CN106755534B - 一种植物dna甲基化组织特异性获取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种植物DNA甲基化组织特异性的获取方法，包括以下步骤：提取植物组织基因组DNA；酶切连接得到连接产物；对连接产物进行PCR预扩增；将得到的PCR预扩增产物稀释后，加入筛选引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；电泳检测，统计DNA条带，将(1,0)记为H，(0,1)记为M，(0,0)和(1,1)记为N，对统计结果赋值，使H＝M＝1，N＝0；根据赋值，利用公式1得到DNA甲基化片段的组织特异性：利用公式2得到DNA甲基化片段组织特异性的偏好性。采用本发明的技术方案实现了植物组织DNA甲基化特异性的定量分析，为后续的组织特异性的DNA甲基化调控基因表达研究提供了技术支持。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种植物DNA甲基化组织特异性获取方法。
背景技术
DNA甲基化在植物发育过程以及基因组防御环境因子胁迫等方面扮演重要的作用，在植物中，DNA甲基化通常发生在CpG或者CpNpG序列上，并且在DNA修复的循环中可以维持不变，所有的植物发育过程都建立在精准的时空特异表达和基因表达调控的基础之上。越来越多的证据表明基因表达的时空特异性不仅由特异的DNA序列(顺式以及反式作用元件控制)调控，还由一些表观修饰因子，其中最主要的就是DNA甲基化进行调控，但目前现有技术中还未见有专门针对DNA甲基化组织特异性的获取方法的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的不足，而提供一种植物DNA甲基化组织特异性的获取方法，实现了植物组织DNA甲基化特异性的定量分析。
本发明提供了一种植物DNA甲基化组织特异性的获取方法，包括以下步骤：
1)提取植物组织基因组DNA；
2)在同一酶切体系中，用同裂酶和EcoRI对所述步骤1)得到的植物组织基因组DNA进行酶切，得到酶切产物，再对酶切产物连接限制性内切酶的接头，得到连接产物；所述同裂酶为Hpa II或Msp I；
3)以所述步骤2)接头为模板设计预扩增引物，再以所述预扩增引物对所述步骤2)得到连接产物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物；
4)将所述步骤3)PCR预扩增产物稀释后，加入带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
5)电泳检测所述步骤4)得到的PCR扩增产物，统计DNA条带，将(1,0)记为H，H代表半甲基化修饰的位点，将(0,1)记为M，M代表全甲基化修饰的位点，(0,0)和(1,1)记为N，N代表无效信息位点和非甲基化位点，对统计结果赋值，使H＝M＝1，N＝0；
6)根据所述步骤5)的赋值，利用公式1得到DNA甲基化片段的组织特异性：
公式1中，n代表分析使用植物组织的数量，i代表第i个DNA甲基化片段，j代表第j个组织，M＝1，H＝1，Ti代表第i个DNA甲基化片段的甲基化模式组织特异性值；Ti等于0代表在全部组织中发生甲基化，Ti等于1代表仅在一个组织中发生了甲基化；
利用公式2得到DNA甲基化片段组织特异性的偏好性：
公式2中，n代表分析使用植物组织的数量，i代表第i个DNA甲基化片段，j代表第j个组织，M＝1，H＝1，Bi代表第i个DNA甲基化片段的甲基化模式在组织中偏好性，Bi在[-1,0)之间代表该片段在组织中甲基化模式偏好为全甲基化模式，Bi在(0,1]之间代表该片段在组织中甲基化模式偏好为半甲基化模式，Bi＝0时代表该片段在组织中甲基化模式没有偏好性。
优选的，所述步骤2)中的接头包括EcoRI接头和同裂酶接头，所述EcoRI接头的序列为SEQ ID No:1或SEQ ID No:2，所述同裂酶接头的序列为SEQ ID No:3或SEQ ID No:4。
优选的，所述步骤3)预扩增引物包括EcoRI预扩增引物和同裂酶预扩增引物，所述EcoRI预扩增引物的序列为SEQ ID No:5，所述同裂酶预扩增引物的序列为SEQ IDNo:6。
优选的，所述步骤4)筛选引物包括EcoRI筛选引物和同裂酶筛选引物，所述EcoRI筛选引物序列为SEQ ID No:7～70中的一种，所述同裂酶筛选引物序列为SEQ ID No:71～134中的一种。
优选的，所述EcoRI筛选引物序列与同裂酶筛选引物序列的组合为SEQ ID No:16+SEQ ID No:132、SEQ ID No:17+SEQ ID No:78、SEQ ID No:22+SEQ ID No:133、SEQ ID No:29+SEQ ID No:80、SEQ ID No:29+SEQ ID No:86、SEQ ID No:29+SEQ ID No:93、SEQ IDNo:29+SEQ ID No:94、SEQ ID No:29+SEQ ID No:109、SEQ ID No:29+SEQ ID No:113、SEQID No:29+SEQ ID No:127、SEQ ID No:29+SEQ ID No:133、SEQ ID No:29+SEQ ID No:134、SEQ ID No:29+SEQ ID No:77、SEQ ID No:29+SEQ ID No:78、SEQ ID No:30+SEQ ID No:86、SEQ ID No:36+SEQ ID No:81、SEQ ID No:45+SEQ ID No:81、SEQ ID No:45+SEQ IDNo:86、SEQ ID No:45+SEQ ID No:100、SEQ ID No:45+SEQ ID No:110、SEQ ID No:45+SEQID No:113、SEQ ID No:45+SEQ ID No:125、SEQ ID No:46+SEQ ID No:80、SEQ ID No:46+SEQ ID No:93、SEQ ID No:46+SEQ ID No:109、SEQ ID No:46+SEQ ID No:110、SEQ ID No:46+SEQ ID No:113、SEQ ID No:46+SEQ ID No:125、SEQ ID No:46+SEQ ID No:127、SEQ IDNo:46+SEQ ID No:78、SEQ ID No:48+SEQ ID No:93、SEQ ID No:49+SEQ ID No:94、SEQ IDNo:61+SEQ ID No:127、SEQ ID No:62+SEQ ID No:113、SEQ ID No:68+SEQ ID No:125、SEQID No:69+SEQ ID No:112、SEQ ID No:70+SEQ ID No:100、SEQ ID No:13+SEQ ID No:109或SEQ ID No:14+SEQ ID No:134。
优选的，所述步骤2)中酶切连接用体系为：每20μl体系包括10×扩增缓冲液2.0μl，植物组织基因组DNA4.0μl，EcoRI 0.25μL，HpaII 0.4μL或MspI0.4μL，EcoRI接头0.5μL，同裂酶接头0.5μL，T4连接酶0.5μL，ddH2O11.85μL。
优选的，所述步骤3)中预扩增用体系为：每50μL体系包括稀释100倍的所述连接产物5μL，EcoRI预扩增引物2.5μL，同裂酶预扩增引物2.5μL，10×扩增缓冲液5μL，Taq DNA聚合酶1μL，dNTPs 0.5μL，ddH2O 33.5μL；
所述预扩增的程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸80s，30～35个循环，72℃延伸5min。
优选的，所述步骤4)中扩增用体系为：每20μL扩增体系包括稀释100倍的所述PCR预扩增产物4μL，同裂酶引物2μL，EcoRI引物2μL，Taq DNA聚合酶1μL，dNTPs 0.5μL，10×扩增缓冲液2.5μL，ddH2O 8μL。
优选的，所述步骤4)扩增的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，13个循环，每个循环退火温度降0.7℃；
所述13个循环后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸80s，23～25个循环，72℃延伸5min。
本发明提供了一种植物DNA甲基化组织特异性的获取方法，包括以下步骤：1)提取植物组织基因组DNA；2)在同一酶切体系中，用同裂酶和EcoRI对所述步骤1)得到的植物组织基因组DNA进行酶切，得到酶切产物，再对酶切产物连接限制性内切酶的接头，得到连接产物；所述同裂酶为Hpa II或MspI；3)以所述步骤2)接头为模板设计预扩增引物，再以所述预扩增引物对所述步骤2)得到连接产物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物；4)将所述步骤3)PCR预扩增产物稀释后，加入带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；5)电泳检测所述步骤4)得到的PCR扩增产物，统计DNA条带，将(1,0)记为H，H代表半甲基化修饰的位点，将(0,1)记为M，M代表全甲基化修饰的位点，(0,0)和(1,1)记为N，N代表无效信息位点和非甲基化位点，对统计结果赋值，使H＝M＝1，N＝0；6)根据所述步骤5)的赋值，利用公式1得到DNA甲基化片段的组织特异性：
公式1中，n代表分析使用植物组织的数量，i代表第i个DNA甲基化片段，j代表第j个组织，M＝1，H＝1，Ti代表第i个DNA甲基化片段的甲基化模式组织特异性值；Ti等于0代表在全部组织中发生甲基化，Ti等于1代表仅在一个组织中发生了甲基化；
利用公式2得到DNA甲基化片段组织特异性的偏好性：
公式2中，n代表分析使用植物组织的数量，i代表第i个DNA甲基化片段，j代表第j个组织，M＝1，H＝1，Bi代表第i个DNA甲基化片段的甲基化模式在组织中偏好性，Bi在[-1,0)之间代表该片段在组织中甲基化模式偏好为全甲基化模式，Bi在(0,1]之间代表该片段在组织中甲基化模式偏好为半甲基化模式，Bi＝0时代表该片段在组织中甲基化模式没有偏好性。采用本发明的技术方案通过对标记位点赋值结合计算公式实现了植物组织DNA甲基化特异性的定量分析，为后续的组织特异性的DNA甲基化调控基因表达研究提供了技术支持。
附图说明
图1为植物组织DNA甲基化特异性MASP分析电泳图，其中a-j分别代表毛白杨的嫩叶、成熟叶、韧皮部、形成层、根、顶点、未成熟木质部、成熟木质部、雄花序和雌花序共10个组织。(1,0)，(0,1)，(0,0)和(1,1)分别代表半甲基化、全甲基化、无效信息位点以及非甲基化位点。
具体实施方式
本发明提供了一种植物DNA甲基化组织特异性的获取方法，包括以下步骤：
1)提取植物组织基因组DNA；
2)在同一酶切体系中，用同裂酶和EcoRI对所述步骤1)得到的植物组织基因组DNA进行酶切，得到酶切产物，再对酶切产物连接限制性内切酶的接头，得到连接产物；所述同裂酶为Hpa II或MspI；
3)以所述步骤2)接头为模板设计预扩增引物，再以所述预扩增引物对所述步骤2)得到连接产物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物；
4)将所述步骤3)PCR预扩增产物稀释后，加入带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
5)电泳检测所述步骤4)得到的PCR扩增产物，统计DNA条带，将(1,0)记为H，H代表半甲基化修饰的位点，将(0,1)记为M，M代表全甲基化修饰的位点，(0,0)和(1,1)记为N，N代表无效信息位点和非甲基化位点，对统计结果赋值，使H＝M＝1，N＝0；
6)根据所述步骤5)的赋值，利用公式1得到DNA甲基化片段的组织特异性：
公式I中，n代表分析使用植物组织的数量，i代表第i个DNA甲基化片段，j代表第j个组织，M＝1，H＝1，Ti代表第i个DNA甲基化片段的甲基化模式组织特异性值；Ti等于0代表在全部组织中发生甲基化，Ti等于1代表仅在一个组织中发生了甲基化；
利用公式2得到DNA甲基化片段组织特异性的偏好性：
公式2中，n代表分析使用植物组织的数量，i代表第i个DNA甲基化片段，j代表第j个组织，M＝1，H＝1，Bi代表第i个DNA甲基化片段的甲基化模式在组织中偏好性，Bi在[-1,0)之间代表该片段在组织中甲基化模式偏好为全甲基化模式，Bi在(0,1]之间代表该片段在组织中甲基化模式偏好为半甲基化模式，Bi＝0时代表该片段在组织中甲基化模式没有偏好性。
在本发明中，所述植物组织优选包括嫩叶、成熟叶、韧皮部、形成层、根、顶点分生组织、未成熟木质部、成熟木质部、雄花序、雌花序、叶片或茎。
本发明对所述植物组织基因组DNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的基因组DNA提取的方法即可。
得到植物组织基因组DNA后，在同一酶切体系中，用同裂酶和EcoRI对得到的植物组织基因组DNA进行酶切，得到酶切产物，再对酶切产物连接限制性内切酶的接头，得到连接产物。在本发明中，所述酶切体系的反应条件优选为14～18℃过夜，更优选为16℃过夜。
在本发明中，所述同裂酶为Hpa II或MspI。本发明对所述同裂酶和EcoRI的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售商品即可。
在本发明中，所述接头优选包括EcoRI接头和同裂酶接头，所述EcoRI接头的序列为SEQ ID No:1或SEQ ID No:2，所述同裂酶接头的序列为SEQ ID No:3或SEQ ID No:4。
在本发明中，所述酶切连接用体系优选为：每20μl体系包括10×扩增缓冲液2.0μl，植物组织基因组DNA4.0μl，EcoRI 0.25μL，HpaII 0.4μL或MspI0.4μL，EcoRI接头0.5μL，同裂酶接头0.5μL，T4连接酶0.5μL，ddH2O 11.85μL。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常用的市售商品即可。
在本发明中，以接头为模板设计预扩增引物，再以所述预扩增引物对得到连接产物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物。在本发明中，所述预扩增引物优选包括EcoRI预扩增引物和同裂酶预扩增引物，所述EcoRI预扩增引物的序列为SEQ ID No:5，所述同裂酶预扩增引物的序列为SEQ ID No:6。
在本发明中，所述预扩增用体系优选为：每50μL体系包括稀释100倍的所述连接产物5μL，EcoRI预扩增引物2.5μL，同裂酶预扩增引物2.5μL，10×扩增缓冲液5μL，Taq DNA聚合酶1μL，dNTPs 0.5μL，ddH2O 33.5μL。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售商品即可。
在本发明中，所述预扩增的程序优选为：94℃预变性2min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸80s，30～35个循环，72℃延伸5min。
在本发明中，将所述PCR预扩增产物稀释后，加入带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
在本发明中，所述PCR预扩增产物稀释的倍数优选为80～120倍，更优选为90～110倍，最优选为100倍。
在本发明中，所述筛选引物优选包括EcoRI筛选引物和同裂酶筛选引物，所述EcoRI筛选引物序列为SEQ ID No:7～70中的一种，所述同裂酶筛选引物序列为SEQ IDNo:71～134中的一种。在本发明中，所述EcoRI筛选引物序列与同裂酶筛选引物序列的组合优选为SEQ ID No:16+SEQ ID No:132、SEQ ID No:17+SEQ ID No:78、SEQ ID No:22+SEQ IDNo:133、SEQ ID No:29+SEQ ID No:80、SEQ ID No:29+SEQ ID No:86、SEQ ID No:29+SEQID No:93、SEQ ID No:29+SEQ ID No:94、SEQ ID No:29+SEQ ID No:109、SEQ ID No:29+SEQ ID No:113、SEQ ID No:29+SEQ ID No:127、SEQ ID No:29+SEQ ID No:133、SEQ IDNo:29+SEQ ID No:134、SEQ ID No:29+SEQ ID No:77、SEQ ID No:29+SEQ ID No:78、SEQID No:30+SEQ ID No:86、SEQ ID No:36+SEQ ID No:81、SEQ ID No:45+SEQ ID No:81、SEQID No:45+SEQ ID No:86、SEQ ID No:45+SEQ ID No:100、SEQ ID No:45+SEQ ID No:110、SEQ ID No:45+SEQ ID No:113、SEQ ID No:45+SEQ ID No:125、SEQ ID No:46+SEQ ID No:80、SEQ ID No:46+SEQ ID No:93、SEQ ID No:46+SEQ ID No:109、SEQ ID No:46+SEQ IDNo:110、SEQ ID No:46+SEQ ID No:113、SEQ ID No:46+SEQ ID No:125、SEQ ID No:46+SEQID No:127、SEQ ID No:46+SEQ ID No:78、SEQ ID No:48+SEQ ID No:93、SEQ ID No:49+SEQ ID No:94、SEQ ID No:61+SEQ ID No:127、SEQ ID No:62+SEQ ID No:113、SEQ ID No:68+SEQ ID No:125、SEQ ID No:69+SEQ ID No:112、SEQ IDNo:70+SEQ ID No:100、SEQ IDNo:13+SEQ ID No:109或SEQ IDNo:14+SEQ IDNo:134。
在本发明中，所述扩增用体系优选为：每20μL扩增体系包括稀释100倍的所述PCR预扩增产物4μL，同裂酶引物2μL，EcoRI引物2μL，Taq DNA聚合酶1μL，dNTPs 0.5μL，10×扩增缓冲液2.5μL，ddH2O 8μL。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规的市售商品即可。
在本发明中，所述扩增的程序优选为：94℃预变性5min，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，13个循环，每个循环退火温度降0.7℃；所述13个循环后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸80s，23～25个循环，72℃延伸5min。
在本发明中，将得到的PCR扩增产物进行电泳检测。在本发明中，所述电泳检测的条件优选为采用1800～2000V恒压进行5～9％聚丙烯酰胺凝胶电泳1～2h。所述电泳采用的电压优选为1800～2000V，更优选为1850～1950V，最优选为1900V。所述电泳用的聚丙烯酰胺凝胶中琼脂的质量体积百分含量优选为5～9％，更优选为6～8％，最优选为7％。所述电泳的时间优选为1～2h，更优选为1.5h。
本发明在所述电泳后，统计DNA条带，将(1,0)记为H，H代表半甲基化修饰的位点，将(0,1)记为M，M代表全甲基化修饰的位点，将(0,0)和(1,1)记为N，N代表无效信息位点和非甲基化位点，对统计结果赋值，使H＝M＝1，N＝0。本发明根据上述赋值，利用公式1得到DNA甲基化片段的组织特异性：
公式I中，n代表分析使用植物组织的数量，i代表第i个DNA甲基化片段，j代表第j个组织，M＝1，H＝1，Ti代表第i个DNA甲基化片段的甲基化模式组织特异性值；Ti等于0代表在全部组织中发生甲基化，Ti等于1代表仅在一个组织中发生了甲基化；
利用公式2得到DNA甲基化片段组织特异性的偏好性：
公式2中，n代表分析使用植物组织的数量，i代表第i个DNA甲基化片段，j代表第j个组织，M＝1，H＝1，Bi代表第i个DNA甲基化片段的甲基化模式在组织中偏好性，Bi在[-1,0)之间代表该片段在组织中甲基化模式偏好为全甲基化模式，Bi在(0,1]之间代表该片段在组织中甲基化模式偏好为半甲基化模式，Bi＝0时代表该片段在组织中甲基化模式没有偏好性。
下面结合实施例对本发明提供的一种植物DNA甲基化组织特异性获取方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、利用本领域常规植物组织DNA提取方法，提取毛白杨的嫩叶、成熟叶、韧皮部、形成层、根、顶点分生组织、未成熟木质部、成熟木质部、雄花序和雌花序共10个组织基因组DNA；
2、分别用Msp I和EcoRI两组酶对植物各组织基因组DNA进行酶切连接，得到连接产物；
双酶切连接反应体系的总体积为20μl，具体如下：
16℃连接过夜。
3、以接头为模板设计的预扩增引物，再以预扩增引物对连接产物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物；
预扩增反应体系为50μL，具体如下：
预扩增的程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸80s，30～35个循环，72℃延伸5min。
4、将PCR预扩增产物稀释100倍后，加入带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增；
选择性扩增体系为20μL，具体如下：
扩增的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，13个循环，每个循环退火温度降0.7℃；
所述13个循环后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸80s，23～25个循环，72℃延伸5min。
5、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，采用1900V恒压进行7％聚丙烯酰胺凝胶电泳1.5h，银染，电泳结果见图1。统计并分析DNA条带；聚丙烯酰胺凝胶电泳所涉及各种试剂在《分子克隆试验指南》中有详细配置方法。统计条带，将(1,0)记为H，(0,1)记为M，(0，0)和(1,1)记为N。对统计结果赋值，使H＝M＝1，N＝0。
6、利用公式1和公式2计算植物组织基因组DNA甲基化组织特异性和偏好性。
利用公式1计算植物组织DNA甲基化片段的组织特异性：
公式1中，n代表分析使用植物组织的数量，i代表第i个DNA甲基化片段，j代表第j个组织，M＝1，H＝1，M代表全甲基化修饰的位点，H代表半甲基化修饰的位点。Ti代表第i个DNA甲基化片段的甲基化模式组织特异性值。Ti等于0代表在全部组织中发生甲基化。Ti等于1代表仅在一个组织中发生了甲基化。
利用公式2计算DNA甲基化片段的组织特异性的偏好性：
公式2中，n代表分析使用植物组织的数量，i代表第i个DNA甲基化片段，j代表第j个组织。M代表全甲基化修饰的位点，H代表半甲基化修饰的位点。Bi代表第i个DNA甲基化片段的甲基化模式在组织中偏好性。Bi在[-1,0)之间代表该片段在组织中甲基化模式偏好为全甲基化模式。Bi在(0,1]之间代表该片段在组织中甲基化模式偏好为半甲基化模式，Bi＝0时代表该片段在组织中甲基化模式没有偏好性。
以毛白杨的嫩叶、成熟叶、韧皮部、形成层、根、顶点、未成熟木质部、成熟木质部、雄花序和雌花序10个组织为研究材料，在4096对引物组合中筛选得到39对扩增稳定并且效率较高的引物用于毛白杨DNA甲基化组织特异性分析，共得到了642个位点，选择了28个位点进行克隆测序，共得到了26条序列，经与杨树基因组数据库比对得到22个基因，并计算了这些基因的甲基化修饰在毛白杨各组织中的特异性以及偏好性，结果见表1和表2。
表1毛白杨MSAP片段在10个组织中的甲基化模式
从表1中可以得出，毛白杨MSAP片段在10个组织中存在迥异的DNA甲基化模式。
表2毛白杨MSAP片段功能注释及组织特异性
从表2中可以得出，毛白杨MSAP片段代表了不同的候选基因，这些基因在10个组织中的甲基化模式特异性和偏好性差别显著。
实施例2
1、利用本领域常规DNA提取方法，提取桉树叶片、根、茎、花序和未成熟木质部5个组织基因组DNA；
2、分别用Hpa II和EcoRI两组酶对植物各组织基因组DNA进行酶切连接，得到连接产物；
双酶切连接反应体系的总体积为20μl，具体如下：
16℃连接过夜。
3、以接头为模板设计的预扩增引物，再以预扩增引物对连接产物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物；
预扩增反应体系为50μL，具体如下：
预扩增的程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸80s，30～35个循环，72℃延伸5min
4、将所述PCR预扩增产物稀释后，加入带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增；
选择性扩增体系为20μL，具体如下：
扩增的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，13个循环，每个循环退火温度降0.7℃；
所述13个循环后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸80s，23～25个循环，72℃延伸5min。
5、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，采用1900V恒压进行7％聚丙烯酰胺凝胶电泳1.5h，银染。统计并分析DNA条带；聚丙烯酰胺凝胶电泳所涉及各种试剂在《分子克隆试验指南》中有详细配置方法。统计条带，将(1,0)记为H，(0,1)记为M，(0，0)和(1,1)记为N(见表2)。对统计结果赋值，使H＝M＝1，N＝0。
6、利用公式1和公式2计算植物组织基因组DNA甲基化组织特异性和偏好性。
利用公式1计算植物组织DNA甲基化片段的组织特异性：
公式1中，n代表分析使用植物组织的数量，i代表第i个DNA甲基化片段，j代表第j个组织。M＝1，H＝1，M代表全甲基化修饰的位点，H代表半甲基化修饰的位点。Ti代表第i个DNA甲基化片段的甲基化模式组织特异性值。Ti等于0代表在全部组织中发生甲基化。Ti等于1代表仅在一个组织中发生了甲基化。
利用公式2计算DNA甲基化片段的组织特异性的偏好性：
公式2中，n代表分析使用植物组织的数量，i代表第i个DNA甲基化片段，j代表第j个组织。M代表全甲基化修饰的位点，H代表半甲基化修饰的位点。Bi代表第i个DNA甲基化片段的甲基化模式在组织中偏好性。Bi在[-1,0)之间代表该片段在组织中甲基化模式偏好为全甲基化模式。Bi在(0,1]之间代表该片段在组织中甲基化模式偏好为半甲基化模式，Bi＝0时代表该片段在组织中甲基化模式没有偏好性。
以桉树叶片、根、茎、花序和未成熟木质部5个组织为研究材料，在4096对引物组合中筛选得到45对扩增稳定并且效率较高的引物用于桉树DNA甲基化组织特异性分析，共得到了831个位点，选择了22个位点进行克隆测序，共得到了18条序列，经与桉树基因组数据库比对得到18个基因，并计算了这些基因的甲基化修饰在桉树各组织中的特异性以及偏好性，结果见表3和
表3桉树MSAP片段在5个组织中的甲基化模式
从表3中可以得出，桉树MSAP片段在5个组织中存在迥异的DNA甲基化模式。
表4桉树MSAP片段功能注释及组织特异性
从表4中可以得出，桉树MSAP片段代表了不同的候选基因，这些基因在5个组织中的甲基化模式特异性和偏好性差别显著。
实施例3
1、利用本领域常规植物组织DNA提取方法，提取拟南芥叶片、茎、根、花和顶点分生组5个组织基因组DNA；
2、分别用Hpa II和EcoRI两组酶对植物各组织基因组DNA进行酶切连接，得到连接产物；
双酶切连接反应体系的总体积为20μl，具体如下：
16℃连接过夜。
3、以所述接头为模板设计的预扩增引物，再以预扩增引物对连接产物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物；
预扩增反应体系为50μL，具体如下：
预扩增的程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸80s，30～35个循环，72℃延伸5min。
4、将所述PCR预扩增产物稀释100倍后，加入带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增；
选择性扩增体系为20μL，具体如下：
扩增的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，13个循环，每个循环退火温度降0.7℃；
所述13个循环后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸80s，23～25个循环，72℃延伸5min。
5、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，采用1900V恒压进行7％聚丙烯酰胺凝胶电泳1.5h，银染。统计并分析DNA条带；聚丙烯酰胺凝胶电泳所涉及各种试剂在《分子克隆试验指南》中有详细配置方法。统计条带，将(1,0)记为H，(0,1)记为M，(0，0)和(1,1)记为N(见表2)。对统计结果赋值，使H＝M＝1，N＝0。
6、利用公式1和公式2计算植物组织基因组DNA甲基化组织特异性和偏好性。
利用公式1计算植物组织DNA甲基化片段的组织特异性：
公式1中，n代表分析使用植物组织的数量，i代表第i个DNA甲基化片段，j代表第j个组织。M＝1，H＝1，M代表全甲基化修饰的位点，H代表半甲基化修饰的位点。Ti代表第i个DNA甲基化片段的甲基化模式组织特异性值。Ti等于0代表在全部组织中发生甲基化。Ti等于1代表仅在一个组织中发生了甲基化。
利用公式2计算DNA甲基化片段的组织特异性的偏好性：
公式2中，n代表分析使用植物组织的数量，i代表第i个DNA甲基化片段，j代表第j个组织。M代表全甲基化修饰的位点，H代表半甲基化修饰的位点。Bi代表第i个DNA甲基化片段的甲基化模式在组织中偏好性。Bi在[-1,0)之间代表该片段在组织中甲基化模式偏好为全甲基化模式。Bi在(0,1]之间代表该片段在组织中甲基化模式偏好为半甲基化模式，Bi＝0时代表该片段在组织中甲基化模式没有偏好性。
以拟南芥叶、茎、根、花和顶点5个组织为研究材料，在4096对引物组合中筛选得到48对扩增稳定并且效率较高的引物用于拟南芥DNA甲基化组织特异性分析，共得到了712个位点，选择了29个位点进行克隆测序，共得到了24条序列，经与拟南芥基因组数据库比对得到18个基因，并计算了这些基因的甲基化修饰在拟南芥各组织中的特异性以及偏好性。结果见表5和表6。
表5拟南芥MSAP片段在5个组织中的甲基化模式
从表5中可以得出，拟南芥MSAP片段在5个组织中存在迥异的DNA甲基化模式。
表6拟南芥MSAP片段功能注释及组织特异性
从表6中可以得出，拟南芥MSAP片段代表了不同的候选基因，这些基因在5个组织中的甲基化模式特异性和偏好性差别显著。
从以上实施例可以得出，采用本发明的技术方案实现了植物组织DNA甲基化特异性的定量分析，为后续的组织特异性的DNA甲基化调控基因表达研究提供了技术支持。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京林业大学
<120> 一种植物DNA甲基化组织特异性获取方法
<130> 2017
<160> 134
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<213> 人工序列
<400> 134
atcatgagtc ctgctcgggg g 21
Claims (6)
1.一种植物DNA甲基化组织特异性的获取方法，包括以下步骤：
1)提取植物组织基因组DNA；
2)在同一酶切体系中，用同裂酶和EcoRI对所述步骤1)得到的植物组织基因组DNA进行酶切，得到酶切产物，再对酶切产物连接限制性内切酶的接头，得到连接产物；所述同裂酶为Hpa II或Msp I；
3)以所述步骤2)接头为模板设计预扩增引物，再以所述预扩增引物对所述步骤2)得到连接产物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物；
4)将所述步骤3)PCR预扩增产物稀释后，加入带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
5)电泳检测所述步骤4)得到的PCR扩增产物，统计DNA条带，将(1,0)记为H，H代表半甲基化修饰的位点，将(0,1)记为M，M代表全甲基化修饰的位点，(0,0)和(1,1)记为N，N代表无效信息位点和非甲基化位点，对统计结果赋值，使H＝M＝1，N＝0；
6)根据所述步骤5)的赋值，利用公式1得到DNA甲基化片段的组织特异性：
公式1中，n代表分析使用植物组织的数量，i代表第i个DNA甲基化片段，j代表第j个组织，M＝1，H＝1，Ti代表第i个DNA甲基化片段的甲基化模式组织特异性值；Ti等于0代表在全部组织中发生甲基化，Ti等于1代表仅在一个组织中发生了甲基化；
利用公式2得到DNA甲基化片段组织特异性的偏好性：
公式2中，n代表分析使用植物组织的数量，i代表第i个DNA甲基化片段，j代表第j个组织，M＝1，H＝1，Bi代表第i个DNA甲基化片段的甲基化模式在组织中偏好性，Bi在[-1,0)之间代表该片段在组织中甲基化模式偏好为全甲基化模式，Bi在(0,1]之间代表该片段在组织中甲基化模式偏好为半甲基化模式，Bi＝0时代表该片段在组织中甲基化模式没有偏好性；
所述步骤2)中的接头包括EcoRI接头和同裂酶接头，所述EcoRI接头的序列为SEQ IDNo:1或SEQ ID No:2，所述同裂酶接头的序列为SEQ ID No:3或SEQ ID No:4；
所述步骤3)预扩增引物包括EcoRI预扩增引物和同裂酶预扩增引物，所述EcoRI预扩增引物的序列为SEQ ID No:5，所述同裂酶预扩增引物的序列为SEQ ID No:6；
所述步骤4)筛选引物包括EcoRI筛选引物和同裂酶筛选引物，所述EcoRI筛选引物序列为SEQ ID No:7～70中的一种，所述同裂酶筛选引物序列为SEQ ID No:71～134中的一种。
2.根据权利要求1所述的获取方法，其特征在于，所述EcoRI筛选引物序列与同裂酶筛选引物序列的组合为SEQ ID No:16+SEQ ID No:132、SEQ ID No:17+SEQ ID No:78、SEQ IDNo:22+SEQ ID No:133、SEQ ID No:29+SEQ ID No:80、SEQ ID No:29+SEQ ID No:86、SEQID No:29+SEQ ID No:93、SEQ ID No:29+SEQ ID No:94、SEQ ID No:29+SEQ ID No:109、SEQ ID No:29+SEQ ID No:113、SEQ ID No:29+SEQ ID No:127、SEQ ID No:29+SEQ ID No:133、SEQ ID No:29+SEQ ID No:134、SEQ ID No:29+SEQ ID No:77、SEQ ID No:29+SEQ IDNo:78、SEQ ID No:30+SEQ ID No:86、SEQ ID No:36+SEQ ID No:81、SEQ ID No:45+SEQ IDNo:81、SEQ ID No:45+SEQ ID No:86、SEQ ID No:45+SEQ ID No:100、SEQ ID No:45+SEQID No:110、SEQ ID No:45+SEQ ID No:113、SEQ ID No:45+SEQ ID No:125、SEQ ID No:46+SEQ ID No:80、SEQ ID No:46+SEQ ID No:93、SEQ ID No:46+SEQ ID No:109、SEQ ID No:46+SEQ ID No:110、SEQ ID No:46+SEQ ID No:113、SEQ ID No:46+SEQ ID No:125、SEQ IDNo:46+SEQ ID No:127、SEQ ID No:46+SEQ ID No:78、SEQ ID No:48+SEQ ID No:93、SEQID No:49+SEQ ID No:94、SEQ ID No:61+SEQ ID No:127、SEQ ID No:62+SEQ ID No:113、SEQ ID No:68+SEQ ID No:125、SEQ ID No:69+SEQ ID No:112、SEQ ID No:70+SEQ ID No:100、SEQ ID No:13+SEQ ID No:109或SEQ ID No:14+SEQ ID No:134。
3.根据权利要求1所述的获取方法，其特征在于，所述步骤2)中酶切连接用体系为：每20μl体系包括10×扩增缓冲液2.0μl，植物组织基因组DNA 4.0μl，EcoRI 0.25μL，HpaII0.4μL或MspI 0.4μL，EcoRI接头0.5μL，同裂酶接头0.5μL，T4连接酶0.5μL，ddH2O 11.85μL。
4.根据权利要求1所述的获取方法，其特征在于，所述步骤3)中预扩增用体系为：每50μL体系包括稀释100倍的所述连接产物5μL，EcoRI预扩增引物2.5μL，同裂酶预扩增引物2.5μL，10×扩增缓冲液5μL，Taq DNA聚合酶1μL，dNTPs 0.5μL，ddH2O 33.5μL；
所述预扩增的程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸80s，30～35个循环，72℃延伸5min。
5.根据权利要求1所述的获取方法，其特征在于，所述步骤4)中扩增用体系为：每20μL扩增体系包括稀释100倍的所述PCR预扩增产物4μL，同裂酶引物2μL，EcoRI引物2μL，TaqDNA聚合酶1μL，dNTPs 0.5μL，10×扩增缓冲液2.5μL，ddH2O 8μL。
6.根据权利要求1或5所述的获取方法，其特征在于，所述步骤4)扩增的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，13个循环，每个循环退火温度降0.7℃；
所述13个循环后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸80s，23～25个循环，72℃延伸5min。
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2017
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