CN104293893A - 采用msap技术检测林木木质部dna甲基化的方法及试剂盒 - Google Patents
采用msap技术检测林木木质部dna甲基化的方法及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104293893A CN104293893A CN201310298785.0A CN201310298785A CN104293893A CN 104293893 A CN104293893 A CN 104293893A CN 201310298785 A CN201310298785 A CN 201310298785A CN 104293893 A CN104293893 A CN 104293893A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- mspi
- hpaii
- primer
- ecori
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
Abstract
本发明公开了一种采用MSAP技术检测林木木质部DNA甲基化的方法及试剂盒。其中，该方法包括以下步骤：S1，提取林木木质部DNA；S2，分别用EcoRI/HpaII、EcoRI/MspI两组酶对林木木质部DNA进行酶切；S3，分别对酶切得到的产物连接上限制性内切酶的接头；S4，以接头为模板设计的预扩增引物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物；S5，将PCR预扩增产物稀释后，加入带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增；S6，电泳检测PCR扩增产物，统计并分析DNA条带。应用本发明的技术方案，能够为表观遗传变异研究提供有力的技术支持，为目标的林木分子标记辅助育种提供新的候选标记位点。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种采用MSAP技术检测林木木质部DNA甲基化的方法及试剂盒。
背景技术
表观遗传调控是不依赖于基因组序列变化，而是通过染色质结构、碱基结构变异及重塑等作用改变表型的分子遗传学机制，其在基因组防御与基因表达以及细胞核遗传中发挥重要作用。基因组DNA甲基化是目前为止研究的最为深入的表观遗传机制之一（Dahl and Guldberg，Biogerontology，2003，4：233–450），其检测方法多样，且发展迅速，其结合的基本方式主要为：甲基化敏感内切酶酶切、重硫酸盐处理甲基化胞嘧啶、聚合酶链式反应（PCR）和生物芯片等。
甲基化敏感扩增多态性（Methylation-sensitive amplification polymorphism，MSAP）技术是一种比较成熟的、稳定可靠的、建立在随机片段扩增长度多态性（AFLP）基础上的检测基因组甲基化的分子标记手段（Cervera et al.,Mol Genet Genomics，2002，268：543–552），主要依赖于甲基化敏感内切酶酶切和聚合酶链式反应，无需知晓全基因组序列即可在全基因组范围内检测甲基化位点，且成本比重硫酸盐处理测序、生物芯片技术低。
甲基化敏感内切酶酶切原理是利用能识别和切割5′-CCGG位点的同裂酶HpaII和MspI对基因组进行酶切，但二者对甲基化位点敏感程度不一致。HpaII能识别并切割非甲基化位点和单链外侧甲基化位点，不能切割双链甲基化序列；MspI能识别并切割未甲基化和双链内侧胞嘧啶甲基化序列，不能切割单链外侧外甲基化序列。若用HpaII切割电泳后显示有带，用MspI切割电泳后没有带，则为半甲基化（hemi-methyaltion，CNG）；若用HpaII切割电泳后显示无带，而用MspI切割电泳后有带，则认为发生全甲基化（full-methylation，CG）；若用HpaII和MspI切割电泳后均显示有带，则认为该位点未发生甲基化；若用HpaII和MspI切割电泳后均显示无带，则认为该位点甲基化类型不确定或该位点为非5′-CCGG序列。CNG和CG之和可以作为总甲基化数目，各种类型甲基化数目分别与总位点数之比为该种类型甲基化相对水平。因此，MSAP法可以分析全基因组甲基化相对水平及特异甲基化类型检测。同时，对这些检测到的特异甲基化位点可以开展克隆、测序与序列比对分析等后续工作。
目前，植物DNA甲基化的研究多集中于拟南芥、玉米、水稻物种中，结果显示DNA甲基化在基因表达调控、个别基因表达模式的遗传等途径中起着重要的作用（Santos et al.,Brazilian J Medical Biol Res，2005，38：1531–1541）。现在，对林木基因组甲基化的研究则较少涉及，即使有为数不多的研究，其材料多使用叶片，但基因组DNA甲基化具有组织特异性，叶片基因组甲基化状态并不能反映整个植株基因组甲基化状态，也不能直接反映出其对林木 重要材性性状的调控作用，因此，对其DNA甲基化位点、相对水平及遗传变异进行研究尤为迫切和必要。
发明内容
本发明旨在提供一种采用MSAP技术检测林木木质部DNA甲基化的方法及试剂盒，以解决现有技术中没有稳定、高效地检测林木木质部DNA甲基化方法的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种采用MSAP技术检测林木木质部DNA甲基化的方法。该方法是采用MSAP技术检测林木木质部DNA甲基化，包括以下步骤：S1，提取林木木质部DNA；S2，分别用EcoRI/HpaII、EcoRI/MspI两组酶对林木木质部DNA进行酶切；S3，分别对酶切得到的产物连接上限制性内切酶的接头；S4，以接头为模板设计的预扩增引物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物；S5，将PCR预扩增产物稀释后，加入带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增；S6，电泳检测PCR扩增产物，统计并分析DNA条带，其中，接头包括EcoRI接头和HpaII/MspI接头，EcoRI接头的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，HpaII/MspI接头的序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；预扩增引物包括EcoRI预扩增引物和HpaII/MspI预扩增引物，EcoRI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：5，HpaII/MspI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：6；筛选引物包括EcoRI筛选引物和HpaII/MspI筛选引物，EcoRI筛选引物序列为SEQ ID NO：7～22，HpaII/MspI筛选引物序列为SEQ ID NO：23～34。
进一步地，步骤S1中，提取林木木质部DNA选用的是活体林木，活体林木的取样方法包括以下步骤：采用利刃将活体林木胸径处（3～5）cm×（3～5）cm面积树皮剥离，取出3～5g木质部后将树皮贴回原处，然后用保鲜膜将伤处包裹，7～10天后去除保鲜膜。
进一步地，步骤S6中，采用毛细管荧光电泳检测PCR扩增产物，在HpaII/MspI筛选引物5’端用荧光基团修饰，荧光基团包括Tamra、Rox、Fam或Hex。
进一步地，HpaII/MspI筛选引物SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33的5’端用荧光基团Fam修饰；HpaII/MspI筛选引物SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34的5’端用荧光基团Hex修饰。
进一步地，筛选引物的组合分别为：SEQ ID NO：14+SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：15+SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：19+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：21+SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：22+SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：7+SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：7+SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：8+SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：9+SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：10+SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：11+SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：12+SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：13+SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：16+SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：20+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：17+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：18+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：9+SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：10+SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：11+SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：13+SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：15+SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：17+SEQ ID NO：33、 SEQ ID NO：19+SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：8+SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：12+SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：8+SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：16+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：18+SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：20+SEQ ID NO：24。
根据本发明的另一个方面，提供一种采用MSAP技术检测林木木质部DNA甲基化的试剂盒。该试剂盒包括MSAP技术所用的接头、预扩增引物和筛选引物序列,其中，其中，接头包括EcoRI接头和HpaII/MspI接头，EcoRI接头的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，HpaII/MspI接头的序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；预扩增引物包括EcoRI预扩增引物和HpaII/MspI预扩增引物，EcoRI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：5，HpaII/MspI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：6；筛选引物包括EcoRI筛选引物和HpaII/MspI筛选引物，EcoRI筛选引物序列为SEQ ID NO：7～22，HpaII/MspI筛选引物序列为SEQ ID NO：23～34。进一步地，该试剂盒包括林木木质部DNA提取试剂。
进一步地，在HpaII/MspI筛选引物5’端用荧光基团修饰，荧光基团包括Tamra、Rox、Fam或Hex。
进一步地，HpaII/MspI筛选引物SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33的5’端用荧光基团Fam修饰；HpaII/MspI筛选引物SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34的5’端用荧光基团Hex修饰。
进一步地，筛选引物的组合分别为：SEQ ID NO：14+SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：15+SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：19+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：21+SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：22+SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：7+SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：7+SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：8+SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：9+SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：10+SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：11+SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：12+SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：13+SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：16+SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：20+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：17+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：18+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：9+SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：10+SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：11+SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：13+SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：15+SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：17+SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：19+SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：8+SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：12+SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：8+SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：16+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：18+SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：20+SEQ ID NO：24。
应用MSAP技术检测林木木质部DNA甲基化，采用本发明提供的接头、预扩增引物和筛选引物，能够稳定、高效地在全基因组水平上检测林木木质部DNA甲基化位点，可以有效地、特异地检测到不同基因型植株基因组DNA甲基化遗传变异位点。采用本发明的技术方案得到的林木木质部DNA甲基化检测结果，可用于甲基化相对水平、特异位点的估算与分析等，可以分析自然群体表观遗传多样性、表观遗传结构等表观遗传学内容，为表观遗传变异研究提供有力的技术支持，为筛选木材品质为目标的林木分子标记辅助育种提供新的候选标记位点。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了实施例1的毛细管电泳后产生的数据经由软件GeneMarker V1.7.1读取的条带图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
林木材性性状是木材应用、产业发展中的重要衡量指标，对其进行遗传改良具有重要价值。基因组DNA甲基化参与调控木材形成过程中基因的表达，因此，对木质部DNA甲基化位点进行检测对于林木甲基化相对水平、特异位点分析及表观遗传学研究等均具有重要意义。但目前，现有技术中还没有安全、可靠、稳定、高效地检测林木DNA甲基化方法。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种采用MSAP技术检测林木木质部DNA甲基化的方法，包括以下步骤：S1，提取林木木质部DNA；S2，分别用EcoRI、EcoRI/MspI两组酶对林木木质部DNA进行酶切；S3，分别对酶切得到的产物连接上限制性内切酶的接头；S4，以接头为模板设计的预扩增引物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物；S5，将PCR预扩增产物稀释后，加入带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增；S6，电泳检测PCR扩增产物，统计并分析DNA条带，其中，接头包括EcoRI接头和HpaII/MspI接头，EcoRI接头的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，HpaII/MspI接头的序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；预扩增引物包括EcoRI预扩增引物和HpaII/MspI预扩增引物，EcoRI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：5，HpaII/MspI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：6；筛选引物包括EcoRI筛选引物和HpaII/MspI筛选引物，EcoRI筛选引物序列为SEQ ID NO：7～22，HpaII/MspI筛选引物序列为SEQ ID NO：23～34。，如表1所示。
表1
应用MSAP技术检测林木木质部DNA甲基化，采用本发明提供的接头、预扩增引物和筛选引物，能够稳定、高效地检测林木DNA甲基化，可以有效地、特异地检测到不同基因型植株基因组DNA甲基化遗传变异位点。
由于DNA甲基化对于植物生长发育具有重要的调控作用，通过对木质部DNA全基因组水平的甲基化位点筛选，然后在自然群体中，利用单标记分析完成DNA甲基化位点与木材品质性状的关联分析，可以为今后筛选木材品质为目标的林木分子标记辅助育种提供新的候选标记位点。
本发明中对林木木质部DNA进行提取可以采用现有技术中通常用的方法，优选地，采用改进的CTAB法。改进的CTAB法包括如下步骤：1）将含有β-巯基乙醇的CTAB提取缓冲液在65°C水浴预热；2）将木质部材料于液氮中研磨成粉末状，取约1g粉末迅速移入1.5mL无菌离心管中；3）于装有植物材料的离心管中加入800μL的CTAB提取缓冲液，漩涡震荡，充分混匀，置65°C水浴，每5min轻轻震荡几次，20min后12000r/min，离心15min；4）吸取上清液，冰浴冷却至室温，加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1）溶液，充分混匀，4°C，12000r/min，离心10min；5）吸取上清液，加入等体积的异丙醇（–20°C预冷），充分混匀，4°C，12000r/min，离心10min；6）重复步骤5）1–2次，以蛋白层不出现为止；7）取上清液，–20°C沉淀1h，4°C，12000r/min，离心10min；8）弃去上清液，9）加入800μL70%乙醇，轻轻震荡后置4°C，12000r/min，离心30s；10）重复步骤9）；11）室温下自然干燥（约5–10min）；12）溶于50～80μL去离子水中，于-20°C下保存备用。
优选地，步骤S1中，提取林木木质部DNA选用的是活体林木，活体林木的取样方法包括以下步骤：采用利刃将活体林木胸径处（3～5）cm×（3～5）cm面积树皮剥离，取出3～5g木质部后将树皮贴回原处，然后用保鲜膜将伤处包裹，7～10天后去除保鲜膜。这种采样方法基本不影响林木正常生长，林木切伤处可在1-2年内基本愈合，而且与现有技术中提取叶片基因组的方法相比，更能够反应整株植物的基因组甲基化状态，更直接地反映出甲基化对林木重要材性性状的调控作用。
步骤S6中的电泳检测可以采用现有技术中的银染技术，优选地，采用毛细管荧光电泳检测PCR扩增产物。在HpaII/MspI对应的筛选引物5’端可以用荧光基团修饰，荧光基团可以多种荧光基团，如Tamra、Rox、Fam或Hex。在毛细管检测结果中，Fam、Hex、Tamra、Rox对应的标记颜色分别为蓝色、绿色、黄色、红色，可根据发光颜色的不同辨别各组产物，可以节约60%左右的成本。
在以往的研究中，PCR扩增产物多态性的检测多采用银染技术，但这种检测方式分辨率、效率较低，受聚丙烯酰胺凝胶胶联强度、时间、操作手法等多种因素影响，且各种试剂均具毒性、步骤繁琐、耗时耗力耗水。随着荧光标记PCR技术的普及和应用，目标片段的大小可以精确到1bp，96泳道同时工作，效率很大程度上得到提高。因此，将毛细管电泳荧光检测技术应用到MSAP甲基化检测中具有很大技术的优势。本发明是首次将MSAP技术与毛细管荧光电泳检测技术相结合，突破了银染过程中剧毒、污染、耗时耗力耗水的局限性，且检测结果更为清晰、准确，分辨率大幅提高。
在本发明一种实施方式中，HpaII/MspI对应的筛选引物5’端用荧光基团Fam或Hex修饰，SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33的5’端用荧光基团Fam或Hex修饰，；HpaII/MspI对应的筛选引物SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34的5’端用荧光基团Hex修饰，具体如下表2所示。
表2
| H/M(AAA) | Fam-5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGAAA-3’ |
| H/M(AAG) | Hex-5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGAAG-3’ |
| H/M(AAT) | Fam-5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGAAT-3’ |
| H/M(ATC) | Hex-5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGATC-3’ |
| H/M(ATT) | Fam-5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGATT-3’ |
| H/M(CAA) | Hex-5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGCAA-3’ |
| H/M(CTC) | Fam-5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGCTC-3’ |
| H/M(GAA) | Hex-5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGGAA-3’ |
| H/M(GAG) | Fam-5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGGAG-3’ |
| H/M(TAC) | Hex-5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGTAC-3’ |
| H/M(TAT) | Fam-5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGTAT-3’ |
| H/M(TCT) | Hex-5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGTCT-3’ |
本发明中的筛选引物组合的原则是EcoRI和HpaII/MspI两组引物，两两配对随机组合。本申请筛选了全部192种引物组合，最终筛选出以下组合扩增效率高并且稳定，每对组合特异片段超过10条以上。
优选地，筛选引物的组合分别为：E(ATT)+H/M(ATC)、E(CAG)+H/M(ATC)、E(GAA)+H/M(CAA)、E(TAC)+H/M(CTC)、E(TCT)+H/M(CTC)、E(AAG)+H/M(TAT)、E(AAG)+H/M(AAA)、E(AAT)+H/M(AAA)、E(ACA)+H/M(AAG)、E(ACT)+H/M(AAG)、E(AGC)+H/M(AAT)、E(AGT)+H/M(AAT)、E(ATC)+H/M(ATT)、E(CCA)+H/M(ATT)、E(GAG)+H/M(CAA)、E(CCT)+H/M(GAA)、E(CTC)+H/M(GAA)、E(ACA)+H/M(GAG)、E(ACT)+H/M(GAG)、E(AGC)+H/M(TAC)、E(ATC)+H/M(TAC)、E(CAG)+H/M(TAT)、E(CCT)+H/M(TAT)、E(GAA)+H/M(TCT)、E(AAT)+H/M(TCT)、E(AGT)+H/M(TAC)、E(ATT)+H/M(GAA)、E(CCA)+H/M(CAA)、E(CTC)+H/M(ATC)和E(GAG)+H/M(AAG)，即SEQ ID NO：14+SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：15+SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：19+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：21+SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：22+SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：7+SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：7+SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：8+SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：9+SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：10+SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：11+SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：12+SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：13+SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：16+SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：20+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：17+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：18+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：9+SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：10+SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：11+SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：13+SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：15+SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：17+SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：19+SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：8+SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：12+SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：8+SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：16+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：18+SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：20+SEQ ID NO：24，上述组合的筛选引物扩增出有效条带片段大小约为60bp-500bp，且扩增稳定、特异性片段较多、扩增效率高。
根据本发明一种实施方式，提供一种检测林木木质部DNA甲基化的试剂盒。该检测试剂盒包括MSAP技术所用的接头、预扩增引物和筛选引物序列如表1中所示。应用MSAP技术检测林木DNA甲基化，采用本发明提供的接头、预扩增引物和筛选引物，能够稳定、高效地检测林木DNA甲基化，可以有效地、特异地检测到不同基因型植株木质部DNA甲基化遗传变异位点。
优选地，该检测试剂盒进一步包括林木木质部DNA提取试剂。林木木质部DNA提取试剂可以是进行改进的CTAB法提取DNA所需要的试剂，具体包括：含有β-巯基乙醇的CTAB提取缓冲液，液氮，氯仿-异戊醇（24:1）溶液，异丙醇，70%乙醇，离子水等。
优选地，在HpaII/MspI筛选引物5’端用荧光基团修饰，荧光基团包括Tamra、Rox、Fam或Hex。荧光基团可以多种荧光基团，如Tamra、Rox、Fam或Hex。在毛细管检测结果中， Fam、Hex、Tamra、Rox对应的标记颜色分别为蓝色、绿色、黄色、红色，可根据发光颜色的不同辨别各组产物。
在本发明一种实施方式中，HpaII/MspI筛选引物5’端用荧光基团Fam或Hex修饰，具体如表2所示。
优选地，筛选引物的组合分别为：E(ATT)+H/M(ATC)、E(CAG)+H/M(ATC)、E(GAA)+H/M(CAA)、E(TAC)+H/M(CTC)、E(TCT)+H/M(CTC)、E(AAG)+H/M(TAT)、E(AAG)+H/M(AAA)、E(AAT)+H/M(AAA)、E(ACA)+H/M(AAG)、E(ACT)+H/M(AAG)、E(AGC)+H/M(AAT)、E(AGT)+H/M(AAT)、E(ATC)+H/M(ATT)、E(CCA)+H/M(ATT)、E(GAG)+H/M(CAA)、E(CCT)+H/M(GAA)、E(CTC)+H/M(GAA)、E(ACA)+H/M(GAG)、E(ACT)+H/M(GAG)、E(AGC)+H/M(TAC)、E(ATC)+H/M(TAC)、E(CAG)+H/M(TAT)、E(CCT)+H/M(TAT)、E(GAA)+H/M(TCT)、E(AAT)+H/M(TCT)、E(AGT)+H/M(TAC)、E(ATT)+H/M(GAA)、E(CCA)+H/M(CAA)、E(CTC)+H/M(ATC)和E(GAG)+H/M(AAG)，即SEQ ID NO：14+SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：15+SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：19+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：21+SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：22+SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：7+SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：7+SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：8+SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：9+SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：10+SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：11+SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：12+SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：13+SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：16+SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：20+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：17+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：18+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：9+SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：10+SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：11+SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：13+SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：15+SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：17+SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：19+SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：8+SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：12+SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：8+SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：16+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：18+SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：20+SEQ ID NO：24，上述组合的筛选引物扩增出有效条带片段大小约为60bp-500bp，且扩增稳定、特异性片段较多、扩增效率高。
本发明中对筛选扩增体系的优化一方面涉及引物对的组合，使得扩增的多态性位点增多，提高了扩增效率，另一方面，对筛选扩增体系中引物浓度、Go Tag酶浓度和dNTP浓度进行了摸索，同时，对扩增模板浓度进行了调整，避免模板浓度过高或过低对实验结果造成影响。在本发明一种典型的实施例中，林木木质部DNA甲基化的检测方法包括以下步骤：
（1）用利刃剥离林木胸径处面积约5cm×5cm或面积更小的树皮，切取少量木质部材料放入液氮中冷冻处理，然后将树皮贴回树干原处，用保鲜膜将树干包裹，一段时间后去除。
（2）采用改进的CTAB（Murray and Thompson，Nucl Acids Res,1980,8:4321–4325）法提取所获得的木质部组织基因组DNA。操作步骤如下：
1）将含有β-巯基乙醇的CTAB提取缓冲液在65°C水浴预热；
2）将木质部材料于液氮中研磨成粉末状，取约1g粉末迅速移入1.5mL无菌离心管中；
3）于装有植物材料的离心管中加入800μL的CTAB提取缓冲液，漩涡震荡，充分混匀，置65°C水浴，每5min轻轻震荡几次，20min后12000r/min，离心15min；
4）吸取上清液，冰浴冷却至室温，加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1）溶液，充分混匀，4°C，12000r/min，离心10min；
5）吸取上清液，加入等体积的异丙醇（–20°C预冷），充分混匀，4°C，12000r/min，离心10 min；
6）重复步骤5）1–2次，以蛋白层不出现为止；
7）取上清液，–20°C沉淀1h，4°C，12000r/min，离心10min；
8）弃去上清液，
9）加入800μL 70%乙醇，轻轻震荡后置4°C，12000r/min，离心30s；
10）重复步骤9）；
11）室温下自然干燥（约5～10min）；
12）溶于50–80μL去离子水中，于-20°C下保存备用。
CTAB（2×）提取缓冲液的配方：
利用NanoVueTM紫外/可见光分光光度计检测基因组DNA浓度和质量，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳后与DNA Marker作对照，进一步检测基因组DNA纯度及完整性。
根据文献（Zhao et al.,Plant Sci,2007,172:930–938）的信息合成接头、预扩增引物和选择性扩增引物，对选择性扩增引物组合进行筛选，并对HpaII/MspI选择性扩增引物5'端用荧光基团Fam或Hex修饰，激光照射下分别显示蓝色或绿色。
各引物5'修饰具体情况如下：
按以下步骤和体系进行酶切、连接、预扩增和选择性扩增：
1）使用同裂酶HpaII/MspI分别与限制性内切酶EcoRI组合对材料基因组DNA分别进行双酶切：
HpaII/EcoRI酶切反应体系
MspI /EcoRI酶切反应体系
将上述体系置于37°C温水浴中3h以充分酶切，后放置于65°C环境下5min致酶失活。
2）将接头EcoRI、HpaII/MspI单链稀释为100μmol L–1，分别充分混合后放置于65°C环境下退火复性10min，自然冷却，接头终浓度为50μmol L–1。将接头分别与上述两组酶切产物进行连接。连接反应体系为：
3）将预扩增引物EcoRI、HpaII/MspI溶解稀释至浓度10μmol L–1后进行预扩增。预扩增反应体系为：
94°C变性2min，按以下参数扩增30个循环，94°C 30s，56°C 30s，72°C 80s，最后72°C延伸5min。
4）将预扩增产物稀释至20倍，选择性扩增引物溶解稀释至浓度10μmol L–1后进行选择性扩增。选择性扩增反应体系为：
94°C变性2min，按下列步骤进行PCR扩增：首个循环扩增参数为94°C 30s，65°C 30s，72°C 80s，然后将每个循环的复性温度依次递减0.7°C，共扩增12个循环；最后按下列步骤扩增23个循环，94°C 30s，55°C 30s，72°C 80s。
利用毛细管电泳检测选择性扩增谱位点，甲基化/非甲基化条带及片段大小由GeneMarkerV1.7.1软件产生，且有条带时记为“1”、无条带时记为“0”。
根据条带有无进行甲基化相对水平、特异位点的计算与分析。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例
下述没有提到的实验参数，具体按照上述试验参数进行操作，本文中提到但没有详细描述的生物学方法采用本领域技术人员采用的常规手段。
选择定植在山东冠县（36°28'28''N，115°26'17''E）毛白杨种质资源库（全国毛白杨种质资源库）中432个无性系构成的自然群体进行检测。
用利刃剥离林木胸径处面积约5cm×5cm大小的树皮，切取少量木质部材料放入液氮中冷 冻处理，然后将树皮贴回树干原处，用保鲜膜将树干包裹，一段时间后去除。
采用改进的CTAB法提取所有木质部组织基因组DNA，并检测其浓度及质量。
利用前述反应体系对所有DNA样本进行酶切、连接、预扩增和选择性扩增。
对选择性扩增产物进行毛细管电泳检测，并利用GeneMarker V1.7.1软件读取条带。
统计条带数目及多态性条带，估算木质部甲基化相对水平。
图1示出了实施例1的毛细管电泳后产生的数据经由软件GeneMarker V1.7.1读取的条带图。左上图为筛选扩增引物组合E(TAC)+H/M(CTC)产生的条带图，蓝色条带（H/M(AAG)5'端经Fam荧光基团修饰）即为样本扩增的位点，橘黄色条带为Standard Size500，左侧数字表示泳道编号，下方数字表示片段大小；左下图为其各位点检测的峰面积，显示信号强度，左侧数据表示峰面积，上侧数据表示片段大小。右上图为选择性扩增引物组合E(ACT)+H/M(AAG)产生的条带图，绿色条带（H/M(AAG)5'端经Hex荧光基团修饰）即为样本扩增的位点，橘黄色条带为Standard Size500，左侧数字表示泳道编号，下方数字表示片段大小；右下图为其各位点检测的峰面积，显示信号强度，左侧数据表示峰面积，上侧数据表示片段大小。
具体结果如下：
30对引物共产生2408条条带（去除片段大小约60bp以下短序列），其中2393条（99.38%）为多态性条带，每对选择性扩增引物组合产生约80条多态性条带。非甲基化相对水平和总甲基化相对水平分别为42.708±6.732%和26.567±5.856%，半甲基化相对水平和全甲基化相对水平分别为13.466±4.644%和13.101±2.281%。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：
应用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术进行活体林木胸径处木质部基因组DNA甲基化位点检测，其中，使用专用工具获取活体树干胸径处木质部材料，提取其基因组DNA后进行酶切、连接、预扩增和选择性扩增，并对选择性扩增产物中甲基化位点（非甲基化序列）进行荧光检测。提取木质部组织全基因组DNA的方法采用改进的CTAB法，并设计出EcoRI+HpaII/MspI组成的30对选择性扩增引物组合及优化的选择性PCR扩增体系，同时还包括MSAP技术首次与荧光检测方法的结合使用，使得本发明的技术方案简便、快速、效率高、易操作，且基本不影响活体林木正常生长，在林木木质部表观遗传学研究中有着广泛的应用前景。
另外，以实施例1中432个样本为例，此方法比利用银染技术检测与条带统计缩短了70%的时间与工作量，避免了剧毒和污染等操作过程。
本发明的延伸利用，可将经扩增后的产物（其使用的不同选择性扩增引物HpaII/MspI(×××)5'端分别由Fam、Hex、Tamra或Rox等荧光基团修饰，激光照射下分别显示蓝色、绿色、黄色和红色）混合上样，则根据发光的不同，同时检测不同选择性扩增引物组合的扩增产物，更可以节约60%左右的成本。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>北京林业大学
<120>采用MSAP技术检测林木DNA甲基化的方法及试剂盒
<130>P73593LYEDX
<160>34
<170>PatentIn version3.2
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>EcoRI接头
<400>1
ctcgtagact gcgtacc 17
<210>2
<211>15
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>EcoRI接头
<400>2
aattggtacg cagtc 15
<210>3
<211>16
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>HpaII/MspI接头
<400>3
gatcatgagt cctgct 16
<210>4
<211>16
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>HpaII/MspI接头
<400>4
cgagcaggac tcatga 16
<210>5
<211>17
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>EcoRI预扩增引物
<400>5
gactgcgtac caattca 17
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>HpaII/MspI预扩增引物
<400>6
atcatgagtc ctgctcgg 18
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>EcoRI筛选引物
<400>7
gactgcgtac caattcaag 19
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>EcoRI筛选引物
<400>8
gactgcgtac caattcaat 19
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>EcoRI筛选引物
<400>9
gactgcgtac caattcaca 19
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>EcoRI筛选引物
<400>10
gactgcgtac caattcact 19
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>EcoRI筛选引物
<400>11
gactgcgtac caattcagc 19
<210>12
<211>19
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>EcoRI筛选引物
<400>12
gactgcgtac caattcagt 19
<210>13
<211>19
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>EcoRI筛选引物
<400>13
gactgcgtac caattcatc 19
<210>14
<211>19
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>EcoRI筛选引物
<400>14
gactgcgtac caattcatt 19
<210>15
<211>19
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>EcoRI筛选引物
<400>15
gactgcgtac caattccag 19
<210>16
<211>19
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>EcoRI筛选引物
<400>16
gactgcgtac caattccca 19
<210>17
<211>19
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>EcoRI筛选引物
<400>17
gactgcgtac caattccct 19
<210>18
<211>19
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>EcoRI筛选引物
<400>18
gactgcgtac caattcctc 19
<210>19
<211>19
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>EcoRI筛选引物
<400>19
gactgcgtac caattcgaa 19
<210>20
<211>19
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>EcoRI筛选引物
<400>20
gactgcgtac caattcgag 19
<210>21
<211>19
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>EcoRI筛选引物
<400>21
gactgcgtac caattctac 19
<210>22
<211>19
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>EcoRI筛选引物
<400>22
gactgcgtac caattctct 19
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>HpaII/MspI筛选引物
<400>23
atcatgagtc ctgctcggaa a 21
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>HpaII/MspI筛选引物
<400>24
atcatgagtc ctgctcggaa g 21
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>HpaII/MspI筛选引物
<400>25
atcatgagtc ctgctcggaa t 21
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>HpaII/MspI筛选引物
<400>26
atcatgagtc ctgctcggat c 21
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>HpaII/MspI筛选引物
<400>27
atcatgagtc ctgctcggat t 21
<210>28
<211>21
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>HpaII/MspI筛选引物
<400>28
atcatgagtc ctgctcggca a 21
<210>29
<211>21
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>HpaII/MspI筛选引物
<400>29
atcatgagtc ctgctcggct c 21
<210>30
<211>21
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>HpaII/MspI筛选引物
<400>30
atcatgagtc ctgctcggga a 21
<210>31
<211>21
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>HpaII/MspI筛选引物
<400>31
atcatgagtc ctgctcggga g 21
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>HpaII/MspI筛选引物
<400>32
atcatgagtc ctgctcggta c 21
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>HpaII/MspI筛选引物
<400>33
atcatgagtc ctgctcggta t 21
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>HpaII/MspI筛选引物
<400>34
atcatgagtc ctgctcggtc t 21。
Claims (10)
1.一种采用MSAP技术检测林木木质部DNA甲基化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，提取林木木质部DNA；
S2，分别用EcoRI/HpaII、EcoRI/MspI两组酶对所述林木木质部DNA进行酶切；
S3，分别对酶切得到的产物连接上限制性内切酶的接头；
S4，以所述接头为模板设计的预扩增引物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物；
S5，将所述PCR预扩增产物稀释后，加入带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增；
S6，电泳检测PCR扩增产物，统计并分析DNA条带，
其中，所述接头包括EcoRI接头和HpaII/MspI接头，所述EcoRI接头的序列为SEQID NO：1和SEQ ID NO：2，所述HpaII/MspI接头的序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；所述预扩增引物包括EcoRI预扩增引物和HpaII/MspI预扩增引物，所述EcoRI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：5，所述HpaII/MspI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：6；所述筛选引物包括EcoRI筛选引物和HpaII/MspI筛选引物，所述EcoRI筛选引物序列为SEQID NO：7～22，所述HpaII/MspI筛选引物序列为SEQ ID NO：23～34。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，提取林木木质部DNA选用的是活体林木，所述活体林木的取样方法包括以下步骤：
采用利刃将所述活体林木胸径处（3～5）cm×（3～5）cm面积树皮剥离，取出3～5g木质部后将树皮贴回原处，然后用保鲜膜将伤处包裹，7～10天后去除所述保鲜膜。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S6中，采用毛细管荧光电泳检测PCR扩增产物，在HpaII/MspI筛选引物5’端用荧光基团修饰，所述荧光基团包括Tamra、Rox、Fam或Hex。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，HpaII/MspI筛选引物SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33的5’端用荧光基团Fam修饰；HpaII/MspI筛选引物SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34的5’端用荧光基团Hex修饰。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述筛选引物的组合分别为：SEQ ID NO：14+SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：15+SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：19+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：21+SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：22+SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：7+SEQID NO：33、SEQ ID NO：7+SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：8+SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：9+SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：10+SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：11+SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：12+SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：13+SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：16+SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：20+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：17+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：18+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：9+SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：10+SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：11+SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：13+SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：15+SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：17+SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：19+SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：8+SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：12+SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：8+SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：16+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：18+SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：20+SEQ ID NO：24。
6.一种采用MSAP技术检测林木木质部DNA甲基化的试剂盒，其特征在于，包括MSAP技术所用的接头、预扩增引物和筛选引物序列，其中，其中，所述接头包括EcoRI接头和HpaII/MspI接头，所述EcoRI接头的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，所述HpaII/MspI接头的序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；所述预扩增引物包括EcoRI预扩增引物和HpaII/MspI预扩增引物，所述EcoRI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：5，所述HpaII/MspI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：6；所述筛选引物包括EcoRI筛选引物和HpaII/MspI筛选引物，所述EcoRI筛选引物序列为SEQ ID NO：7～22，所述HpaII/MspI筛选引物序列为SEQ ID NO：23～34。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括林木木质部DNA提取试剂。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，在所述HpaII/MspI筛选引物5’端用荧光基团修饰，所述荧光基团包括Tamra、Rox、Fam或Hex。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述HpaII/MspI筛选引物SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33的5’端用荧光基团Fam修饰；HpaII/MspI筛选引物SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34的5’端用荧光基团Hex修饰。
10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述筛选引物的组合分别为：SEQID NO：14+SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：15+SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：19+SEQID NO：28、SEQ ID NO：21+SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：22+SEQ ID NO：29、SEQID NO：7+SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：7+SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：8+SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：9+SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：10+SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：11+SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：12+SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：13+SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：16+SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：20+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：17+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：18+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：9+SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：10+SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：11+SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：13+SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：15+SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：17+SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：19+SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：8+SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：12+SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：8+SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：16+SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：18+SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：20+SEQ ID NO：24。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310298785.0A CN104293893A (zh) | 2013-07-16 | 2013-07-16 | 采用msap技术检测林木木质部dna甲基化的方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310298785.0A CN104293893A (zh) | 2013-07-16 | 2013-07-16 | 采用msap技术检测林木木质部dna甲基化的方法及试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104293893A true CN104293893A (zh) | 2015-01-21 |
Family
ID=52313841
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310298785.0A Pending CN104293893A (zh) | 2013-07-16 | 2013-07-16 | 采用msap技术检测林木木质部dna甲基化的方法及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104293893A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105256379A (zh) * | 2015-11-23 | 2016-01-20 | 武汉大学 | 一种新的基因组简化甲基化测序文库的制备方法 |
| CN106755534A (zh) * | 2017-03-01 | 2017-05-31 | 北京林业大学 | 一种植物dna甲基化组织特异性获取方法 |
| CN106755436A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-05-31 | 北京林业大学 | 一种林木基因组dna甲基化遗传连锁图谱的构建方法 |
| CN106967806A (zh) * | 2017-04-06 | 2017-07-21 | 西北农林科技大学 | 一种利用msap方法鉴别樱桃矮化砧木的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102080128A (zh) * | 2010-11-29 | 2011-06-01 | 山东农业大学 | 甲基化敏感扩增多态性技术在转基因植物毒性分析的应用 |
-
2013
- 2013-07-16 CN CN201310298785.0A patent/CN104293893A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102080128A (zh) * | 2010-11-29 | 2011-06-01 | 山东农业大学 | 甲基化敏感扩增多态性技术在转基因植物毒性分析的应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| KAIFENG MA等: "Variation in Genomic Methylation in Natural Populations of Chinese White Poplar", 《PLOS ONE》 * |
| XIANG GAO等: "In Vitro Micropropagation of Freesia hybrida and the Assessment of Genetic and Epigenetic Stability in Regenerated Plantlets", 《J PLANT GROWTH REGUL》 * |
| 高寰等: "三叶木通MSAP 反应体系的优化及引物筛选", 《中草药》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105256379A (zh) * | 2015-11-23 | 2016-01-20 | 武汉大学 | 一种新的基因组简化甲基化测序文库的制备方法 |
| CN106755436A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-05-31 | 北京林业大学 | 一种林木基因组dna甲基化遗传连锁图谱的构建方法 |
| CN106755534A (zh) * | 2017-03-01 | 2017-05-31 | 北京林业大学 | 一种植物dna甲基化组织特异性获取方法 |
| CN106755534B (zh) * | 2017-03-01 | 2020-06-16 | 北京林业大学 | 一种植物dna甲基化组织特异性获取方法 |
| CN106967806A (zh) * | 2017-04-06 | 2017-07-21 | 西北农林科技大学 | 一种利用msap方法鉴别樱桃矮化砧木的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104789676B (zh) | 一种鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼的试剂盒及其使用方法 | |
| KR100956323B1 (ko) | 벼 품종을 식별하기 위한 다중 실시간 ｐｃｒ 방법 | |
| CN108728572A (zh) | 一种标定四季茶花杂交新品种分子身份证的标记方法 | |
| CN104293893A (zh) | 采用msap技术检测林木木质部dna甲基化的方法及试剂盒 | |
| KR101258694B1 (ko) | 배 품종 식별용 ｓｃａｒ 마커 및 그 용도 | |
| CN107881256A (zh) | 用于鉴定桃果实苦仁/甜仁性状的单核苷酸多态性标记位点、引物对、试剂盒及应用 | |
| CN103088136B (zh) | 一种鉴别日光蜂不同遗传支系的引物及鉴别方法 | |
| AU2021101596A4 (en) | SSR molecular marker primer set for identifying Rhynchostylis and use thereof | |
| KR20160060384A (ko) | 초위성체 마커를 이용한 배 품종식별 방법 | |
| ES2821751T3 (es) | Procedimientos y kits para la detección del mildiú pulverulento | |
| BIMA AKZAD et al. | Detecting DNA polymorphism on mulberry (Morus sp.) using RAPD and ISSR markers | |
| KR101286990B1 (ko) | 벼 품종을 식별하기 위한 다중 실시간 ｐｃｒ 방법 | |
| KR101271822B1 (ko) | 감 품종 판별용 프라이머 세트 | |
| CN108384885B (zh) | 一种香樟ssr引物组合及其品种鉴定方法 | |
| AU2021101595A4 (en) | SSR molecular marker primer set for identifying Cattleya Alliance and use thereof | |
| CN116716426A (zh) | 基于白木香基因组的ssr分子标记引物组合及试剂盒和应用 | |
| Kyaligonza et al. | Identification of F1 cassava (Manihot esculenta Crantz) progeny using microsatellite markers and capillary electrophoresis | |
| CN111944922B (zh) | 基于芍药转录组序列开发的est-ssr引物组及其应用 | |
| CN111763668B (zh) | 测序引物组及基于pcr的全基因组测序方法 | |
| CN107338246A (zh) | 番茄果实干汁性状的特异性序列及其分子标记物与鉴定方法 | |
| CN105483281A (zh) | 一种用于鉴定糯玉米沪五彩花糯1号的snp分子标记及其鉴定方法 | |
| CN103255224B (zh) | 一种鉴别迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊幼虫的pcr鉴定引物及其鉴定方法 | |
| KR101359542B1 (ko) | 복숭아 품종 식별용 초위성체 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| JP2022025729A (ja) | カンキツ品種の識別方法 | |
| Pazeto et al. | Genetic diversity in Jatropha species from different regions of Brazil based on morphological characters and inters-simple sequence repeat (ISSR) molecular markers |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150121 |