CN115920033A - 抗肿瘤抑制素2抗体的制药用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新的抗肿瘤抑制素2(ST2)抗体在制备用于预防或治疗炎性、过敏性或自身免疫性疾病的药物中的应用。所述抗ST2抗体能够以高亲和力与人ST2结合，能够阻断人ST2与人IL‑33的结合，由此能够有效抑制IL‑33/ST2信号传导通路，对炎性、过敏性或自身免疫性疾病具有积极的预防和治疗作用。

Description

抗肿瘤抑制素2抗体的制药用途

相关申请的交叉引用

本专利申请要求于2021年7月21日提交的申请号为CN202110824642.3的中国发明专利申请的优先权权益，在此将其全部内容引入作为参考。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体而言，本发明涉及一种抗肿瘤抑制素2抗体在制备药物和治疗相关疾病中的用途。

背景技术

白介素33(IL-33)是IL-1家族的成员，在细胞损伤或过敏原刺激下释放，经肥大细胞的蛋白酶或某些具有酶活性的过敏原加工后，直接激活局部浸润的嗜碱性粒细胞、肥大细胞、2型固有淋巴细胞(ILC2)、T细胞和嗜酸性粒细胞诱导过敏性炎症。此外，白介素33作用于其受体，通过与其受体相互作用在体内外发挥功能。例如，IL-33能以高亲和力与抗肿瘤抑制素2(suppression of tumorigenicity 2，ST2)结合，通过下游分子触发信号传导级联，激活NFκb(核因子κb)和MAP(丝裂原活化蛋白)激酶途径，从而刺激靶细胞并导致靶细胞产生细胞因子和趋化因子等一系列功能反应。IL-33/ST2信号通路的激活促进炎症细胞因子的表达，包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、MIP-1α、IP-10、MCP-1、TNF和GM-CSF。已表明IL-33/ST2信号通路的失调或激活与多种免疫介导的疾病有关，包括过敏性哮喘、类风湿性关节炎、炎性肠病、过敏性皮炎、特应性皮炎、变应性鼻炎、鼻息肉、全身性硬化症等等，治疗性阻断IL-33/ST2途径可有助于克服过免疫反应。

由此可知，抗ST2的抗体可阻断IL-33与ST2蛋白的结合，抑制其下游信号通路，从而在与IL-33/ST2信号通路激活相关的疾病中发挥治疗作用。

发明内容

本发明的发明人提供了一种对人ST2具有高亲和力和高功能活性的新抗体。研究表明，该抗体通过以高亲和力特异性地结合人ST2，能够阻断人IL-33与肥大细胞、2型固有淋巴细胞(ILC2)和嗜碱性粒细胞等细胞上ST2的结合，阻止IL-33/ST2信号通路的激活，从而实现对炎性和过敏性疾病的治疗作用；进一步地，显示该抗体在不同的炎性和过敏性疾病模型中具有明显的药效。

因此，本发明的目的在于提供一种新的抗ST2抗体的制药用途。

本发明的技术方案如下。

一方面，本发明提供一种抗肿瘤抑制素2(ST2)抗体或其片段在制备用于预防治疗或改善炎性、过敏性或自身免疫性疾病的药物中的应用。

根据本发明，所述炎性、过敏性或自身免疫性疾病与IL-33/ST2信号传导通路的激活相关。具体而言，本发明所述的炎性、过敏性或自身免疫性疾病为子宫内膜异位、心力衰竭、过敏性皮炎、过敏性或变应性鼻炎、鼻息肉、特应性皮炎、慢性阻塞性肺病、哮喘(例如过敏性哮喘)、肺纤维化、败血症、炎性肠病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、全身性硬化症、韦格纳氏肉芽肿或化疗相关性腹泻。

本发明所述的抗ST2抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区并且在重链可变区和轻链可变区中分别包含重链CDR1(H-CDR1)、CDR2(H-CDR2)、CDR3(H-CDR3)和轻链CDR1(L-CDR1)、CDR2(L-CDR2)、CDR3(L-CDR3)，其中：

H-CDR1包含SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，H-CDR2包含SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，H-CDR3包含SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；和，L-CDR1包含SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，L-CDR2包含SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，L-CDR3包含SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列。

本发明提供的所述抗ST2抗体或其片段可以为抗ST2的单克隆抗体、scFv、BsFv、dsFv、(dsFv)₂、Fab、Fab'、F(ab')₂或Fv等抗体形式。或者，所述抗ST2抗体可以为抗ST2的鼠抗体、嵌合抗体、完全或部分人源化抗体。所述ST2为哺乳动物ST2，优选灵长类动物ST2，更优选人ST2。

优选地，所述抗ST2抗体或其片段的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)二者均包括上述CDR以及间隔的框架区(framework region，FR)，各个结构域的排列方式为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

优选地，所述抗ST2抗体或其片段的所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列或其变体，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列或其变体。

本发明的上下文中，“氨基酸序列的变体”是指与所述氨基酸序列具有至少75％序列同一性(例如至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、进一步优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性等≥75％的任何百分比的同一性)的氨基酸序列。

因此，就本发明抗ST2抗体或其片段的重链可变区和轻链可变区而言，所述“至少75％序列同一性”导致的氨基酸序列的至多25％差异可存在于重链可变区或轻链可变区中的任意框架区中。所述差异可以由任何位置的氨基酸缺失、添加或置换产生，其中置换可以是保守置换或非保守置换。

优选地，所述ST2抗体或其片段还包含恒定区。优选地，所述抗ST2抗体或其片段还包含人或鼠的重链恒定区(CH)和/或轻链恒定区(CL)，更优选地包含选自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重链恒定区和/或κ或λ型轻链恒定区。

优选地，所述抗体为单克隆抗体，优选为鼠源、嵌合或人源化的单克隆抗体；更优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区为IgG1或IgG4亚型，轻链恒定区为κ型。或者，例如，所述抗体为免疫球蛋白，具体为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的人亚型，更优选为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。

根据本发明的具体实施方式，所述抗ST2抗体或其片段包含重链恒定区，所述重链恒定区包含如SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列或其变体。和/或，所述抗ST2抗体或其片段包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含如SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列或其变体。如上文所限定，“氨基酸序列的变体”是指与所述氨基酸序列具有至少75％序列同一性。

优选地，本发明提供的抗ST2抗体包含重链和/或轻链，优选地包含两条重链和/或两条轻链。根据本发明的具体实施方式，本发明的抗ST2抗体为分离的人IgG4/κ亚型的单克隆抗体，其包含两条相同的轻链和两条相同的重链，二者二硫键连接，其中，重链包含SEQID NO.17所示的氨基酸序列，轻链包含SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供一种用于预防或治疗炎性、过敏性或自身免疫性疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用本发明的抗ST2抗体或其片段，例如治疗有效量的所述抗ST2抗体或其片段。所述受试者为哺乳类动物，优选灵长类动物，进一步优选人或食蟹猴，更优选人。本发明上文就应用所限定的抗ST2抗体或其片段可用于本发明提供的预防或治疗方法中。

具体而言，所施用的抗ST2抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区并且在重链可变区和轻链可变区中分别包含重链CDR1(H-CDR1)、CDR2(H-CDR2)、CDR3(H-CDR3)和轻链CDR1(L-CDR1)、CDR2(L-CDR2)、CDR3(L-CDR3)，其中：

H-CDR1包含SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，H-CDR2包含SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，H-CDR3包含SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；和，L-CDR1包含SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，L-CDR2包含SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，L-CDR3包含SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列。

优选地，所述抗ST2抗体或其片段可以为抗ST2的单克隆抗体、scFv、BsFv、dsFv、(dsFv)₂、Fab、Fab'、F(ab')₂或Fv抗体形式。或者，所述抗ST2抗体可以为抗ST2的鼠抗体、嵌合抗体、完全或部分人源化抗体。所述ST2为哺乳动物ST2，优选灵长类动物ST2，更优选人ST2。

优选地，所述抗ST2抗体或其片段的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)二者均包括上述CDR以及间隔的框架区(framework region，FR)，各个结构域的排列方式为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

优选地，所述抗ST2抗体或其片段的所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列或其变体，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列或其变体。

优选地，所述ST2抗体或其片段还包含恒定区。优选地，所述抗ST2抗体或其片段还包含人或鼠的重链恒定区(CH)和/或轻链恒定区(CL)，更优选地包含选自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重链恒定区和/或κ或λ型轻链恒定区。

优选地，所述抗体为单克隆抗体，优选为鼠源、嵌合或人源化的单克隆抗体；更优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区为IgG1或IgG4亚型，轻链恒定区为κ型。或者，例如，所述抗体为免疫球蛋白，具体为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的人亚型，更优选为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。

根据本发明的具体实施方式，所述抗ST2抗体或其片段包含重链恒定区，所述重链恒定区包含如SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列或其变体。和/或，所述抗ST2抗体或其片段包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含如SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列或其变体。

优选地，本发明提供的抗ST2抗体包含重链和/或轻链，优选地包含两条重链和/或两条轻链。根据本发明的具体实施方式，本发明的抗ST2抗体为分离的人IgG4/κ亚型的单克隆抗体，其包含两条相同的轻链和两条相同的重链，二者二硫键连接，其中，重链包含SEQID NO.17所示的氨基酸序列，轻链包含SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列。

根据本发明，所述炎性、过敏性或自身免疫性疾病与IL-33/ST2信号传导通路的激活相关。具体而言，本发明所述的炎性、过敏性或自身免疫性疾病为子宫内膜异位、心力衰竭、过敏性皮炎、过敏性或变应性鼻炎、鼻息肉、特应性皮炎、慢性阻塞性肺病、哮喘(例如过敏性哮喘)、肺纤维化、败血症、炎性肠病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、全身性硬化症、韦格纳氏肉芽肿或化疗相关性腹泻。

与现有技术相比，本发明提供了一种新的抗肿瘤抑制素2(ST2)抗体，实验证明该抗体能够以高亲和力与人ST2结合，阻断人IL-33与人ST2的结合，由此有效阻止IL-33/ST2信号传导通路的激活；此外，该抗体无明显的ADCC和CDC效应。药效学实验进一步证明，本发明的抗ST2抗体对炎性、过敏性或自身免疫性疾病具有积极的预防和治疗作用。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1示出了来自不同编号的小鼠的B细胞培养上清液的NF-κB报告基因活性抑制率。

图2示出了抗体抑制重组人IL-33促HUVEC细胞IL-6生成活性结果。

图3示出了抗体抑制重组人IL-33促HMC-1细胞IL-8生成活性结果。

图4示出了实施例13中检测的食蟹猴皮肤肿胀面积变化比值(Ratio)，其中4A：生理盐水激发；4B：组胺激发；4C：猪蛔虫卵提取物激发。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，G2-G4 vs G1(One-way ANOVA/Dunnett’s)。

图5示出了实施例14中检测的食蟹猴疾病相关症状和严重程度，其中X+2A：体重变化；X+2B：腹泻评分；X+2C：活动评分；X+2D：食欲评分；X+2E：严重程度的AUC。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，G1、G3 vs G2(Two-way ANOVA/Dunnett’s)。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

采用了以下试剂：

Human ST2：NP_003847.2(Met1-Phe328)

Human ST2-his：C末端融合了6个组氨酸标签的Human ST2

Human IL33：NP_254274.1(Ser112-Thr270)

Human IL33-his：C末端融合了6个组氨酸标签的Human IL33

human ST2-fc：C末端融合了human IgG1 Fc标签的Human ST2

对照抗体CNTO7160：重链示于SEQ ID NO.19，轻链示于SEQ ID NO.20。

实施例1抗ST2鼠抗的筛选

以Human ST2-his为抗原，通过常规免疫程序免疫小鼠，然后以该抗原对经免疫小鼠的血清进行ELISA检测，获得血清为阳性反应的小鼠的脾脏。用该抗原进行B细胞淘选、培养。

取B细胞的培养上清，再次针对抗原Human ST2-his进行ELISA筛选；此外，进行KU812 NF-κB报告基因法筛选。根据阴性对照和阳性对照的值计算各克隆的抑制率，部分B细胞克隆的结果见图1。

提取B细胞的mRNA，逆转录成cDNA，PCR扩增抗体序列。将来自相同B细胞克隆的轻重链搭配转染CHO-K1细胞，从表达完成后的上清中获取鼠抗。取获得的鼠抗，进行结合human ST2活性筛选、抑制IL33结合human ST2活性筛选、抑制IL33激活KU812 NF-κB报告基因活性筛选、亲和力测定和体外药理研究、不同种属的ST2结合实验等，并且与对照抗体CNTO7160相比较。

最终确定了选择鼠抗“5886-156H+L”进行人源化。鼠抗“5886-156H+L”来自5886-156细胞克隆，其重链为5886-156H，轻链为5886-156L。

实施例2人源化单克隆抗体的制备

将5886-156H+L鼠抗的重链和轻链可变区序列与人种系序列进行比较，该比较是对IMGT数据库进行的blast搜索。从该组人种系基因中去除冗余基因以及那些具有未配对半胱氨酸的基因。在框架和CDR区两者中选择其余最接近匹配人种系基因作为受体人框架。基于IGHJ/IGJK种系基因的序列相似性选择FR-4。表1是5886-156H+L的鼠抗及其人源化序列形式，其中HZ0版本代表仅CDR移植的，HZ1版本引入了回复突变。人源化后的具体序列见表1，其中以下划线示出了相应的CDR(根据增强Chothia/AbM CDR的定义)。

表1 5886-156重轻链可变区的人源化序列形式

以SEQ ID NO.15所示重链恒定区和SEQ ID NO.16所示轻链恒定区，构建源自于相同鼠抗的人源化轻重链，进行组合并转染CHO-K1细胞，转染24h后加入10μg/mL MSX进行加压筛选，待细胞密度和活力恢复后接种进行Feed-batch表达，表达完成后，从上清获得蛋白并经protein A纯化，定量。

人源化抗体及其重轻链可变区的搭配方式见表2，后缀“ix”表示该抗体为相应的嵌合抗体。

表2 5886-156人源化抗体的轻重链可变区序列搭配

实施例3人源化单克隆抗体的活性表征

(1)人源化抗体抑制IL33结合human ST2活性筛选

将human ST2-fc蛋白包被过夜，将稀释好的human IL33-his与稀释好的抗体1:1混合，按照50μL/孔加入到96孔板中，室温孵育1h；加入组氨酸标签二抗(1:2500)，50μL/孔，室温孵育1h；TMB显色10min，2M硫酸100μL/孔终止。结果见表3。

表3人源化抗体抑制IL33结合human ST2的活性以及相较于CNTO7160的相对活性

抗体	<![CDATA[IC<sub>50</sub>(μg/mL)]]>	相对活性	最大抑制率
				5886-156-H1L0	1.217	103.12％	89.24％
5886-156-H1L1	1.004	125.00％	88.05％
				CNTO7160			92.55％

(2)人源化抗体抑制IL33促KU812-IL5生成活性筛选

将human IL33-his用培养基稀释到80ng/mL，抗体用培养基稀释到640μg/mL，4倍稀释，共11个浓度，将二者1:1混合后50μL/孔加到96孔板中。取对数生长期的KU812细胞离心，按照100000个/孔，50μL/孔加到上述96孔板中，孵育48h。按照Human IL-5DuoSet ELISA试剂盒说明书测定细胞培养上清中IL5的浓度。

结果见表4。

表4人源化抗体抑制IL33促KU812-IL5生成活性结果以及相较于CNTO7160的相对活性

抗体	<![CDATA[IC<sub>50</sub>(μg/mL)]]>	相对活性	最大抑制率
				5886-156-H1L0	0.03539	181.12％	98.07％
5886-156-H1L1	0.02893	221.57％	94.95％
				CNTO7160			97.55％

(3)人源化抗体亲和力测定

抗体与human ST2-his相互作用实验使用Biacore X100进行。

(3-1)human ST2与抗体在pH7.4条件下解离动力学亲和力实验：实验均在25℃下在HBS-EP(1×)缓冲液(pH7.4)中操作。

抗human ST2抗体稀释至2μg/mL，捕获于Protein A芯片表面，捕获时间60s。抗体捕获之后，注射溶液形式的human ST2-his(起始浓度20nM，2倍梯度稀释6个浓度)。监测缔合180s，监测解离700s，通过注射pH2.0的甘氨酸溶液获得传感器表面的再生。动力学数据使用1:1结合模型分析。

(3-2)human ST2与抗体在pH5.5条件下解离动力学亲和力实验：

参照(6-1)中描述的实验过程进行，区别在于使解离在pH5.5的HBS-EP(1×)缓冲液条件下进行，监测解离600s。

结果见表5。

表5人源化抗体pH7.4和pH5.5条件下的亲和力

*CN104334582B中的抗体Ab2

(4)5886-156-H1L1人源化抗体的进化

为了进一步减少5886-156-H1L1人源化抗体翻译后修饰和提高人源化程度，对原5886-156-H1L1人源化抗体的重链可变区序列按照氨基酸顺序进行Q1E和R72V突变形成5886-156H-VH-HZ2。以该突变后的重链可变区和5886-156L-VL-HZ1(SEQ ID NO.6)构建人IgG4/κ亚型的单克隆抗体，抗体命名为5886-156-H2L1，重链和轻链序列如下：

重链(SEQ ID NO.17)

(可变区(粗体)：SEQ ID NO.7；H-CDR1/2/3(粗体带下划线)：SEQ ID NO.8/9/10；恒定区(斜体带下划线)：SEQ ID NO.14)

轻链(SEQ ID NO.18)

(可变区(粗体)：SEQ ID NO.6；L-CDR1/2/3(粗体带下划线)：SEQ ID NO.11/12/13；恒定区(斜体带下划线)：SEQ ID NO.16)

实施例4 5886-156-H2L1与重组人ST2蛋白的结合活性(Biacore法)

该抗体与human ST2相互作用的实验使用Biacore T200进行。

Human ST2与抗体在pH7.4条件下解离动力学亲和力实验：实验均在25℃下在HBS-EP(1×)缓冲液(pH7.4)中操作。将anti-human Fc抗体偶联至CM5芯片中，将稀释至5.0μg/ml的5886-156-H2L1抗体用anti-human Fc抗体捕获于CM5芯片通道中，捕获时间30s。抗体捕获后，注射不同浓度的Human ST2抗原(起始浓度16nM，2倍比稀释7个浓度)。监测结合时间180s，解离时间700s。最后使用pH1.5的甘氨酸对芯片再生。动力学数据使用1:1结合模型分析。结果见表6。

表6 5886-156-H2L1在pH7.4条件下的亲和力

实施例5 5886-156-H2L1抑制IL33促KU812-IL5生成活性筛选

将human IL33-his用培养基稀释到80ng/mL，抗体用培养基稀释到640μg/mL，4倍稀释，共11个浓度，将二者1:1混合后50μL/孔加到96孔板中。取对数生长期的KU812细胞离心，按照100000个/孔，50μL/孔加到上述96孔板中，孵育48h。按照Human IL-5DuoSet ELISA试剂盒说明书测定细胞培养上清中IL5的浓度。结果见表7。

表7人源化抗体抑制IL33促KU812-IL5生成活性结果以及相较于CNTO7160的相对活性

抗体	<![CDATA[IC<sub>50</sub>(μg/mL)]]>	相对活性	最大抑制率
				5886-156-H2L1	0.0343	403.79％	94.16％
CNTO7160	0.1385		95.21％

实施例6 5886-156-H2L1与重组人ST2蛋白的结合活性(ELISA法)

Human ST2-his用包被缓冲液稀释到1μg/mL，按照50μL/孔加入96孔板内，4℃包被过夜；第二天将包被板取出用PBST洗涤3次；再用封闭液室温孵育1h，PBST再洗涤3次；5886-156-H2L1从100ng/mL起始3倍稀释，8个点，按照50μL/孔加入96孔板内；室温孵育1h，PBST洗涤三次，加入羊抗人二抗(1：10000)，按照50μL/孔加入96孔板内；室温孵育1h，PBST洗涤三次，按照50μL/孔加TMB到96孔板内，避光显色10min，2M硫酸100μL/孔终止；在酶标仪上读取OD450值。

检测5886-156-H2L1与人ST2重组蛋白的相对结合活性(EC50)范围为16.34～17.32ng/mL。

实施例7 5886-156-H2L1与ST2结合的种属特异性(ELISA法)

将5886-156-H2L1原液置换入PBS缓冲液内，加入Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin试剂，Biotin与5886-156-H2L1分子的摩尔比为10:1。混匀后，室温反应30分钟。再将标记后的溶液超滤至PBS缓冲，去除多余的标记试剂。分装，冻存于超低温冰箱。

将人、食蟹猴、大鼠和小鼠的ST2稀释至1μg/mL，包被至ELISA板上。封闭洗涤后，将Biotin标记后的5886-156-H2L1原液稀释至1μg/mL，后续2倍梯度稀释至0.977ng/mL，共11个梯度。加入封闭好的ELISA板内，室温孵育约2hr，洗涤3次。加入10000倍稀释的Streptavidin-HRP，室温孵育30分钟，洗涤3次。加入已平衡至室温的TMB溶液，避光反应8分钟，终止反应，于450/650nm读数。使用仪器自带软件进行拟合。结果表明，5886-156-H2L1能够与人和食蟹猴的ST2特异性结合，亲和力相似，EC50分别为7.044ng/mL(人)、7.588ng/mL(食蟹猴)。5886-156-H2L1不结合大鼠和小鼠的ST2。

实施例8 5886-156-H2L1对重组人ST2蛋白和重组人IL-33结合的相对阻断活性(ELISA法)

将human ST2-fc蛋白包被过夜，将稀释好的human IL33-his与稀释好的5886-156-H2L1 1:1混合，按照50μL/孔加入到96孔板中，室温孵育1h；加入组氨酸标签二抗(1:2500)，50μL/孔，室温孵育1h；TMB显色10min，2M硫酸100μL/孔终止。

测定5886-156-H2L1阻断IL-33与ST2结合能力(IC50)范围869.6～994.9ng/mL。

实施例9 5886-156-H2L1抑制重组人IL-33促HUVEC细胞IL-6生成活性(ELISA法)

采用膜表达ST2的HUVEC作为靶细胞，通过检测IL-6的产生量来间接评价5886-156-H2L1抗体阻断活性功能。具体将HUVEC细胞按照10000个/孔，100μL体系，37℃、5％CO2条件下孵育18-24h。将human IL33-his用培养基稀释到10ng/mL，5886-156-H2L1用培养基稀释到400μg/mL，4倍稀释，共11个浓度，将二者1:1混合后100μL/孔加到上述96孔板中，37℃、5％CO2条件下孵育18-24h。按照Human IL-6DuoSet ELISA试剂盒说明书测定细胞培养上清中IL6浓度。实验结果表明，5886-156-H2L1有显著的量效曲线，具有良好的阻断IL-33与ST2结合的生物学活性。结果见图2。

实施例10 5886-156-H2L1抑制重组人IL-33促HMC-1细胞IL-8生成活性(ELISA法)

采用膜表达ST2的HMC-1作为靶细胞，通过检测IL-8的产生量来间接评价5886-156-H2L1抗体阻断活性功能。具体将human IL33-his稀释到终浓度1000ng/mL，5886-156-H2L1按照起始640μg/mL，4倍稀释，共11个浓度，将二者1:1混合后按照50μL/孔加入到96孔板中。取对数生长期的HMC-1细胞按照50000个/孔，50μL/孔加入到上述96孔板中，37℃、5％CO2条件下孵育18-24h。按照Human IL-8DuoSet ELISA试剂盒说明书测定细胞培养上清中IL8浓度。实验结果表明，5886-156-H2L1有显著的量效曲线，具有良好的阻断IL-33与ST2结合的生物学活性。结果见图3。

实施例11 5886-156-H2L1的ADCC效应实验

(1)PBMC法

将SK-BR-3细胞消化处理后重悬在ADCC分析培养基中，取样计数后将其细胞密度稀释调整到5×10⁴个细胞/mL，在96孔细胞培养板中每孔加入100μl细胞稀释液，在ESR(Effector Spontaneous Release，效应细胞自发释放)孔、CMB(Culture MediumBackground，空白培养基)孔和VCC(Volume Correction Control，体积校正)孔中加入100μl ADCC分析培养基，将加好样的96孔细胞板置于37℃，CO₂培养箱孵育18±2h。取对数生长期的KU812细胞，取样计数，1000rpm离心处理5min，分析培养基重悬稀释细胞密度为2×10⁵cells/ml。在与加入SK-BR-3细胞平行的孔内分别加入25μl的KU812细胞稀释液。将阳性对照(Herceptin)用分析培养基稀释到浓度为500ng/ml、50ng/ml、5ng/ml、1.25ng/ml、0.313ng/ml、0.0781ng/ml、0.00781ng/ml和0.000781ng/ml，之后取50μl阳性对照加入到已加入SK-BR-3细胞的孔内。将5886-156-H2L1单抗用分析培养基稀释到浓度为1000000ng/ml、100000ng/ml、10000ng/ml、1000ng/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml和0.1ng/ml，之后取50μl加到已加入KU812细胞的孔内，TSR(Target Spontaneous Release，靶细胞自发释放)孔、TMR(Target Maximum Release，靶细胞最大释放)孔每孔加入100μl分析培养基，(E+T)SR孔和ESR孔每孔加入50μl分析培养基。将加完样品的96孔细胞板置于微孔板恒温振荡器中，100rpm混匀30min。将PBMC细胞400×g离心10min，弃上清后用分析培养基重悬计数，取适量该细胞悬液调整细胞密度至2.5×10⁶cells/ml和5.0×10⁶cells/ml，在阳性对照样品孔内加入50μl密度为2.5×10⁶cells/ml的PBMC细胞稀释液，在待测抗体样品孔内加入25μl密度为5×10⁶cells/ml的PBMC细胞稀释液，在(E+T)SR孔和ESR孔每孔加入50μl各自对应浓度的PBMC稀释液。加样完成后的96孔细胞板置于，CO₂培养箱37℃孵育4h。根据Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST试剂盒，在孵育完成的TMR孔和VCC孔中加入10μl LysisBuffer，在CO₂培养箱37℃孵育30min，之后在每孔中加入100μl Working Solution，避光室温反应30min，最后在每孔中加入50μl Stop Solution，混合后读取吸光度值(OD490 nm)。

计算公式：

％Target cell Lysis＝[(OD_ER–OD_(T+E)SR)/(OD_TMR-OD_TSR)]×100

12.2报告基因法

将SK-BR-3细胞消化处理后重悬在ADCC分析培养基中，取样计数后将其细胞密度稀释调整到2×10⁵cells/mL，在96孔细胞培养板中每孔加入100μl细胞稀释液，将加好样的96孔细胞板置于37℃，CO₂培养箱孵育22±2h。取对数生长期的KU812细胞，取样计数，1000rpm离心处理5min，分析培养基重悬稀释细胞密度为1.33×10⁶cells/ml。在与加入SK-BR-3细胞平行的孔内分别加入15μl的KU812细胞稀释液。将阳性对照(Herceptin)用分析培养基稀释到浓度为1500ng/ml、750ng/ml、375ng/ml、187.5ng/ml、93.75ng/ml、46.88ng/ml、23.44ng/ml、11.72ng/ml、5.86ng/ml和2.93ng/ml，将孵育好的SK-BR-3细胞组中的培养液吸弃，之后在每孔中加入30μl稀释好的阳性对照。将5886-156-H2L1单抗用分析培养基稀释到浓度为1000000ng/ml、100000ng/ml、10000ng/ml、1000ng/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml和0.001ng/ml，之后取30μl加到已加入KU812细胞的孔内。将加完样的96孔细胞板置于CO₂培养箱37℃孵育30min。期间制备效应细胞，将效应细胞Jurkat-ADCC12细胞400×g离心5min后用分析培养基重悬计数，之后调整细胞密度至4×10⁶cells/ml和8×10⁶cells/ml，在阳性对照样品孔内加入30μl密度为4×10⁶cells/ml的效应细胞稀释液，在5886-156-H2L1单抗样品孔内加入15μl密度为8×10⁶cells/ml的效应细胞稀释液。期间设置阴性对照(30μl SK-BR-3细胞+30μl分析培养基+30μl密度为4×10⁶cells/ml的效应细胞和15μl KU812细胞+30μl分析培养基+15μl密度为8×10⁶cells/ml的效应细胞)，空白对照(60μl分析培养基)。将加完样的96孔细胞板置于CO₂培养箱37℃孵育16-24h。孵育结束后加入60μl/孔Bio-Glo Luciferase Assay System试剂，室温900rpm避光震荡2分钟后迅速用酶标仪检测光信号，选择化学发光模式，在30分钟内完成检测。

计算公式：

背景均值：空白对照孔RLU的均值；阴性对照均值：阴性对照孔RLU的均值。

实验结果表明，在两种不同检测体系内，5886-156-H2L1无明显的ADCC作用。

实施例12 5886-156-H2L的CDC效应实验

将Raji细胞300×g离心5min，去上清后加入CDC分析培养基重悬，取样计数后将其细胞密度稀释调整到1×10⁶cells/mL。取对数生长期的KU812细胞，取样计数，300g离心5min，分析培养基重悬稀释细胞密度为1×10⁶cells/ml。分别在不同96孔细胞培养板中每孔加入50μl制好两种细胞稀释液。将阳性对照(MabThera)用分析培养基稀释到浓度为10000ng/ml、5000ng/ml、2500ng/ml、1250ng/ml、625ng/ml、312.5ng/ml、156.3ng/ml、78.1ng/ml、39.1ng/ml和19.5ng/ml，取50μl稀释好的阳性对照加入有Raji细胞的孔内。将5886-156-H2L1单抗用分析培养基稀释到浓度为1000000ng/ml、100000ng/ml、10000ng/ml、1000ng/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml和0.001ng/ml，之后取50μl加到已加入KU812细胞的孔内。将加好样的96孔细胞板置于CO₂培养箱37℃孵育30min。孵育结束后每孔加入50μl含有24％补体的分析培养基，再将细胞板置于CO₂培养箱37℃孵育2h。期间需设置无补体对照、无抗体对照和空白对照。之后将96孔板每孔加入10μl的Resazurin后，放置在恒温震荡器中室温震荡1-2min后，继续在培养箱内孵育16-20h后取出读板。

计算公式：CDC％＝100×(E-S)/(M-S)

E：experimental well的信号；S(自发杀伤)：无抗体对照的信号；M(最大杀伤)：空白对照的信号。

实验结果表明，5886-156-H2L1不具有明显的激活补体系统介导产生CDC效应的活性。

实施例13 5886-156-H2L1在猪蛔虫卵提取物诱导的过敏性皮炎中的药效研究

本实施例中，采用猪蛔虫卵提取物(Ascaris.Suum，厂家：STALLERGENES GREER；批号：302145)诱导的食蟹猴过敏性皮炎模型，研究5886-156-H2L1对过敏性皮炎与特应性皮炎的预防或治疗作用。

将24只对猪蛔虫卵提取物天然敏感的食蟹猴分成4组，每组6只，依次为溶媒对照组、阳性对照组(苯海拉明)、5886-156-H2L1低剂量组(10mg/kg)、5886-156-H2L1高剂量组(30mg/kg)。其中，对于两个5886-156-H2L1组，提前(-4h)静脉注射给予由生理盐水稀释的5886-156-H2L1；对于阳性对照组，提前(-24h和-1h)苯海拉明2mg/kg灌胃；对于溶媒对照组，提前(-4h)静脉注射生理盐水(2mL/kg)。

给药后激发皮肤肿胀反应：各组中动物分别在腹部皮内注射生理盐水1个点，组胺(Histamine)1个点和A.suum 3个点。在生理盐水、组胺和A.suum激发后0min和20min测量激发点肿胀面积，以两者的比值(Ratio＝20min面积/0min面积)来反映皮肤的肿胀反应。

结果表明与溶媒对照组相比，5886-156-H2L1高剂量组(30mg/kg)给药可以显著降低皮内注射A.suum引起的皮肤肿胀反应(p<0.01)；与溶媒对照组相比，5886-156-H2L1低剂量组和高剂量组(10mg/kg和30mg/kg)预防给药可以显著降低皮内注射组胺引起的皮肤肿胀反应。结果如图4所示。

实施例14 5886-156-H2L1在伊利替康诱导的肠黏膜炎模型中的药效研究

本实施例中，采用伊立替康(CPT-11，盐酸伊立替康，湖北盛天恒创生物科技有限公司；Cas号：136572-09-3)诱导的食蟹猴粘膜炎模型，研究5886-156-H2L1对伊利替康诱导的肠黏膜炎的预防或治疗作用。

将9只食蟹猴分成3组(G1组、G2组、G3组)，每组3只。在Day 0～2这三天，G1组静脉注射CPT-11溶媒(<3％DMSO)，G2和G3组静脉注射CPT-11(30mg/kg)，每天一次；在Day-1、2、5、8，G2组静脉注射生理盐水，G3组静脉注射5886-156-H2L1(用生理盐水稀释)(10mg/kg)；Day12动物解剖取肠组织进行病理检查。

与正常对照组(G1)相比，伊利替康静脉注射引起了粘膜炎，表现为腹泻，食欲下降，体重降低，肠道炎症和粘液分泌减少。与生理盐水组(G2)相比，5886-156-H2L1显示出缓解疾病症状(腹泻、体重下降、食欲不振和缺乏活动)的功效。疾病相关症状变化和严重程度的AUC如图5所示。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (8)

1.一种抗肿瘤抑制素2(ST2)抗体或其片段在制备用于预防、治疗或改善炎性、过敏性或自身免疫性疾病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述炎性、过敏性或自身免疫性疾病与IL-33/ST2信号传导通路的激活相关。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述炎性或过敏性疾病为子宫内膜异位、心力衰竭、过敏性皮炎、过敏性或变应性鼻炎、鼻息肉、特应性皮炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺纤维化、败血症、炎性肠病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、全身性硬化症、韦格纳氏肉芽肿或化疗相关性腹泻。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其特征在于，所述抗ST2抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区并且在重链可变区和轻链可变区中分别包含重链CDR1(H-CDR1)、CDR2(H-CDR2)、CDR3(H-CDR3)和轻链CDR1(L-CDR1)、CDR2(L-CDR2)、CDR3(L-CDR3)，其中：

H-CDR1包含SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，H-CDR2包含SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，H-CDR3包含SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；和，L-CDR1包含SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，L-CDR2包含SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，L-CDR3包含SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的应用，其特征在于，所述抗ST2抗体或其片段为抗ST2的单克隆抗体、scFv、BsFv、dsFv、(dsFv)₂、Fab、Fab'、F(ab')₂或Fv抗体形式；

或者，所述抗ST2抗体为抗ST2的鼠抗体、嵌合抗体、完全或部分人源化抗体。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的应用，其特征在于，所述抗ST2抗体的所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列或其变体，所述轻链可变区(VL)包含SEQ IDNO.6所示的氨基酸序列或其变体。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的应用，其特征在于，所述ST2抗体或其片段还包含恒定区；

优选地，所述抗ST2抗体或其片段还包含人或鼠的重链恒定区(CH)和/或轻链恒定区(CL)，更优选地包含选自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重链恒定区和/或κ或λ型轻链恒定区；

优选地，所述抗体为单克隆抗体，优选为鼠源、嵌合或人源化的单克隆抗体；更优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区为IgG1或IgG4亚型，轻链恒定区为κ型。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的应用，其特征在于，所述抗ST2抗体包含重链和/或轻链，优选地包含两条重链和/或两条轻链；

优选地，所述抗ST2抗体为人IgG4/κ亚型的单克隆抗体，其包含两条相同的轻链和两条相同的重链；

进一步优选地，所述抗体的重链包含SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列，轻链包含SEQID NO.18所示的氨基酸序列。

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