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：147中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；或c)a)之輕鏈可變結構域及b)之重鏈可變結構域。

第一態樣之較佳抗原結合蛋白質包括彼等包含以下者：與SEQ ID NO：95中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：29中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：96中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：30中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：97中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：31中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：98中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：32中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：99中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：33中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：100中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：34中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：101中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：35中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：102中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：36中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：103中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：37中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：104中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：38中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：105中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：39中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：163中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：145中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：164中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：146中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；及彼等包含以下者：與SEQ ID NO：165中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：147中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域。

在第二態樣中，ST2抗原結合蛋白質包含a)與SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164或SEQ ID NO：165中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域；b)與SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：147中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；或c)a)之輕鏈可變結構域及b)之重鏈可變結構域。

第二態樣之較佳抗原結合蛋白質包括彼等包含以下者：與SEQ ID NO：95中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：29中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：96中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：30中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與 SEQ ID NO：97中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：31中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：98中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：32中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：99中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：33中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：100中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：34中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：101中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：35中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：102中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：36中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：103中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：37中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：104中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：38中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：105中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：39中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：163中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：145中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：164中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：146中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；及彼等包含以下者：與SEQ ID NO：165中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：147中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域。

在第三態樣中，ST2抗原結合蛋白質含有包含以下之輕鏈可變結構域：a)與SEQ ID NO：106中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：117中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：128中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；b)與SEQ ID NO：107中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：118中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：129中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的 LCDR3；c)來自序列SEQ ID NO：108中所述LCDR1之具有不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：119中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：130中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；d)與SEQ ID NO：109中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：120中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：131中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；e)與SEQ ID NO：110中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：121中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：132中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；f)與SEQ ID NO：111中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：122中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：133中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；g)與SEQ ID NO：112中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：123中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：134中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；h)與SEQ ID NO：113中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：124中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：135中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；i)與SEQ ID NO：114中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：125中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：136中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；j)與SEQ ID NO：115中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：126中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：137中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；k)與SEQ ID NO：116中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：127中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：138中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；l)與SEQ ID NO：166中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：169中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：172中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；m)與SEQ ID NO：167中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：170中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：173中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；或n)與SEQ ID NO：168中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：171中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：174中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；及包含以下之重鏈可變結構域：o)與SEQ ID NO：40中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：51中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：62中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；p)與SEQ ID NO：41中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：52中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：63中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；q)與SEQ ID NO：42中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：53中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：64中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；r)與SEQ ID NO：43中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：54中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：65中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；s)與SEQ ID NO：44中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：55中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：66中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；t)與SEQ ID NO：45中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：56中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：67中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；u)與SEQ ID NO：46中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：57中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：68中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；v)與SEQ ID NO：47中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與 SEQ ID NO：58中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：69中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；w)與SEQ ID NO：48中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：59中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：70中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；x)與SEQ ID NO：49中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：60中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：71中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；y)與SEQ ID NO：50中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：61中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：72中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；z)與SEQ ID NO：148中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：151中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：154中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；aa)與SEQ ID NO：149中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：152中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：155中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；或bb)與SEQ ID NO：150中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：153中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：156中所述HCDR3序列相差不超過 3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3。

第三態樣之較佳ST2抗原結合蛋白質包括彼等包含a)之輕鏈可變結構域及o)之重鏈可變結構域者；彼等包含b)之輕鏈可變結構域及p)之重鏈可變結構域者；彼等包含c)之輕鏈可變結構域及q)之重鏈可變結構域者；彼等包含d)之輕鏈可變結構域及r)之重鏈可變結構域者；彼等包含e)之輕鏈可變結構域及s)之重鏈可變結構域者；彼等包含f)之輕鏈可變結構域及t)之重鏈可變結構域者；彼等包含g)之輕鏈可變結構域及u)之重鏈可變結構域者；彼等包含h)之輕鏈可變結構域及v)之重鏈可變結構域者；彼等包含i)之輕鏈可變結構域及w)之重鏈可變結構域者；彼等包含j)之輕鏈可變結構域及x)之重鏈可變結構域者；彼等包含k)之輕鏈可變結構域及y)之重鏈可變結構域者；彼等包含l)之輕鏈可變結構域及z)之重鏈可變結構域者；彼等包含m)之輕鏈可變結構域及aa)之重鏈可變結構域者；以及彼等包含n)之輕鏈可變結構域及bb)之重鏈可變結構域者。

在本發明之第四態樣中，第一、第二或第三態樣之ST2抗原結合蛋白質以小於或等於1×10^-10M之親和力結合人類ST2。

在本發明之第五態樣中，第一、第二、第三或第四態樣之ST2抗原結合蛋白質抑制人類ST2結合人類IL-33。

在本發明之第六態樣中，第一、第二、第三、第四或第五態樣之ST2抗原結合蛋白質減少人類ST2表現細胞中之人類IL-33介導之ST2信號傳導。

在本發明之第七態樣中，第六態樣之ST2抗原結合蛋白質減少食蟹猴ST2表現細胞中之IL-33介導之食蟹猴ST2信號傳導。

在本發明之第八態樣中，第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七態樣之ST2抗原結合蛋白質係抗體，例如人類抗體。較佳抗體包括彼等包含具有SEQ ID：84中所述胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO：18中所述胺基酸序列之重鏈之抗體；彼等包含具有SEQ ID：85中所述胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO：19中所述胺基酸序列之重鏈者；彼等包含具有SEQ ID：86中所述胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO：20中所述胺基酸序列之重鏈者；彼等包含具有SEQ ID：87中所述胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO：21中所述胺基酸序列之重鏈者；彼等包含具有SEQ ID：88中所述胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO：22中所述胺基酸序列之重鏈者；彼等包含具有SEQ ID：89中所述胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO：23中所述胺基酸序列之重鏈者；彼等包含具有SEQ ID：90中所述胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO：24中所述胺基酸序列之重鏈者；彼等包含具有SEQ ID：91中所述胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO：25中所述胺基酸序列之重鏈者；彼等包含具有SEQ ID：92中所述胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO：26中所述胺基酸序列之重鏈者；彼等包含具有SEQ ID：93中所述胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO：27中所述胺基酸序列之重鏈者；彼等包含具有SEQ ID：94中所述胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO：28中所述胺基酸序列之重鏈者；彼等包含具有SEQ ID：160中所述胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO：142中所述胺基酸序列之重鏈者；彼等包含具有SEQ ID：161中所述胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO：143中所述胺基酸序列之重鏈者；及彼等包含具有SEQ ID：162中所述胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO：144中所述胺基酸序列之重鏈者。

在第九態樣中，本發明提供編碼ST2抗原結合蛋白質之一或多種多肽組份(例如，抗體輕鏈或抗體重鏈)之經分離核酸。在較佳實施例中，核酸編碼包含以下之多肽：a)輕鏈可變結構域，其與SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164或SEQ ID NO：165中所述胺基酸序列具有至少95%一致性；b)重鏈可變結構域，其與SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：147中所述胺基酸序列具有至少95%一致性；c)與SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164或SEQ ID NO：165中所述胺基酸序列相差不超過5個胺基酸添加、缺失或取代之輕鏈可變結構域；d)與SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：147中所述胺基酸序列相差不超過5個胺基酸添加、缺失或取代之重鏈可變結構域；e)包含以下之輕鏈可變結構域：i)與SEQ ID NO：106中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：117中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：128中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；ii)與SEQ ID NO：107中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：118中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：129中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；iii)與SEQ ID NO：108中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：119中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：130中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；iv)與SEQ ID NO：109中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：120中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：131中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；v)與SEQ ID NO：110中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：121中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：132中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；vi)與SEQ ID NO：111中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：122中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：133中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；vii)與SEQ ID NO：112中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：123中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：134中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；viii)與SEQ ID NO：113中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：124中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：135中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；ix)與SEQ ID NO：114中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：125中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：136中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；x)與SEQ ID NO：115中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：126中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：137中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；xi)與SEQ ID NO：116中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：127中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：138中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；xii)與SEQ ID NO：166中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：169中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：172中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；xiii)與SEQ ID NO：167中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：170中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：173中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；或xiv)與SEQ ID NO：168中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：171中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：174中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；或f)包含以下之重鏈可變結構域：i)與SEQ ID NO：40中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：51中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：62中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；ii)與SEQ ID NO：41中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：52中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：63中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；iii)與SEQ ID NO：42中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：53中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：64中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；iv)與SEQ ID NO：43中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：54中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：65中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；v)與SEQ ID NO：44中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：55中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：66中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；vi)與SEQ ID NO：45中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：56中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：67中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；vii)與SEQ ID NO：46中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：57中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：68中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；viii)與SEQ ID NO：47中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：58中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：69中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3； ix)與SEQ ID NO：48中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：59中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：70中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；x)與SEQ ID NO：49中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：60中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：71中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；xi)與SEQ ID NO：50中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：61中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：72中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；xii)與SEQ ID NO：148中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：151中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：154中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；xiii)與SEQ ID NO：149中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：152中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：155中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；或xiv)與SEQ ID NO：150中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：153中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：156中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3。

在第九態樣之某些實施例中，多肽編碼抗體輕鏈且與SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158或SEQ ID NO：159中所述核苷酸序列至少80%、至少90%、至少95%或100%一致。在第九態樣之其他實施例中，多肽編碼抗體重鏈且與SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：141中所述核苷酸序列至少80%、至少90%、至少95%或100%一致。

在第十態樣中，本發明提供包含第八態樣之一或多個經分離核酸的表現載體。在某些實施例中，表現載體編碼抗體輕鏈、抗體重鏈或抗體輕鏈與重鏈二者。

在第十一態樣中，本發明提供包含第九態樣之一或多個經分離核酸可操作地連接至啟動子的重組宿主細胞，包括包含本發明之第十態樣之一或多個表現載體的重組宿主細胞。在較佳實施例中，重組宿主細胞分泌結合ST2之抗體。較佳宿主細胞係哺乳動物宿主細胞，包括CHO細胞系。

在第十二態樣中，本發明提供治療自體免疫或發炎性病症之方法，該方法包含向有需要之患者投與治療有效量之第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八態樣中任一者之ST2抗原結合蛋白質。在較佳實施例中，ST2抗原結合蛋白質係包含如SEQ ID NO：95中所述輕鏈可變結構域胺基酸序列及如SEQ ID NO：29中所述重鏈可變結構域胺基酸序列之抗體(例如，Ab1)、包含如SEQ ID NO：96中所述輕鏈可變結構域胺基酸序列及如SEQ ID NO：30中所述重鏈可變結構域胺基酸序列之抗體(例如，Ab2)、包含如SEQ ID NO：97中所述輕鏈可變結構域胺基酸序列及如SEQ ID NO：31中所述重鏈可變結構域胺基酸序列之抗體(例如，Ab3)、包含如SEQ ID NO：98中所述輕鏈可變結構域胺基酸序列及如SEQ ID NO：32中所述重鏈可變結構域胺基酸序列之抗體(例如，Ab4)、包含如SEQ ID NO：99中所述輕鏈可變結構域胺基酸序列及如SEQ ID NO：33中所述重鏈可變結構域胺基酸序列之抗體(例如，Ab5)、包含如SEQ ID NO：100中所述輕鏈可變結構域胺基酸序列及如SEQ ID NO：34中所述重鏈可變結構域胺基酸序列之抗體(例如，Ab6)、包含如SEQ ID NO：101中所述輕鏈可變結構域胺基酸序列及如SEQ ID NO：35中所述重鏈可變結構域胺基酸序列之抗體(例如，Ab7)、包含如SEQ ID NO：102中所述輕鏈可變結構域胺基酸序列及如SEQ ID NO：36中所述重鏈可變結構域胺基酸序列之抗體(例如，Ab8)、包含如SEQ ID NO：103中所述輕鏈可變結構域胺基酸序列及如SEQ ID NO：37中所述重鏈可變結構域胺基酸序列之抗體(例如，Ab9)、包含如SEQ ID NO：104中所述輕鏈可變結構域胺基酸序列及如SEQ ID NO：38中所述重鏈可變結構域胺基酸序列之抗體(例如，Ab10)、包含如SEQ ID NO：105中所述輕鏈可變結構域胺基酸序列及如SEQ ID NO：39中所述重鏈可變結構域胺基酸序列之抗體(例如，Ab11)；包含如SEQ ID NO：163中所述輕鏈可變結構域胺基酸序列及如SEQ ID NO：45中所述重鏈可變結構域胺基酸序列之抗體(例如，Ab30)；包含如SEQ ID NO：164中所述輕鏈可變結構域胺基酸序列及如SEQ ID NO：146中所述重鏈可變結構域胺基酸序列之抗體(例如， Ab32)；或包含如SEQ ID NO：165中所述輕鏈可變結構域胺基酸序列及如SEQ ID NO：147中所述重鏈可變結構域胺基酸序列之抗體(例如，Ab33)。在較佳實施例中，ST2抗原結合蛋白質抑制IL-33結合ST2。在尤佳實施例中，自體免疫或發炎性病症係哮喘、發炎性腸病、類風濕性關節炎、牛皮癬、異位性皮炎、纖維化、慢性阻塞性肺病、全身性紅斑狼瘡、硬化、華格納氏肉芽腫、貝歇病、鼻竇炎、鼻息肉、嗜伊紅性枝氣管炎及心血管疾病。

在第十三態樣中，本發明提供藉由培養第十一態樣之重組宿主細胞並自該培養物分離ST2抗原結合蛋白質來製備第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八態樣中任一者之ST2抗原結合蛋白質的方法。

在十四態樣中，本發明提供第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八態樣中任一者之與選自由以下組成之群之抗體交叉競爭的ST2抗原結合蛋白質：a)包含以下之抗體：包含SEQ ID：84中所述胺基酸序列之輕鏈及包含SEQ ID NO：18中所述胺基酸序列之重鏈；b)包含以下之抗體：包含SEQ ID：85中所述胺基酸序列之輕鏈及包含SEQ ID NO：19中所述胺基酸序列之重鏈；c)包含以下之抗體：包含SEQ ID：86中所述胺基酸序列之輕鏈及包含SEQ ID NO：20中所述胺基酸序列之重鏈；d)包含以下之抗體：包含SEQ ID：87中所述胺基酸序列之輕鏈及包含SEQ ID NO：21中所述胺基酸序列之重鏈；e)包含以下之抗體：包含SEQ ID：88中所述胺基酸序列之輕鏈及包含SEQ ID NO：22中所述胺基酸序列之重鏈；f)包含以下之抗體：包含SEQ ID：89中所述胺基酸序列之輕鏈及包含SEQ ID NO：23中所述胺基酸序列之重鏈； g)包含以下之抗體：包含SEQ ID：90中所述胺基酸序列之輕鏈及包含SEQ ID NO：24中所述胺基酸序列之重鏈；h)包含以下之抗體：包含SEQ ID：91中所述胺基酸序列之輕鏈及包含SEQ ID NO：25中所述胺基酸序列之重鏈；i)包含以下之抗體：包含SEQ ID：92中所述胺基酸序列之輕鏈及包含SEQ ID NO：26中所述胺基酸序列之重鏈；j)包含以下之抗體：包含SEQ ID：93中所述胺基酸序列之輕鏈及包含SEQ ID NO：27中所述胺基酸序列之重鏈；k)包含以下之抗體：包含SEQ ID：94中所述胺基酸序列之輕鏈及包含SEQ ID NO：28中所述胺基酸序列之重鏈；l)包含以下之抗體：包含SEQ ID：160中所述胺基酸序列之輕鏈及包含SEQ ID NO：142中所述胺基酸序列之重鏈；m)包含以下之抗體：包含SEQ ID：161中所述胺基酸序列之輕鏈及包含SEQ ID NO：143中所述胺基酸序列之重鏈；n)包含以下之抗體：包含SEQ ID：162中所述胺基酸序列之輕鏈及包含SEQ ID NO：144中所述胺基酸序列之重鏈。

在第十五態樣中，本發明提供結合包含人類ST2結構域1及結構域2之多肽(SEQ ID NO：175)的經分離ST2抗原結合蛋白質、較佳抗體或其抗原結合片段，其中當將單一突變引入該多肽之人類ST2結構域1或結構域2中時，結合受到顯著抑制，其中該單一突變係選自由以下組成之群：L14R、I15R、S33R、E43R、V47R、A62R、G65R、T79R、D92R、D97R、V104R、G138R、N152R及V176R。「顯著受到抑制」意指，所量測結合差異在統計學上顯著。在較佳實施例中，對於該群中之兩個或更多個成員(包括該群之所有成員)而言，結合受到顯著抑制。在第十五態樣之某些實施例中，當將單一突變引入多肽之人類ST2結構域1或結構域2中時，結合亦顯著受到活化，其中該單一突變係選自由L53R、R72A及S73R組成之群。「顯著受到活化」意指，所量測結合差異在統計學上顯著。在較佳實施例中，對於該群之所有成員而言，結合受到顯著活化。在第十五態樣之某些實施例中，ST2結合蛋白質與含有包含SEQ ID：85中所述胺基酸序列之輕鏈及包含SEQ ID NO：19中所述胺基酸序列之重鏈的抗體交叉競爭結合人類ST2。在尤佳實施例中，抗原結合蛋白質係第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八態樣之抗原結合蛋白質。

在第十六態樣中，本發明提供第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第十四或第十五態樣之抗原結合蛋白質，其中該ST2結合蛋白質、較佳抗體或其抗原結合片段結合ST2之包含SEQ ID NO：1之胺基酸33-44及/或88-94的一部分，如藉由氫/氘交換分析所測定。

在第十七態樣中，本發明提供第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第十四、第十五或第十六態樣之抗原結合蛋白質、較佳抗體或其抗原結合片段，其結合ST2，從而產生界面，其中由該結合產生之界面包含選自由以下組成之群之ST2殘基：K1、F2、P19、R20、Q21、G22、K23、Y26、I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79及Y81。在第十七態樣之較佳實施例中，由該結合產生之界面包含ST2殘基P19、R20、Q21、G22、K23及/或Y26；ST2殘基I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79及/或Y81；或ST2殘基P19、R20、Q21、G22、K23、Y26、I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79及Y81。界面可藉由結合ST2與未結合ST2之間的溶劑暴露差異來測定且界面殘基定義為彼等差異大於10%之胺基酸及彼等與該抗體形成水介導之氫鍵者或藉由彼等具有至少一個在該抗體之5Å內之原子之胺基酸來測定。

在第十八態樣中，本發明提供包含以下之經分離ST2抗原結合蛋白質、較佳抗體或其抗原結合片段：a)與SEQ ID NO：96中所述胺基酸序列具有至少90%或至少95%一致性之輕鏈可變結構域；b)與SEQ ID NO：30中所述胺基酸序列具有至少90%或至少95%一致性之重鏈可變結構域；c)a)之輕鏈可變結構域及b)之重鏈可變結構域；d)與SEQ ID NO：96中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域；e)與SEQ ID NO：30中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；f)d)之輕鏈可變結構域e)之重鏈可變結構域；g)包含以下之輕鏈可變結構域：與SEQ ID NO：107中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1、與SEQ ID NO：118中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2、及與SEQ ID NO：129中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；h)包含以下之重鏈可變結構域：與SEQ ID NO：41中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1、與SEQ ID NO：52中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2、及與SEQ ID NO：63中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；或i)g)之輕鏈可變結構域及h)之重鏈可變結構域。

在第十八態樣之較佳實施例中，輕鏈可變區包含D28或其保守取代、I29或其保守取代、S30或其保守取代、N31或其保守取代、Y32或其保守取代、Y49或其保守取代、D50或其保守取代、N53或其保守取代、E55或其保守取代、T56或其保守取代、D91或其保守取代、D92或其保守取代、N93或其保守取代、F94或其保守取代或L96或其保守取代。在其他較佳實施例中，輕鏈可變區包含D28或其保守取代、N31或其保守取代、D50或其保守取代、N53或其保守取代、E55 或其保守取代、D91或其保守取代及D92或其保守取代。在其他較佳實施例中，輕鏈可變區包含D28、N31、D50、N53、E55、D91及D92。

第十八態樣亦包括ST2結合蛋白質、較佳抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含W33或其保守取代、I50或其保守取代、D57或其保守取代、R59或其保守取代、H99或其保守取代、G100或其保守取代、T101或其保守取代、S102或其保守取代、S103或其保守取代、D104或其保守取代、Y105或其保守取代，或Y106或其保守取代；其中該重鏈可變區包含S102或其保守取代、S103或其保守取代、D104或其保守取代及Y105或其保守取代；且其中該重鏈可變區包含S102、S103、D104及Y105。

在第十八態樣之某些實施例中，ST2抗原結合蛋白質以小於或等於1×10^-10M之親和力特異性結合人類ST2，抑制人類ST2結合人類IL-33，減少人類ST2表現細胞中之人類IL-33介導之ST2信號傳導，抑制食蟹猴ST2結合食蟹猴IL-33，減少食蟹猴ST2表現細胞中之IL-33介導之食蟹猴ST2信號傳導，及/或係抗體，例如人類抗體。

圖1 ST2 mAb治療顯著抑制枝氣管肺泡灌洗液(BALF)Balb/c及C57Bl/6小鼠中之由IL-33誘導之IL-5。

圖2 ST2 mAb治療在蟑螂過敏原(CRA)誘導之哮喘模型中有效。ST2抗體治療小鼠比同型對照Ig治療小鼠具有顯著更少之BALF嗜伊紅性白血球。

圖3 ST2 mAb對來自各種供體之CD4+ T細胞之由人類IL-33誘導之IL-5產生的抑制。(-)線繪示無抑制時人類IL-33與人類IL-2之組合的陽性對照值。(‥‥)繪示人類IL-2之陽性對照值。(--)線繪示培養基對照值。

圖4 人類IL-33在人類NK細胞分析中之劑量反應。

圖5 人類NK細胞分析中由Ab2對市售ST2抗體引起之IL-33活性降低。純系HB12、FB9及2A5係自MBL International公司獲得。純系B4E6係自MD Biosciences獲得。純系97203係自R&D Systems獲得。

圖6 如藉由HDX所測定ST2中Ab2結合之區之定位(參見實例12)。對應於ST2之細胞外結構域之胺基酸15-26之區突出顯示為紅色且對應於ST2之細胞外結構域之胺基酸70-76之區突出顯示為洋紅色。

圖7 ST2/Ab2 sc-dsFv複合物之總體結構。兩種Ab2 sc-dsFv分子顯示為卡通圖(cartoon representation)且輕鏈(LC)/重鏈(HC)對分別著青色/藍色或淡黃色/金色。兩種ST2分子顯示為洋紅色及綠色卡通。

圖8 結合界面。ST2顯示為黃色卡通。Ab2之重鏈及輕鏈顯示為灰色及小麥色卡通。重鏈及輕鏈之CDR環按下列順序著色：CDR1：紅色(HC)或淡紅色(LC)；CDR2：綠色(HC)或淡綠色(LC)；及CDR3：藍色(HC)或淡藍色(LC)。

圖9 ST2及Ab2 sc-dsFv之靜電表面電位圖。圖9A).ST2及Ab2 sc-dsFv之電荷及表面互補性。結合界面突出顯示於環中。圖9B)左：Ab2(灰色/小麥色卡通)結合ST2(表面)上之帶正電斑片(patch)；右：ST2(黃色卡通)結合Ab2 sc-dsFv(表面)之酸性斑片。對於靜電電位圖而言，紅色表面代表負電荷且藍色表面代表正電荷。

圖10 Ab2可變結構域內當結合ST2時與該抗原形成界面之殘基。CDR區加框。界面內之殘基顯示為粗體。與ST2內之胺基酸形成氫鍵或鹽橋之殘基為斜體。

本文所用各部分標題僅用於組織目的，而不能理解為限制所述標的物。本說明書正文內引用之所有參考文獻之全部內容皆以引用方式明確地併入本文中。

可將標準技術用於重組DNA、寡核苷酸合成、組織培養及轉化、蛋白質純化等。酶促反應及純化技術可依照製造商說明書實施，或如業內習用方法實施，或如本文所述實施。以下程序及技術通常可依照業內熟知之習用方法及如說明書中所引用及論述之各種一般及更具體之參考文獻中所述來實施。例如，參見Sambrook等人，2001,Molecular Cloning：A Laboratory Manuel，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,cold Spring Harbor,N.Y.，其出於任何目的以引用方式併入本文中。除非提供具體定義，否則結合本文所述分析化學、合成有機化學以及醫學及醫藥化學所用之命名以及其實驗室程序及技術為業內所熟知且習用者。標準技術可用於化學合成；化學分析；醫藥製備、調配及遞送；及患者之治療。

ST2

本文所述抗原結合蛋白質結合ST2。ST2表現為可溶性非信號傳導變體(可溶性ST2或sST2)與全長跨膜形式(FL ST2、ST2或ST2L)二者。實例性人類ST2L胺基酸序列在本文中提供於表1中。該蛋白質係由若干結構域構成：胺基酸1-18對應於可在哺乳動物細胞中在蛋白質加工期間裂解之前導序列；胺基酸19-331對應於細胞外結構域；胺基酸332-350對應於跨膜結構域；且胺基酸351-556對應於細胞內結構域。在較佳實施例中，抗原結合蛋白質結合ST2L之細胞外結構域且阻止ST2與IL-33之交互作用。實例性人類IL-33胺基酸序列提供於表1中。

IL-33經由包含ST2L及AcP之異源二聚受體傳導信號。實例性人類AcP胺基酸序列提供於表1中。此蛋白質亦係由若干結構域構成：胺基酸1-20對應於可在哺乳動物細胞中在蛋白質加工期間裂解之前導序列；胺基酸21-367對應於細胞外結構域；胺基酸368-388對應於跨膜結構域；且胺基酸389-570對應於細胞內結構域。在實例性實施例中，ST2抗原結合蛋白質結合ST2L且阻止表現ST2L及AcP之細胞中由IL-33介導之信號傳導。

本發明之實例性實施例以高親和力結合人類ST2與食蟹猴ST2二者，包括彼等以高親和力結合食蟹猴IL-33及食蟹猴ST2並阻斷其交互作用者。該等特性允許在非人類靈長類中進行資訊性毒理學研究。

食蟹猴ST2L之實例性胺基酸序列提供於表2中。該蛋白質係由若干結構域構成：胺基酸1-18對應於可在哺乳動物細胞中在蛋白質加工期間裂解之前導序列；胺基酸19-331對應於細胞外結構域；胺基酸332-350對應於跨膜結構域；且胺基酸351-556對應於細胞內結構域。

食蟹猴AcP之實例性胺基酸序列提供於表2中。該蛋白質係由若干結構域構成：胺基酸1-20對應於可在哺乳動物細胞中在蛋白質加工期間裂解之前導序列；胺基酸21-367對應於細胞外結構域；胺基酸368-388對應於跨膜結構域；且胺基酸389-570對應於細胞內結構域。

食蟹猴IL-33之實例性胺基酸序列提供於表2中。

ST2抗原結合蛋白質

本發明提供特異性結合ST2之抗原結合蛋白質。抗原結合蛋白質之實施例包含特異性結合ST2之肽及/或多肽。此等肽或多肽可視情況包括一或多個轉譯後改質。抗原結合蛋白質之實施例包括特異性結合ST2之抗體及其片段，如本文以不同方式所定義。該等包括特異性結合人類ST2之抗體，包括彼等抑制IL-33結合及/或活化ST2者。

本發明之抗原結合蛋白質特異性結合ST2。本文所用「特異性結合」意指，抗原結合蛋白質相對於其他蛋白質優先結合ST2。在一些實施例中，「特異性結合」意指ST2抗原結合蛋白質對ST2之親和力高於對於其他蛋白質。特異性結合ST2之ST2抗原結合蛋白質對人類ST2之結合親和力可小於或等於1×10^-7M、小於或等於2×10^-7M、小於或等於3×10^-7M、小於或等於4×10^-7M、小於或等於5×10^-7M、小於或等於6×10^-7M、小於或等於7×10^-7M、小於或等於8×10^-7M、小於或等於9×10^-7M、小於或等於1×10^-8M、小於或等於2×10^-8M、小於或等於3×10^-8M、小於或等於4×10^-8M、小於或等於5×10^-8M、小於或等於6×10^-8M、小於或等於7×10^-8M、小於或等於8×10^-8M、小於或等於9×10^-8M、小於或等於1×10^-9M、小於或等於2×10^-9M、小於或等於3×10^-9M、小於或等於4×10^-9M、小於或等於5×10^-9M、小於或等於6×10^-9M、小於或等於7×10^-9M、小於或等於8×10^-9M、小於或等於9×10^-9M、小於或等於1×10^-10M、小於或等於2×10^-10M、小於或等於3×10^-10M、小於或等於4×10^-10M、小於或等於5×10^-10M、小於或等於6×10^-10M、小於或等於7×10^-10M、小於或等於8×10^-10M、小於或等於9×10^-10M、小於或等於1×10^-11M、小於或等於2×10^-11M、小於或等於3×10^-11M、小於或等於4×10^-11M、小於或等於5×10^-11M、小於或等於6×10^-11M、小於或等於7×10^-11M、小於或等於8×10^-11M、小於或等於9×10^-11M、小於或等於1×10^-12M、小於或等於2×10^-12M、小於或等於3×10^-12M、小於或等於4×10^-12M、小於或等於5×10^-12M、小於或等於6×10^-12M、小於或等於7×10^-12M、小於或等於8×10^-12M或小於或等於9×10^-12M。

量測抗原結合蛋白質之結合親和力之方法為業內所熟知。習用於親和力測定之方法包括表面電漿共振(SPR)(Morton及Myszka「Kinetic analysis of macromolecular interactions using surface plasmon resonance biosensors」Methods in Enzymology(1998)295,268-294)、生物層干涉術(Abdiche等人「Determining Kinetics and Affinities of Protein Interactions using a Parallel Real-time Label-free Biosensor,the Octet」Analytical Biochemistry(2008)377,209-217)、動力學排斥分析(KinExA)(Darling及Brault「Kinetic exclusion assay technology：characterization of molecular interactions」Assay and Drug Dev Tech(2004)2,647-657)、等溫熱量測定(Pierce等人「Isothermal Titration Calorimetry of Protein-Protein Interactions」Methods(1999)19,213-221)及分析超速離心(Lebowitz等人「Modern analytical ultracentrifugation in protein science：A tutorial review」Protein Science(2002),11：2067-2079)。實例3提供實例性方法。

應理解，當本文提及ST2結合抗體之各實施例時，其亦涵蓋該等抗體之ST2結合片段。ST2結合片段包含保留特異性結合ST2之能力的本文所述任一抗體片段或結構域。ST2結合片段可在本文所述任一支架中。

在某些治療性實施例中，ST2抗原結合蛋白質抑制ST2結合IL-33及/或抑制一或多種與ST2結合IL-33相關之生物學活性，例如，由IL-33介導之信號傳導。認為此等抗原結合蛋白質具有「中和性」。在某些實施例中，中和性ST2抗原結合蛋白質特異性結合ST2並將ST2與IL-33之結合抑制10%至100%之間之任一值，例如至少約20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、 82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大。例如，可藉由測定抗原結合蛋白質阻斷IL-33結合ST2或IL-33結合共受體ST2及AcP之能力來測試ST2抗原結合蛋白質之中和能力，例如，參見實例6之IL-33阻斷分析。另一選擇為，可在量測ST2抗原結合蛋白質之存在之效應之分析中在量測由IL-33介導之生物學功能之分析中測試ST2抗原結合蛋白質之中和能力。例如，IL-33誘導生物反應(例如介質之細胞內信號傳導或增加之mRNA表現或介質之分泌)之能力，該等介質係(例如)來自諸如嗜伊紅性白血球、嗜鹼性球、T細胞、肥大細胞、NK細胞、NKT細胞、嗜中性球或先天輔助細胞等細胞之細胞介素及趨化激素。另一選擇為，IL-33促進諸如嗜伊紅性白血球、嗜鹼性球、T細胞、肥大細胞、NK細胞、NKT細胞、嗜中性球或先天輔助細胞等細胞之分化、增殖、存活、趨化性、形狀改變或黏著性質之能力。另一選擇為，IL-33誘導諸如CD11b等某些細胞活化標記物在諸如嗜伊紅性白血球、嗜鹼性球、T細胞、肥大細胞、NK細胞、NKT細胞、嗜中性球或先天輔助細胞等細胞上之細胞表面表現的能力。實例性方法提供於實例7-10中。

抗原結合蛋白質之實施例包含如本文以不同方式所定義支架結構與一或多個互補決定區(CDR)。實施例進一步包括包含支架結構與一或多個抗體重鏈或輕鏈可變結構域的抗原結合蛋白質。實施例包括包含以下之抗體：選自由以下組成之群之輕鏈可變結構域：Ab1輕鏈可變結構域(LCv)、Ab2 LCv、Ab3 LCv、Ab4 LCv、Ab5 LCv、Ab6 LCv、Ab7 LCv、Ab8 LCv、Ab9 LCv、Ab10LCv、Ab11 LCv、Ab30 LCv、Ab32 LCv及Ab33 LCv(分別為SEQ ID NO：95-105、163-165)及/或選自由以下組成之群之重鏈可變結構域：Ab1重鏈可變結構域(HCv)、Ab2 HCv、Ab3 HCv、Ab4 HCv、Ab5 HCv、Ab6 HCv、Ab7 HCv、Ab8 HCv、Ab9 HCv、Ab10 HCv、Ab11HCv、Ab30HCv、Ab32HCv及Ab33HCv(分別為SEQ ID NO：29-39、145-147)以及其片段、衍生物、突變蛋白質及變體。

包含Ab1 LCv之實例性輕鏈係包含SEQ ID NO：84中所述胺基酸序列之輕鏈。

包含Ab2 LCv之實例性輕鏈係包含SEQ ID NO：85中所述胺基酸序列之輕鏈。

包含Ab3 LCv之實例性輕鏈係包含SEQ ID NO：86中所述胺基酸序列之輕鏈。

包含Ab4 LCv之實例性輕鏈係包含SEQ ID NO：87中所述胺基酸序列之輕鏈。

包含Ab5 LCv之實例性輕鏈係包含SEQ ID NO：88中所述胺基酸序列之輕鏈。

包含Ab6 LCv之實例性輕鏈係包含SEQ ID NO：89中所述胺基酸序列之輕鏈。

包含Ab7 LCv之實例性輕鏈係包含SEQ ID NO：9O中所述胺基酸序列之輕鏈。

包含Ab8 LCv之實例性輕鏈係包含SEQ ID NO：91中所述胺基酸序列之輕鏈。

包含Ab9 LCv之實例性輕鏈係包含SEQ ID NO：92中所述胺基酸序列之輕鏈。

包含Ab10 LCv之實例性輕鏈係包含SEQ ID NO：93中所述胺基酸序列之輕鏈。

包含Ab11 LCv之實例性輕鏈係包含SEQ ID NO：94中所述胺基酸序列之輕鏈。

包含Ab30 LCv之實例性輕鏈係包含SEQ ID NO：160中所述胺基酸序列之輕鏈。

包含Ab32 LCv之實例性輕鏈係包含SEQ ID NO：161中所述胺基酸序列之輕鏈。

包含Ab33 LCv之實例性輕鏈係包含SEQ ID NO：162中所述胺基酸序列之輕鏈。

包含Ab1 HCv之實例性重鏈係包含SEQ ID NO：18中所述胺基酸序列之重鏈。

包含Ab2 HCv之實例性重鏈係包含SEQ ID NO：19中所述胺基酸序列之重鏈。

包含Ab3 HCv之實例性重鏈係包含SEQ ID NO：20中所述胺基酸序列之重鏈。

包含Ab4 HCv之實例性重鏈係包含SEQ ID NO：21中所述胺基酸序列之重鏈。

包含Ab5 HCv之實例性重鏈係包含SEQ ID NO：22中所述胺基酸序列之重鏈。

包含Ab6 HCv之實例性重鏈係包含SEQ ID NO：23中所述胺基酸序列之重鏈。

包含Ab7 HCv之實例性重鏈係包含SEQ ID NO：24中所述胺基酸序列之重鏈。

包含Ab8 HCv之實例性重鏈係包含SEQ ID NO：25中所述胺基酸序列之重鏈。

包含Ab9 HCv之實例性重鏈係包含SEQ ID NO：26中所述胺基酸序列之重鏈。

包含Ab10 HCv之實例性重鏈係包含SEQ ID NO：27中所述胺基酸序列之重鏈。

包含Ab11 HCv之實例性重鏈係包含SEQ ID NO：28中所述胺基酸序列之重鏈。

包含Ab30 HCv之實例性重鏈係包含SEQ ID NO：142中所述胺基酸序列之重鏈。

包含Ab32 HCv之實例性重鏈係包含SEQ ID NO：143中所述胺基酸序列之重鏈。

包含Ab33 HCv之實例性重鏈係包含SEQ ID NO：144中所述胺基酸序列之重鏈。

所設想支架之其他實例包括：纖連蛋白、新抑癌素CBM4-2、載脂蛋白、T-細胞受體、蛋白質-A結構域(蛋白質Z)、Im9、TPR蛋白質、鋅指結構域、pVIII、鳥類胰臟多肽、GCN4、WW結構域Src同源結構域3、PDZ結構域、TEM-1 β內醯胺酶、硫氧還蛋白、葡萄球菌核酶、PHD-指結構域、CL-2、BPTI、APPI、HPSTI、依可汀(ecotin)、LACI-D1、LDTI、MTI-II、蠍毒素、昆蟲防衛素-A肽、EETI-II、Min-23、CBD、PBP、細胞色素b-562、Ldl受體結構域、γ晶體蛋白、泛素、運鐵蛋白及或C型凝集素樣結構域。非抗體支架及其作為治療劑之應用綜述於Gebauer及Skerra，Curr.Opin.Chem.Biol.,13：245-255(2009)及Binz等人，Nat.Biotech.,23(10)：1257-1268(2005)中，該等文獻之全部內容皆以引用方式併入本文中。

本發明態樣包括包含以下可變結構域之抗體：Ab1 LCv/Ab1 HCv(SEQ ID NO：95/SEQ ID NO：29)、Ab2 LCv/Ab2 HCv(SEQ ID NO：96/SEQ ID NO：30)、Ab3 LCv/Ab3 HCv(SEQ ID NO：97/SEQ ID NO：31)、Ab4 LCv/Ab4 HCv(SEQ ID NO：98/SEQ ID NO：32)、Ab5 LCv/Ab5 HCv(SEQ ID NO：99/SEQ ID NO：33)、Ab6 LCv/Ab6 HCv(SEQ ID NO：100/SEQ ID NO：34)、Ab7 LCv/Ab7 HCv(SEQ ID NO：101/SEQ ID NO：35)、Ab8 LCv/Ab8 HCv(SEQ ID NO：102/SEQ ID NO：36)、Ab9 LCv/Ab9 HCv(SEQ ID NO：103/SEQ ID NO：37)、Ab10 LCv/Ab10 HCv(SEQ ID NO：104/SEQ ID NO：38)、Ab11 LCv/Ab11 HCv(SEQ ID NO：105/SEQ ID NO：39)、Ab30 LCv/Ab30 HCv(SEQ ID NO：163/SEQ ID NO：145)、Ab32 LCv/Ab32 HCv(SEQ ID NO：164/SEQ ID NO：146)、Ab33 LCv/Ab33 HCv(SEQ ID NO：165/SEQ ID NO：147)及其組合以及其片段、衍生物、突變蛋白質及變體。

本發明之實例性抗體包括Ab1(SEQ ID NO：84/SEQ ID NO：18)、Ab2(SEQ ID NO：85/SEQ ID NO：19)、Ab3(SEQ ID NO：86/SEQ ID NO：20)、Ab4(SEQ ID NO：87/SEQ ID NO：21)、Ab5(SEQ ID NO：88/SEQ ID NO：22)、Ab6(SEQ ID NO：89/SEQ ID NO：23)、Ab7(SEQ ID NO：90/SEQ ID NO：24)、Ab8(SEQ ID NO：91/SEQ ID NO：25)、Ab9(SEQ ID NO：92/SEQ ID NO：26)、Ab10(SEQ ID NO：93/SEQ ID NO：27)、Ab11(SEQ ID NO：94/SEQ ID NO：28)、Ab30(SEQ ID NO：160/SEQ ID NO：142)、Ab32(SEQ ID NO：161/SEQ ID NO：143)及Ab33(SEQ ID NO：162/SEQ ID NO：144)。

通常，抗體輕鏈或重鏈之各可變結構域包含3個CDR。重鏈可變結構域包含重鏈CDR1(HCDR1)、重鏈CDR2(HCDR2)及重鏈CDR3(HCDR3)。輕鏈可變結構域包含輕鏈CDR1(LCDR1)、輕鏈CDR2(LCDR2)及輕鏈CDR3(LCDR3)。在某些實施例中，抗原結合蛋白質包含一或多個含於本文所述較佳可變結構域內之CDR。

此等CDR之實例包括(但不限於)：Ab1 LCv之CDR：LCDR1(SEQ ID NO：106)、LCDR2(SEQ ID NO：117)及LCDR3(SEQ ID NO：128)；Ab2 LCv之CDR：LCDR1(SEQ ID NO：107)、LCDR2(SEQ ID NO：118)及LCDR3(SEQ ID NO：129)；Ab3 LCv之CDR：LCDR1(SEQ ID NO：108)、LCDR2(SEQ ID NO：119)及LCDR3(SEQ ID NO：130)； Ab4 LCv之CDR：LCDR1(SEQ ID NO：109)、LCDR2(SEQ ID NO：120)及LCDR3(SEQ ID NO：131)；Ab5 LCv之CDR：LCDR1(SEQ ID NO：110)、LCDR2(SEQ ID NO：121)及LCDR3(SEQ ID NO：132)；Ab6 LCv之CDR：LCDR1(SEQ ID NO：111)、LCDR2(SEQ ID NO：122)及LCDR3(SEQ ID NO：133)；Ab7 LCv之CDR：LCDR1(SEQ ID NO：112)、LCDR2(SEQ ID NO：123)及LCDR3(SEQ ID NO：134)；Ab8 LCv之CDR：LCDR1(SEQ ID NO：113)、LCDR2(SEQ ID NO：124)及LCDR3(SEQ ID NO：135)；Ab9 LCv之CDR：LCDR1(SEQ ID NO：114)、LCDR2(SEQ ID NO：125)及LCDR3(SEQ ID NO：136)；Ab10 LCv之CDR：LCDR1(SEQ ID NO：115)、LCDR2(SEQ ID NO：126)及LCDR3(SEQ ID NO：137)；Ab11 LCv之CDR：LCDR1(SEQ ID NO：116)、LCDR2(SEQ ID NO：127)及LCDR3(SEQ ID NO：138)；Ab30 LCv之CDR：LCDR1(SEQ ID NO：166)、LCDR2(SEQ ID NO：169)及LCDR3(SEQ ID NO：172)；Ab32 LCv之CDR：LCDR1(SEQ ID NO：167)、LCDR2(SEQ ID NO：170)及LCDR3(SEQ ID NO：173)；Ab33 LCv之CDR：LCDR1(SEQ ID NO：168)、LCDR2(SEQ ID NO：171)及LCDR3(SEQ ID NO：174)；Ab1 HCv之CDR：HCDR1(SEQ ID NO：40)、HCDR2(SEQ ID NO：51)及HCDR3(SEQ ID NO：62)；Ab2 HCv之CDR：HCDR1(SEQ ID NO：41)、HCDR2(SEQ ID NO：52)及HCDR3(SEQ ID NO：63)； Ab3 HCv之CDR：HCDR1(SEQ ID NO：42)、HCDR2(SEQ ID NO：53)及HCDR3(SEQ ID NO：64)；Ab4 HCv之CDR：HCDR1(SEQ ID NO：43)、HCDR2(SEQ ID NO：54)及HCDR3(SEQ ID NO：65)；Ab5 HCv之CDR：HCDR1(SEQ ID NO：44)、HCDR2(SEQ ID NO：55)及HCDR3(SEQ ID NO：66)；Ab6 HCv之CDR：HCDR1(SEQ ID NO：45)、HCDR2(SEQ ID NO：56)及HCDR3(SEQ ID NO：67)；Ab7 HCv之CDR：HCDR1(SEQ ID NO：46)、HCDR2(SEQ ID NO：57)及HCDR3(SEQ ID NO：68)；Ab8 HCv之CDR：HCDR1(SEQ ID NO：47)、HCDR2(SEQ ID NO：58)及HCDR3(SEQ ID NO：69)；Ab9 HCv之CDR：HCDR1(SEQ ID NO：48)、HCDR2(SEQ ID NO：59)及HCDR3(SEQ ID NO：70)；Ab10 HCv之CDR：HCDR1(SEQ ID NO：49)、HCDR2(SEQ ID NO：60)及HCDR3(SEQ ID NO：71)；Ab11 HCv之CDR：HCDR1(SEQ ID NO：50)、HCDR2(SEQ ID NO：61)及HCDR3(SEQ ID NO：72)；Ab30 HCv之CDR：HCDR1(SEQ ID NO：148)、HCDR2(SEQ ID NO：151)及HCDR3(SEQ ID NO：154)；Ab32 HCv之CDR：HCDR1(SEQ ID NO：149)、HCDR2(SEQ ID NO：152)及HCDR3(SEQ ID NO：155)；及Ab33 HCv之CDR：HCDR1(SEQ ID NO：150)、HCDR2(SEQ ID NO：153)及HCDR3(SEQ ID NO：156)。

在一些實施例中，抗原結合蛋白質包含：A)多肽，例如，輕鏈，其包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列之LCDR1：SEQ ID NO：106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、166、167及168；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列之LCDR2：SEQ ID NO：117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、169、170及171；及/或具有選自由以下組成之群之胺基酸序列之LCDR3：SEQ ID NO：128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、172、173及174；及/或B)多肽，例如，重鏈，其包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列之HCDR1：SEQ ID NO：40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、148、149及150；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列之HCDR2：SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、151、152及153；及/或具有選自由以下組成之群之胺基酸序列之HCDR3：SEQ ID NO：62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、154、155及156。

在其他實施例中，抗原結合蛋白質包含A)包含以下之輕鏈胺基酸序列：Ab1 LCv、Ab2 LCv、Ab3 LCv、Ab4 LCv、Ab5 LCv、Ab6 LCv、Ab7 LCv、Ab8 LCv、Ab9 LCv、Ab10 LCv、Ab11 LCv、Ab30 LCv、Ab32 LCv及Ab33 LCv中任一者之LCDR1、LCDR2及LCDR3；以及B)包含以下之重鏈胺基酸序列：Ab1 HCv、Ab2 HCv、Ab3 HCv、Ab4 HCv、Ab5 HCv、Ab6 HCv、Ab7 HCv、Ab8 HCv、Ab9 HCv、Ab10 HCv、Ab11 HCv、Ab30 HCv、Ab32 HCv及Ab33 HCv中任一者之HCDR1、HCDR2及HCDR3。

在某些實施例中，CDR與本文所述實例性CDR相差不超過1個、不超過2個、不超過3個、不超過4個、不超過5個或不超過6個之胺基酸添加、缺失或取代。

本發明態樣包括包含選自由以下組成之群之輕鏈可變結構域之抗體：SEQ ID NO：95、96、97、98、99、100、101、102、103、 104、105、163、164及165。本發明態樣包括包含選自由以下組成之群之重鏈可變結構域之抗體：SEQ ID NO：29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、145、146及147。本發明其他態樣包括包含以下之抗體：A)選自由以下組成之群之輕鏈可變結構域：SEQ ID NO：95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、163、164及165，及B)選自由以下組成之群之重鏈可變結構域：SEQ ID NO：29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、145、146及147。

本發明抗體可包含任何業內已知之恆定區。輕鏈恆定區可為(例如)κ-或λ-型輕鏈恆定區，例如人類κ-或λ-型輕鏈恆定區。重鏈恆定區可為(例如)α-、δ-、ε-、γ-或μ-型重鏈恆定區，例如人類α-、δ-、ε-、γ-、或μ-型重鏈恆定區。在一個實施例中，輕鏈或重鏈恆定區係天然存在恆定區之片段、衍生物、變體或突變蛋白質。

本發明態樣包括包含選自由以下組成之群之輕鏈可變區的抗體：SEQ ID NO：95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、163、164及165，該等序列具有不超過1個、不超過2個、不超過3個、不超過4個、不超過5個、不超過6個、不超過7個、不超過8個、不超過9個或不超過10個胺基酸添加、缺失或取代。本發明態樣包括包含選自由以下組成之群之重鏈可變區的抗體：SEQ ID NO：29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、145、146及147，該等序列具有不超過1個、不超過2個、不超過3個、不超過4個、不超過5個、不超過6個、不超過7個、不超過8個、不超過9個或不超過10個胺基酸添加、缺失或取代。本發明其他態樣包括包含以下之抗體：A)選自由以下組成之群之輕鏈可變區：SEQ ID NO：95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、163、164及165，該等序列具有不超過1個、不超過2個、不超過3個、不超過4個、不超過5個、不超過6個、不超過7個、不超過8個、不超過9個或不超過10個胺基酸添加、缺失或取代；及B)選自由以下組成之群之重鏈可變區：SEQ ID NO：29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、145、146及147，該等序列具有不超過1個、不超過2個、不超過3個、不超過4個、不超過5個、不超過6個、不超過7個、不超過8個、不超過9個或不超過10個胺基酸添加、缺失或取代。

在一種變化形式中，抗原結合蛋白質包含與選自由以下組成之群之輕鏈可變區胺基酸序列至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、163、164及165。在另一變化形式中，抗原結合蛋白質包含與選自由以下組成之群之重鏈可變區胺基酸序列至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、145、146及147。在另一實施例中，抗原結合蛋白質包含A)與選自由以下組成之群之輕鏈可變區胺基酸序列至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、163、164及165；以及B)與選自由以下組成之群之重鏈可變區胺基酸序列至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、145、146及147。

在某些實施例中，抗原結合蛋白質包含輕鏈及/或重鏈CDR3。在一些實施例中，抗原結合蛋白質包含選自SEQ ID NO：128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、172、173、174、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、154、155及156中所述序列之群之胺基酸序列。在某些實施例中，胺基酸序列與SEQ ID NO：128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、172、173、174、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、154、155及156中所述實例性序列相差不超過1個、不超過2個、不超過3個、不超過4個、不超過5個或不超過6個胺基酸添加、缺失或取代。因此，本發明實施例包括包含與選自SEQ ID NO：128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、172、173、174、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、154、155及156中所述序列之群之胺基酸序列至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列的抗原結合蛋白質。

在某些實施例中，抗原結合蛋白質包含輕鏈及/或重鏈CDR2。在一些實施例中，抗原結合蛋白質包含選自SEQ ID NO：117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、169、170、171、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、151、152及153中所述序列之群之胺基酸序列。在某些實施例中，胺基酸序列與SEQ ID NO：117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、169、170、171、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、151、152及153中所述實例性序列相差不超過1個、不超過2個、不超過3個、不超過4個、不超過5個或不超過6個胺基酸添加、缺失或取代。因此，本發明實施例包括包含與選自SEQ ID NO：117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、169、170、171、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、151、152及153中所述序列之群之胺基酸序列至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列的抗原結合蛋白質。

在某些實施例中，抗原結合蛋白質包含輕鏈及/或重鏈CDR1。在一些實施例中，抗原結合蛋白質包含選自SEQ ID NO：106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、166、167、168、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、148、149及150中所述序列之群之胺基酸序列。在某些實施例中，胺基酸序列與SEQ ID NO：106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、166、167、168、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、148、149及150中所述實例性序列相差不超過1個、不超過2個、不超過3個、不超過4個、不超過5個或不超過6個胺基酸添加、缺失或取代。因此，本發明實施例包括包含與選自SEQ ID NO：106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、166、167、168、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、148、149及150中所述序列之群之胺基酸序列至少80%、至少81%、至少82%、至少 83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列的抗原結合蛋白質。

本發明之抗原結合蛋白質包含傳統抗體之支架，該等傳統抗體包括人類及單株抗體、雙特異性抗體、雙功能抗體、微型抗體、結構域抗體、合成抗體(在本文中有時稱作「抗體模擬物」)、嵌合抗體、抗體融合物(有時稱作「抗體偶聯物」)及分別各自之片段。可將上述CDR(包括CDR之各種組合)移植至任一以下支架中。

本文所用術語「抗體」係指特異性結合抗原之各種形式的包含一或多條多肽鏈之單體或多聚蛋白質，如本文以不同方式所述。在某些實施例中，抗體係藉由重組DNA技術產生。在其他實施例中，抗體係藉由酶促或化學裂解天然存在之抗體產生。在另一態樣中，抗體係選自由以下組成之群：a)人類抗體、b)人類化抗體、c)嵌合抗體、d)單株抗體、e)多株抗體、f)重組抗體、g)抗原-結合片段、h)單鏈抗體、i)雙鏈抗體、j)雙鏈抗體、k)雙鏈抗體、l)Fab片段、m)F(ab’)₂片段、n)IgA抗體、o)IgD抗體、p)IgE抗體、q)IgG1抗體、r)IgG2抗體、s)IgG3抗體、t)IgG4抗體及u)IgM抗體。

可變區或結構域包含至少3個嵌入框架區(命名為框架區FR1、FR2、FR3及FR4)內之重鏈或輕鏈CDR。Kabat等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Public Health Service N.I.H.,Bethesda,MD。傳統抗體結構單元通常包含四聚物。各四聚物通常係由兩個相同的多肽鏈對構成，各對具有一條「輕」鏈及一條「重」鏈。各鏈之胺基端部分包括主要負責抗原識別的具有約100個至110個或更多個胺基酸之可變區。各鏈的羧基端部分界定主要負責效應子功能之恆定區。將人類輕鏈分類為κ或λ輕鏈。將重鏈分類為μ、δ、γ、α 或ε，且將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG具有若干亞類，包括(但不限於)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM具有亞類，包括(但不限於)IgM1及IgM2。本發明實施例包括納入本文所述抗原結合蛋白質之可變結構域或CDR之抗體的所有此等類別及亞類。

一些天然存在之抗體(例如彼等在駱駝及駝馬中發現者)係由兩條重鏈組成之二聚物且不包括輕鏈。本發明涵蓋可結合ST2之兩條重鏈之二聚抗體或其片段。

重鏈及輕鏈之可變區通常展現相對保守之由3個超變區(即互補決定區或CDR)接合之框架區(FR)的相同一般結構。CDR主要負責抗原識別及結合。來自各對之兩條鏈的CDR由框架區對準，使其能夠與特異性表位結合。自N端至C端，輕鏈及重鏈二者皆包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。胺基酸在各結構域中之分配符合Kabat之定義。

CDR構成抗原結合之主要表面接觸點。輕鏈之CDR3且尤其重鏈之CDR3可構成輕鏈及重鏈可變區內抗原結合中之最重要的決定簇。在一些抗體中，重鏈CDR3似乎構成抗原與抗體之間的主要接觸區域。可使用僅改變CDR3之活體外選擇方案來改變抗體之結合性質或測定促成抗原結合之殘基。

天然存在之抗體通常包括將抗體引導至細胞途徑用於蛋白質分泌且通常不存在於成熟抗體中的信號序列。編碼本發明抗體之多核苷酸可編碼天然存在之信號序列或異源信號序列，如下文所述。

在一個實施例中，抗原結合蛋白質係包含1至6個本文所述實例性CDR之抗體。本發明抗體可為任一類型，包括IgM、IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgD、IgA或IgE抗體。在具體實施例中，抗原結合蛋白質係IgG型抗體，例如，IgG1抗體。

在一些實施例中，例如，當抗原結合蛋白質係具有完全重鏈及輕鏈之抗體時，CDR全部來自同一物種，例如，人類。另一選擇為，例如，在抗原結合蛋白質含有小於6個來自上文所概述之序列之CDR的實施例中，其他CDR可來自其他物種或可為不同於實例性序列中描繪之人類CDR者。例如，來自本文所鑑別合適序列之HCDR3及LCDR3區可與視情況選自替代物種或不同人類抗體序列或其組合之HCDR1、HCDR2、LCDR1及LCDR2一起使用。例如，本發明之CDR可替代商業相關嵌合或人類化抗體之CDR區。

具體實施例利用抗原結合蛋白質之為人類組份之支架組份。然而，在一些實施例中，支架組份可為來自不同物種之混合物。因此，若抗原結合蛋白質係抗體，則此抗體可為嵌合抗體及/或人類化抗體。一般而言，「嵌合抗體」與人類化抗體」二者係指組合來自超過一個物種之區之抗體。例如，「嵌合抗體」通常包含來自小鼠(或大鼠，在一些情況下)之可變區及來自人類之恆定區。

「人類化抗體」通常係指可變結構域框架區已交換為在人類抗體中發現之序列之非人類抗體。通常，在人類化抗體中，整個抗體(除一或多個CDR外)係由人類源多核苷酸編碼或除了在一或多個CDR內以外與此一抗體一致。將一些或全部由源自非人類有機體之核酸編碼之CDR移植至人類抗體可變區之β摺疊框架中以產生特異性由所移入CDR決定之抗體。此等抗體之產生闡述於(例如)WO 92/11018；Jones 1986,Nature 321：522-525；Verhoeyen等人，1988,Science 239：1534-1536中。人類化抗體亦可使用具有經遺傳改造之免疫系統之小鼠生成。Roquc等人，2004,Biotechnol.Prog.20：639-654。在本文所述實例性實施例中，所鑑別CDR係人類，且因此，此情況下之人類化抗體與嵌合抗體二者皆包括一些非人類CDR；例如，可生成包含HCDR3及LCDR3區且其他CDR區中之一或多者具有不同物種來源之人類化抗體。

在一個實施例中，ST2抗原結合蛋白質係多特異性抗體，且特別為雙特異性抗體，有時亦稱作「雙功能抗體」。該等係結合兩種或更多種不同抗原或單一抗原上之不同表位的抗體。在某些實施例中，雙特異性抗體結合ST2及人類效應子細胞(例如，T細胞)上之抗原。此等抗體可用於靶向針對表現ST2之細胞(例如表現ST2之腫瘤細胞)之效應子細胞反應。在較佳實施例中，人類效應子細胞抗原係CD3。美國專利第7,235,641號。製備雙特異性抗體之方法為業內已知。一種此類方法涉及改造重鏈之Fc部分以產生「隆凸(knob)」及「孔洞(hole)」，在細胞中共同表現時此有助於重鏈形成雜二聚物。U.S.7,695,963。另一方法亦涉及改造重鏈之Fc部分，但使用靜電牽引以在細胞中共同表現時促進雜二聚物形成，同時阻止重鏈形成均二聚物。WO 09/089,004，其全部內容以引用方式併入本文中。

在一個實施例中，ST2抗原結合蛋白質係微型抗體。微型抗體係包含scFv接合至CH3結構域之最小化抗體樣蛋白質。Hu等人，1996,Cancer Res.56：3055-3061。

在一個實施例中，ST2抗原結合蛋白質係結構域抗體；例如，參見美國專利第6,248,516號。結構域抗體(dAb)係抗體之功能性結合結構域，其對應於人類抗體之重(VH)鏈或輕(VL)鏈之可變區。dAB具有約13kDa之分子量或小於完全抗體大小的1/10。dAB在多種宿主(包括細菌、真菌及哺乳動物細胞系統)中充分表現。另外，dAb即使在受到諸如冷落乾燥或熱變性等苛刻條件後仍高度穩定且保留活性。例如，參見美國專利6,291,158、6,582,915、6,593,081、6,172,197；美國專利第2004/0110941號；歐洲專利0368684；美國專利6,696,245；WO04/058821；WO04/003019及WO03/002609。

在一個實施例中，ST2抗原結合蛋白質係抗體片段，亦即本文所概述保留對ST2之結合特異性之任一抗體之片段。在各實施例中，抗體結合蛋白質包含(但不限於)F(ab)、F(ab')、F(ab')2、Fv或單鏈Fv片段。最低程度地，本文所指抗體包含可特異性結合ST2之多肽，其包含輕鏈或重鏈可變區之全部或一部分，例如一或多個CDR。

結合ST2之抗體片段之其他實例包括(但不限於)(i)Fab片段，其由VL、VH、CL及CH1結構域組成；(ii)Fd片段，其由VH及CH1結構域組成；(iii)Fv片段，其由單一抗體之VL及VH結構域組成；(iv)dAb片段(Ward等人，1989,Nature 341：544-546)，其由單一可變結構域組成；(v)經分離CDR區；(vi)F(ab')₂片段，即包含兩個經連接Fab片段之二價片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結構域及VL結構域係由肽連接體連接，該連接體允許兩個結構域締合以形成抗原結合位點(Bird等人，1988,Science 242：423-426；Huston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879-5883)；(viii)雙特異性單鏈Fv二聚物(PCT/US92/09965)；及(ix)「雙功能抗體」或「三功能抗體」、藉由基因融合構築之多價或多特異性片段(Tomlinson等人，2000,Methods Enzymol.326：461-479；WO94/13804；Holliger等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-6448)。抗體片段可經改質。例如，該等分子可藉由納入連接VH及VL結構域之二硫橋來穩定(Reiter等人，1996,Nature Biotech.14：1239-1245)。本發明態樣包括該等片段之非CDR組份為人類序列之實施例。

在一個實施例中，ST2抗原結合蛋白質係完全人類抗體。在此實施例中，如上文所概述，具體結構包含所描述包含CDR區之完全重鏈及輕鏈。其他實施例利用本發明一或多個CDR與來自其他人類抗體之其他CDR、框架區、J及D區、恆定區等。例如，本發明CDR可替代任一數目之人類抗體、尤其商業相關抗體之CDR。

單鏈抗體可藉由用胺基酸橋(短肽連接體)連接重鏈與輕鏈可變結構域(Fv區)片段而產生單多肽鏈來形成。此等單鏈Fv(scFv)已可藉由將編碼肽連接體之DNA融合在編碼兩個可變結構域多肽(V_L及V_H)的DNA之間來製備。可使所得多肽自身摺疊回以形成抗原結合單體，或其可形成多聚物(例如二聚物、三聚物或四聚物)，此端視兩個可變結構域之間撓性連接體之長度而定(Kortt等人，1997,Prot.Eng.10：423；Kortt等人，2001,Biomol.Eng.18：95-108)。藉由組合包含不同V_L及V_H之多肽，可形成結合不同表位之多聚scFv(Kriangkum等人，2001,Biomol.Eng.18：31-40)。所研發用於產生單鏈抗體之技術包括彼等闡述於以下文獻中者：美國專利第4,946,778號；Bird,1988,Science 242：423；Huston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879；Ward等人，1989,Nature 334：544；de Graaf等人，2002,Methods Mol Biol.178：379-87。本發明涵蓋源自本文所提供抗體之單鏈抗體，包括(但不限於)包含以下之可變結構域組合之scFv：Ab1 LCv/Ab1 HCv(SEQ ID NO：95/SEQ ID NO：29)、Ab2 LCv/Ab2 HCv(SEQ ID NO：96/SEQ ID NO：30)、Ab3 LCv/Ab3 HCv(SEQ ID NO：97/SEQ ID NO：31)、Ab4 LCv/Ab4 HCv(SEQ ID NO：98/SEQ ID NO：32)、Ab5 LCv/Ab5 HCv(SEQ ID NO：99/SEQ ID NO：33)、Ab6 LCv/Ab6 HCv(SEQ ID NO：100/SEQ ID NO：34)、Ab7 LCv/Ab7 HCv(SEQ ID NO：101/SEQ ID NO：35)、Ab8 LCv/Ab8 HCv(SEQ ID NO：102/SEQ ID NO：36)、Ab9 LCv/Ab9 HCv(SEQ ID NO：103/SEQ ID NO：37)、Ab10 LCv/Ab10 HCv(SEQ ID NO：104/SEQ ID NO：38)及Ab11 LCv/Ab11 HCv(SEQ ID NO：105/SEQ ID NO：39)、Ab30 LCv/Ab30 HCv(SEQ ID NO：163/SEQ ID NO：145)、Ab32 LCv/Ab32 HCv(SEQ ID NO：164/SEQ ID NO：146)、Ab33 LCv/Ab33 HCv(SEQ ID NO：165/SEQ ID NO：147)及其組合。

在一個實施例中，ST2抗原結合蛋白質係抗體融合蛋白質(在本文中有時稱作「抗體偶聯物」)。偶聯物對象可為蛋白質性或非蛋白質性；後者通常係使用抗原結合蛋白質及偶聯物對象上之官能基生成。在某些實施例中，抗體偶聯至非蛋白質性化學品(藥物)以形成抗體藥物偶聯物。

在一個實施例中，ST2抗原結合蛋白質係抗體類似物，有時稱作「合成抗體」。例如，多種產品利用具有移植CDR之替代性蛋白質支架或人工支架。此等支架包括(但不限於)經引入以穩定結合蛋白質之三維結構的突變以及由(例如)生物相容性聚合物組成之完全合成支架。例如，參見Korndorfer等人，2003,Proteins：Structure,Function,and Bioinformatics，第53卷，第1期：121-129；Roque等人，2004,Biotechnol.Prog.20：639-654。另外，可使用肽抗體模擬物(「PAM」)，以及基於抗體模擬物之產品，其中利用纖連蛋白連接素組份作為支架。

本文所用「蛋白質」意指至少兩個共價附接之胺基酸，其包括蛋白質、多肽、寡肽及肽。在一些實施例中，兩個或更多個共價附接之胺基酸係由肽鍵附接。例如，當蛋白質係使用如下文所概述表現系統及宿主細胞重組製得時，蛋白質可由天然存在之胺基酸及肽鍵構成。另一選擇為，蛋白質可包括合成胺基酸(例如，高苯丙胺酸、瓜胺酸、鳥胺酸及正白胺酸)或可抵抗蛋白酶或其他生理及/或存儲條件之擬肽結構，即，「肽或蛋白質類似物」，例如類肽(參見，Simon等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：9367，以引用方式併入本文中)。此等合成胺基酸尤其可在藉由業內熟知之習用方法在活體外合成抗原結合蛋白質時納入。另外，可使用擬肽、合成及天然存在之殘基/結構之任何組合。「胺基酸」亦包括亞胺基酸殘基，例如脯胺酸及羥脯胺酸。胺基酸「R基團」或「側鏈」可呈(L)-或(S)-組態。在具體實施例中，胺基酸係呈(L)-或(S)-組態。

在某些態樣中，本發明提供結合ST2且在一些實施例中重組人類 ST2或其部分之重組抗原結合蛋白質。在此背景下，「重組蛋白質」係使用重組技術利用業內已知之任何技術及方法(即藉助如本文所述重組核酸之表現)製得之蛋白質。用於產生重組蛋白質之方法及技術為業內所熟知。本發明實施例包括結合野生型ST2之重組抗原結合蛋白質及其變體。

「基本上由......組成」意指，胺基酸序列可相對於所引述SEQ ID NO：序列改變約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%且仍保留生物學活性，如本文所述。

在一些實施例中，本發明抗原結合蛋白質係經分離蛋白質或實質上純的蛋白質。「經分離」蛋白質不伴有在自然狀態下通常所締合之材料之至少一些，例如構成給定試樣中總蛋白質之至少約5重量%或至少約50重量%。應理解，端視環境而定，經分離蛋白質可構成總蛋白質含量之5重量%至99.9重量%。例如，蛋白質可藉助使用誘導型啟動子或高表現啟動子以顯著更高之濃度製得，使得該蛋白質係以增加之濃度量製得。該定義包括在眾多種業內已知之有機體及/或宿主細胞中產生抗原結合蛋白質。

對於胺基酸序列而言，序列一致性及/或相似性係藉由使用業內已知之標準技術測定，包括(但不限於)Smith及Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2：482之局部序列一致性演算法、Needleman及Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48：443之序列一致性比對演算法、Pearson及Lipman,1988,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.85：2444之相似性搜索法、該等演算法之電腦化實施方案(GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，在Wisconsin Genetics Software Package中，Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wis.)、由Devereux等人，1984,Nucl.Acid Res.12：387-395闡述之最佳配合序列程式，較佳使用預設設定或藉由檢測。較佳地，一致性百分比係藉由FastDB基於以下參數計算：1之錯配罰分；1之空位罰分；0.33之空位大小罰分；及30之接合罰分，「Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,」Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications，第127-149頁(1988)，Alan R.Liss公司。

可用演算法之實例係PILEUP。PILEUP使用漸進性成對比對自一組有關序列產生多個序列比對。其亦可繪製用於產生比對之顯示成簇關係之樹。PILEUP使用Feng及Doolittle，1987,J.Mol.Evol.35：351-360之漸進性比對方法之簡化形式；該方法與由Higgins及Sharp，1989,CABIOS 5：151-153所述者相似。可用PILEUP參數包括3.00之預設空位加權值、0.10之預設空位長度加權值及加權末端空位。

可用演算法之另一實例係闡述於以下文獻中之BLAST演算法：「Altschul等人，1990,J.Mol.Biol.215：403-410；Altschul等人，1997,Nucleic AcidsRes.25：3389-3402；及Karin等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5787。尤其可用之BLAST程式係自Altschul等人，1996,Methods in Enzymology 266：460-480獲得之WU-BLAST-2程式。WU-BLAST-2使用若干搜索參數，多數設定為預設值。將可調節參數設定為以下值：重疊跨度=1，重疊分數=0.125，字臨限值(T)=II。HSP S及HSP S2參數係動態值且係由程式本身確定，此端視特定序列之組成及正在針對所關注序列搜索之特定數據庫之組成而定；然而，該等值可經調節以增加靈敏度。

另一可用演算法係空位BLAST，如由Altschul等人，1993,Nucl.Acids Res.25：3389-3402所報導。空位BLAST使用BLOSUM-62取代評分；臨限值T參數設定為9；使用兩命中法(two-hit method)以觸發無空位延伸；要求k之空位長度具有10+k之成本；X_u設定為16；且X_g在數據庫搜索階段設定為40且在演算法之輸出階段設定為67。對應於約22位元之評分觸發空位比對。

通常，個別變體CDR與本文所描繪之序列之間之胺基酸同源性、相似性或一致性係至少80%，且更通常具有較佳至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及幾乎100%之增加之同源性或一致性。以相似方式，關於本文所鑑別結合蛋白質之核酸序列之「核酸序列一致性百分比(%)」定義為候選序列中與抗原結合蛋白質之編碼序列中之核苷酸殘基一致之核苷酸殘基的百分比。具體方法利用設定為預設參數之WU-BLAST-2之BLASTN模組，其中分別將重疊跨度及重疊分數設定為1及0.125。

通常，編碼個別變體CDR之核苷酸序列與本文所描繪之核苷酸序列之間之核酸序列同源性、相似性或一致性係至少80%，且更通常具有較佳至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%及幾乎100%之增加之同源性或一致性。

因此，「變體CDR」係與本發明親本CDR具有指定同源性、相似性或一致性者，且共有生物功能，包括(但不限於)親本CDR之特異性及/或活性之至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。

儘管預先確定用於引入胺基酸序列變異之位點或區，但無需預先確定突變本身。例如，為了將給定位點處突變之性能最佳化，可在靶密碼子或靶區處實施隨機誘變並篩選表現抗原結合蛋白質CDR變體之期望活性之最佳組合。用於在具有已知序列之DNA中之預定位點處達成取代突變之技術為業內所熟知，例如，M13引子誘變及PCR誘變。使用抗原結合蛋白質活性分析(例如ST2結合)進行突變體之篩選。

胺基酸取代通常為單一殘基；插入通常將為約一(1)至約二十(20)個胺基酸殘基，但可容忍顯著更大之插入。缺失在約一(1)至約二十(20)個胺基酸殘基範圍內，但在一些情況下缺失可大得多。

取代、缺失、插入或其任一組合可用於達成最終衍生物或變體。通常，對幾個胺基酸進行該等改變以將該分子之改變、尤其抗原結合蛋白質之免疫原性及特異性最小化。然而，在某些情況下可容忍更大變化。保守取代通常係依照如表3中所描繪之下表實施。

功能或免疫學特性之實質性變化係藉由選擇保守性小於表3中所示之取代者實施。例如，可實施更顯著地影響以下之取代：改變區域中多肽主鏈之結構，例如α螺旋或β摺疊結構；靶位點處分子之電荷或疏水性；或側鏈之大小。一般而言，預計產生最大多肽性質變化之取代係彼等其中(a)親水性殘基(例如，絲胺醯基或蘇胺醯基)經(或由)疏水性殘基(例如，亮胺醯基、異亮胺醯基、苯丙胺醯基、纈胺醯基或丙胺醯基)取代者；(b)半胱胺酸或脯胺酸經(或由)任一其他殘基取代者；(c)具有正電側鏈之殘基(例如，離胺醯基、精胺醯基或組胺醯基)經(或藉由)負電殘基(例如，麩胺醯基或天冬氨醯基)取代者；或(d)具有龐大側鏈之殘基(例如，苯丙胺酸)經(或藉由)不具有側鏈者(例如，甘胺酸)取代者。

變體通常展現與天然存在之類似物相同之定性生物活性且將誘發與該類似物相同之免疫反應，但變體亦視需要經選擇以修改抗原結合蛋白質之特性。另一選擇為，變體可經設計以改變抗原結合蛋白質之生物活性。例如，可如本文所論述改變或去除糖基化位點。

在本發明範圍內的ST2抗體之其他衍生物包括ST2抗體或其片段與其他蛋白質或多肽的共價或聚集性偶聯物，例如藉由表現包含異源性多肽與ST2抗體多肽N端或C端融合之重組融合蛋白質而獲得者。例如，偶聯肽可為諸如酵母α因子前導子等異源信號(或前導子)多肽，或諸如表位標籤等肽。含有ST2抗體之融合蛋白質可包含經添加以促進ST2抗體之純化或鑑別的肽(例如聚His)。亦可將ST2抗體多肽連接至FLAG肽，如Hopp等人，Bio/Technology 6：1204,1988及美國專利5,011,912中所述。FLAG肽具有高抗原性且提供與特異性單株抗體(mAb)可逆結合之表位，從而使得能夠快速分析並且便捷地純化所表現重組蛋白。可用於製備使FLAG肽與給定多肽融合之融合蛋白質的試劑可在市面上購得(Sigma,St.Louis,MO)。

在一個實施例中，使用衍生自免疫球蛋白之多肽來製備寡聚物。包含某些與抗體衍生多肽中各部分(包括Fc結構域)融合之異源多肽之融合蛋白的製備已闡述於(例如)以下文獻中：Ashkenazi等人，1991,PNAS USA 88：10535；Byrn等人，1990,Nature 344：677；及Hollenbaugh等人，1992「Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins」，Current Protocols in Immunology，增刊4，第10.19.1-10.19.11頁。

本發明之一個實施例係關於包含兩種融合蛋白之二聚物，其係藉由融合ST2抗體之ST2結合片段與抗體之Fc區來產生。該二聚物可藉由(例如)以下方式來製備：將編碼融合蛋白質之融合基因插入合適表現載體中，在經重組表現載體轉化之宿主細胞中表現該基因融合物，並且使得可以非常類似抗體分子之方式組裝所表現融合蛋白質，隨後在Fc部分之間形成鏈間二硫鍵以產生二聚物。

本文所用術語「Fc多肽」包括衍生自抗體Fc區之多肽之天然及突變蛋白質形式。亦包括此等多肽之含有促進二聚化之鉸鏈區的截短形式。包含Fc部分(及自其形成之寡聚物)之融合蛋白質提供可在蛋白質A或蛋白質G管柱上藉由親和力層析便捷地純化之優點。

闡述於PCT申請案WO 93/10151(以引用方式併入本文中)中的一種適宜Fc多肽係自N端鉸鏈區延伸至人類IgG抗體Fc區之天然C端的單鏈多肽。另一可用Fc多肽係美國專利第5,457,035號及Baum等人，1994,EMBO J.13：3992-4001中所述之Fc突變蛋白質。此突變蛋白質之胺基酸序列與WO 93/10151中所示天然Fc序列相同，只是胺基酸19已自Leu變為Ala，胺基酸20已自Leu變為Glu，並且胺基酸22已自Gly變為Ala。突變蛋白質所展現針對Fc受體之親和性降低。

在其他實施例中，可用抗體重鏈及/或輕鏈中之可變部分取代ST2抗體中之重鏈及/或輕鏈可變部分。

製備寡聚ST2抗體衍生物之另一方法涉及使用離胺酸拉鏈。離胺酸拉鏈結構域係促進在其中發現該等結構域之蛋白質寡聚之肽。離胺酸拉鏈最初係在若干種DNA-結合蛋白中鑑別(Landschulz等人，1988,Science 240：1759)，並且此後發現其存於多種不同蛋白質中。已知離胺酸拉鏈係天然存在之肽及其二聚化或三聚化之衍生物。適於產生可溶性寡聚蛋白質之離胺酸拉鏈結構域之實例闡述於PCT申請案WO 94/10308中，且衍生自肺表面活性蛋白D(SPD)之離胺酸拉鏈闡述於Hoppe等人，1994,FEBS Letters 344：191中，其以引用方式併入本文中。經修飾白胺酸拉鏈之使用允許與其融合之異源蛋白質進行穩定三聚化，此闡述於Fanslow等人，1994,Semin.Immunol.6：267-78中。在一種方法中，在適宜宿主細胞中表現包含ST2抗體片段或衍生物融合至白胺酸拉鏈肽之重組融合蛋白質，且自培養物上清液回收形成之可溶性寡聚ST2抗體片段或衍生物。

抗原結合蛋白質之共價修飾包括在本發明範圍內，且通常(但並非總是)以轉譯後方式進行。藉由使抗原結合蛋白質之特定胺基酸殘基與能夠與所選側鏈或N-或C-端殘基反應之有機衍生化劑反應而將若干類型之抗原結合蛋白質共價修飾引入分子中。

最通常使半胱胺醯基殘基與α-鹵代乙酸酯(及對應胺)(例如氯乙酸或氯乙醯胺)反應，以獲得羧甲基或羧基醯胺基甲基衍生物。半胱胺醯基殘基亦係藉由與以下物質反應來衍生化：溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙醯基磷酸鹽、N-烷基馬來醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對-氯汞基苯甲酸鹽、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑。

組胺醯基殘基係藉由與焦碳酸二乙酯(pH 5.5-7.0)反應來衍生化，此乃因此試劑對組胺醯基側鏈具有相對特異性。亦可使用對溴苯醯甲基溴；較佳在0.1M二甲基胂酸鈉(pH 6.0)中實施該反應。

使離胺酸基及胺基端殘基與琥珀酸酐或其他羧酸酐反應。用該等試劑進行衍生化具有逆轉離胺酸基殘基電荷之效應。用於衍生化含α胺基殘基之其他適宜試劑包括醯亞胺酯，例如甲基吡啶亞胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氫化物；三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2,4-戊二酮；及轉胺酶催化之與乙醛酸酯之反應。

精胺醯基殘基係藉由與一種或若干習用試劑(尤其為苯甲醯甲醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮及茚三酮)反應來改質。精胺酸殘基之衍生化因胍官能基之高pK_a而需要在鹼性條件下實施反應。此外，該等試劑可與離胺酸之基團以及精胺酸ε-胺基反應。

可實施酪胺醯基殘基之特定改質，其中特別關注藉由與芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反應將光譜標記引入酪胺醯基殘基中。最通常地，分別使用N-乙醯基咪唑及四硝基甲烷來形成O-乙醯基酪胺醯基物質及3-硝基衍生物。酪胺醯基殘基係使用¹²⁵I或¹³¹I碘化以製備用於放射免疫分析中之經標記蛋白質，上述氯胺T方法適宜。

羧基側基(天冬胺醯基或麩胺醯基)係藉由與碳化二亞胺(R'-N=C=N--R')(例如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳化二亞胺)反應來選擇性改質，其中R及R'係視情況不同之烷基。此外，藉由與銨離子反應將天冬醯胺醯基及麩醯胺酸醯基殘基轉化成天冬醯胺醯基及麩胺醯基殘基。

用雙官能劑進行衍生化可用於將抗原結合蛋白質交聯至用於多種方法中之水不溶性載體基質或表面。常用交聯劑包括(例如)1,1-雙(二偶氮乙醯基)-2-苯基乙烷；戊二醛；N-羥基琥珀醯亞胺酯，例如，與4-疊氮基水楊酸之酯；同雙官能醯亞胺酯，包括二琥珀醯亞胺基酯，例如3,3'-二硫雙(珀醯亞胺基丙酸酯)；及雙官能馬來醯亞胺，例如雙-N-馬來醯亞胺基-1,8-辛烷。諸如3-[(對疊氮基苯基)二硫]丙亞胺酸甲酯等衍生化劑產生能夠在光存在下形成交聯之可光活化中間體。另一選擇為，採用諸如溴化氰活化之碳水化合物等反應性水不溶性基質及闡述於美國專利第3,969,287號、第3,691,016號、第4,195,128號、第4,247,642號、第4,229,537號及第4,330,440號中之反應性基板進行蛋白質固定。

通常將麩醯胺酸醯基及天冬醯胺醯基殘基分別脫去醯胺基成對應麩胺醯基及天冬胺醯基殘基。另一選擇為，在弱酸性條件下將該等殘基脫去醯胺基。該等殘基中之任一形式皆屬於本發明範圍內。

其他改質包括脯胺酸及離胺酸之羥基化、絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基之磷酸化、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α胺基之甲基化(T.E.Creighton,Proteins：Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,1983，第79-86頁)、N端胺之乙醯基化及任一C端羧基之醯胺化。

包括在本發明範圍內的抗原結合蛋白質之另一類型之共價改質包含改變蛋白質之糖基化模式。如業內已知，糖基化模式可取決於蛋白質之序列(例如，存在或不存在特定糖基化胺基酸殘基，下文所論述)或產生該蛋白質之宿主細胞或有機體二者。特定表現系統論述於下文中。

多肽糖基化通常係經N-連接或O-連接。N-連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈的附接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X係除脯胺酸外之任何胺基酸)係用於酶促附接碳水化合物部分與天冬醯胺側鏈之識別序列。因此，多肽中任一該等三肽序列之存在皆可形成潛在糖基化位點。O-連接糖基化係指一種糖(N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖)與羥基胺基酸(最通常為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸)之附接。

通常藉由改變胺基酸序列以使抗體含有一或多個上述三肽序列(對於N-連接糖基化位點)來將糖基化位點方便地添加至抗體中。亦可藉由向起始序列中添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或用一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基實施取代(對於O-連接糖基化位點)來達成該改變。為方便起見，抗原結合蛋白質胺基酸較佳係經由DNA層面之變化來改變，尤其藉由使編碼靶多肽之DNA之預先鹼基突變以生成將轉譯成期望胺基酸之密碼子來改變。

增加抗原結合蛋白質上碳水化合物部分之數目之另一手段係藉由糖苷至蛋白質之化學或酶促偶合。該等程序係有利的，原因在於其無需在具有關於N-及O-連接糖基化之糖基化能力之宿主細胞中產生蛋白質。端視所用偶合模式而定，糖可附接至(a)精胺酸及組胺酸；(b)游離羧基；(c)游離巰基，例如半胱胺酸之彼等；(d)游離羥基，例如絲胺酸、蘇胺酸或羥脯胺酸之彼等；(e)芳香族殘基，例如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之彼等；或(f)麩醯胺酸之醯胺。該等方法闡述於1987年9月11日公開之WO 87/05330中，以及Aplin及Wriston，1981,CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306頁中。

可以化學或酶促方式去除存在於起始抗原結合蛋白質上之碳水化合物部分。化學去糖基化需要使蛋白質暴露於化合物三氟甲磺酸或等效化合物。此處理可裂解除連接糖(N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺)外之多數或全部糖，同時留下完整多肽。化學去糖基化闡述於Hakimuddin等人，1987,Arch.Biochem.Biophys.259：52及Edge等人，1981,Anal.Biochem.118：131中。多肽上碳水化合物部分之酶促裂解可藉由使用如Thotakura等人，1987,Meth.Enzymol.138：350中所述之多種內-及外-糖苷酶來達成。潛在糖基化位點處之糖基化可藉由使用如Duskin等人，1982,J.Biol.Chem.257：3105中所述化合物衣黴素(tunicamycin)來阻止。衣黴素阻斷蛋白質-N-糖苷連接形成。

抗原結合蛋白質之另一類型之共價改質包含以下列專利中所述之方式將抗原結合蛋白質連接至各種非蛋白質性聚合物，包括(但不限於)各種多元醇(例如聚乙二醇、聚丙二醇)或聚氧化伸烷基：美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號或第4,179,337號。另外，如業內已知，可在抗原結合蛋白質內之各個位置處實施胺基酸取代以促進諸如PEG等聚合物之添加。

在一些實施例中，本發明抗原結合蛋白質之共價改質包含添加一或多個標記。

術語「標記基團」意指任何可檢測標記。適宜標記基團之實例包括(但不限於)以下：放射性同位素或放射性核素(例如，³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)、螢光基團(例如，FITC、玫瑰紅(rhodamine)、鑭系元素磷光體)、酶基團(例如，辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光基團、生物素基團或由二級報告子識別之預定多肽表位(例如，白胺酸拉鏈對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合結構域、表位標籤)。在一些實施例中，經由不同長度之間隔子臂將標記基團偶合至抗原結合蛋白質以降低潛在的空間位阻。標記蛋白質之各種方法為業內已知且可用於實施本發明。

一般而言，標記端視欲在其中檢測其之分析分為多個類別：a)同位素標記，其可為放射性或重質同位素；b)磁性標記(例如，磁性粒子)；c)氧化還原活性部分；d)光學染料；酶基團(例如辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；e)生物素化基團；及f)由二級報告子識別之預定多肽表位(例如，白胺酸拉鏈對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合結構域、表位標籤等)。在一些實施例中，經由不同長度之間隔子臂將標記基團偶合至抗原結合蛋白質以降低潛在的空間位阻。標記蛋白質之各種方法為業內已知且可用於實施本發明。

特定標記包括光學染料，包括(但不限於)發色團、磷光體及螢光團，其中後者在許多情況下係特定的。螢光團可為「小分子」螢光體(fluore)或蛋白質性螢光體。

「螢光標記」意指可經由其固有螢光性質檢測之任何分子。適宜螢光標記包括(但不限於)螢光素、玫瑰紅、四甲基玫瑰紅、伊紅、紅螢素(erythrosin)、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石綠色、茋、螢光黃(Lucifer Yellow)、瀑布藍(Cascade BlueJ)、德克薩斯紅(Texas Red)、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC紅640、Cy 5、Cy 5.5、LC紅705、俄勒岡綠(Oregon green)、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、瀑布藍、瀑布黃及R-藻紅素(PE)(Molecular Probes,Eugene,OR)、FITC、玫瑰紅及德克薩斯紅(Pierce,Rockford,IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science,Pittsburgh,PA)。包括發色團在內之適宜光學染料闡述於Molecular Probes Handbook(Richard P.Haugland)中，該文獻以引用方式明確地併入本文中。

適宜蛋白質性螢光標記亦包括(但不限於)綠色螢光蛋白質，包括海腎(Renilla)、海筆(Ptilosarcus)或水母(Aequorea)物種之GFP(Chalfie等人，1994,Science 263：802-805)；EGFP(Clontech Laboratories公司，Genbank登錄號U55762)；藍色螢光蛋白質(BFP,Quantum Biotechnologies公司，1801 de Maisonneuve Blvd.West,8th Floor,Montreal,Quebec,Canada H3H 1J9；Stauber,1998,Biotechnologies 24：462-471；Heim等人，1996,Curr.Biol.6：178-182)；強化黃色螢光蛋白質(EYFP,Clontech Laboratories公司)；螢光素酶(Ichiki等人，1993,J.Immunol.150：5408-5417)；β半乳糖苷酶(Nolan等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2603-2607)及海腎(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美國專利第5292658號、第5418155號、第5683888號、第5741668號、第5777079號、第5804387號、第5874304號、第5876995號、第5925558號)。所有上述參考文獻皆以引用方式明確地併入本文中。

本文所述實例性抗原結合蛋白質具有基於抗原結合蛋白質所結合之ST2上之獨特表位的性質。術語「表位」意指當抗原結合蛋白質結合靶分子時，該靶分子之與該抗原結合蛋白質(例如，抗體)接觸之胺基酸。表位可鄰接或不鄰接，例如，(i)在單鏈多肽中，不在該多肽序列中彼此鄰接但在靶分子背景內之胺基酸殘基與抗原結合蛋白質結合，或(ii)在包含兩種或更多種個別組份(例如，ST2及AcP)之多聚受體中，胺基酸殘基存在於該等個別組份之一或多者上，但仍與抗原結合蛋白質結合。表位決定簇可包括分子之化學活性表面基團，例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，且可具有特定三維結構特性及/或特定電荷特性。通常，對特定靶分子具有特異性之抗原結合蛋白質在蛋白質及/或巨分子之複雜混合物中將優先識別靶分子上之表位。

表徵與抗原結合蛋白質結合之表位之方法為業內所熟知，包括(但不限於)分箱(binning)(交叉競爭)(Miller等人，「Epitope binning of murine monoclonal antibodies by a multiplexed pairing assay」J Immunol Methods(2011)365,118-25)、肽定位(例如，PEPSPOT^TM)(Albert等人，「The B-cell Epitope of the Monoclonal Anti-Factor VIII Antibody ESH8 Characterized by Peptide Array Analysis」2008 Thromb Haemost 99,634-7)、諸如嵌合體等誘變方法(Song等人，「Epitope Mapping of Ibalizumab,a Humanized Anti-CD4 Monoclonal Antibody with Anti-HIV-1 Activity in Infected Patients」J.Virol.(2010)84,6935-6942)、丙胺酸掃描(Cunningham及Wells「High-resolution epitope mapping of HGH-receptor interactions by alanine-scanning mutagenesis」Science(1989)244,1081-1085)、精胺酸掃描(Lim等人，「A diversity of antibody epitopes can induce signaling through the erythropoietin receptor」Biochemistry(2010)49,3797-3804)、HD交換方法(Coates等人，「Epitope mapping by amide hydrogen/deuterium exchange coupled with immobilization of antibody,on-line proteolysis,liquid chromatography and mass spectrometry」Rapid Commun.Mass Spectrom.(2009)23639-647)、NMR交叉飽和方法(Morgan等人「Precise epitope mapping of malaria parasite inhibitory antibodies by TROSY NMR cross-saturation」Biochemistry(2005)44,518-23)及結晶學(Gerhardt等人，「Structure of IL-17A in complex with a potent,fully human neutralizing antibody」J.Mol.Biol(2009)394,905-21)。該等方法在其所提供關於包含表位之胺基酸之細節程度上有所不同。

本發明抗原結合蛋白質包括彼等與本文所述實例性抗原結合蛋白質(例如，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab30、Ab32或Ab33)具有重疊表位者。在某些實施例中，該抗原結合蛋白質與實例性抗原結合蛋白質具有一致之表位。在其他實施例中，抗原結合蛋白質僅結合與實例性抗原結合蛋白質相同之胺基酸亞群。

在某些實施例中，ST2抗原結合蛋白質與Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab30、Ab32或Ab33具有一致或重疊之表位且包含a)與SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164或SEQ ID NO：165中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域；b)與SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：147中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；或c)a)之輕鏈可變結構域及b)之重鏈可變結構域。

在某些實施例中，ST2抗原結合蛋白質與Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab30、Ab32或Ab33具有一致或重疊之表位，且包含與SEQ ID NO：95中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：29中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：96中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：30中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：97中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：31中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：98中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：32中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：99中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：33中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：100中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：34中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：101中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：35中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：102中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：36中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：103中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：37中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：104中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：38中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：105中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：39中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：163中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：145中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：164中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：146中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域；及彼等包含以下者：與SEQ ID NO：165中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：147中所述胺基酸序列具有至少90%一致性、至少95%一致性或一致之重鏈可變結構域。

在某些實施例中，ST2抗原結合蛋白質與Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab30、Ab32或Ab33具有一致或重疊之表位，且包含a)與SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164或SEQ ID NO：165中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域；b)與SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：147中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；或c)a)之輕鏈可變結構域及b)之重鏈可變結構域。

在某些實施例中，ST2抗原結合蛋白質與Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab30、Ab32或Ab33具有一致或重疊之表位，且包含與SEQ ID NO：95中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：29中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：96中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：30中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：97中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：31中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：98中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：32中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：99中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：33中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：100中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：34中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：101中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：35中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：102中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：36中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：103中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：37中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：104中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：38中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：105中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：39中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：163中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：145中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；彼等包含以下者：與SEQ ID NO：164中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：146中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域；及彼等包含以下者：與SEQ ID NO：165中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的輕鏈可變結構域及與SEQ ID NO：147中所述胺基酸序列相差不超過10個或不超過5個胺基酸添加、缺失或取代的重鏈可變結構域。

在某些實施例中，ST2抗原結合蛋白質與Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab30、Ab32或Ab33具有一致或重疊之表位，且包含含有以下之輕鏈可變結構域：a)與SEQ ID NO：106中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：117中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：128中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；b)與SEQ ID NO：107中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：118中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及來自LCDR3序列中所述SEQ ID NO：129之具有不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；c)來自序列SEQ ID NO：108中所述LCDR1之具有不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：119中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：130中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；d)與SEQ ID NO：109中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：120中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：131中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；e)與SEQ ID NO：110中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：121中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：132中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；f)與SEQ ID NO：111中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：122中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：133中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；g)與SEQ ID NO：112中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：123中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：134中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；h)與SEQ ID NO：113中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：124中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：135中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；i)與SEQ ID NO：114中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：125中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：136中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；j)與SEQ ID NO：115中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：126中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：137中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；k)與SEQ ID NO：116中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：127中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：138中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；l)與SEQ ID NO：166中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：169中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：172中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；m)與SEQ ID NO：167中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：170中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：173中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；或n)與SEQ ID NO：168中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：171中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：174中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；及包含以下之重鏈可變結構域：o)與SEQ ID NO：4O中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：51中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：62中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；p)與SEQ ID NO：41中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：52中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：63中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；q)與SEQ ID NO：42中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：53中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：64中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；r)與SEQ ID NO：43中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：54中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：65中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；s)與SEQ ID NO：44中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：55中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：66中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；t)與SEQ ID NO：45中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：56中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：67中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；u)與SEQ ID NO：46中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：57中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：68中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；v)與SEQ ID NO：47中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：58中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：69中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；w)與SEQ ID NO：48中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：59中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：70中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；x)與SEQ ID NO：49中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：60中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：71中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；y)與SEQ ID NO：50中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：61中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：72中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；z)與SEQ ID NO：148中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：151中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：154中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；aa)與SEQ ID NO：149中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：152中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：155中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3；或bb)與SEQ ID NO：150中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：153中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：156中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3。

上文剛剛闡述之較佳ST2抗原結合蛋白質包括彼等包含a)之輕鏈可變結構域及o)之重鏈可變結構域者；彼等包含b)之輕鏈可變結構域及p)之重鏈可變結構域者；彼等包含c)之輕鏈可變結構域及q)之重鏈可變結構域者；彼等包含d)之輕鏈可變結構域及r)之重鏈可變結構域者；彼等包含e)之輕鏈可變結構域及s)之重鏈可變結構域者；彼等包含f)之輕鏈可變結構域及t)之重鏈可變結構域者；彼等包含g)之輕鏈可變結構域及u)之重鏈可變結構域者；彼等包含h)之輕鏈可變結構域及v)之重鏈可變結構域者；彼等包含i)之輕鏈可變結構域及w)之重鏈可變結構域者；彼等包含j)之輕鏈可變結構域及x)之重鏈可變結構域者；彼等包含k)之輕鏈可變結構域及y)之重鏈可變結構域者；彼等包含l)之輕鏈可變結構域及z)之重鏈可變結構域者；彼等包含m)之輕鏈可變結構域及aa)之重鏈可變結構域者；以及彼等包含n)之輕鏈可變結構域及bb)之重鏈可變結構域者。

具有一致表位或重疊表位之抗原結合蛋白質通常將交叉競爭與抗原結合。因此，在某些實施例中，本發明抗原結合蛋白質與Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab30、Ab32或Ab33交叉競爭。「交叉競爭(cross-compete或cross-competition)」意指抗原結合蛋白質競爭靶標上之相同表位或結合位點。此競爭可藉由以下分析測定：參考抗原結合蛋白質(例如，抗體或抗原結合部分)阻止或抑制測試抗原結合蛋白質之特異性結合且反之亦然。可使用多種競爭性結合分析來測定測試分子是否與參考分子競爭結合。可採用之分析之實例包括固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心式競爭分析(例如，參見Stahli等人(1983)Methods in Enzymology 9：242-253)、固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(例如，參見Kirkland等人，(1986)J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接標記分析、固相直接標記夾心式分析、Luminex(Jia等人，「A novel method of Multiplexed Competitive Antibody Binning for the characterization of monoclonal antibodies」J.Immunological Methods(2004)288,91-98)及表面電漿共振((Song等人，「Epitope Mapping of Ibalizumab,a Humanized Anti-CD4 Monoclonal Antibody with Anti-HIV-1 Activity in Infected Patients」J.Virol.(2010)84,6935-6942)。測定交叉競爭之實例性方法闡述於實例5中。通常，當競爭抗原結合蛋白質過量存在時，其會將參考抗原結合蛋白質與常見抗原之結合抑制至少50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些情況下，將結合抑制至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。

Ab2以高親和力結合人類及食蟹猴ST2並阻斷IL-33結合ST2，由此阻斷IL-33介導之ST2信號傳導。與Ab2具有一致、相似或重疊表位之抗體可共有該等獨特特性。在較佳實施例中，ST2抗原結合蛋白質與Ab2交叉競爭結合ST2。與Ab2交叉競爭之實例性ST2抗原結合蛋白質包括Ab1、Ab3、Ab5、Ab7、Ab8及Ab30(參見實例5)。若嘗試發現與Ab2結合重疊、相似或一致之表位之抗體，則可針對與Ab2交叉競爭篩選一或多種抗體。此外，當製備與Ab2交叉反應之抗體之變體時，則可篩選此等抗體以測定在變異後是否維持交叉競爭，表明變體之表位未自親本分子顯著改變。因此，在某些實施例中，本發明提供與Ab2交叉競爭結合ST2之抗體變體。

除與彼此交叉競爭外，具有重疊、相似或一致表位之抗體亦可以相似方式受ST2誘變影響。某些突變可抑制抗體之結合；其他可增強或活化結合。在實例11中，對ST2之一部分細胞外結構域實施掃描精胺酸/丙胺酸誘變並測定對實例性抗體之效應。本發明範圍內包括具有以下特性之ST2結合蛋白質，使得其以與實例性抗體相似之方式受到誘變影響。

在某些實施例中，ST2抗原結合蛋白質之結合受ST2中之單一突變抑制，其中單一突變係選自由以下組成之群：L14R、I15R、S33R、E43R、V47R、A62R、G65R、T79R、D92R、D97R、V104R、G138R、N152R及V176R。在較佳實施例中，該群中2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個、9個或更多個、10個或更多個或全部中任一者之單一突變個別地抑制ST2結合蛋白質之結合。在其他實施例中，ST2抗原結合蛋白質之結合由ST2中之單一突變活化，其中該單一突變係選自由以下組成之群：L53R、R72A及S73R。在較佳實施例中，該群中之全部單一突變個別地活化ST2結合蛋白質之結合。在較佳實施例中，ST2抗原結合蛋白質共有Ab2之屬性且受L14R、I15R、S33R、E43R、V47R、A62R、G65R、T79R、D92R、D97R、V104R、G138R、N152R及V176R中之任一者抑制並且由L53R、R72A、S73R中之任一者活化。

基於表位表徵抗體之另一方法係醯胺氫/氘交換(HDX)。HDX已廣泛地用於研究蛋白質構象及動力學、蛋白質-配體交互作用及蛋白質-蛋白質交互作用(Zhang及Smith 1993，Engen及Smith 2001)。質譜檢測提供強有力之工具來測定交換程度，此乃因用氘替代單一氫可使每次交換之質量增加1Da。HDX之程度可在肽層面上藉由在受控條件下藉助液相層析結合串聯質譜分析蛋白質水解消化物來容易地量測(Engen及Smith 2001，Baerga-Ortiz,Hughes等人2002，Codreanu、Ladner等人2002，Hamuro、Coales等人2006，Coales、Tuske等人2009，Zhang、Zhang等人2012)。

在抗體(游離對結合狀態)不存在及存在下，比較ST2之蛋白質水解消化物之間之抗原HDX概況可揭示交互作用位點。具體而言，當抗體結合ST2時，游離ST2中之溶劑可及醯胺氫可受到保護，且因此，觀察到較緩慢之交換速率。因此，抗體存在下比其不存在下獲得更少之氘之區係潛在結合表位。當測定表位時，考慮其他因素，包括游離狀態下之交換速率、對抗原蛋白質結構之瞭解以及來自其他表位定位努力之結果。

Ab2與T2之結合係藉由HDX分析，如實例12中所述。分析證實，Ab2結合ST2結構之包含SEQ ID NO：1之胺基酸19-322之胺基酸33-44及88-94之部分(分別為成熟ST2之胺基酸15-26及70-76)/改變其交換速率。與Ab2具有重疊表位、相似或一致表位之抗體亦將結合SEQ ID NO：1之33-44及88-94內之胺基酸/改變其交換速率。在某些實施例中，當結合ST2並藉由HDX分析時，ST2結合蛋白質(例如，抗體)保護SEQ ID NO：1之胺基酸33-44中之任一者。在其他實施例中，保護胺基酸88-94中之任一者。二者皆指示，結合表位與Ab2部分重疊。在較佳實施例中，保護33-44中之任一者與88-94中之任一者二者。在某些實施例中，當結合ST2並藉由HDX分析時，ST2結合蛋白質(例如，抗體)保護SEQ ID NO：1之全部胺基酸33-44。在其他實施例中，保護全部胺基酸88-94。二者皆指示，與Ab2具有相似結合表位。在較佳實施例中，保護全部33-44與全部88-94二者，從而指示與Ab2一致或接近一致之表位。

使用X射線結晶學進一步分析Ab2與ST2之結合。X射線結晶學與HDX分析一致。Ab與抗原之間之界面可藉由諸多方式測定/界定。在實例13中，界面係使用溶劑暴露差異且藉由距離來測定。在如藉由溶劑暴露差異或小於5之距離所測定在與Ab2之界面內之ST2殘基係(對應於成熟ST2(缺乏前導序列)中之位置)K1、F2、P19、R20、Q21、G22、K23、Y26、I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、 R78、T79及Y81。在某些實施例中，ST2結合蛋白質與ST2形成與Ab2之界面重疊之界面，包括彼等其中K1、F2、P19、R20、Q21、G22、K23、Y26、I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79或Y81中之任一者在界面內者。在一些實施例中，ST2結合蛋白質與ST2形成界面，其中P19、R20、Q21、G22、K23及/或Y26在界面內。在其他實施例中，I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79及/或Y81在界面內。在較佳實施例中，K1、F2、P19、R20、Q21、G22、K23、Y26、I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79及Y81在界面內。

晶體結構指示，某些胺基酸殘基與Ab2之胺基酸形成氫鍵或鹽橋。彼等殘基包括K1、R20、K23、Y26、T75、N77、R78及T79。在某些實施例中，ST2抗原結合蛋白質與K1、R20、K23、Y26、T75、N77、R78及T79中之一或多者形成氫鍵或鹽橋。

晶體結構進一步提供關於Ab2之哪些殘基與ST2形成界面之資訊。圖10指示輕鏈可變區及重鏈可變區中與ST2形成界面之殘基。亦指示與ST2中之胺基酸形成氫鍵或鹽橋之殘基。可使用此資訊來設計Ab2之變體，包括彼等含有以下者：與Ab2之輕鏈或重鏈可變結構域具有90%一致性、95%一致性及在其中有10個或更少個插入、缺失及/或取代之可變結構域。可能希望維持界面內之胺基酸，同時改變非界面殘基。因此，可設計並產生維持結合ST2之在Ab2之一或多個CDR內具有一或多個胺基酸添加、取代及/或缺失的Ab2變體。

在一些實施例中，ST2結合蛋白質包含Ab2輕鏈可變區(SEQ ID NO：96)之變體，其中D28、I29、S30、N31、Y32、Y49、D50、N53、E55、T56、D91、D92、N93、F94及/或L96保持不變化或包含其保守取代；及/或Ab2重鏈可變區(SEQ ID NO：30)之變體，其中W33、I50、D57、R59、H99、G100、T101、S102、S103、D104、Y105及/或 Y106保持不變化或包含保守突變。在較佳實施例中，輕鏈可變區之D28、N31、D50、N53、E55、D91及D92保持不變化且重鏈之S102、S103、D104及Y105保持不變化。

編碼ST2抗原結合蛋白質之多核苷酸

本發明內涵蓋編碼ST2抗原結合蛋白質(包括抗體)之核酸，如本文所定義。較佳核酸包括彼等編碼本文所述實例性輕鏈及重鏈者。

編碼Ab1 LC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：73中所述序列之核酸。

編碼Ab2 LC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：74中所述序列之核酸。

編碼Ab3 LC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：75中所述序列之核酸。

編碼Ab4 LC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：76中所述序列之核酸。

編碼Ab5 LC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：77中所述序列之核酸。

編碼Ab6 LC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：78中所述序列之核酸。

編碼Ab7 LC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：79中所述序列之核酸。

編碼Ab8 LC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：80中所述序列之核酸。

編碼Ab9 LC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：81中所述序列之核酸。

編碼Ab10 LC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：82中所述序列之核酸。

編碼Ab11 LC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：83中所述序列之核酸。

編碼Ab30 LC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：157中所述序列之核酸。

編碼Ab32 LC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：158中所述序列之核酸。

編碼Ab33 LC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：159中所述序列之核酸。

編碼Ab1 HC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：7中所述序列之核酸。

編碼Ab2 HC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：8中所述序列之核酸。

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編碼Ab7 HC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：13中所述序列之核酸。

編碼Ab8 HC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：14中所述序列之核酸。

編碼Ab9 HC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：15中所述序列之核酸。

編碼Ab10 HC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：16中所述序列之核酸。

編碼Ab11 HC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：17中所述序列之核酸。

編碼Ab30 HC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：139中所述序列之核酸。

編碼Ab32 HC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：140中所述序列之核酸。

編碼Ab33 HC之實例性核酸係包含SEQ ID NO：141中所述序列之核酸。

本發明態樣包括編碼本文所述胺基酸序列之多核苷酸變體(例如，因簡併性)。

本發明態樣包括多種實施例，包括(但不限於)以下實例性實施例。

經分離多核苷酸，其中該多核苷酸編碼一或多種包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之多肽： A. 1.輕鏈可變結構域序列，其與SEQ ID NO：95-105、163-165中所述輕鏈可變結構域序列至少90%一致； 2.重鏈可變結構域序列，其與SEQ ID NO：29-39、145-147中所述重鏈可變結構域序列至少90%一致； 3.(1)之輕鏈可變結構域及(2)之重鏈可變結構域；及 B.包含CDR1、CDR2、CDR3之輕鏈可變結構域及/或包含CDR1、CDR2、CDR3之重鏈可變結構域，該等CDR1、CDR2、CDR3之各CDR與以下序列相同或相差不超過總共3個胺基酸添加、取代及/或缺失：1. Ab1之輕鏈CDR1(SEQ ID NO：106)、CDR2(SEQ ID NO：117)、CDR3(SEQ ID NO：128)或重鏈CDR1(SEQ ID NO：40)、CDR2(SEQ ID NO：51)、CDR3(SEQ ID NO：62)；2. Ab2之輕鏈CDR1(SEQ ID NO：107)、CDR2(SEQ ID NO：118)、CDR3(SEQ ID NO：129)或重鏈CDR1(SEQ ID NO：41)、CDR2(SEQ ID NO：52)、CDR3(SEQ ID NO：63)；3. Ab3之輕鏈CDR1(SEQ ID NO：108)、CDR2(SEQ ID NO：119)、CDR3(SEQ ID NO：130)或重鏈CDR1(SEQ ID NO：42)、CDR2(SEQ ID NO：53)、CDR3(SEQ ID NO：64)；4. Ab4之輕鏈CDR1(SEQ ID NO：109)、CDR2(SEQ ID NO：120)、CDR3(SEQ ID NO：131)或重鏈CDR1(SEQ ID NO：43)、CDR2(SEQ ID NO：54)、CDR3(SEQ ID NO：65)；5. Ab5之輕鏈CDR1(SEQ ID NO：110)、CDR2(SEQ ID NO：121)、CDR3(SEQ ID NO：132)或重鏈CDR1(SEQ ID NO：44)、CDR2(SEQ ID NO：55)、CDR3(SEQ ID NO：66)；6. Ab6之輕鏈CDR1(SEQ ID NO：111)、CDR2(SEQ ID NO：122)、CDR3(SEQ ID NO：133)或重鏈CDR1(SEQ ID NO：45)、CDR2(SEQ ID NO：56)、CDR3(SEQ ID NO：67)；7. Ab7之輕鏈CDR1(SEQ ID NO：112)、CDR2(SEQ ID NO：123)、CDR3(SEQ ID NO：134)或重鏈CDR1(SEQ ID NO：46)、CDR2(SEQ ID NO：57)、CDR3(SEQ ID NO：68)；8. Ab8之輕鏈CDR1(SEQ ID NO：113)、CDR2(SEQ ID NO：124)、CDR3(SEQ ID NO：135)或重鏈CDR1(SEQ ID NO：47)、CDR2(SEQ ID NO：58)、CDR3(SEQ ID NO：69)；9. Ab9之輕鏈CDR1(SEQ ID NO：114)、CDR2(SEQ ID NO：125)、CDR3(SEQ ID NO：136)或重鏈CDR1(SEQ ID NO：48)、CDR2(SEQ ID NO：59)、CDR3(SEQ ID NO：70)； 10. Ab10之輕鏈CDR1(SEQ ID NO：115)、CDR2(SEQ ID NO：126)、CDR3(SEQ ID NO：137)或重鏈CDR1(SEQ ID NO：49)、CDR2(SEQ ID NO：60)、CDR3(SEQ ID NO：71)；11. Ab11之輕鏈CDR1(SEQ ID NO：116)、CDR2(SEQ ID NO：127)、CDR3(SEQ ID NO：138)或重鏈CDR1(SEQ ID NO：50)、CDR2(SEQ ID NO：61)、CDR3(SEQ ID NO：72)；12. Ab30之輕鏈CDR1(SEQ ID NO：166)、CDR2(SEQ ID NO：169)、CDR3(SEQ ID NO：172)或重鏈CDR1(SEQ ID NO：148)、CDR2(SEQ ID NO：151)、CDR3(SEQ ID NO：154)；13. Ab32之輕鏈CDR1(SEQ ID NO：167)、CDR2(SEQ ID NO：170)、CDR3(SEQ ID NO：173)或重鏈CDR1(SEQ ID NO：149)、CDR2(SEQ ID NO：152)、CDR3(SEQ ID NO：155)；及14. Ab33之輕鏈CDR1(SEQ ID NO：168)、CDR2(SEQ ID NO：171)、CDR3(SEQ ID NO：174)或重鏈CDR1(SEQ ID NO：150)、CDR2(SEQ ID NO：153)、CDR3(SEQ ID NO：156)。

在較佳實施例中，由經分離核酸編碼之多肽係結合ST2之抗原結合蛋白質之組份。

對應於本文所述胺基酸序列之核苷酸序列(欲用作分離核酸用探針或引子或用作數據庫搜索用查詢序列)可藉由自胺基酸序列「回譯」或藉由鑑別與已鑑別編碼DNA序列之多肽具有胺基酸一致性之區獲得。可採用習知聚合酶鏈反應(PCR)程序來分離並擴增編碼ST2抗原結合蛋白質或ST2抗原結合蛋白質多肽片段之期望組合的DNA序列。採用界定DNA片段組合之期望端之寡核苷酸作為5'及3'引子。寡核苷酸另外可含有限制性內切酶識別位點，以有助於將DNA片段之擴增組合插入表現載體中。PCR技術闡述於Saiki等人，Science 239：487(1988)；Recombinant DNA Methodology；Wu等人編輯，Academic Press公司，San Diego(1989)，第189-196頁；及PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Innis等人編輯，Academic Press公司(1990)中。

本發明核酸分子包括呈單鏈形式及雙鏈形式二者之DNA及RNA，以及對應互補序列。DNA包括(例如)cDNA、基因組DNA、化學合成之DNA、藉由PCR擴增之DNA及其組合。本發明核酸分子包括全長基因或cDNA分子以及或其片段之組合。本發明核酸優先源自人類來源，但本發明亦包括彼等源自非人類物種者。

在自天然存在來源分離之核酸之情況下，「經分離核酸」係已自存於分離該核酸之有機體基因組中之毗鄰遺傳序列分開的核酸。在例如自模板酶促合成或以化學方式合成之核酸(例如PCR產物、cDNA分子或寡核苷酸)之情況下，應理解，自此等過程獲得之核酸係經分離核酸。經分離核酸分子係指呈單獨片段形式或作為較大核酸構築物之組份之核酸分子。在一個較佳實施例中，核酸實質上不含污染性內源性材料。核酸分子較佳已藉由標準生物化學方法(例如彼等概述於Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1989)中者)自經至少一次分離之DNA或RNA得到，其係呈實質上純的形式且其量或濃度使得能夠鑑別、操縱及回收其組成性核苷酸序列。此等序列較佳係以未被通常存於真核基因中之內部非轉譯序列或內含子間斷的開放閱讀框形式提供及/或構築。非轉譯DNA之序列可存於開放閱讀框之5'或3'，其中該等序列不會干擾編碼區之操縱或表現。

本發明亦包括在中度嚴格條件下且更佳在高度嚴格條件下與編碼如本文所述ST2抗原結合蛋白質之核酸雜交之核酸。影響雜交條件選擇之基本參數及用於設計適宜條件之指導闡述於以下文獻中：Sambrook、Fritsch及Maniatis(1989,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，第9章及第11章；及Current Protocols in Molecular Biology,1995，Ausubel等人編輯，John Wiley & Sons公司，第2.10及6.3-6.4部分)，且可由熟習此項技術者根據(例如)DNA之長度及/或鹼基組成容易地測定。一種達成中度嚴格條件之方式涉及使用含有5×SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)之預洗滌溶液、約50%甲醯胺、6×SSC之雜交緩衝液及約55℃之雜交溫度(或其他相似雜交溶液，例如含有約50%甲醯胺者，且雜交溫度為約42℃)以及約60℃在0.5×SSC、0.1% SDS中之洗滌條件。通常，高度嚴格條件定義為如上雜交條件，但在約68℃、0.2×SSC、0.1% SDS下進行洗滌。SSPE(1×SSPE係0.15M NaCl、10mM NaH₂PO₄及1.25mM EDTA，pH 7.4)可代替雜交及洗滌緩衝液中之SSC(1×SSC係0.15M NaCl及15mM檸檬酸鈉)；在完成雜交後15分鐘實施洗滌。應理解，洗滌溫度及洗滌鹽濃度可藉由應用管控雜交反應及雙鏈體穩定性之基本原理視需要經調節以達成期望嚴格度，如彼等熟習此項技術者已知及下文所進一步闡述(例如，參見Sambrook等人，1989)。當使核酸與未知序列之靶核酸雜交時，假定雜合體長度為雜交核酸之長度。當使已知序列之核酸雜交時，雜合體長度可藉由比對該等核酸之序列並鑑別一或多個具有最佳序列互補性之區來測定。預期長度小於50個鹼基對之雜合體之雜交溫度應比雜合體之解鏈溫度(Tm)小5至10℃，其中Tm係根據以下等式來測定。對於長度小於18個鹼基對之雜合體而言，Tm(℃)=2(A+T鹼基數)+4(G+C鹼基數)。對於長度大於18個鹼基對之雜合體而言，Tm(℃)=81.5+16.6(log₁₀[Na⁺])+0.41(G+C%)-(600/N)，其中N係雜合體中之鹼基數，且[Na⁺]係雜交緩衝液中鈉離子之濃度(1×SSC之[Na⁺]=0.165M)。較佳地，各此類雜交核酸之長度為至少15個核苷酸(或更佳至少18個核苷酸或至少20個核苷酸或至少25個核苷酸或至少30個核苷酸或至少40個核苷酸或最佳至少50個核苷酸)，或為與其所雜交之本發明核酸之長度的至少25%(更佳至少50%或至少60%或至少70%且最佳至少80%)，且其與其所雜交之本發明核酸具有至少60%(更佳至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%且最佳至少99.5%)序列一致性，其中序列一致性係藉由在比對以將重疊及一致性最大化同時將序列空位最小化時比較雜交核酸之序列來測定，如上文所更詳細地闡述。

本發明變體通常係藉由以下步驟來製備：使用盒或PCR誘變或業內所熟知之其他技術對編碼抗原結合蛋白質之DNA之核苷酸實施位點特異性誘變以產生DNA編碼變體，及之後在細胞培養物中表現重組DNA，如本文所概述。然而，具有最多約100-150個殘基之包含變體CDR之抗原結合蛋白質片段可藉由活體外合成利用確定技術製備。變體通常展現與天然存在之類似物相同之定性生物活性，例如，結合ST2，但亦可選擇具有修改特性之變體，如下文所更全面地概述。

如彼等熟習此項技術者所應瞭解，由於遺傳密碼之簡併性，因此可製備極大量之核酸，其全部編碼本發明CDR(以及重鏈及輕鏈或抗原結合蛋白質之其他組份)。因此，已鑑別出特定胺基酸序列，彼等熟習此項技術者藉由以不改變所編碼蛋白質胺基酸序列之方式簡單地修改一或多個密碼子之序列可達成任一數目之不同核酸。

本發明亦提供呈質粒、表現載體、轉錄或表現盒形式之表現系統及構築物，其包含至少一個多如上核苷酸。另外，本發明提供包含此等表現系統或構築物之宿主細胞。

通常，任一宿主細胞中所用表現載體皆可含有用於質粒維持及用於外源核苷酸序列選殖及表現之序列。此等序列(統稱為「側接序列」)在某些實施例中通常將包括以下核苷酸序列中之一或多者：啟動子、一或多個增強子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供體及受體剪接位點之完整內含子序列、編碼多肽分泌用前導序列之序列、核糖體結合位點、多腺苷酸化序列、用於插入編碼欲表現之多肽之核酸的多連接體區及可選標記物元件。下文論述該等序列中之每一者。

視情況，載體可含有「標籤」編碼序列，即，定位於ST2抗原結合蛋白質編碼序列5'或3'末端之寡核苷酸分子；該寡核苷酸序列編碼聚His(例如六His)或另一「標籤」，例如FLAG、HA(血球凝集素流感病毒)或myc，因此而存在市售抗體。此標籤在多肽表現時通常與多肽融合，且可用作自宿主細胞親和純化或檢測ST2抗原結合蛋白質之手段。例如，可藉由管柱層析使用針對該標籤之抗體作為親和基質來完成親和純化。視情況，標籤隨後可藉由各種手段(例如使用某些裂解用肽酶)自經純化ST2抗原結合蛋白質去除。

側接序列可為同源(即，來自與宿主細胞相同之物種及/或株)、異源(即，來自與宿主細胞物種或株不同之物種)、雜合體(即，來自一種以上來源之側接序列之組合)、合成或天然。因此，側接序列之來源可為任一原核或真核有機體、任一脊椎動物或無脊椎動物有機體或任一植物，前提條件為該側接序列在該宿主細胞機器中起作用且可由該宿主細胞機器活化。

可用於本發明載體中之側接序列可藉由此項技術中所熟知若干方法中之任一者獲得。通常，本文可用之側接序列先前已藉由定位及/或藉由限制性內切酶消化鑑別且因此其可使用合適限制性內切酶自適當組織來源分離。在一些情況下，可知側接序列之全核苷酸序列。在本文中，可使用用於核酸合成或選殖之本文所述方法來合成側接序列。

無論已知所有抑或僅一部分側接序列，其皆可利用聚合酶鏈式反應(PCR)及/或藉由利用適宜探針(例如來自相同或另一物種之寡核苷酸及/或側接序列片段)篩選基因組文庫來獲得。倘若未知側接序列，則含有側接序列之DNA片段可自可含有(例如)編碼序列或甚至其他基因之較大片DNA分離。可藉由以下步驟達成分離：限制性內切酶消化以產生適當的DNA片段，之後使用瓊脂糖凝膠純化、Qiagen®管柱層析(Chatsworth,CA)或熟習此項技術者已知之其他方法進行分離。熟習此項技術者應易於明瞭用以達成此目的之適宜酶的選擇。

複製起點通常為彼等所購得原核表現載體之一部分，且該起點有助於載體在宿主細胞中之擴增。若所選載體不含複製起始位點，則其可根據已知序列以化學方式合成並連接至該載體中。例如，質粒pBR322(New England Biolabs,Beverly,MA)之複製起點適於大多數革蘭氏陰性細菌，且各病毒起點(例如，SV40、多瘤病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒(VSV)或乳頭瘤病毒，例如HPV或BPV)可用於在哺乳動物細胞中選殖載體。一般而言，哺乳動物表現載體無需複製起點組件(例如，通常使用SV40起點，此僅因為其亦含有早期啟動子)。

轉錄終止序列通常定位於多肽編碼區末端之3'且可用於終止轉錄。通常，原核細胞中之轉錄終止序列依序為富含G-C之片段以及聚T序列。儘管該序列可自文庫容易地選殖或甚至作為載體之一部分購得，但其亦可使用用於核酸合成之方法(例如，彼等本文所述者)來合成。

可選標記物基因編碼在選擇性培養基中生長之宿主細胞存活及生長所需蛋白質。典型選擇標記物基因編碼如下蛋白質：(a)賦予原核宿主細胞對抗生素或其他毒素(例如，安比西林(ampicillin)、四環素(tetracycline)、康黴素)之抗性；(b)補足細胞之營養缺陷型不足；或(c)供給自複合培養基或所界定培養基無法獲得之關鍵營養素。特定可選標記物係康黴素抗性基因、安比西林抗性基因及四環素抗性基因。有利地，新黴素抗性基因亦可用於在原核及真核宿主細胞中選擇。

其他可選基因可用於擴增將受表現之基因。擴增係產生對於生長或細胞存活至關重要之蛋白質所需基因在連續世代重組細胞之染色體內串聯重複的過程。適於哺乳動物細胞之可選標記物之實例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)及無啟動子胸苷激酶。在選擇壓力下放置哺乳動物細胞轉化體，其中僅有該等轉化體藉助存於載體中之可選基因獨特地適於存活。選擇壓力係藉由在以下條件下培養轉化細胞來施加：培養基中選擇試劑之濃度連續地增加，藉此擴增該可選基因與編碼另一基因(例如結合ST2多肽之抗原結合蛋白質抗體)之DNA。因此，自經擴增DNA合成增加量之諸如ST2抗原結合蛋白質等多肽。

核糖體結合位點通常為mRNA之轉譯起始所需且其特徵在於Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。該元件通常定位於啟動子之3'端及欲受表現多肽編碼序列之5'端。在某些實施例中，一或多個編碼區可以可操作地連接至內部核糖體結合位點(IRES)，從而允許來自單一RNA轉錄本之兩個開放閱讀框轉譯。

在一些情況下，例如倘若期望在真核宿主細胞表現系統中進行糖基化，則可操縱各種前序列或原序列以改良糖基化或產率。例如，可改變特定信號肽之肽酶裂解位點或添加原序列，此亦可影響糖基化。最終蛋白質產物可在-1位(相對於成熟蛋白質之第一個胺基酸)中具有隨表現產生之一或多個可能未完全去除之其他胺基酸。例如，最終蛋白質產物可具有在肽酶裂解位點中所發現附接至胺基端之一或兩個胺基酸殘基。另一選擇為，若酶在成熟多肽內之此區域處進行切割，則使用一些酶裂解位點可產生期望多肽之稍微截短形式。

本發明之表現及選殖載體通常會含有被宿主有機體識別且以可操作方式連接至編碼ST2抗原結合蛋白質之分子的啟動子。啟動子係定位於結構基因(通常在約100至1000bp內)起始密碼子上游(即，5')控制該結構基因轉錄的未轉錄序列。習慣上，將啟動子歸為以下兩類中之一類：誘導型啟動子及組成型啟動子。誘導型啟動子可因應培養條件某種變化(例如，存在或不存在營養素或溫度變化)起始在其控制下之DNA之轉錄量增加。另一方面，組成型啟動子均勻地轉錄與其可操作地連接之基因，亦即，對基因表現有極小或無控制。大量由多種潛在宿主細胞識別之啟動子為業內所熟知。藉由以下方式將適宜啟動子可操作地連接至編碼包含重鏈或輕鏈之本發明ST2抗原結合蛋白質之DNA：藉助限制性酶消化自源DNA去除啟動子並將期望啟動子序列插入載體中。

與酵母宿主一起使用之適宜啟動子亦為業內所熟知。有利地，將酵母增強子與酵母啟動子一起使用。與哺乳動物宿主細胞一起使用之適宜啟動子為業內所熟知且包括(但不限於)彼等自諸如下列等病毒之基因組獲得者：多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如，腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、鳥類肉瘤病毒、細胞巨大病毒、逆轉錄病毒、肝炎-B病毒且最佳為猿病毒40(SV40)。其他適宜哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子，例如，熱休克啟動子及肌動蛋白啟動子。

可關注之其他啟動子包括(但不限於)：SV40早期啟動子(Benoist及Chambon,1981,Nature 290：304-310)；CMV啟動子(Thornsen等人，1984,Proc.Natl.Acad.U.S.A.81：659-663)；含於勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)3'長端重複內之啟動子(Yamamoto等人，1980,Cell 22：787-797)；皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444-1445)；來自金屬硫蛋白基因之啟動子及調控序列(Prinster等人，1982,Nature 296：39-42)；及諸如β內醯胺酶啟動子等原核啟動子(Villa-Kamaroff等人，1978,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.75：3727-3731)；或tac啟動子(DeBoer等人，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)。亦關注以下展現組織特異性且已用於轉基因動物之動物轉錄控制區：胰臟腺泡細胞中具有活性之彈性蛋白酶I基因控制區(Swift等人，1984,Cell 38：639-646；Ornitz等人，1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald,1987,Hepatology 7：425-515)；在胰臟β細胞中具有活性之胰島素基因控制區(Hanahan,1985,Nature 315：115-122)；在淋巴樣細胞中具有活性之免疫球蛋白基因控制區(Grosschedl等人，1984,Cell 38：647-658；Adames等人，1985,Nature 318：533-538；Alexander等人，1987,Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)；在睪丸細胞、乳房細胞、淋巴樣細胞及肥大細胞中具有活性之小鼠乳房腫瘤病毒控制區(Leder等人，1986,Cell 45：485-495)；在肝中具有活性之白蛋白基因控制區(Pinkert等人，1987,Genes and Devel.1：268-276)；在肝中具有活性之α-胎蛋白質基因控制區(Krumlauf等人，1985,Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer等人，1987,Science 253：53-58)；在肝中具有活性之α1-抗胰蛋白酶基因控制區(Kelsey等人，1987,Genes and Devel.1：161-171)；在骨骼樣細胞中具有活性之β-球蛋白基因控制區(Mogram等人，1985,Nature 315：338-340；Kollias等人，1986,Cell 46：89-94)；在腦中寡樹突神經膠質細胞中具有活性之髓磷脂鹼性蛋白質基因控制區(Readhead等人，1987,Cell 48：703-712)；在骨骼肌中具有活性之肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(Sani,1985,Nature 314：283-286)；及在下視丘中具有活性之促性腺釋放激素基因控制區(Mason等人，1986,Science 234：1372-1378)。

可將增強子序列插入載體中以增加高等真核生物對編碼包含輕鏈或重鏈之本發明ST2抗原結合蛋白質之DNA之轉錄。增強子係作用於啟動子以增加轉錄之DNA的順式作用元件，其長度通常為約10-300 bp。增強子之取向及位置具有相對獨立性，已在轉錄單元之5'位及3'位發現。已知若干增強子序列可自哺乳動物基因獲得(例如，珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)。然而，通常使用來自病毒之增強子。業內已知之SV40增強子、細胞巨大病毒早期啟動子增強子、多瘤增強子及腺病毒增強子係用於活化真核啟動子之實例性增強元件。儘管增強子可在編碼序列之5'或3'位於載體中，但通常定位於啟動子之5'位點。可將編碼合適的天然或異源信號序列(前導序列或信號肽)之序列納入表現載體中，以促進抗體之細胞外分泌。信號肽或前導之選擇取決於欲在其中產生抗體之宿主細胞之類型，且異源信號序列可替代天然信號序列。在哺乳動物宿主細胞中具有功能之信號肽之實例包括以下：介白素-7(IL-7)信號序列，其闡述於美國專利第4,965,195號；介白素-2受體信號序列，其闡述於Cosman等人，1984,Nature 312：768中；介白素-4受體信號肽，其闡述於歐洲專利第0367 566號中；I型介白素-1受體信號肽，其闡述於美國專利第4,968,607號中；II型介白素-1受體信號肽，其闡述於歐洲專利第0 460 846號中。

載體可含有一或多個在將該載體整合至宿主細胞基因組中時促進表現的元件。實例包括EASE元件(Aldrich等人2003 Biotechnol Prog.19：1433-38)及基質附接區(MAR)。MAR介導染色質之結構組織且可使整合載體不產生「位置」效應。因此，MAR在使用載體產生穩定轉染子時尤其有用。諸多天然及合成的含MAR核酸為業內已知，例如，美國專利第6,239,328號、第7,326,567號、第6,177,612號、第6,388,066號、第6,245,974號、第7,259,010號、第6,037,525號、第7,422,874號、第7,129,062號。

可自諸如市售載體等起始載體構築本發明表現載體。此等載體可含有或可不含所有期望側接序列。倘若一或多個本文所述側接序列尚未存於載體中，則可個別地獲得該等側接序列並將其連接至該載體。用於獲得各側接序列之方法為熟習此項技術者所熟知。

在已構築載體且已將編碼包含輕鏈、重鏈或輕鏈及重鏈之ST2抗原結合序列之核酸分子插入載體之適當位點中後，可將所完成載體插入適宜宿主細胞中用於擴增及/或多肽表現。可藉由習知方法將用於ST2抗原結合蛋白質之表現載體轉化至所選宿主細胞中，包括轉染、感染、磷酸鈣共沈澱、電穿孔、微注射、脂轉染、DEAE-葡聚糖介導轉染或其他已知技術。所選方法在一定程度上隨欲用宿主細胞類型而變化。該等方法及其他適宜方法為熟習此項技術者所熟知且闡述於(例如)Sambrook等人，2001(見上文)中。

當在合適條件下培養時，宿主細胞合成ST2抗原結合蛋白質，該ST2抗原結合蛋白質隨後可自培養基(若宿主細胞將ST2抗原結合蛋白質分泌至培養基中)或直接自產生其之宿主細胞(若不分泌該ST2抗原結合蛋白質)收集。合適宿主細胞之選擇將取決於各種因素，例如期望表現量、活性(例如糖基化或磷酸化)所期望或所需要多肽改質及摺疊成生物活性分子之容易性。宿主細胞可為真核或原核。

可用作表現用宿主之哺乳動物細胞系為業內所熟知且包括(但不限於)可自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)獲得之永生化細胞系且可使用任何業內已知用於表現系統之細胞系來製備本發明重組多肽。一般而言，用包含編碼期望抗ST2抗體多肽之DNA的重組表現載體來轉化宿主細胞。可採用之宿主細胞尤其為原核生物、酵母或高等真核細胞。原核生物包括革蘭氏(gram)陰性或革蘭氏陽性有機體，例如大腸桿菌(E.coli)或芽孢桿菌(bacilli)。高等真核細胞包括昆蟲細胞及已確定之源於哺乳動物之細胞系。適宜哺乳動物宿主細胞系之實例包括COS-7猴腎細胞系(ATCC CRL 1651)(Gluzman等人，1981、Cell 23：175)、L細胞、293 細胞、C127細胞、3T3細胞(ATCC CCL 163)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或其衍生物(例如Veggie CHO及在無血清培養基中生長之有關細胞系)(Rasmussen等人，1998,Cytotechnology 28：31)、HeLa細胞、BHK(ATCC CRL 10)細胞系及源自非洲綠色猴腎細胞系CVI之CVI/EBNA細胞系(ATCC CCL 70)(如由McMahan等人，1991所述)、EMBO J.10：2821、人類胚腎細胞(例如293、293 EBNA或MSR 293)、人類表皮A431細胞、人類Colo205細胞、其他經轉化靈長類細胞系、正常二倍體細胞、源自初生組織、初生外植體之活體外培養物之細胞株、HL-60、U937、HaK或Jurkat細胞。視情況，例如，當期望在各種信號轉導或報告子分析中使用多肽時，可使用諸如HepG2/3B、KB、NIH 3T3或S49等哺乳動物細胞系來表現多肽。另一選擇為，可在諸如酵母等低等真核生物中或在諸如細菌等原核生物中產生多肽。適宜酵母包括啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)株、假絲酵母屬(Candida)或能夠表現異源多肽之任何酵母株。適宜菌株包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)或能夠表現異源多肽之任一菌株。若多肽係在酵母或細菌中製得，則可能期望藉由(例如)合適位點之磷酸化或糖基化對其中產生之多肽進行改質，以獲得功能多肽。此等共價附接可使用已知的化學或酶促方法達成。多肽亦可藉由在一或多種昆蟲表現載體中將本發明經分離核酸可操作地連接至適宜控制序列並採用昆蟲表現系統來產生。用於桿狀病毒/昆蟲細胞表現系統之材料及方法係以套組形式購自(例如)Invitrogen,San Diego,Calif.,U.S.A.(MaxBac®套組)且此等方法為業內所熟知，如Summers及Smith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin第1555號(1987)以及Luckow及Summers,Bio/Technology 6：47(1988)中所述。亦可採用無細胞轉譯系統使用源自本文所揭示核酸構築物之RNA來產生多肽。與細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主一起使用之合適選殖及表現載體闡述於Pouwels等人(Cloning Vectors：A Laboratory Manual,Elsevier,New York,1985)中。包含較佳可操作地連接至至少一種表現控制序列之本發明經分離核酸之宿主細胞係「重組宿主細胞」。

在某些實施例中，可經由測定具有高表現量且組成型地產生具有ST2結合性質之抗原結合蛋白質之細胞系來選擇細胞系。在另一實施例中，可自不產生自身抗體而具有製備並分泌異源抗體之能力的B細胞譜系選擇細胞系。

空乏細胞之ST2抗原結合蛋白質

在較佳實施例中，ST2抗原結合蛋白質結合ST2並抑制IL-33結合，藉此減少ST2表現細胞中由IL-33介導之信號傳導。然而，在某些實施例中，ST2抗原結合蛋白質結合ST2並靶向ST2表現細胞用於空乏。當然，ST2抗原結合蛋白質可抑制IL-33結合並靶向ST2細胞用於空乏。

空乏細胞之ST2抗原結合蛋白質尤其可用於治療與ST2過表現相關之疾病，例如，發炎性疾病或ST2表現腫瘤。利用抗原結合蛋白質(抗體)靶向細胞之方法為業內所熟知。下文論述實例性實施例。

抗體藥物偶聯物

本發明實施例包括抗體藥物偶聯物(ADC)。通常，ADC包含抗體偶聯至化學治療劑，例如，細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、毒素或放射劑。可使用連接體分子來偶聯藥物與抗體。可用於ADC技術中之眾多種連接體及藥物為業內已知且可用於本發明實施例中。(參見US20090028856；US2009/0274713；US2007/0031402；WO2005/084390；WO2009/099728；US5208020；US5416064；US5475092；5585499；6436931；6372738及6340701，全部以引用方式併入本文中)。

連接體

在某些實施例中，ADC包含由一或多種連接體組份構成之連接體。實例性連接體組份包括6-馬來醯亞胺基己醯基、馬來醯亞胺基丙醯基、纈胺酸-瓜胺酸、丙胺酸-苯丙胺酸、對胺基苯甲氧基羰基及彼等自與連接體試劑偶聯產生者，包括(但不限於)N-琥珀醯亞胺基4-(2-琥珀醯亞胺基)戊酸酯(「SPP」)、N-琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1甲酸酯(「SMCC」，在本文中亦稱作「MCC」)及N-琥珀醯亞胺基(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸酯(「SIAB」)。

連接體可為「可裂解」連接體或「不可裂解」連接體(Ducry及Stump,Bioconjugate Chem.2010,21,5-13；其全部內容以引用方式併入本文中)。可裂解連接體經設計以在經受某些環境因素時(例如，在內在化至靶細胞中時)釋放藥物。可裂解連接體包括酸不穩定連接體、蛋白酶敏感性連接體、光不穩定連接體、二甲基連接體或含二硫化物連接體。在由靶細胞內在化且在靶細胞內降解後，不可裂解連接體往往保持與抗體之至少一個胺基酸及藥物共價締合。實例性不可裂解連接體係MCC。

藥物

在某些實施例中，抗體係偶聯至化學治療劑。化學治療劑之實例包括烷基化劑，例如沙奧特帕(thiotepa)及環磷醯胺(CYTOXAN.TM.)；烷基磺酸鹽，例如補束剋(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)及烏瑞替哌(uredopa)；伸乙基亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基三聚氰胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺；乙醯生合成物(acetogenin)(尤其為布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(包括合成類似物托泊替康(topotecan))；苔蘚蟲素(bryostatin)；卡裏斯他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素(cryptophycin)(尤其為隱藻素1及隱藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；多卡米辛(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189及CBI-TMI)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑制素(spongistatin)；氮芥，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、甲氮芥(mechlorethamine)、鹽酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、黴法蘭(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯乙酸氮芥膽甾醇酯(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、羅氮芥(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin)，尤其為卡奇黴素.γ1及卡奇黴素θI，例如，參見Angew Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994)；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；埃斯波黴素(esperamicin)；以及新抑癌素發色團及有關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(anthramycin)、偶氮絲胺酸、博來黴素(bleomycin)、放線菌素c(cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(caminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)；色黴素(chromomycin)、更生黴素(dactinomycin)、道諾魯比辛(daunorubicin)、比托魯比辛(detorubicin)、6-二偶氮-5-側氧基-L-正白胺酸、杜薩魯比辛(doxorubicin)(包括嗎啉基-杜薩魯比辛、氰基嗎啉基-杜薩魯比辛、2-吡咯啉基-杜薩魯比辛及去氧杜薩魯比辛)、泛艾黴素(epirubicin)、依索比辛(esorubicin)、依達比辛(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)、黴酚酸、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(porfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比辛(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈尿佐菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他汀(zinostatin)、佐柔比辛(zorubicin)；抗代謝物，例如甲胺蝶呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如二甲葉酸、甲胺蝶呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，例如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-阿紮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素，例如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯；抗腎上腺物質(anti-adrenal)，例如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充物，例如亞葉酸；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷；胺基酮戊酸；安吖啶(amsacrine)；貝斯他布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatrexate)；地佛法明(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依佛米塞(elfomithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；愛波喜龍(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明(lonidamine)；類美坦素(maytansinoid)，例如美坦辛(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；尼曲吖啶(nitracrine)；噴司他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；畢拉魯比辛(pirarubicin)；鬼臼酸；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK.RTM.；雷佐生(razoxane)；根黴素；施佐非蘭(sizofuran)；鍺螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢黴烯(trichothecene)(尤其為T-2毒素、韋拉卡瑞A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及蛇形菌索(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加賽特辛(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside，「Ara-C」)；環磷醯胺；沙奧特帕；類紫杉醇(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL.TM.,Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)及多西紫杉醇(doxetaxel)(TAXOTERE.RTM.,Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；甲胺蝶呤；鉑類似物，例如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(etoposide，VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；絲裂黴素C(mitomycin C)；米托蒽醌；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；溫諾平(navelbine)；能滅瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；紅比黴素(daunomycin)；胺基蝶呤；截瘤達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類維生素A；卡培他濱(capecitabine)；及任一上述之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。此定義中亦包括調控或抑制激素對腫瘤之作用的抗激素劑，例如抗雌激素，包括(例如)他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬 (keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(弗瑞斯，Fareston)；及抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及任一上述之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。可與本發明一起使用之其他化學治療劑揭示於美國公開案第20080171040號或美國公開案第20080305044號中且其全部內容以引用方式併入本文中。

預期抗體可偶聯至兩種或更多種不同的化學治療劑，或醫藥組合物可包含抗體混合物，其中抗體組份相同但偶聯至不同化學治療劑。此等實施例可用於靶向靶細胞之多種生物途徑。

在較佳實施例中，ADC包含抗體偶聯至一或多種類美坦素分子，該等分子係藉由抑制微管蛋白聚合起作用之有絲分裂抑制劑。類美坦素(包括各種改質)闡述於以下專利中：美國專利第3896111號、第4151042號、第4137230號、第4248870號、第4256746號、第4260608號、第4265814號、第4294757號、第4307016號、第4308268號、第4309428號、第4313946號、第4315929號、第4317821號、第4322348號、第4331598號、第4361650號、第4364866號、第4424219號、第4450254號、第4362663號、第4371533號及WO 2009/099728。類美坦素藥物部分可自天然來源分離，使用重組技術產生或以合成方式製備。實例性類美坦素包括C-19-去氯(美國專利第4256746號)、C-20-羥基(或C-20-去甲基)+/- C-19-去氯(美國專利第4307016號及第4361650號)、C-20-去甲氧基(或C-20-醯氧基)(-OCOR)、+/-去氯(美國專利第4294757號)、C-9-SH(美國專利第4,424,219號)、C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(美國專利第4,331,598號)、C-14-羥基甲基或醯氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美國專利第4,450,254號)、C-15-羥基/醯氧基(美國專利第4,364,866號)、C-15-甲氧基(美國專利第4,313,946 號及第4,315,929號)、C-18-N-去甲基(美國專利第4,362,663號及第4,322,348號)及4,5-去氧(美國專利第4,371,533號)。

可使用類美坦素化合物上之不同位置作為連接位置，此取決於所期望連接之類型。例如，在形成酯連接時，具有羥基之C-3位置、經羥基甲基改質之C-14位置、經羥基改質之C-15位置及具有羥基之C-20位置全部適宜(美國專利第5208020號、第RE39151號及第6913748號；美國專利申請公開案第20060167245號及第20070037972號及第WO 2009099728號)。

較佳類美坦素包括彼等在業內稱為DM1、DM3及DM4者(美國專利申請公開案第2009030924號及第20050276812號，其以引用方式併入本文中)。

含有類美坦素之ADC、製備此等ADC之方法及其治療應用揭示於美國專利第5208020號及第5416064號、美國專利申請公開案第20050276812號及WO 2009099728(全部以引用方式併入本文中)中。可用於製備類美坦素ADC之連接體為業內已知(美國專利第5208020號及美國專利申請公開案第2005016993號及第20090274713號；全部以引用方式併入本文中)。包含SMCC連接體之類美坦素ADC可如美國專利公開案第2005/0276812號中所揭示製備。

效應子功能強化抗體

抗體Fc部分之一種功能係在該抗體結合其靶標時與免疫系統通訊。此視為「效應子功能」。通訊導致抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。ADCC及ADCP係經由Fc與免疫系統細胞表面上之Fc受體之結合介導。CDC係經由Fc與補體系統之蛋白質(例如，Clq)結合介導。

IgG亞類在其介導效應子功能之能力上有所不同。例如，IgG1在介導ADCC及CDC上遠遠優於IgG2及IgG4。因此，在以破壞表現ST2 之細胞為靶標之實施例中，抗ST2 IgG1抗體較佳。

可藉由將一或多個突變引入Fc中來增加或降低抗體之效應子功能。本發明實施例包括具有經改造以增加效應子功能之Fc之抗原結合蛋白質，例如，抗體(U.S.7,317,091及Strohl,Curr.Opin.Biotech.,20：685-691,2009；二者之全部內容皆以引用方式併入本文中)。具有增加之效應子功能之實例性IgG1 Fc分子包括(基於Kabat編號方案)彼等具有以下取代者：S239D/I332E

S239D/A330S/I332E

S239D/A330L/I332E

S298A/D333A/K334A

P247I/A339D

P247I/A339Q

D280H/K290S

D280H/K290S/S298D

D280H/K290S/S298V

F243L/R292P/Y300L

F243L/R292P/Y300L/P396L

F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L

G236A/S239D/I332E

K326A/E333A

K326W/E333S

K290E/S298G/T299A

K290N/S298G/T299A

K290E/S298G/T299A/K326E

K290N/S298G/T299A/K326E。

本發明之其他實施例包括具有經改造以降低效應子功能之Fc之抗原結合蛋白質，例如，抗體。具有降低之效應子功能之實例性Fc分子包括(基於Kabat編號方案)彼等具有以下取代者：N297A(IgG1)

L234A/L235A(IgG1)

V234A/G237A(IgG2)

L235A/G237A/E318A(IgG4)

H268Q/V309L/A330S/A331S(IgG2)

C220S/C226S/C229S/P238S(IgG1)

C226S/C229S/E233P/L234V/L235A(IgG1)

L234F/L235E/P331S(IgG1)

S267E/L328F(IgG1)。

增加含IgG Fc蛋白質之效應子功能之另一方法係藉由減少Fc之岩藻糖基化。自附接至Fc之雙觸角複雜型寡糖去除核岩藻糖顯著增加ADCC效應子功能，而不會改變抗原結合或CDC效應子功能。已知用於減少或消除含Fc分子(例如，抗體)之岩藻糖基化的若干方式。該等包括在某些哺乳動物細胞系中之重組表現，該等哺乳動物細胞系包括FUT8敲除細胞系、變體CHO系Lec13、大鼠雜交瘤細胞系YB2/0、包含特異性地針對FUT8基因之小干擾RNA之細胞系以及共同表現β-1,4-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III及高爾基(Golgi)α甘露糖苷酶II之細胞系。另一選擇為，含Fc分子可在非哺乳動物細胞(例如植物細胞、酵母或原核細胞(例如，大腸桿菌))中表現。因此，在本發明之某些實施例中，組合物包含具有減少之岩藻糖基化或完全無岩藻糖基化之抗體，例如，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10或Ab11。

醫藥組合物

在一些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含治療有效量之一種或複數種本發明抗原結合蛋白質以及醫藥上有效之稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑。在某些實施例中，抗原結合蛋白質係抗體。本發明醫藥組合物包括(但不限於)液體、冷凍及凍乾組合物。

較佳地，調配材料在所用劑量及濃度下對接受者無毒。在具體實施例中，提供醫藥組合物包含治療有效量之ST2抗原結合蛋白質，例如ST2結合抗體。

在某些實施例中，醫藥組合物可含有用於修改、維持或保持(例如)組合物之以下性質的調配材料：pH、容積滲透濃度、黏度、澄清度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放、吸收或滲透的速率。在此等實施例中，適宜調配材料包括(但不限於)胺基酸(例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸、脯胺酸或離胺酸)；抗微生物劑；抗氧化劑(例如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩衝液(例如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)；膨脹劑(例如甘露醇或甘胺酸)；螯合劑(例如乙二胺四乙酸，EDTA)；錯合劑(例如咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)；填充劑；單糖；二糖；及其他碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑、矯味劑及稀釋劑；乳化劑；親水聚合物(例如聚乙烯吡咯啶酮)；低分子量多肽；鹽形成抗衡離子(例如鈉)；防腐劑(例如苯紮氯銨(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞(thimerosal)、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(例如丙三醇、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露醇或山梨醇)；懸浮劑；表面活性劑或潤濕劑(例如普流尼克(pluronic)、PEG、山梨醇酐酯、聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯)、曲拉通(triton)、胺丁三醇(tromethamine)、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；穩定性增強劑(例如蔗糖或山梨醇)；張力增強劑(例如鹼金屬鹵化物、較佳氯化鈉或氯化鉀，甘露醇、山梨醇)；遞送媒劑；稀釋劑；賦形劑及/或醫藥佐劑。參見REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(A.R.Genrmo編輯)，1990，Mack Publishing公司。

在某些實施例中，最佳醫藥組合物可由熟習此項技術者根據(例如)既定投與途徑、遞送模式及期望劑量來測定。例如，參見REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，見上文。在某些實施例中，此等組合物可影響本發明抗原結合蛋白質之物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。在某些實施例中，醫藥組合物中之初始媒劑或載劑可實質上為水性或非水性。例如，適宜媒劑或載劑可為注射用水、生理鹽水或人工腦脊髓液，其可能補加有非經腸投與用組合物中之其他常見材料。中性緩衝鹽水或與血清白蛋白混合之鹽水係其他實例性媒劑。在具體實施例中，醫藥組合物包含pH為約7.0-8.5之Tris緩衝液或pH為約4.0-5.5之乙酸鹽緩衝液，且可進一步包括山梨醇或其適宜取代物。在本發明之某些實施例中，可藉由混合具有期望純度之所選組合物與可選調配劑來製備用於儲存之呈凍乾餅或水溶液形式之ST2抗原結合蛋白質組合物(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，見上文)。此外，在某些實施例中，可使用諸如蔗糖等合適賦形劑將ST2抗原結合蛋白質產物調配為凍乾物。

可選擇本發明醫藥組合物用於非經腸遞送。另一選擇為，可選擇組合物用於吸入或用於藉由消化道遞送，例如經口遞送。此等醫藥上可接受之組合物之製備為熟習此項技術者所熟知。調配組份較佳以投與位點可接受之濃度存在。在某些實施例中，使用緩衝液將組合物維持在生理pH或略低之pH，通常在約5至約8之pH範圍內。

當計劃非經腸投與時，用於本發明中之治療組合物可以無致熱原之非經腸可接受水溶液形式提供，其包含存於醫藥上可接受之媒劑中之期望ST2抗原結合蛋白質。尤其適於非經腸注射之媒劑係無菌蒸餾水，其中將ST2抗原結合蛋白質調配成無菌等滲溶液並以適當方式保存。在某些實施例中，製備可涉及調配期望分子與可使產物受控釋放或持續釋放之試劑，例如可注射微球體、生物蝕解顆粒、聚合化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體，其可藉由積存注射(depot injection)來遞送。在某些實施例中，亦可使用透明質酸，其具有延長在循環中之持續時間之效應。在某些實施例中，可使用可植入藥物遞送裝置來引入期望抗原結合蛋白質。

可調配本發明醫藥組合物以供吸入。在該等實施例中，有利地將ST2抗原結合蛋白質調配成乾燥可吸入粉劑。在具體實施例中，亦可將ST2抗原結合蛋白質吸入溶液與用於氣溶膠遞送之推進劑一起調配。在某些實施例中，可對溶液實施噴霧。因此，經肺投與及調配方法進一步闡述於國際專利申請案第PCT/US94/001875號中，該案件以引用方式併入且闡述化學改質蛋白質之經肺遞送。

亦預期可經口投與調配物。可在存在或不存在通常用於複合諸如錠劑及膠囊等固體劑型之載劑的情況下調配以此方式投與的ST2抗原結合蛋白質。在某些實施例中，膠囊可經設計以在胃腸道中之位點釋放調配物之活性部分，從而使生物利用度最大化並使全身性預降解最小化。可包括其他試劑以促進ST2抗原結合蛋白質之吸收。亦可採用稀釋劑、矯味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑及結合劑。

彼等熟習此項技術者可明瞭其他醫藥組合物，包括涉及ST2抗原結合蛋白質之呈持續遞送或受控遞送調配物形式的調配物。用於調配多種其他持續遞送或受控遞送手段之手術，例如脂質體載劑、生物蝕解微粒或多孔珠粒及積存注射，亦為熟習此項技術者已知。例如，參見國際專利申請案第PCT/US93/00829號，其以引用方式併入且闡述用於遞送醫藥組合物之多孔聚合物微粒之受控釋放。持續釋放製劑可包括呈成型物件形式之半滲透性聚合物基質，例如膜或微膠囊。持續釋放基質可包括聚酯、水凝膠、聚交酯(如美國專利第3,773,919號及歐洲專利申請公開案第EP 058481號所揭示，其各自以引用方式併入)、L-麩胺酸與L-麩胺酸-γ-乙酯之共聚物(Sidman等人，1983,Biopolymers 2：547-556)、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，1981,J.Biomed.Mater.Res.15：167-277；及蘭格爾，1982,Chem.Tech.12：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，1981，見上文)或聚D(-)-3-羥基丁酸(歐洲專利申請公開案第EP 133,988號)。持續釋放組合物亦可包括可藉由業內已知若干種方法中之任一者製備之脂質體。例如，參見Eppstein等人，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688-3692；歐洲專利申請公開案第EP 036,676號；第EP 088,046號及第EP 143,949號，其以引用方式併入。

用於活體內投與之醫藥組合物通常係以無菌製劑形式來提供。可藉由無菌濾膜過濾來實施滅菌。當組合物經凍乾時，使用此方法之滅菌可在凍乾及重構之前或之後實施。非經腸投與用組合物可以凍乾形式或溶液形式儲存。一般將非經腸組合物置入具有無菌進入孔之容器(例如具有可藉由皮下注射針頭刺穿之塞子的靜脈注射溶液袋或小瓶)中。

本發明態樣包括自緩衝ST2抗原結合蛋白質調配物，其可用作醫藥組合物，如國際專利申請案第WO 06138181A2號(PCT/US2006/022599)中所述，該案件之全部內容以引用方式併入本文中。

如上文所論述，某些實施例提供ST2抗原結合蛋白質組合物、尤其醫藥ST2抗原結合蛋白質組合物，其除ST2抗原結合蛋白質外亦包含一或多種賦形劑，例如彼等在此部分及本文中別處所說明性闡述者。賦形劑可在此方面出於眾多種目的用於本發明中，例如調節調配物之物理、化學或生物性質，例如調節黏度；及或用於本發明方法中以改良有效性及或穩定此等調配物及用於抵抗因(例如)在製造、運送、儲存、預使用製備、投與期間及之後發生之應力所致降格及腐敗之方法中。

關於蛋白質穩定及調配材料以及可用於此方面之方法之多種解釋可參見(例如)Arakawa等人，「Solvent interactions in pharmaceutical formulations」，Pharm Res.8(3)：285-91(1991)；Kendrick等人，「Physical stabilization of proteins in aqueous solution」，RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS：THEORY AND PRACTICE,Carpenter及Manning編輯Pharmaceutical Biotechnology.13：61-84(2002)及Randolph等人，「Surfactant-protein interactions」，Pharm Biotechnol.13：159-75(2002)，該等文獻中每一者之全部內容皆以引用方式併入本文中，尤其與本發明賦形劑及其用於自緩衝蛋白質調配物之方法有關之部分，尤其關於用於獸醫及/或人類醫學應用之蛋白質醫藥產品及方法之部分。

鹽可根據本發明某些實施例用於(例如)調節調配物之離子強度及/或等滲性及/或改良本發明組合物之蛋白質或另一成份之溶解性及/或物理學穩定性。

如所熟知，離子可藉由以下方式穩定蛋白質之天然狀態：結合蛋白質表面上之帶電殘基及屏蔽蛋白質中之帶電及極性基團及降低其靜電交互作用、吸引性及排斥性交互作用之強度。離子亦可藉由結合至特定而言蛋白質之變性肽連接(--CONH)來穩定蛋白質之變性狀態。此外，蛋白質中具有帶電及極性基團之離子交互作用亦可降低分子間靜電交互作用且藉此預防或降低蛋白質聚集及不溶性。

離子物種在其對蛋白質之效應上差異顯著。已研發諸多離子分類分級及其對蛋白質之效應，其可用於調配本發明醫藥組合物。一個實例係Hofmeister系列，其藉由對溶液中蛋白質之構象穩定之效應來對離子及極性非離子溶質進行分級。穩定溶質稱作「親液劑(kosmotropic)」。去穩定溶質稱作「離液劑(chaotropic)」。親液劑通常以高濃度(例如，>1莫耳濃度硫酸銨)使用以自溶液沈澱蛋白質(「鹽析」)。離液劑通常用於使蛋白質變性及/或溶解(「salting-in」)。離子對「鹽溶(salt-in)」及「鹽析」之相對有效性界定其在Hofmeister系列中之位置。

可在ST2抗原結合蛋白質調配物中根據各本發明實施例使用游離胺基作為膨脹劑、穩定劑及抗氧化劑以及其他標準應用。可使用離胺酸、脯胺酸、絲胺酸及丙胺酸來穩定調配物中之蛋白質。可在凍乾中使用甘胺酸以確保準確的餅結構及性質。精胺酸可用於抑制液體調配物與凍乾調配物二者中之蛋白質聚集。蛋胺酸可用作抗氧化劑。

多元醇包括糖，例如，甘露醇、蔗糖及山梨醇；及多羥基醇，例如甘油及丙二醇；及出於本文之論述目的，聚乙二醇(PEG)及有關物質。多元醇係親液劑。其係液體調配物與凍乾調配物二者中之可用穩定劑，用以保護蛋白質免於物理及化學降解過程。多元醇亦可用於調節調配物之張力。

可用於選擇本發明實施例之多元醇尤其為甘露醇，其通常用於確保凍乾調配物中之餅之結構穩定性。其確保餅之結構穩定性。其通常與凍乾保護劑(lyoprotectant)(例如，蔗糖)一起使用。山梨醇及蔗糖係在製造過程期間在散裝材料輸送或製備期間用於調節張力及作為穩定劑用以抵抗冷凍-解凍應力的尤佳試劑。諸如葡萄糖及乳糖等還原糖(其含有游離醛基或酮基)可將表面離胺酸及精胺酸殘基糖化。因此，其通常並非用於本發明之尤佳多元醇。另外，形成此等反應性物質之糖(例如蔗糖)在酸性條件下水解為果糖及葡萄糖且隨後引起糖化，就此而言，其亦並非本發明之尤佳多元醇。PEG可用於穩定蛋白質且作為凍乾保護劑且就此而言可用於本發明。

ST2抗原結合蛋白質調配物之實施例進一步包含表面活性劑。蛋白質分子可易於吸附在表面上且易於變性並隨後於空氣-液體、固體-液體及液體-液體界面聚集。該等效應之規模通常與蛋白質濃度成反比。該等有害交互作用之規模通常與蛋白質濃度成反比且通常因物理攪動(例如在在產品運送及處置期間生成者)而惡化。

通常使用表面活性劑來預防、最小化或減少表面吸附。就此而言，可用於本發明中之表面活性劑包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、山梨醇酐聚乙氧化物之其他脂肪酸酯及泊洛沙姆188(poloxamer 188)。

表面活性劑亦通常用於控制蛋白質構象穩定性。就此而言使用表面活性劑具有蛋白質特異性，此乃因任一給定表面活性劑通常會穩定一些蛋白質並使其他去穩定。

聚山梨醇酯易於氧化降解且供貨狀態通常含有足量過氧化物而引起蛋白質殘基側鏈、尤其蛋胺酸氧化。因此，聚山梨醇酯應小心地使用，且在使用時，應以其最低有效濃度採用。就此而言，聚山梨醇酯例示了賦形劑應以其最低有效濃度使用之一般規則。

ST2抗原結合蛋白質調配物之實施例進一步包含一或多種抗氧化劑。可藉由維持環境氧及溫度之適當量且藉由避免暴露於光在一定程度上來預止醫藥調配物中蛋白質之有害氧化。亦可使用抗氧化賦形劑來防止蛋白質之氧化降解。就此而言，尤其可用之抗氧化劑係還原劑、氧/自由基清除劑及螯合劑。用於本發明治療性蛋白質調配物中之抗氧化劑較佳具有水溶性且維持其在產品之整個存架壽命期間之活性。就此而言，EDTA係本發明之較佳抗氧化劑。

抗氧化劑可損害蛋白質。例如，尤其諸如麩胱甘肽等還原劑可破壞分子內二硫連接。因此，選擇用於本發明中之抗氧化劑以尤其消除或充分地降低本身損害調配物中之蛋白質之可能性。

本發明之調配物可包括為蛋白質輔因子且為形成蛋白質配位錯合物所需之金屬離子，例如形成某些胰島素懸浮液所需之鋅。金屬離子亦可抑制一些降解蛋白質之過程。然而，金屬離子亦催化降解蛋白質之物理及化學過程。

可使用鎂離子(10-120mM)來抑制天冬胺酸異構化成異天冬胺酸。Ca⁺²離子(高達100mM)可增加人類去氧核糖核酸酶之穩定性。然而，Mg⁺²、Mn⁺²及Zn⁺²可使rhDNase去穩定。類似地，Ca⁺²及Sr⁺²可穩定因子VIII，Mg⁺²、Mn⁺²及Zn⁺²、Cu⁺²及Fe⁺²可使其去穩定，且Al⁺³離子可增加其聚集。

ST2抗原結合蛋白質調配物之實施例進一步包含一或多種防腐劑。當研發涉及自相同容器萃取一次以上之多劑量非經腸調配物時，需要防腐劑。其主要功能係在藥物產品之整個存架壽命或使用期內抑制微生物生長並確保產品無菌性。常用防腐劑包括苯甲醇、苯酚及間甲酚。儘管防腐劑以小分子非經腸物質形式使用之歷史較長，但對包括防腐劑之蛋白質調配物之研發可能具有挑戰性。防腐劑幾乎總是對蛋白質具有去穩定效應(聚集)，且此已成為限制其在多劑量蛋白質調配物中應用之主要因素。迄今為止，多數蛋白質藥物僅經調配用於單次使用。然而，在可達成多劑量調配物時，其具有可方便患者之附加優點，且增加可銷售性。良好實例係人類生長激素(hGH)之防腐劑，其中對防腐調配物之研發已導致更方便、多用途注射筆呈現物之商業化。至少4種含有hGH防腐調配物之此等筆裝置當前可在市面上購得。諾德人體生長激素(Norditropin)(液體，Novo Nordisk)、努托平AQ(Nutropin AQ)(液體，Genentech)及增若托平(Genotropin)(凍乾-雙室藥筒，Pharmacia & Upjohn)含有苯酚，而用間甲酚調配索瑪托(Somatrope)(Eli Lilly)。

在防腐劑型調配及研發期間需要考慮若干態樣。藥物產品中之有效防腐劑濃度必須經最佳化。此需要以賦予抗微生物有效性而不損害蛋白質穩定性之濃度範圍測試劑型中之給定防腐劑。

如可預計，含有防腐劑之液體調配物之研發比凍乾調配物更具有挑戰性。冷凍乾燥產品可不使用防腐劑經凍乾並在使用時用含有防腐劑之稀釋劑重構。此縮短防腐劑與蛋白質接觸之時間，從而將相關穩定性風險顯著最小化。對於液體調配物而言，應在整個產品存架壽命(約18至24個月)內維持防腐劑有效性及穩定性。應注意的重要一點在於，含有有效藥物及所有賦形劑組份之最終調配物應顯示防腐劑有效性。

ST2抗原結合蛋白質調配物通常會尤其按一定生物利用性及持久性範圍經設計用於特定投與途徑及方法，用於特定投與劑量及投與頻率，用於特定疾病之特定治療。因此，調配物可根據本發明設計用於藉由任一適宜途徑遞送，包括(但不限於)經口、耳、眼、直腸及陰道及藉由非經腸途徑，包括靜脈內及動脈內注射、肌內注射及皮下注射。

在醫藥組合物已經調配後，其可作為溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體、晶體或作為脫水或凍乾粉末儲存於無菌小瓶中。此等調配物可以即用形式或以在投與前重構之形式(例如，凍乾)儲存。本發明亦提供用於產生單劑量投與單元之套組。本發明套組各自可含有具有乾燥蛋白質之第一容器與具有水性調配物之第二容器二者。在本發明之某些實施例中，提供含有單室及多室預填充注射器(例如，液體注射器及凍乾物注射(lyosyringe))之套組。

欲採用之含有ST2抗原結合蛋白質之醫藥組合物的治療有效量應取決於(例如)治療背景及目標。熟習此項技術者應瞭解，治療之合適劑量量應部分地根據以下因素而改變：所遞送分子、使用ST2抗原結合蛋白質所針對之適應症、投與途徑及患者之大小(體重、身體表面或器官大小)及/或狀況(年齡及一般健康狀況)。在某些實施例中，臨床醫師可對劑量進行滴定測定並修改投與途徑以獲得最佳治療效果。根據上述因素，典型劑量可在約0.1μg/kg至最高約30mg/kg或更高之間範圍內。在具體實施例中，劑量可在1.0μg/kg至最高約20mg/kg之間範圍內，任選地在10μg/kg至最高約10mg/kg或100μg/kg至最高約5mg/kg之間範圍內。

ST2抗原結合蛋白之治療有效量較佳可降低疾病症狀之嚴重程度，增加無疾病症狀期之頻率或持續時間或預防因感病性所致之損傷或殘疾。

醫藥組合物可使用醫學裝置投與。用於投與醫藥組合物之醫學裝置之實例闡述於以下美國專利中：第4,475,196號、第4,439,196號、第4,447,224號、第4,447,233號、第4,486,194號、第4,487,603號、第4,596,556號、第4,790,824號、第4,941,880號、第5,064,413號、第5,312,335號、第5,312,335號、第5,383,851號及第5,399,163號，該等專利全部以引用方式併入本文中。

診斷或治療ST2相關疾病或病症之方法

本發明ST2抗原結合蛋白質尤其可用於檢測生物試樣中之ST2。在某些實施例中，使自患者獲得之生物試樣與ST2抗原結合蛋白質接觸。然後檢測ST2抗原結合蛋白質與ST2之結合以測定ST2在該試樣中之存在或相對量。此等方法可用於診斷或測定適於用ST2抗原結合蛋白質治療之患者。

在某些實施例中，使用本發明ST2抗原結合蛋白質來診斷、檢測或治療自體免疫或發炎性病症。在治療自體免疫或發炎性病症時，ST2抗原結合蛋白質可靶向免疫系統之ST2表現細胞用於破壞及/或可阻斷ST2與IL-33之交互作用。

與IL-33介導之信號傳導相關之病症尤其適於用本文所揭示一或多種ST2抗原結合蛋白質治療。此等病症包括(但不限於)發炎、自體免疫性疾病、腫瘤相關自體免疫性疾病、軟骨發炎、纖維化疾病及/或骨降解、關節炎、類風濕性關節炎、幼年型關節炎、幼年型類風濕性關節炎、少關節幼年型類風濕性關節炎、多關節幼年型類風濕性關節炎、全身性發作性幼年型類風濕性關節炎、幼年型黏連性脊椎炎、幼年型腸病性關節炎、幼年型反應性關節炎、幼年型賴透氏症候群(juvenile Reiter’s Syndrome)、SEA症候群(血清陰性、接骨點病變、關節病症候群)、幼年型皮肌炎、幼年型牛皮癬關節炎、幼年型硬皮症、幼年型全身性紅斑狼瘡、幼年型血管炎、少關節類風濕性關節炎、多關節類風濕性關節炎、全身性發作性類風濕性關節炎、黏連性脊椎炎、腸病性關節炎、反應性關節炎、賴透氏症候群、SEA症候群(血清陰性、接骨點病變、關節病症候群)、皮肌炎、牛皮癬關節炎、硬皮症、全身性紅斑狼瘡、血管炎、肌炎、多發性肌炎、皮肌炎、結節性多發性動脈炎、華格納氏肉芽腫、動脈炎、風濕性多肌痛、類肉瘤病、硬皮症、硬化症、原發性膽道硬化症、硬化性膽管炎、休格倫症候群(Sjogren’s syndrome)、牛皮癬、斑塊狀牛皮癬、滴狀牛皮癬、皮褶牛皮癬、膿皰性牛皮癬、紅皮性牛皮癬、皮炎、異位性皮炎、動脈粥樣硬化、狼瘡、史迪爾氏病(Still’s disease)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、重症肌無力、發炎性腸病(IBD)、克隆氏病(Crohn’s disease)、潰瘍性結腸炎、乳糜瀉、多發性硬化症(MS)、哮喘、COPD、鼻竇炎、伴有息肉之鼻竇炎、嗜伊紅性食道炎、嗜伊紅性枝氣管炎、格林-巴利病(Guillain-Barre disease)、I型糖尿病、甲狀腺炎(例如，格雷氏病，Graves’ disease)、艾迪森氏病(Addison’s disease)、雷諾氏現象(Raynaud’s phenomenon)、自體免疫性肝炎、GVHD、移植排斥、腎損傷及諸如此類。

在較佳實施例中，自體免疫或發炎性病症係哮喘、異位性皮炎、慢性阻塞性肺病、肺纖維化、敗血症及外傷、HIV感染、全身性紅斑狼瘡、發炎性腸病、類風濕性關節炎、硬化、華格納氏肉芽腫、貝歇病、心血管疾病、鼻竇炎、鼻息肉及嗜伊紅性枝氣管炎。

在某些實施例中，使用本發明ST2抗原結合蛋白質來診斷、檢測或治療癌症或致瘤性病症。在治療癌症或致瘤性病症時，ST2抗原結合蛋白質可靶向ST2表現細胞用於破壞及/或可阻斷ST2與IL-33之交互作用，藉此減少由IL-33介導之信號傳導。例如，高度可溶性ST2之表現與乳癌患者之改良存活相關。(Prechtel等人，Lab Invest(2001)81：159-165)。由於可溶性ST2結合並阻斷由IL-33介導之信號傳導，因此預期阻斷由IL-33介導之信號傳導之ST2抗原結合蛋白質可用於促進乳癌患者之改良存活。可用ST2抗原結合蛋白質診斷、檢測或治療之癌症或致瘤性病症包括(但不限於)實體瘤，通常為肺癌、卵巢癌、乳癌、前列腺癌、子宮內膜癌、腎癌、食道癌、胰臟癌、鱗狀細胞癌、眼色素層黑色素瘤、子宮頸癌、結腸直腸癌、膀胱癌、腦癌、胰臟癌、頭癌、頸癌、肝癌、白血病、淋巴瘤及霍奇金氏病(Hodgkin’s disease)、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、胃癌、星狀神經膠質癌、胃及肺腺癌。

抗原結合蛋白質可用於抑制腫瘤生長、進展及/或轉移。此抑制可使用各種方法監測。例如，抑制可減小腫瘤大小及/或降低腫瘤內之代謝活性。該等參數皆可藉由(例如)MRI或PET掃描量測。抑制亦可藉由生檢來監測以確定腫瘤內壞死程度、腫瘤細胞死亡及血管分佈 (vascularity)程度。可使用已知方法監測轉移程度。

實例

以下實例(實際及預測二者)係出於說明本發明具體實施例或特徵之目的提供且不欲限制其範圍。

實例1：ST2抗體在哮喘動物模型中有效

此實例證實，投與結合ST2且抑制由IL-33介導之信號傳導之抗體在發炎性疾病(即哮喘)動物模型中有效。中和性小鼠ST2 mAb(ST2代用mAb)在活體內抑制外源性投與之IL-33之活性。在靜脈內注射100ug抗ST2 mAb後2小時經鼻內向小鼠投與200ng重組小鼠IL-33。第二天，藉由ELISA量測枝氣管肺泡灌洗液(BALF)IL-5濃度。在鹽水刺激前，自經鹽水治療小鼠之BALF獲得基線IL-5濃度。自用IL-33刺激之同型對照Ig治療小鼠獲得最大BALF IL-5濃度。與同型對照Ig治療相比，ST2 mAb治療顯著抑制BALB/c及C57BL/6小鼠品系之BALF中由IL-33誘導之IL-5(圖1)。

ST2代用mAb在蟑螂過敏原(CRA)誘導之哮喘模型中有效，其中ST2抗體治療小鼠之BALF嗜伊紅性白血球顯著少於同型對照Ig治療小鼠。在第1天、第3天、第6天、第8天、第10天及第13天，用100μg CRA刺激BALB/c小鼠。在第0天、第7天及第13天，向小鼠注射250μg抗ST2 mAb或同型對照Ig，其中在最終鼻內CRA刺激之前進行第13天抗體注射。在第14天，將小鼠麻醉且使其經受肺灌洗。計算BALF細胞群之數目且用抗ST2 mAb治療導致存在顯著更少之總BALF細胞，其中嗜伊紅性白血球包含顯著受影響之細胞群(圖2)。

實例2：使用Xenomouse®平臺產生抗ST2抗體

使用XENOMOUSE®技術生成針對人類ST2之完全人類抗體(美國專利第6,114,598號、第6,162,963號、第6,833,268號、第7,049,426號、第7,064,244號，其全部內容以引用方式併入本文中；Green等人，1994,Nature Genetics 7：13-21；Mendez等人，1997,Nature Genetics 15：146-156；Green及Jakobovitis,1998,J.Ex.Med.188：483-495,Kellermann及Green，2002,Current Opinion in Biotechnology,13：593-597)。

用包含融合至人類抗體Fc結構域之人類ST2之細胞外結構域之多肽或用人類ST2-Fc融合蛋白質與人類IL-33之複合物對XMG2K、XMG4K及XMG4KL XENOMOUSE®動物實施免疫。根據揭示於以下案件中之方法使用適宜量之免疫原(即，10μg可溶性ST2/小鼠)對XENOMOUSE®動物實施初始免疫：1996年12月3申請之美國專利申請案第08/759,620號及1998年6月11日公開之國際專利申請案第WO 98/24893號及2000年12月21日公開之WO 00/76310，其揭示內容以引用方式併入本文中。在初始免疫後，按計劃投與免疫原之後續強化免疫(5μg可溶性ST2或ST2/IL33複合物/小鼠)且保持誘導抗ST2抗體在小鼠中之適宜效價所需之持續時間。藉由適宜方法(例如，ELISA或螢光活化細胞分選(FAC))測定效價。

鑑別展現適宜效價之動物，且自引流淋巴結獲得淋巴球並且在需要時彙集用於各小組。取淋巴組織在適宜培養基(例如，杜貝克改良伊氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)；DMEM；可自Invitrogen,Carlsbad,CA獲得)中研磨而與淋巴球分離，以使組織釋放細胞，且將其懸浮於DMEM中。使用適宜方法選擇及/或擴增B細胞，且使用業內已知技術使其與適宜融合對象(例如，非分泌性骨髓瘤P3X63Ag8.653細胞(美國典型培養物保藏中心CRL 1580；Kearney等人，J.Immunol.123,1979,1548-1550))融合。

在一種融合方法中，將淋巴球與融合對象細胞以1：4之比率混合。藉由以400×g離心4分鐘，使細胞混合物緩慢地沈澱集結，輕輕倒出上清液，並輕輕地混合細胞混合物(例如，藉由使用1mL移液管)。用PEG/DMSO(聚乙二醇/二甲基亞碸；可自Sigma-Aldrich,St.Louis MO獲得；1mL/百萬個淋巴球)誘導融合。在輕輕攪動的同時，經1分鐘緩慢地添加PEG/DMSO，之後混合1分鐘。然後在輕輕攪動的同時，經2分鐘添加IDMEM(DMEM，無麩醯胺酸；2mL/百萬個B細胞)，之後經3分鐘添加額外IDMEM(8mL/百萬個B細胞)。

使融合細胞緩慢地沈澱集結(400×g 6分鐘)且再懸浮於20mL選擇培養基(DMEM，其含有偶氮絲胺酸及次黃嘌呤[HA]及視需要選用之其他補充材料)/百萬個B細胞中。在37℃下將細胞培育20-30分鐘且隨後再懸浮於200mL選擇培養基中並在T175燒瓶中培養3至4天，然後平鋪於96孔板中。

使用標準技術將細胞分配至96孔板中，讓所得純系達到最大群落形成度。在培養若干天後，收集上清液且經過篩選分析。用基於ELISA之分析法來篩選接受ST2-Fc/IL33複合物免疫之小鼠所生成之雜交瘤上清液，該分析法係使用經過0.5ug/mL ST2-Flag/his與人類IL-33之複合物在4℃下被動式塗覆一夜之96孔聚苯乙烯ELISA板來進行。為測定ST-2特異結合性，使用經過10ug/mL中性卵白素(neutravidin)在4℃下被動式塗覆一夜之96孔聚苯乙烯板進行第二次ELISA篩選。然後用0.5ug/mL生物素化人類IL33洗滌並加載在分析板上。此ELISA篩選法可鑑別超過1200種抗ST2特異性結合劑。

藉由螢光測定微體積分析技術(FMAT)藉由以下方式篩選接受可溶性ST2-Fc免疫之小鼠所生成之雜交瘤上清液之ST2抗原特異性抗體：針對經過全長人類ST2過渡轉染之重組HEK293T細胞進行篩選且針對模擬轉染HEK293T細胞進行反篩選(counter-screening)。簡言之，以40ul/孔之體積，依6,000個ST2陽性細胞/孔及14,000個模擬轉染ST2陰性細胞/孔之密度，將細胞接種至384孔FMAT板中。然後添加雜交瘤上清液且使其在室溫下結合1小時，之後進行洗滌且使用抗人類Fc-Cy5二級抗體進行二次檢測。此FMAT篩選經由來自自用ST2之細胞外結構域免疫小鼠生成之雜交瘤的2200抗ST2特異性結合劑鑑別。

然後使用干擾素γ細胞介素釋放分析進一步表徵此組合組之3400個抗ST2特異性雜交瘤上清液功能性拮抗ST2信號傳導之能力。簡言之，將經純化人類周邊血單核細胞(PBMNC)或經純化人類NK細胞接種至96孔組織培養板中且用人類IL-33及IL-12刺激，從而誘導干擾素γ釋放至上清液中。對上清液中之干擾素γ含量進行定量且直接分析其與Il-33/ST2依賴性信號傳導之相關性。使用此生物分析，測試雜交瘤試樣經由阻斷ST2信號傳導途徑來阻斷干擾素γ釋放之能力。此篩選鑑別出578個自ST2-Fc免疫生成之將干擾素γ釋放抑制80%以上之雜交瘤上清液。另外，鑑別出505個自ST2Fc/IL-33複合物免疫生成之將干擾素γ釋放抑制70%以上之雜交瘤上清液。

然後進一步表徵此組之1083個雜交瘤上清液之與小鼠及食蟹猴ST2之交叉反應性結合，對於相對親和力分級，藉由限制性抗原ELISA進行表徵，對於生物化學受體/配體阻斷，藉由ELISA進行表徵，且對於內源性結合，藉由FAC使用細胞系進行表徵。使用該等二次分析中生成之數據將大組多樣化成2個由40個雜交瘤系構成之組，對其進進一步進行亞選殖、放大及純化。

實例3：K _D 測定

在此實例中，測定ST2結合抗體之親和力。使用裝配有GLC感測器晶片(Bio-Rad)之Proteon XPR-36光學生物感測器實施表面電漿共振評估。在25℃下在HBS-EP+(1×)緩衝系統(10mM HEPES pH 7.4,150mM NaCl,3.0mM EDTA,0.05%表面活性劑P20,GE Heathcare)中實施生物感測器分析。所有試劑在注射前皆保持在8℃下。

經由標準胺偶合將山羊抗人類IgG(具有Fc片段特異性，Jackson ImmunoResearch)固定至垂直方向上之感測器表面之1-6道(約4000RU)且隨後用乙醇胺阻斷。將抗體捕獲(約40-100RU)至垂直方向上之1-5道。垂直道6留作空白並用於參考目的。收集15種抗體之群組(3組，各有5種)之數據。

在運行緩衝液中準備ST2試劑(人類或食蟹猴)，以達到25nM之濃度且隨後稀釋3倍至309pM。沿水平方向進行單一注射遞送全濃度系列之各ST2分子，使用緩衝液來完成一列6個試樣且提供雙重參照反應數據之線內(in-line)空白。以100uL/min之流動速率監測締合(3min)及解離(30min)速率。

利用10mM甘胺酸(pH 1.5,30uL)以100uL/min之流動速率使表面再生。

對數據進行基線校正、裁剪、對準、參照扣減(interspot)，且隨後使用ProteOn Manager(2.1.2.05版)擬合至1：1結合模型。結果示於表4中。

使用經略微修改之電漿共振方案來測定其他抗體之親和力。在25℃下使用裝備有CM5感測器晶片之Biacore 3000儀器(Biacore International AB,Uppsala,Sweden)對Ab1、Ab2、Ab3及Ab4實施表面電漿共振評估。使用標準胺偶合化學利用HBS-EP((10mM HEPES pH 7.4,150mM NaCl,3mM EDTA,0.005%表面活性劑P20,GE Heathcare)作為運行緩衝液將抗Fcγ特異性捕獲抗體共價固定至CM4晶片上之兩個流動槽。簡言之，用0.1M NHS與0.4M EDC之1：1(v/v)混合物活化各流動槽。將AffiniPure山羊抗人類IgG Fcγ片段特異性抗體(Jackson ImmunoResearch公司，West Grove,PA)以30ug/ml在10mM乙酸鈉(pH 5.0)中固定於兩個流動槽上，其中目標量為3,000RU。藉由注射1M乙醇胺使殘餘反應性表面去活化。對於所有剩餘步驟，然後將運行緩衝液轉換為HBS-EP+0.1mg/ml BSA。

在運行緩衝液中準備一式三份所有抗體並將其稀釋3倍，且進行注射，以使得以10μl/min於測試流動槽上經3分鐘注射導致約75-90反應單位抗體捕獲於測試流動槽表面上。在對照流動槽表面上未捕獲到抗體。然後使不同濃度(200nM-0.0914nM)之人類或食蟹猴ST2連同緩衝液空白流動於兩個流動槽上。使用50ul/min之流動速率及2分鐘締合階段、之後4分鐘解離階段。在每次循環後利用注射50uL 10 mM甘胺酸(pH 1.5)使表面再生。然後在測試流動槽上捕獲新鮮抗體以準備下一循環。以200nM之濃度一式三份實施單獨的長解離實驗(60min)。

藉由以下方式對數據進行雙重參照：扣減對照表面反應以去除本體折射率變化，且隨後扣減去平均緩衝液空白反應以去除來自實驗性流動槽之系統性人為因素。利用局部Rmax在BIA評估軟體v 4.1ST2(Biacore International AB,Uppsala,Sweden)中處理數據且以全局方式將其擬合至1：1交互作用模型。測定締合(k_a)及解離(k_d)速率常數並使用其來計算解離平衡常數(K_D)。Ab1、Ab2、Ab3及Ab4之解離速率常數及解離平衡常數匯總於表5中。

實例4：抗體之pH敏感性結合

在低pH下以降低親和力結合靶標之治療性抗體可具有增強之PK性質，此將允許其較不頻繁地或以較低劑量遞送。(Nat Biotechnol.2010 28(11)：1203-7 T.Igawa等人Antibody recycling by engineered pH-dependent antigen binding improves the duration of antigen neutralization)，此乃因溶酶體在低pH下引起抗體之靶標釋放，之後後續靶降解及抗體再循環。

在Biacore 4000上實施抗體Ab1、Ab2、Ab3及Ab4之pH敏感性結合之生物感測器分析。設定與實例3相似，其中實施該等抗體之K_D量測，只是針對兩次相同注射之2.46nM單一濃度之αST2抗體對數據進行擬合。以30uL/min之流動速率監測pH 7.4下之締合(5min)速率及pH 5.5及7.4下之解離(10min)速率。在Scrubber中將參考扣除數據擬合至1：1模型。若干抗體展示在較低pH下之離解速率明顯更快，如表6中所示。

實例5：抗體交叉競爭

表徵表位之常見方式係經由競爭實驗。可認為彼此競爭之抗體結合靶標上之相同位點。此實例闡述測定對結合ST2之競爭之方法以及該方法在應用於本文所述諸多抗體時之結果。

可以諸多方式實施分箱實驗(Binning experiment)，且所用方法可對分析結果具有效應。該等方法共同之處在於，ST2通常由一種參照抗體結合並用另一種抗體來探測。若參照抗體阻止探針抗體之結合，則認為該等抗體在同一箱(bin)中。採用抗體之順序非常重要。若採用抗體A作為參照抗體且其阻斷抗體B之結合，則相反情況並非總是成立：用抗體B作為參照抗體不一定會阻斷抗體A。此處有諸多因素在起作用：抗體之結合可導致靶標構象變化，此會阻止第二抗體結合，或彼此重疊但未完全咬合之表位可能會使第二抗體與靶標仍具有足夠高之親和性交互作用從而容許結合。一般而言，若以任一順序均可觀察到競爭則認為抗體分箱在一起，且若兩種抗體可彼此阻斷則可能表位重疊地更完全。

對於此實例，使用Jia等人(J.Immunological Methods,288(2004)91-98)所述多重分箱方法之修改形式。使用可溶性ST2-FLAG His。在室溫下及黑暗中將各珠粒代碼的經抗生蛋白鏈菌素塗覆之Luminex珠粒(Luminex，編號為L100-L1XX-01，XX指定珠粒代碼)在100ul 6 pg/珠粒的生物素化單價小鼠抗人類IgG捕獲抗體(BD Pharmingen，編號為555785)中培育1小時，然後用PBSA(磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)+1%牛血清白蛋白(BSA))洗滌3×。將各代碼之珠粒單獨地與100ul以1：10稀釋之抗ST2抗體(塗覆抗體)一起培育1小時，然後洗滌。彙集珠粒，然後將其分配至96孔過濾板(Millipore，編號為MSBVN1250)中。100ul 2ug/ml ST2添加至一半孔中且將緩衝液添加至另一半孔中並培育1小時，然後洗滌。將100ul以1：10稀釋之抗ST2抗體(檢測Ab)添加至一個含有ST2之孔中及一個不含ST2之孔中，培育1小時，然後洗滌。運行無關人類IgG(Jackson，編號為009-000-003)以及無抗體條件(空白)作為陰性對照。將20ul PE-偶聯單價小鼠抗人類IgG(BD Pharmingen，編號為555787)添加至各孔中並培育1小時，然後洗滌。將珠粒再懸浮於75ul PBSA中並在BioPlex儀器(BioRad)上收集至少100個事件/珠粒代碼。

自含有ST2之反應之信號扣減無ST2之相應抗體對的中值螢光強度(MFI)。對於被認為同時結合且因此存於不同箱中之抗體對而言，反應值必須滿足以下兩個標準：1)不論哪種情況最高，該等值必須為與其自身配對之塗覆抗體、無關抗體或空白的2倍，及2)該等值必須大於與無關抗體或空白塗覆珠粒共存之檢測抗體之信號。發現最少三箱，如下表7中所示。

實例6：IL-33阻斷分析

使用兩次AlphaScreen來探索ST2抗體之作用機制。組合使用該等分析來測定抗體是否可抑制IL-33與ST2之締合，或相反，抗體是否可特異性地阻斷共受體ST2與AcP之締合，同時仍允許IL-33與ST2締合。AlphaScreen係增強型發光鄰近均相分析(Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay)篩選之首字母縮寫。

在第一次篩選中，評估抗體阻斷IL-33與ST2之間之締合的能力。此分析量測抗ST2抗體阻斷生物素化人類IL-33(與抗生蛋白鏈菌素供體珠粒偶合)與帶6×組胺酸標籤之人類ST2(與Ni-螯合物受體珠粒偶合)締合之能力。在96孔半區板(Perkin Elmer)中使用40ul反應物實施IL-33/ST2 AlphaScreen。用於兩次AlphaScreen之分析緩衝液皆含有40mM HEPES(pH=7.4)、1mM CaCl2、0.1% BSA、0.05% Tween-20及100mM NaCl。各分析孔含有0.3nM生物素化人類IL-33、0.3nM人類ST2-FH(FH代表FLAG及6×組胺酸標籤)、10ug/ml抗生蛋白鏈菌素塗覆之供體珠粒(Perkin Elmer,Waltham,MA)、10ug/ml Ni-螯合物塗覆之受體珠粒(Perkin Elmer)及12.5ug/ml抗ST2 Ab。在添加所有分析組份後，將板在黑暗中室溫下培育過夜。第二天，在2103 Envision多標記讀取器(Perkin Elmer)上讀取板。使用供體珠粒在680nm下之雷射激發來產生可在受體珠粒中起始發光/螢光級聯之活性氧，該等受體珠粒因珠粒偶合蛋白質之交互作用而緊密鄰近，從而導致發射在570nm下檢測到之光。

在第二次分析中，評估抗體抑制由IL-33介導之ST2與共受體AcP之締合的能力。此分析量測抗ST2抗體阻斷由IL-33介導之生物素化人類ST2-Fc(與抗生蛋白鏈菌素供體珠粒偶合)與帶6×組胺酸標籤之人類AcP(與Ni-螯合物受體珠粒偶合)締合之能力。在384孔不透明微量多孔(optiplate，Perkin Elmer)中在8ul反應物中實施ST2/AcP AlphaScreen。各分析孔皆含有5nM人類IL-33、5nM生物素化人類ST2-Fc、5nM人類AcP-FH、10ug/ml抗生蛋白鏈菌素塗覆之供體珠粒、10ug/ml Ni-螯合物塗覆之受體珠粒及12.5ug/ml抗ST2 Ab。在添加所有分析組份後，將板在黑暗中室溫下培育過夜。第二天，使用與上文第一分析相同之參數在2103 Envision多標記讀取器(Perkin Elmer)上讀取板。

兩次AlphaScreen之結果呈現於下表8中。各抗體之抑制呈現為相對於分析孔中不包括抗體時之分析中之信號，使用12.5ug/ml濃度給定抗體之AlphaScreen中之信號的抑制百分比。一些抗體相比於其抑制ST2/IL-33/AcP交互作用更完全地抑制ST2與IL-33之交互作用，且一些抗體相比於抑制ST2與IL-33之交互作用更完全地抑制ST2/IL-33/AcP交互作用。全部抗體皆將IL-33與ST2之交互作用抑制至少50%。

實例7：活體外人類IL-33生物分析

在人類生物分析中利用自用人類IL-33及人類IL-2刺激之各種供體獲得之經純化CD4+ T細胞來測試實例性ST2人類mAb。分析程序如下。在96孔圓底板中以250,000個細胞/孔以60ul體積接種細胞。在預培育後，將30ul 4×huIL-2+huIL-33混合物添加至各孔中。96孔圓底板中之總體積係120ul。以20ug/ml開始抗體且進行1：3稀釋以產生10點曲線。達成4×，總共30ul。在預培育Ab與細胞後，將30ul 4×huIL-2+huIL-33混合物添加至各孔中。37℃、5% CO2保持48小時。收穫上清液。藉由huIL-5 ELISA分析對IL-5之抑制。

圖3顯示ST2 mAb對來自各種供體之CD4+ T細胞之由人類IL-33誘導之IL-5產生的抑制。(-)線繪示無抑制時人類IL-33與人類IL-2之組合的陽性對照值。(‥‥)繪示人類IL-2之陽性對照值。(--)線繪示培養基對照值。將人類CD4+ T細胞與抗ST2 mAb預培育30分鐘且隨後用人類IL-33(4ng/ml)及人類IL-2(10ng/ml)刺激48小時。圖3顯示，ST2抗體能夠抑制由人類IL-33誘導之ST2活化，如藉由來自CD4+ T細胞之IL-5產生所測定。ST2抗體能夠以約<100nM之IC50拮抗CD4+ T細胞之由IL-33誘導之IL-5產生。表9顯示代表性IC50值。

實例8：食蟹猴CD4+ T細胞IFNγ釋放分析

藉由ISOLYMPH(Gallard-Schlesinger Industries,Plainview,NY)梯度離心自酸性檸檬酸鹽右旋糖(ACD)處理之正常供體周邊血富集食蟹猴周邊血單核細胞(PBMC)。使用Miltenyi Biotec之食蟹猴CD4+ T細胞分離套組來實施食蟹猴CD4+ T細胞之隨後分離。在室溫下將經分離食蟹猴CD4+ T細胞(2×10⁵個細胞/孔，於96孔板中)與不同濃度之經純化單株抗體一起培育30分鐘且隨後用IL-33(10ng/mL)、IL-2(10ng/mL)及IL-12p70(50ng/mL)刺激84小時。然後藉由ELISA分析所得無細胞食蟹猴CD4+ T細胞培養物上清液中食蟹猴IFNγ之存在(實例數據提供於表10中)。在食蟹猴CD4+ T細胞IFNγ釋放分析中自3個單獨供體測定經純化單株抗體之效能。

實例9：人類嗜伊紅性白血球IL-8釋放分析

藉由ISOLYMPH(Gallard-Schlesinger Industries,Plainview,NY)梯度離心自肝素化正常供體周邊血富集人類紅血球及顆粒球。使用ACK溶解緩衝液(Gibco,Carlsbad,CA)去除紅血球。使用Miltenyi Biotec之嗜伊紅性白血球分離套組實施嗜伊紅性白血球之隨後分離。在室溫下將經分離嗜伊紅性白血球(2×10⁵個細胞/孔，於96孔板中)與若干稀釋度之非純系或純系上清液或不同濃度之經純化單株抗體一起培育30分鐘且然後用IL-33(2ng/mL)及IL-3(100ng/mL)刺激3天。然後藉由ELISA分析所得無細胞嗜伊紅性白血球培養上清液中IL-8之存在。實例數據示於表11中。在嗜伊紅性白血球IL-8釋放分析中自3個單獨供體測定經純化單株抗體之效能。

實例10：抗ST2抗體與市售抗體相比之效能 人類IL-33在人類NK細胞分析中之劑量反應。

用人類IL-12(1ng/mL)+增加量之人類IL-33處理原代CD56陽性人類NK細胞(5×10⁴個細胞)，如圖4中所示。22小時後，收集無細胞上清液且使用商業分析(R&D Systems)量測IFN-γ濃度。使用10ng/mL IL-33作為用於ST2抗體抑制之刺激劑量。

抗體對IL-33活性之抑制

如上刺激人類NK細胞。在添加IL-33及IL-12前30分鐘，將ST2抗體以如圖5中所示之濃度添加至細胞。在IL-33處理後22小時，收集無細胞上清液且使用商業分析(R&D Systems)量測IFN-γ濃度。指示市售抗體之純系名稱。僅Ab2完全地抑制IL-33依賴性IFN-γ反應且其比任一市售huST2抗體顯著更有效。對應於各抗體之IC50值示於表12中。

實例11：ST2之丙胺酸/精胺酸掃描誘變

此實例基於ST2誘變對ST2抗體結合靶標之能力之效應來表徵ST2抗體。先前結合數據指示，ST2結構域1及2在此實例中主要負責藉由ST2掃描誘變所分析抗體組之抗體結合。因此，在突變位點之設計中在全長ST2之背景下在結構上僅考慮ST2之結構域1及2(D1D2)。

自Lingel等人，Structure(London,England：1993).Elsevier Ltd 17,1398-410獲得ST2及IL-33複合模型坐標。在分子操作環境中計算ST2之每殘基側鏈溶劑可及性(Molecular Operating Environment(MOE),2011.10；Chemical Computing Group公司，1010 Sherbooke St.West,Suite第910號，Montreal,QC,Canada,H3A 2R7,2011)。然後使用該等溶劑可及性值藉由首先選擇所有具有至少10Å²側鏈暴露之D1D2殘基或具有至少10Å²總暴露之甘胺酸殘基來選擇用於誘變之D1D2表面殘基。去除具有正π角之甘胺酸殘基，此同樣適用於脯胺酸殘基，此乃因此等位置處之突變具有扭曲局部蛋白質結構之較高可能性。亦自選擇去除半胱胺酸殘基以維持二硫連接。在目視檢測後去除殘基A82。此方法產生140個誘變用殘基之列表。所有殘基皆突變成精胺酸，除了精胺酸及離胺酸殘基，其突變成丙胺酸。

在24孔板中在過渡轉染之293-6E懸浮液細胞(NRCC)中表現pTT5載體中帶His-Avi-標籤之親本ST2細胞外結構域(ECD)之所有突變體構築物。藉由在pTT5載體中共轉染BiR A來達成活體內生物素化。利用PBS透析上清液以去除過量生物素。

使用BioPlex結合分析來量測抗ST2抗體與點突變之ST2之結合。使生物素化突變體結合至80珠粒代碼之抗生蛋白鏈菌素塗覆之珠粒(Luminex，編號為L100-L1XX-01，XX指定珠粒代碼)上。80珠粒代碼允許對兩個由70個突變體構成之組(共140個突變體)進行多重處理(multiplexing)。各組包括6個親本對照、3個無關蛋白質對照及1個空白。比較突變蛋白質之抗體結合與親本蛋白質之抗體結合。

用PBS+1% BSA將100ul以1：7稀釋且預結合珠粒之ST2突變體、親本及對照或無蛋白質洗滌5×，彙集並等分至96孔過濾板(Millipore)中，然後再次洗滌。將100ul以3倍稀釋之抗ST2抗體添加至3個相同孔中，在RT下培育1小時並洗滌。100ul以1：500稀釋之PE-偶聯抗人類IgG Fc(Jackson，編號為109-116-170)添加至各孔中，培育0.5小時並洗滌。將珠粒再懸浮於75uL溶液中，振盪至少3min，且在BioPlex上讀取。

在運行結合分析前，實施驗證實驗以評價「珠粒區」-「珠粒區」(B-B)可變性。在驗證實驗中，使所有珠粒與相同野生型對照蛋白質偶聯。因此，珠粒區之間之差異單純地歸因於B-B方差且不會與野生型蛋白質與突變蛋白質之間之差異混淆。運行抗體之滴定，其中在不同孔中有12個重複。

此統計學分析之目標係估計結合曲線之所估計EC50之B-B可變性。然後使用所估計B-B標準偏差(SD)來構建在曲線比較實驗期間野生型蛋白質及突變蛋白質之EC50信賴區間。

將四參數邏輯模型擬合至各珠粒區之結合數據。使用所得含有曲線品質控制(QC)結果及曲線之頂部(max)、底部(min)、希爾斜率(Hillslope)(斜率)及EC50(xmid)自然對數之參數估計值的「sumout.xls」檔案作為分析用原始數據。然後藉由使用SAS PROC MIXED程序擬合混合效應模型來估計各參數之B-B可變性。分析中僅包括具有「良好」QC狀態之曲線。最終混合效應模型僅包括殘餘部分(即個別珠粒區)作為隨機效應。亦藉由混合效應模型來估計各參數之最小平方均值(LS-均值)。藉由取B-B方差之平方根來計算B-B SD。亦計算LS-均值+2SD與LS-均值-2SD(其大約代表總體之上側及下側97.5百分位)之間之倍數變化。

對於各抗體而言，為鑑別相對於WT對照不產生大量反應之突變體，鑑別max(MFI)小於30%WT對照之max(MFI)之突變體且將其標誌為命中max。

比較突變體結合曲線與野生型結合曲線之EC50。出於進一步考慮，將統計學顯著性差異鑑別為命中。自此分析中排除具有「無擬合」或「壞擬合」標誌之曲線。

在EC50估計值比較中考慮兩個變化來源，即曲線擬合變化及珠粒間變化。野生型及突變體係連接至不同珠粒，因此其差異與珠粒間差異混淆。藉由log EC50估計值之標準誤差來估計曲線擬合變化。珠粒間變化係以實驗方式使用將野生型對照連接至各珠粒之實驗來測定。使用此實驗之野生型結合曲線之EC50估計值的珠粒變化來估計實際定位實驗中之珠粒間變化。

使用司徒登氏t測試(Student's t-test)來實施兩個EC50(以對數標度)之比較。將t統計值計算為δ(EC50估計值間之絕對差)與δ之標準偏差之間之比率。由三個分量(突變體及野生型曲線在非線性回歸中之EC50方差估計值以及自單獨實驗估計之兩倍珠粒間方差)之和來估計δ之方差。珠粒間方差加倍歸因於以下假定：突變體與野生型珠粒二者具有相同方差。

使用薩特思韋特逼近法(Satterthwaite’s approximation)(1946)來計算δ之標準偏差之自由度。

個別p值及信賴區間(95%及99%)係根據各比較之司徒登氏t分佈來獲得。

在多個野生型對照之情況下，藉由挑選與突變體最相似之野生型對照(即挑選具有最大p值者)來實施保守處理法。

在同時實施大量測試時，多重性調節對控制假陽性非常重要。對於此分析實施兩種形式之多重性調節：族誤差(FWE)控制及錯誤發現率(FDR)控制。FEW處理法控制一或多個並非真正命中之可能性；FDR處理法控控制所選擇命中中假陽性之預計比例。前一種處理法控比後一種更保守並且不如後一種有效。有許多方法可用於該兩種處理法，對於此分析，選擇霍克方法(Hochberg’s method)(1988)進行FWE分析並選擇本傑明-霍克(Benjamini-Hochberg)FDR方法(1995)進行FDR分析。計算兩種處理法中各抗體或整個分析之經調節p值。

藉由以下準則將突變體選擇為具有效應：1)返回該突變體之壞擬合或無擬合結果，2)針對命中max準則選擇突變體。3)族誤差p值小於0.01或4)Bmax值大於200%親本。若效應降低Bmax或增加EC50值，則將命中稱為抑制劑，若效應增加Bmax或降低EC50值，則將命中稱為活化物。因對>90%所測試抗體之效應而自命中列表排除8個突變，其係：K37A、R46A、D63R、V71R、G106R、K112A、N132R、Q137R及Y141R。

分析結果提供於表13及14中。

實例12：氫/氘交換(HDX)分析

在此實例中，Ab2結合ST2且測定結合對HDX之效應。

在哺乳動物293-6E細胞中過渡表現在C端上具有FLAG-標籤與His-標籤二者之可溶性ST2蛋白質(含有SEQ ID NO：1之胺基酸19-322之結構域1-3)並經IMAC(固定金屬離子親和力層析)純化且藉由製備型SEC(尺寸排除層析)進一步純化。然後使用超濾將該蛋白質濃縮至3.5mg/mL。在經改造CHO-CS9細胞中表現ST2抗體Ab2且經蛋白質A親和力層析純化，之後進行製備型SEC。使用分析型SEC來測定0.75：1.00莫耳比之抗體：抗原對於確保ST2蛋白質完全結合抗體係最佳的。游離ST2蛋白質與抗原-抗體複合物二者皆儲存在PBS緩衝液(pH 7.2)中。

在自動化HDX系統上實施HDX實驗(Zhang、Zhang等人2012)。簡言之，H/D交換過程以將5uL游離ST2蛋白質溶液(3.5mg/mL)或ST2-抗體複合物(其中jST2濃度為3.5mg/mL，抗原：抗體比例為1：0.75)稀釋至存於100mM PBS中之25uL D₂O(pH 7.2)緩衝液中開始，該緩衝液係藉由在25℃下將PBS錠劑溶解於D₂O水中製備。對於各HDX實驗而言，將交換反應物培育不同標記持續時間(30秒、2min、8min、30min及2小時、8小時)，且藉由在1℃下混合20μL標記溶液與80μL淬滅/變性/還原緩衝液(7.25M尿素及625mM叁(2-羧基乙基)膦(TCEP)、0.45M甘胺酸(pH 2.7))來淬滅標記反應。

將淬滅溶液之40μL等分試樣轉移至120μL 0.4mg/mL豬胃蛋白酶(Sigma,St.Louis,MO)溶液中。在1℃下立即將消化溶液注射至試樣環路中且保持6min以進行完全消化。此外，藉由C18管柱(3個串聯管柱，BEH C18,2.1mm×5mm，Waters公司，Milford,MA)分離消化物。在1℃下利用5-min 1-40% ACN梯度實施HPLC分離。在數據依賴性LC-MS/MS實驗中藉由Orbitrap Elite質譜儀(Thermo Scientific,San Jose,CA)分析LC溶析物。

在由LEAP Shell(LEAP Technologies,Carrboro,NC)控制之LEAP HD-X PAL系統上實施氘標記、淬滅、蛋白質水解消化及注射。

實驗重複3次，且在各實驗中，各時間點重複兩次。將標準肽混合物添加至試樣中以追蹤並校正返交換可變性。該混合物含有該三種肽：緩激肽、血管收縮素I及白胺酸腦啡肽。使用經特別設計之四肽PPPI(由AnaSpec,Fremont,CA合成)作為第二內標物以將運行間可變性最小化。亦將無H/D交換之ST2蛋白質消化物作為對照分析。

利用質量分析儀程式處理所得數據檔案(Zhang、Zhang等人2012)。軟體自抗原消化物鑑別肽，計算各肽之交換速率，校正自內標物獲得之返交換資訊，並將數據擬合至模型中，以得到各殘基之防護因數。

比較游離ST2與結合抗體之ST2蛋白質之間之交換概況揭示兩個所關注區且其可為潛在表位。由多個重疊肽將ST2序列中之該兩個區精修至IVRCPRQGKPSY(SEQ ID NO：1之胺基酸33-44，對應於成熟ST2之胺基酸15-26)及IVRSPTF(SEQ ID NO：1之胺基酸88-94，對應於成熟ST2之胺基酸70-76)。當ST2處於游離狀態時，該等區受保護較小，而交換速率在ST2及he抗體結合後顯著降低。此外，基於圖6中所示ST2同源結構模型，該兩個序列延伸物佔據蛋白質外表面上之相似空間位置。該等結果得出以下結論：兩種肽參與Ab2與ST2蛋白質之間之結合。

實例13：X射線結晶學

在此實例中，Ab2及ST2之sc-dsFv片段之複合物的晶體結構提供交互作用界面中之特定胺基酸殘基。

在BL21(DE3)星細胞中表現Ab2 sc-dsFv。簡言之，Ab2 sc-dsFv含有由連接體(G₄S)₃連接至輕鏈可變結構域之重鏈可變結構域。為進一步穩定該分子，藉由於重鏈可變區之44位及輕鏈可變區之101位突變成半胱胺酸將二硫鍵改造至分子中。該蛋白質表現為包涵體。將包涵體溶解並再摺疊。在尺寸排除管柱(SEC)及離子交換MonoQ管柱上進一步純化蛋白質，且隨後在SEC上精製(polished)。

在293S細胞中表現ST2。藉由Ni-親和力管柱純化蛋白質且利用EndoH去糖基化。在SEC上進一步純化蛋白質。

藉由混合Ab2 sc-dsFv與過量ST2形成Ab2 sc-dsFv與ST2之複合物。在SEC上純化複合物且將其濃縮至12mg/ml用於結晶。在16℃下使用坐滴式法蒸氣擴散法使蛋白質複合物在32-36% PEG400及0.1M Hepes(pH 7.5-8.5)中結晶。

於Advanced Light Source,Lawrence Berkeley National Lab(Berkeley,CA)收集1.9Å解析度數據集。用MOSFLM(Leslie,1992)處理數據且藉由CCP4程式套中之SCALA(Collaborative Computational Project，4號(1994))按比例縮放。藉由分子替代方法利用程式PHASER(McCoy等人，2007)使用IL-1RII之公開結構之D1D2結構域(pdb代碼：3O4O)及Ab2之Fab結構之可變結構域作為研究模型來解析該結構。利用REFMAC5(Murshudov等人，1997)及COOT(Emsley及Cowtan,2004)實施迭代結構精修及模型構建。

利用CCP4包中之程式PISA、AREAMOL及NCONTACT實施界面分析。利用Pymol(The PyMOL Molecular Graphics System.Schrödinger)精製圖。

將ST2/Ab2 sc-dsFv複合物之晶體結構解析為1.9Å之解析度。在不對稱單元中存在兩個獨立的ST2/Ab2 sc-dsFv複合物對(圖7)。各複合物由一個ST2分子及一個Ab2 sc-dsFv片段組成。ST2分子係由兩個IgG-樣結構域(D1及D2結構域)構成。Ab2 Fv結構域利用重鏈及輕鏈之所有6個CDR環來與ST2分子交互作用(圖8)。對於ST2而言，ST2之兩個環(環BC及環FG)及N端與抗體進行直接交互作用。ST2與Ab2 sc- dsFv之間之總隱藏溶劑可及表面積係1803Å²。

ST2與Ab2之間之界面高度帶電。ST2在D1結構域中具有鹼基殘基簇(Lys及Arg)。此帶正電表面斑片與Ab2上由CDR區中之酸性殘基簇(Asp及Glu)形成之帶負電斑片互補(圖9)。

使用兩種不同方法來界定界面殘基。在第一種方法中，使用溶劑暴露差異來界定界面殘基。計算複合物中ST2(或Ab2 sc-dsFv)之各殘基之溶劑可及表面積且將其與自複合物剝離之ST2(或Ab2 sc-dsFv)中對應殘基之溶劑可及表面積進行比較。ST2及Ab2之所有差異大於10%之胺基酸分別列示於表15及表16中。ST2之Arg72及Tyr81之表面暴露差異小於10%。然而，對複合結構之檢測揭示，兩個殘基皆與Ab2重鏈殘基形成水介導之氫鍵且因此其包括在列表中。

在第二種方法中，選擇在與其對象蛋白質之預定距離內具有至少一個原子之界面殘基。基於不同距離截止值界定兩個殼。

核殼包括所有距離高達5.0Å之殘基。

邊界殼包括所有距離長於5.0Å但短於8.0Å之殘基。

ST2、Ab2之重鏈及輕鏈之各殼中之胺基酸殘基完全列表分別示於表17、18及19中。對於與對象蛋白質形成氫鍵或鹽橋之殘基而言，特定交互作用之類型表示為殘基後括弧(HB表示氫鍵且SB表示鹽橋)。

藉由溶劑暴露差異所界定表位殘基匹配藉由距離截止值所界定核交互作用基團之殘基。表20列示界面內之所有氫鍵及鹽橋對。表20界面中之交互作用對

藉由結晶學數據確認自實例12之HDX-MS分析獲得之ST2表位區。將來自HDX之兩個表位(15-26及70-76)鑑別為較高解析度結晶學數據中之表位。具體而言，將Arg20、Gly22、Lys23及Tyr26以及Thr75鑑別為靠近抗體，距離小於3.4Å。鑑別為與抗體之距離介於3.4Å與5Å之間之其他殘基(Pro 19、Gln21、Ile70、Val71、Arg72、Ser73 Pro74及Phe76)亦涵蓋在HDX表位中。

總之，結果確認，自HDX-MS與結晶學二者獲得之ST2表位區係一致的。結構域1中之BC環及FG環(參見結晶學數據)係主要交互作用位點。

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<120> ST2抗原結合蛋白質

<130> A-1712-

<150> US 61/792,619

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<151> 2012-05-18

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> PRT

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<400> 143

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<212> PRT

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<212> DNA

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<212> DNA

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<211> 8

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<400> 174

<210> 175

<211> 187

<212> PRT

<213> 智人

<400> 175

Claims

一種經分離ST2抗體，其包含：a)輕鏈可變結構域，其與SEQ ID NO：96中所述胺基酸序列具有至少90%一致性；b)重鏈可變結構域，其與SEQ ID NO：30中所述胺基酸序列具有至少90%一致性；或c)a)之輕鏈可變結構域及b)之重鏈可變結構域。
如請求項1之ST2抗體，其中該輕鏈可變結構域與SEQ ID NO：96中所述胺基酸序列具有至少95%一致性。
如請求項1或2之ST2抗體，其中該重鏈可變結構域與SEQ ID NO：30中所述胺基酸序列具有至少95%一致性。
一種經分離ST2抗體，其包含：a)與SEQ ID NO：96中所述胺基酸序列相差不超過10個胺基酸添加、缺失或取代之輕鏈可變結構域；b)與SEQ ID NO：30中所述胺基酸序列相差不超過10個胺基酸添加、缺失或取代之重鏈可變結構域；或c)a)之該輕鏈可變結構域及b)之該重鏈可變結構域。
如請求項4之ST2抗體，其中該輕鏈可變結構域與SEQ ID NO：96中所述胺基酸序列相差不超過5個胺基酸添加、缺失或取代。
如請求項4或5之ST2抗體，其中該重鏈可變結構域與SEQ ID NO：30中所述胺基酸序列相差不超過5個胺基酸添加、缺失或取代。
如請求項1、2、4及5中任一項之ST2抗體，其中該輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO：96中所述胺基酸序列。
如請求項1、2、4及5中任一項之ST2抗體，其中該重鏈可變結構域包含SEQ ID NO：30中所述胺基酸序列。
一種經分離ST2抗體，其包含：a)包含以下之輕鏈可變結構域：與SEQ ID NO：107中所述LCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR1；與SEQ ID NO：118中所述LCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR2；及與SEQ ID NO：129中所述LCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的LCDR3；及b)包含以下之重鏈可變結構域：與SEQ ID NO：41中所述HCDR1序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR1；與SEQ ID NO：52中所述HCDR2序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR2；及與SEQ ID NO：63中所述HCDR3序列相差不超過3個胺基酸添加、缺失或取代的HCDR3。
如請求項1、2、4、5及9中任一項之經分離ST2抗體，其中該輕鏈可變區包含D28或其保守取代、I29或其保守取代、S30或其保守取代、N31或其保守取代、Y32或其保守取代、Y49或其保守取代、D50或其保守取代、N53或其保守取代、E55或其保守取代、T56或其保守取代、D91或其保守取代、D92或其保守取代、N93或其保守取代、F94或其保守取代或L96或其保守取代。
如請求項10之經分離ST2抗體，其中該輕鏈可變區包含D28或其保守取代、N31或其保守取代、D50或其保守取代、N53或其保守取代、E55或其保守取代、D91或其保守取代及D92或其保守取代。
如請求項11之經分離ST2抗體，其中該輕鏈可變區包含D28、N31、D50、N53、E55、D91及D92。
如請求項1、2、4、5及9中任一項之經分離ST2抗體，其中該重鏈可變區包含W33或其保守取代、I50或其保守取代、D57或其保守取代、R59或其保守取代、H99或其保守取代、G100或其保守取代、T101或其保守取代、S102或其保守取代、S103或其保守取代、D104或其保守取代、Y105或其保守取代或Y106或其保守取代。
如請求項13之經分離ST2抗體，其中該重鏈可變區包含S102或其保守取代、S103或其保守取代、D104或其保守取代及Y105或其保守取代。
如請求項14之經分離ST2抗體，其中該重鏈可變區包含S102、S103、D104及Y105。
如請求項1、2、4、5及9中任一項之ST2抗體，其中該輕鏈可變結構域包含如SEQ ID NO：107中所述之LCDR1；如SEQ ID NO：118中所述之LCDR2序列及如SEQ ID NO：129中所述之LCDR3序列；且該重鏈可變結構域包含如SEQ ID NO：41中所述之HCDR1；如SEQ ID NO：52中所述之HCDR2序列及如SEQ ID NO：63中所述之HCDR3序列。
如請求項1、2、4、5及9中任一項之ST2抗體，其中該抗體以小於或等於1×10^-10M之親和力特異性結合人類ST2。
如請求項1、2、4、5及9中任一項之ST2抗體，其中該抗體抑制人類ST2結合人類IL-33。
如請求項1、2、4、5及9中任一項之ST2抗體，其中該抗體減少人類ST2表現細胞中由人類IL-33介導之ST2信號傳導。
如請求項18之ST2抗體，其中該抗體抑制食蟹猴ST2結合食蟹猴IL-33。
如請求項20之ST2抗體，其中該抗體減少食蟹猴ST2表現細胞中由IL-33介導之食蟹猴ST2信號傳導。
如請求項1、2、4、5及9中任一項之ST2抗體，其中該抗體係人類抗體。
如請求項22之ST2抗體，其包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含SEQ ID：85中所述胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO：19中所述胺基酸序列。
一種經分離核酸，其編碼如請求項1至23中任一項之抗體之輕鏈可變結構域。
一種經分離核酸，其編碼如請求項1至23中任一項之抗體之重鏈可變結構域。
一種經分離核酸，其編碼如請求項1至23中任一項之抗體之輕鏈可變結構域及重鏈可變結構域。
如請求項24之經分離核酸，其中該核酸編碼抗體輕鏈。
如請求項27之經分離核酸，其中該輕鏈係由包含與SEQ ID NO：74中所述核苷酸序列至少80%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
如請求項27之經分離核酸，其中該輕鏈係由包含與SEQ ID NO：74中所述核苷酸序列至少90%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
如請求項27之經分離核酸，其中該輕鏈係由包含與SEQ ID NO：74中所述核苷酸序列至少95%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
如請求項27之經分離核酸，其中該輕鏈係由包含SEQ ID NO：74中所述核苷酸序列之核酸編碼。
如請求項25之經分離核酸，其中該核酸編碼抗體重鏈。
如請求項32之經分離核酸，其中該重鏈係由包含與SEQ ID NO：8中所述核苷酸序列至少80%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
如請求項32之經分離核酸，其中該重鏈係由包含與SEQ ID NO：8 中所述核苷酸序列至少90%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
如請求項32之經分離核酸，其中該重鏈係由包含與SEQ ID NO：8中所述核苷酸序列至少95%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
如請求項32之經分離核酸，其中該重鏈係由包含SEQ ID NO：8中所述核苷酸序列之核酸編碼。
一種表現載體，其包含如請求項24至36中任一項之經分離核酸。
一種重組宿主細胞，其包含可操作地連接至啟動子之如請求項24至36中任一項之經分離核酸。
一種重組宿主細胞，其包含如請求項37之表現載體。
如請求項39之重組宿主細胞，其中該宿主細胞分泌可結合ST2之抗體。
如請求項39至40中任一項之重組宿主細胞，其中該細胞係源於哺乳動物之細胞。
如請求項41之重組宿主細胞，其中該細胞係中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。
一種如請求項1至23中任一項之ST2抗體之用途，其用於製造用以治療自體免疫或發炎性病症之藥劑。
如請求項43之用途，其中該抗體包含如SEQ ID NO：96中所述之輕鏈可變結構域胺基酸序列及如SEQ ID NO：30中所述之重鏈可變結構域胺基酸序列。
如請求項44之用途，其中該抗體包含如SEQ ID NO：85中所述之輕鏈胺基酸序列及如SEQ ID NO：19中所述之重鏈胺基酸序列。
如請求項43至45中任一項之用途，其中該抗原結合蛋白質抑制IL-33結合ST2。
如請求項46之用途，其中該自體免疫或發炎性病症係哮喘、異位性皮炎、慢性阻塞性肺病、肺纖維化、敗血症及外傷、全身性紅斑狼瘡、發炎性腸病、類風濕性關節炎、硬化、華格納氏肉芽腫(Wegener's granulomatosis)、貝歇病(Behchet disease)、心血管疾病、鼻竇炎、鼻息肉或嗜伊紅性枝氣管炎。
一種製備ST2抗體之方法，該方法包含：a)培養如請求項39至42中任一項之重組宿主細胞；及b)自該培養物分離該ST2抗體。
一種經分離ST2抗體，其中該ST2抗體與包含含有SEQ ID：85中所述胺基酸序列之輕鏈及含有SEQ ID NO：19中所述胺基酸序列之重鏈的抗體交叉競爭。
如請求項49之經分離ST2抗體，其中該ST2抗體係如請求項1至23中任一項之ST2抗體。
一種經分離ST2抗體，其中如藉由氫/氘交換分析所測定，該ST2抗體與包含SEQ ID NO：1之胺基酸19至322之ST2在SEQ ID NO：1之胺基酸33至44或88至94內結合。
如請求項51之經分離ST2抗體，其中如藉由氫/氘交換分析所測定，該ST2抗體係在SEQ ID NO：1之胺基酸33至44及88至94內結合。
如請求項52之經分離ST2抗體，其中該ST2結合蛋白質係如請求項1至23中任一項之ST2結合蛋白質。
一種經分離ST2抗體，其結合ST2，從而產生界面，其中藉由該結合產生之該界面包含ST2殘基K1、F2、P19、R20、Q21、G22、K23、Y26、I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79或Y81。
如請求項54之經分離ST2抗體，其中藉由該結合產生之該界面包含ST2殘基P19、R20、Q21、G22、K23或Y26。
如請求項55之經分離ST2抗體，其中藉由該結合產生之該界面包含ST2殘基P19、R20、Q21、G22、K23及Y26。
如請求項54之經分離ST2抗體，其中藉由該結合產生之該界面包含ST2殘基I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79或Y81。
如請求項57之經分離ST2抗體，其中藉由該結合產生之該界面包含ST2殘基I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79及Y81。
如請求項54之經分離ST2抗體，其中藉由該結合產生之該界面包含ST2殘基P19、R20、Q21、G22、K23、Y26、I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79及Y81。
如請求項59之經分離ST2抗體，其中藉由該結合產生之該界面包含ST2殘基K1、F2、P19、R20、Q21、G22、K23、Y26、I70、V71、R72、S73、P74、T75、F76、N77、R78、T79及Y81。
如請求項54至60中任一項之經分離ST2抗體，其中該界面係藉由結合ST2與未結合ST2之間之溶劑暴露差異來測定，其中界面殘基定義為彼等差異大於10%之胺基酸及彼等與該抗體形成水介導之氫鍵者。
如請求項54至60中任一項之經分離ST2抗體，其中該等界面殘基定義為彼等具有至少一個在該抗體之5 內之原子之胺基酸。