CN106967806A - 一种利用msap方法鉴别樱桃矮化砧木的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于马哈利矮化植株技术领域，公开了一种利用MSAP方法鉴别樱桃矮化砧木的方法，利用MSAP对25株矮化马哈利樱桃和25株半矮化马哈利樱桃进行甲基化水平和模式分析；从64对引物中筛选出15对重复性好、条带清晰的引物，在半矮化组中共扩增4577个条带，其中半甲基化336个，全甲基化1274个，在矮化组中共扩增4444个条带，其中半甲基化349个，全甲基化1383个；半矮化组单态性位点23个，多态性位点136个，矮化组单态性位点17个，多态性位点142个。矮化组的甲基化水平和多态性均高于半矮化组，进而可以推测马哈利砧木的矮化很可能和甲基化有关，为马哈利矮化植株的进一步选育提供理论支撑。

Description

一种利用MSAP方法鉴别樱桃矮化砧木的方法
技术领域
本发明属于马哈利矮化植株技术领域，尤其涉及一种利用MSAP方法鉴别樱桃矮化砧木的方法。
背景技术
DNA甲基化是一种表观遗传现象，是高等植物普遍存在的一种DNA共价修饰方式，甲基化并不改变DNA的碱基排列顺序，但是可以抑制遗传信息的传递，从而引起表观性状的变化，它可以遗传，也可以通过去甲基化酶等作用发生去甲基化逆转。DNA甲基化的状态对染色体结构、转座子活性以及基因的表达调控等至关重要，甲基化状态的改变可以造成某些基因功能的丧失或发生亚功能化，Miura等研究发现，DNA甲基化水平降低可以导致具亚稳态矮化表型的水稻向正常表型转变，林如涛等研究发现，从江香猪血液和肝脏基因组的总甲基化程度随体重的增加而下降，刘琼瑶等发现矮生观赏杉木中参与MAPK级联途径的蛋白磷酸酶IBR5基因启动子区域的甲基化水平上升，这些研究均表明甲基化与生物体的矮化有关。目前植物DNA甲基化的研究方法很多，如HPLC、RRBS、MSAP、COBRA、和RLGS等，而MSAP技术不需要知道被测DNA的序列信息，在不同生物上具有通用性，并且MSAP技术可以检测植物不同品系的DNA甲基化差异，对马哈利的现有研究，多集中在砧穗互作、生长动态、激素处理等生理研究方面，生理研究表明植株在一定条件下可实现早果，但不能解决植株矮化的问题。Masoud用SRAP分子标记、PEDRO用RAPD分子标记等研究均发现马哈利种群内基因多态性丰富，但马哈利的变异及其多样性，在砧木繁育中，还没有充分利用。
综上所述，现有技术存在的问题是：目前植物DNA甲基化的研究方法很多，如HPLC、RRBS、MSAP、COBRA、和RLGS等，而MSAP技术不需要知道被测DNA的序列信息，在不同生物上具有通用性，并且MSAP技术可以检测植物不同品系的DNA甲基化差异。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用MSAP方法鉴别樱桃矮化砧木的方法。
本发明是这样实现的，一种鉴别樱桃矮化砧木的引物，所述鉴别樱桃矮化砧木的引物为15对；序列为：SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：15。
进一步，所述鉴别樱桃矮化砧木的引物还包括：接头引物SEQ ID NO：16；预扩引物；SEQ ID NO：17；选择性引物SEQ ID NO：18。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述鉴别樱桃矮化砧木的引物的利用MSAP方法鉴别樱桃矮化砧木的方法，所述利用MSAP方法鉴别樱桃矮化砧木的方法包括以下步骤：
步骤一，采用改良CTAB法提取DNA，DNA样品纯度和浓度用nano-drop检测后，1％琼脂糖凝胶电泳；
步骤二，MSAP分析，25μL酶切体系，37℃酶切6h，80℃灭活15min；30μL连接体系，16℃连接16h，80℃灭活15min；20μL预扩增体系，94℃30S，56℃30S，72℃80S，扩增30个循环，最后72℃延伸8min。产物于2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果；20μL选择性扩增体系，第一轮扩增参数：94℃30S，65℃30S，72℃80S，以后每轮循环温度-0.7℃，扩增12轮；再按下列参数扩增28轮：94℃30S，55℃30S，72℃80S，最后72℃延伸8min；
步骤三，MSAP条带统计及数据分析，从64对引物中筛选条带清晰、重复性及特异性良好的15对引物进行扩增，产物经6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，统计范围为150bp-500bp，计算甲基化频率，并对统计结果利用SPSS进行t测验和单因素方差分析做差异性显著检验。
进一步，所述产物经6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将扩增出的条带分为3种，第一种为半甲基化型，记为(+，-)，即EcoRⅠ+HpaⅡ酶切后扩增有带，而EcoRⅠ+MspⅠ酶切后扩增无带，指5'-CmCGG-3'位点为外侧胞嘧啶甲基化；第二种为全甲基化型，记为(-，+)，即EcoRⅠ+MspⅠ酶切后扩增有带，而EcoRⅠ+HpaⅡ酶切后扩增无带，指5'-mCCGG-3'位点为内侧胞嘧啶甲基化；第三种为非甲基化位点或内侧胞嘧啶单链甲基化，记为(+，+)，即EcoRⅠ+MspⅠ和EcoRⅠ+HpaⅡ酶切后扩增都有带。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述鉴别樱桃矮化砧木的引物鉴定的樱桃矮化砧木。
本发明的优点及积极效果为：利用MSAP技术对25株矮化马哈利樱桃和25株半矮化马哈利樱桃进行甲基化水平和模式分析；从64对引物中筛选出15对重复性好、条带清晰的引物，在半矮化组中共扩增4577个条带，其中半甲基化336个，全甲基化1274个，在矮化组中共扩增4444个条带，其中半甲基化349个，全甲基化1383个；半矮化组单态性位点23个，多态性位点136个，矮化组单态性位点17个，多态性位点142个。由此得出结论，矮化组的甲基化水平和多态性均高于半矮化组，进而可以推测马哈利砧木的矮化和甲基化有关，为马哈利矮化植株的进一步选育提供理论支撑。本发明通过从马哈利CDR-1自然状态下自交后代中选择较矮化的植株，并与马哈利CDR-1作对比，借助MSAP技术检测它们的甲基化多态性，分析它们的甲基化水平和模式，进而推测其矮化的表观性状与其基因组甲基化修饰的关系。本发明采用此方法对矮化组和半矮化组马哈利樱桃进行甲基化检测。MSAP是以AFLP为基础的进行酶切位点的甲基化分析，分别用EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ两组内切酶酶切基因组DNA，检测其甲基化修饰水平。西北农林科技大学于1991年从匈牙利引进马哈利樱桃，历经十年从中选出矮化紧凑的优系，培育出了半矮化、高抗根癌病、抗寒、耐盐碱的马哈利CDR-1，在我国的西北地区种植推广。
附图说明
图1是本发明实施例提供的利用MSAP方法鉴别樱桃矮化砧木的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的引物对E+AAG和H+TCA在矮化组(25个样本)的MSAP扩增图谱示意图；
图中：从左到右，依次为1号个体的H泳道、M泳道，2号H泳道、M泳道，一直到25号H泳道、M泳道。
图3是本发明实施例提供的引物对E+AAG和H+TCA在半矮化组25个样本中的MSAP扩增图谱示意图；
图中：从左到右，依次为1号个体的H泳道、M泳道，2号H泳道、M泳道，到25号H、M。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例提供的鉴别樱桃矮化砧木的引物为15对SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：15。如表2所示。
本发明实施例提供的鉴别樱桃矮化砧木的引物还包括：接头引物SEQ ID NO：16；预扩引物；SEQ ID NO：17；选择性引物SEQ ID NO：18。如表1所示。
如图1所示，本发明实施例提供的利用MSAP方法鉴别樱桃矮化砧木的方法包括以下步骤：
S101：采用改良CTAB法提取DNA，DNA样品纯度和浓度用nano-drop检测后，1％琼脂糖凝胶电泳；
S102：MSAP分析，25μL酶切体系，37℃酶切6h，80℃灭活15min；30μL连接体系，16℃连接16h，80℃灭活15min；20μL预扩增体系，94℃30S，56℃30S，72℃80S，扩增30个循环，最后72℃延伸8min。产物于2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果；20μL选择性扩增体系，第一轮扩增参数：94℃30S，65℃30S，72℃80S，以后每轮循环温度-0.7℃，扩增12轮；再按下列参数扩增28轮：94℃30S，55℃30S，72℃80S，最后72℃延伸8min；
S103：MSAP条带统计及数据分析，从64对引物中筛选条带清晰、重复性及特异性良好的15对引物进行扩增，产物经6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，统计范围为150bp-500bp，计算甲基化频率，并对统计结果利用SPSS进行t测验和单因素方差分析做差异性显著检验。
下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。
1材料与方法
1.1材料
所用马哈利砧木均来自于西北农林科技大学樱桃试验站岐山苗圃。2014年12月，在马哈利一年生砧木(种子为马哈利CDR-1的自然授粉种)落叶后，按照节间密度较密、主干顶部直径与基部直径比约1:2、分叉较少或几乎不分叉、植株高度较矮等条件，筛选一批矮化砧木，经2015年和2016年再次选择确定矮化特征后，对矮化趋势明显的25棵植株，采集叶片，记为矮化组，同时选择马哈利CDR-1普通高度植株25株，采集叶片，记为半矮化组。
1.2DNA的提取
采用改良CTAB法提取DNA，DNA样品纯度和浓度用nano-drop检测后，1％琼脂糖凝胶电泳。
1.3MSAP分析
MSAP分析程序使用Xiong等的方法并适当调改，接头及引物参照Evangellia等。
1.3.1 25μL酶切体系
37℃酶切6h，80℃灭活15min。
1.3.2 30μL连接体系
16℃连接16h，80℃灭活15min。
1.3.3 20μL预扩增体系
94℃30S，56℃30S，72℃80S，扩增30个循环，最后72℃延伸8min。产物于2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。
1.3.4 20μL选择性扩增体系
第一轮扩增参数：94℃30S，65℃30S，72℃80S，以后每轮循环温度-0.7℃，扩增12轮；再按下列参数扩增28轮：94℃30S，55℃30S，72℃80S，最后72℃延伸8min。
1.4MSAP条带统计及数据分析
从64对引物中筛选条带清晰、重复性及特异性良好的15对引物进行扩增，产物经6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(图2，图3)，将扩增出的条带分为3种，第一种为半甲基化型，记为(+，-)，即EcoRⅠ+HpaⅡ酶切后扩增有带，而EcoRⅠ+MspⅠ酶切后扩增无带，指5'-CmCGG-3'位点为外侧胞嘧啶(单链)甲基化；第二种为全甲基化型，记为(-，+)，即EcoRⅠ+MspⅠ酶切后扩增有带，而EcoRⅠ+HpaⅡ酶切后扩增无带，指5'-mCCGG-3'位点为内侧胞嘧啶(双链)甲基化；第三种为非甲基化位点或内侧胞嘧啶单链甲基化，记为(+，+)，即
EcoRⅠ+MspⅠ和EcoRⅠ+HpaⅡ酶切后扩增都有带。统计范围为150bp-500bp，计算甲基化频率，并对统计结果利用SPSS进行t测验和单因素方差分析做差异性显著检验。
2结果与分析
2.1 DNA甲基化水平分析与比较
2.1.1 DNA甲基化水平分析
25份矮化马哈利砧木及25份半矮化马哈利砧木扩增条带统计结果见表2，15对引物25株个体，矮化组共检测到4444个位点，半甲基化位点349个，全甲基化位点1383个，平均每个体检测到178个位点，半甲基化位点14个，全甲基化位点55个，半甲基化率7.85％，全甲基化率31.12％，半矮化组共检测到4577个位点，半甲基化位点336个，全甲基化位点1274个，平均每个体检测到183个位点，半甲基化位点13个，全甲基化位点51个，半甲基化率7.33％，全甲基化率27.83％，因此可以推测马哈利砧木基因组“CCGG”位点双链内侧甲基化水平比单链外侧甲基化水平高，基因组“CCGG”位点甲基化的主要方式为双链内侧的全甲基化。
2.1.2 DNA甲基化水平差异分析
t测验结果表明，矮化组与半矮化组在全甲基化水平和总甲基化水平上差异极显著，在半甲基化水平上差异达到显著水平而未达极显著水平，由此可知，矮化的马哈利基因组的甲基化水平相比半矮化马哈利高，尤其在全甲基化水平和总甲基化水平上变异率高。
为了进一步明确区分组内差异和组间差异，在t测验的基础上，又进一步做了单因素方差分析，在全甲基化水平上，F测验和t测验结果一致，均差异极显著，组间均方135.3，组内均方0.46，证明差异显著性主要来自组间；在总甲基化水平上，F测验和t测验结果一致，均差异极显著，组间均方180.9，组内均方1.3，表明差异显著性主要来自组间；在半甲基化水平上，F测验和t测验结果一致，均差异显著，组间均方3.3，组内均方0.6，表明差异显著性主要来自组间。据此可得出结论，矮化组与半矮化组马哈利基因组的甲基化水平的确存在显著差异。
2.2 DNA甲基化模式及多态性分析
2.2.1 DNA甲基化多态性分析
同一位点在不同个体基因组中甲基化模式可分为两大类，单态性和多态性。单态性是指甲基化模式在不同个体中保持一致，多态性即一个样品在甲基化模式上不同于另一个样品，表明CCGG位点甲基化状态在不同个体植株中表现不同，由表3可知，马哈利半矮化组基因组甲基化多态性位点占扩增总位点的85.53％，单态性位点占14.47％，马哈利矮化组基因组多态性位点占扩增总位点的89.31％，单态性位点占10.69％，从而可以得出推论：在MSAP所能检测到的有效位点范围内，马哈利砧木基因组甲基化多态性位点远多于单态性位点，且矮化组多态性位点高于半矮化组。
在25株马哈利矮化砧木及25株半矮化马哈利砧木中，共扩增出现7种多态性类型(表3、表4)，多态性类型主要是A3(++、--)、A4(++、-+、--)、C1(-+、--)三种，(++、--)类型说明同一位点的非甲基化位点可以在某些个体中发生内外侧同时甲基化或外侧双链甲基化，(++、-+、--)类型说明同一位点的非甲基化位点可以在某些个体中发生单链外侧甲基化或内外侧同时甲基化或外侧双链甲基化，(-+、--)类型说明同一位点的单链外侧甲基化位点可以在某些个体中发生内外侧同时甲基化或外侧双链甲基化。可推测，马哈利基因组甲基化多态性位点主要发生在非甲基化位点与双链内侧全甲基化位点上，还有双链内侧全甲基化位点与内外侧同时甲基化位点上。
2.2.2 DNA甲基化多态性类型比较分析
两组之间的甲基化多态性主要差异类型是A2(++、-+)、A3(++、--)、A4(++、-+、--)，矮化组A2(++、-+)、A4(++、-+、--)类型较正常组高，A3(++、--)类型较正常组低，可以推出矮化组同一位点的非甲基化位点在某些个体中发生单链外侧甲基化的概率高于正常组，发生内外侧同时甲基化或外侧双链甲基化概率较正常组低。
表1接头及引物序列
表2
表3马哈利基因组甲基化类型统计
表4甲基化多态性类型统计
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110>西北农林科技大学
<120> 一种利用MSAP方法鉴别樱桃矮化砧木的方法
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<400> 核苷酸序列
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<212> DNA
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<400> 核苷酸序列
E+AAG GACTGCGTACCAATTCAAG
H/M+TGA ATGAGTCTCGATCGGTGA
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H/M+TGA ATGAGTCTCGATCGGTGA
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5'-AATTGGTACGCAGTC-3' 5'-CGATCGAGACTCAT -3'
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<212> DNA
<213>人工序列
<400> 核苷酸序列
5'-GACTGCGTACCAATTCA-3'
5'-ATGAGTCTCGATCGG -3'
<210> 18
<211> 316
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 核苷酸序列
E+AAC 5'-GACTGCGTACCAATTCAAC-3' H/M+TCA 5'-ATGAGTCTCGATCGGTCA-3'
E+AAG 5'-GACTGCGTACCAATTCAAG-3' H/M+TCT 5'-ATGAGTCTCGATCGGTCT-3'
E+ACC 5'-GACTGCGTACCAATTCACC-3' H/M+TTA 5'-ATGAGTCTCGATCGGTTA-3'
E+ATC 5'-GACTGCGTACCAATTCATC-3' H/M+TTC 5'-ATGAGTCTCGATCGGTTC-3'
E+AGA 5'-GACTGCGTACCAATTCAGA-3' H/M+TTG 5'-ATGAGTCTCGATCGGTTG-3'
E+AGG 5'-GACTGCGTACCAATTCAGG-3' H/M+TGC 5'-ATGAGTCTCGATCGGTGC-3'
E+ATG 5'-GACTGCGTACCAATTCATG-3' H/M+TGA 5'-ATGAGTCTCGATCGGTGA-3'
E+ACG 5'-GACTGCGTACCAATTCACG-3' H/M+ATC 5'-ATGAGTCTCGATCGGATC-3'

Claims (5)

1.一种鉴别樱桃矮化砧木的引物，其特征在于，所述鉴别樱桃矮化砧木的引物为15对；序列为：SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：15。
2.如权利要求1所述的鉴别樱桃矮化砧木的引物，其特征在于，所述鉴别樱桃矮化砧木的引物还包括：接头引物SEQ ID NO：16；预扩引物；SEQ ID NO：17；选择性引物SEQ ID NO：18。
3.一种利用权利要求1或2任意一项所述鉴别樱桃矮化砧木的引物的利用MSAP方法鉴别樱桃矮化砧木的方法，其特征在于，所述利用MSAP方法鉴别樱桃矮化砧木的方法包括以下步骤：
步骤一，采用改良CTAB法提取DNA，DNA样品纯度和浓度用nano-drop检测后，1％琼脂糖凝胶电泳；
步骤二，MSAP分析，25μL酶切体系，37℃酶切6h，80℃灭活15min；30μL连接体系，16℃连接16h，80℃灭活15min；20μL预扩增体系，94℃30S，56℃30S，72℃80S，扩增30个循环，最后72℃延伸8min；产物于2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果；20μL选择性扩增体系，第一轮扩增参数：94℃30S，65℃30S，72℃80S，以后每轮循环温度-0.7℃，扩增12轮；再按下列参数扩增28轮：94℃30S，55℃30S，72℃80S，最后72℃延伸8min；
步骤三，MSAP条带统计及数据分析，从64对引物中筛选条带清晰、重复性及特异性良好的15对引物进行扩增，产物经6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，统计范围为150bp-500bp，计算甲基化频率，并对统计结果利用SPSS进行t测验和单因素方差分析做差异性显著检验。
4.如权利要求3所述的利用MSAP方法鉴别樱桃矮化砧木的方法，其特征在于，所述产物经6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将扩增出的条带分为3种，第一种为半甲基化型，记为(+，-)，即EcoR Ⅰ+Hpa Ⅱ酶切后扩增有带，而EcoR Ⅰ+Msp Ⅰ酶切后扩增无带，指5'-CmCGG-3'位点为外侧胞嘧啶甲基化；第二种为全甲基化型，记为(-，+)，即EcoR Ⅰ+Msp Ⅰ酶切后扩增有带，而EcoR Ⅰ+Hpa Ⅱ酶切后扩增无带，指5'-mCCGG-3'位点为内侧胞嘧啶甲基化；第三种为非甲基化位点或内侧胞嘧啶单链甲基化，记为(+，+)，即EcoR Ⅰ+Msp Ⅰ和EcoR Ⅰ+HpaⅡ酶切后扩增都有带。
5.一种利用权利要求1～2任意一项所述鉴别樱桃矮化砧木的引物鉴定的樱桃矮化砧木。
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