CN104288841A - 一种具有弹性的多孔壳聚糖海绵的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有弹性的多孔壳聚糖海绵的制备方法，包括以下步骤：将脂肪醛溶于无水乙醇中，配成交联剂溶液，然后把空白壳聚糖海绵浸泡在交联剂溶液中，交联反应后取出壳聚糖海绵，用无水乙醇反复清洗数次，将表面残余的交联剂清洗干净，室温下自然风干，即得到具有弹性的多孔壳聚糖海绵。本发明方法具有如下的有益结果：避免了泡碱后壳聚糖海绵发生塌陷、体积缩小的缺点，同时也避免产生大量的废水污染；保证了海绵在人体内的生物安全性；本发明方法提供的多孔壳聚糖海绵具有弹性，这种特性使其在组织工程多孔支架领域具有广阔应用前景。

Description

一种具有弹性的多孔壳聚糖海绵的制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有弹性的多孔壳聚糖海绵的制备方法，属于生物医用材料、组织工程材料制备技术领域。 

背景技术

壳聚糖(chitosan)是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰化作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。自1859年，法国人Rouget首先得到壳聚糖后，这种天然高分子材料的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、生物降解性等优良性能被各行各业广泛关注，在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用研究取得了重大进展，特别是在组织工程多孔支架材料领域也得到了广泛的应用。理想的支架材料应当具有以下特征：(1)有良好的生物相容性，无明显炎症反应、免疫反应和细胞毒性。(2)材料与组织细胞间有良好的界面关系，有利于细胞的黏附、铺展和繁殖等功能。(3)材料便于加工成为在分子水平、宏观水平上理想的二维、三维空间结构，在移植后能保持原来的形态，且具有生物可降解性和适宜的降解速率，即在体外以及植入体内后的降解和吸收速度与细胞组织生长的速度相匹配。(4)材料可为生长因子的储存和释放及细胞的锚定提供适当的三维位点。(5)具有组织器官所要求的生物力学强度，材料不会在患者活动中塌陷、撕裂、破溃。壳聚糖可生物降解、生物相容性好、无刺激性、无免疫原性、无热原反应、具有抗菌活性及无毒副作用，成本低廉，且冻干法制备的壳聚糖海绵具有一定的生物力学强度，是制备组织工程多孔支架材料的良好的生物高分子材料。 

通过冷冻干燥法制备而成的壳聚糖水凝胶或海绵，广泛的应用于医用敷料和组织工程领域中。传统的壳聚糖海绵需经历二次冷冻干燥过程，这主要是因为壳聚糖在第一次冷冻干燥后还残留稀醋酸溶剂，需要用碱液中和后进行第二次冷冻干燥，否则得到的壳聚糖海绵在水中会部分溶解。但泡碱后壳聚糖海绵容易发生塌陷，体积缩小，影响了壳聚糖海绵的多孔性，且这种海绵不具有弹性。如中国专利CN101979104A报道了一种多孔壳聚糖海绵支架，制作方法是将壳聚糖醋酸溶液预冻后进行冷冻干燥，再加入碱液NaOH做水化处理，然后进行第二次冷冻干燥得到多孔壳聚糖海绵。进行NaOH水化处理不仅会对环境造成污染，还会导致壳聚糖海绵发生塌陷，体积缩小，影响其多孔性。 

为了提高壳聚糖海绵的多孔性，有文献采用在壳聚糖溶液中直接添加交联剂的方法。如Mao等(Chinese Journal Biomedical Engineering,2001,10(2):66-69)用戊二醛交联壳聚糖和明胶的酸性水溶液得到壳聚糖-明胶复合聚合物水凝胶，利用其中的水作为致孔剂，通过控制预 冻过程的传热模式制备出多孔海绵支架。该方法在制备过程中加入了有毒性的戊二醛作交联剂，因此这种多孔支架在临床应用上受到了限制。中国专利CN102504328A报道了一种以壳聚糖为原料，正戊醇和水作为致孔剂，戊二醛作交联剂，采用微波炉对其进行微波辐射处理，利用微波辐射产生热效应使壳聚糖多孔支架发生交联，最终得到壳聚糖多孔支架。其制备过程较繁琐，同时也加入了有毒性的戊二醛作交联剂。C.Wischke等(Journal of Materials Chemistry B,2014,21(2):3315-3323)在制作壳聚糖海绵支架时加入了3％的京尼平作为交联剂，通过二次冷冻干燥方法制备了在水合作用下具有形状记忆功能的壳聚糖海绵支架。该方法所选用的交联剂京尼平价格昂贵，所得到的样品只有在水合作用下才具有形状恢复的功能，应用较窄。到目前为止，还未见有关于具有弹性的多孔壳聚糖海绵的报道。 

发明内容

本发明的主要目的是解决目前壳聚糖海绵不具有弹性的技术难题，提供一种具有弹性的多孔壳聚糖海绵的制备方法。 

本发明解决上述技术问题采用如下技术方案：一种具有弹性的多孔壳聚糖海绵的制备方法，包括以下步骤：将脂肪醛溶于无水乙醇中，配成0.015～0.2mol/L的交联剂溶液，然后把空白壳聚糖海绵浸泡在交联剂溶液中，交联反应后取出壳聚糖海绵，用无水乙醇反复清洗数次，将表面残余的交联剂清洗干净，室温下自然风干，即得到具有弹性的多孔壳聚糖海绵。 

按上述方案，空白壳聚糖海绵的制备方法：将壳聚糖粉末溶解在1％(v/v)的醋酸溶液中，制备得到1.0％～3.0％(w/v)的壳聚糖醋酸溶液(即每100mL浓度为1％的醋酸溶液中，溶解有1.0～3.0g的壳聚糖)，然后倒入模具中，进行预冷冻、冷冻干燥即得空白的壳聚糖海绵。 

按上述方案，所述的壳聚糖粉末脱乙酰度为70％～100％，粘度为100～200cp·s。 

按上述方案，所述的脂肪醛为十二醛、十四醛、十六醛和十八醛中的任意一种。 

按上述方案，所述的交联反应条件是在60～80℃下浸泡4～18h。 

按上述方案，所述预冷冻的温度为-18℃以下；冷冻干燥机的参数为：冷阱温度<-52℃，真空度<10Pa，冻干时间为16～24h。 

本发明的机理是：壳聚糖大分子链上分布着许多羟基、氨基，它们会形成各种分子内和分子间的氢键，正是因为这些氢键的存在，才形成了壳聚糖大分子的二级结构。壳聚糖的三级结构就是指重复顺序的一级结构和非共价相互作用造成的有序的二级结构导致空间有规则的形成了三维网状结构。本发明旨在向壳聚糖中添加无毒副作用的直链饱和脂肪醛类交联剂，通过醛基与壳聚糖分子中的氨基发生希夫碱反应，在壳聚糖链上引入直链烷烃，削弱壳聚糖的分子间氢键，增加壳聚糖分子链的间距，改变了原有单纯壳聚糖的三维网状结构，从而使 得壳聚糖海绵孔隙率增加，且具有弹性。本发明方法中壳聚糖与直链饱和脂肪醛的交联反应方程式如下式所示： 

本发明方法具有如下的有益结果： 

(1)本发明方法免除了传统制备工艺的泡碱步骤，保持了壳聚糖海绵一次冻干后原有的体积与疏松多孔的形貌，避免了泡碱后壳聚糖海绵发生塌陷、体积缩小的缺点，同时也避免产生大量的废水污染； 

(2)本发明方法采用的交联剂为无毒的食品添加剂脂肪醛类，且使用浓度较低，保证了海绵在人体内的生物安全性； 

(3)本发明方法提供的多孔壳聚糖海绵具有弹性，这种特性使其在组织工程多孔支架领域具有广阔应用前景。 

附图说明

图1为通过扫描电子显微镜(SEM)观察实施例1所得样品的微观结构； 

图2为实施例1所得样品与传统冻干的壳聚糖海绵的弹性测试对比图。 

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步描述。应理解，本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书限定的范围内。 

实施例1：具有弹性的多孔壳聚糖海绵的制备 

称取1.0g壳聚糖粉末，其中壳聚糖的脱乙酰度为98％，粘度为100cp·s。将壳聚糖溶于50mL1％(v/v)醋酸中，配制得到2.0％(w/v)的壳聚糖溶液。然后将其倒在十二孔培养板中，于-20℃冰箱中进行预冷冻。将冻结后的壳聚糖溶液放置于真空冷冻干燥机中冻干24h，其中冷冻干燥机的参数为：冷阱温度<-52℃，真空度<10Pa。 

用移液枪移取700μL的十二醛，溶解在30mL无水乙醇中，超声至十二醛完全溶解，得到0.2mol/L澄清透明的交联剂溶液。将空白壳聚糖海绵从十二孔培养板中取出，放入交联剂溶液中浸泡，浸泡温度为70℃，浸泡时间为8h。反应完后将壳聚糖海绵从交联剂溶液中取出，用无水乙醇清洗数次，将壳聚糖海绵上残余的交联剂清洗掉。然后将清洗后的海绵在室 温下自然风干，即获得一种具有弹性的多孔壳聚糖海绵。 

图1是通过扫描电子显微镜(SEM，HitachiS-4800)对本实施例制备得到的壳聚糖海绵进行表征，其表面微观结构如图1所示。由图可见，在放大倍为90倍的视野下，经十二醛改性的壳聚糖海绵呈疏松多孔的结构。 

实施例2：具有弹性的多孔壳聚糖海绵的制备 

称取0.5g壳聚糖，其中壳聚糖的脱乙酰度为98％，粘度为200cp·s。将壳聚糖溶于50mL1％(v/v)醋酸中，配制得到1.0％(w/v)的壳聚糖溶液。然后将其倒在十二孔培养板中，于-20℃冰箱中进行预冷冻。将冻结后的壳聚糖溶液放置于真空冷冻干燥机中冻干18h，其中冷冻干燥机的参数为：冷阱温度<-52℃，真空度<10Pa。 

用移液枪移取400μL的十四醛，溶解在30mL无水乙醇中，超声至十四醛完全溶解，得到0.07mol/L澄清透明的交联剂溶液。将空白壳聚糖海绵从十二孔培养板中取出，放入交联剂溶液中浸泡，浸泡温度为75℃，浸泡时间为6h。反应完后将壳聚糖海绵从交联剂溶液中取出，用无水乙醇清洗数次，将壳聚糖海绵上残余的交联剂清洗掉。然后将清洗后的海绵在室温下自然风干，即获得一种具有弹性的多孔壳聚糖海绵。 

实施例3：具有弹性的多孔壳聚糖海绵的制备 

称取1g壳聚糖，其中壳聚糖的脱乙酰度为70％，粘度为150cp·s。将壳聚糖溶于50mL1％(v/v)醋酸中，配制得到2.0％(w/v)的壳聚糖溶液。然后将其倒在十二孔培养板中，于-18℃冰箱中进行预冷冻。将冻结后的壳聚糖溶液放置于真空冷冻干燥机中冻干20h，其中冷冻干燥机的参数为：冷阱温度<-52℃，真空度<10Pa。 

用移液枪移取300μL的十八醛，溶解在30mL无水乙醇中，超声至十八醛完全溶解，得到0.04mol/L澄清透明的交联剂溶液。将空白壳聚糖海绵从十二孔培养板中取出，放入交联剂溶液中浸泡，浸泡温度为60℃，浸泡时间为18h。反应完后将壳聚糖海绵从交联剂溶液中取出，用无水乙醇清洗数次，将壳聚糖海绵上残余的交联剂清洗掉。然后将清洗后的海绵在室温下自然风干，即获得一种具有弹性的多孔壳聚糖海绵。 

实施例4：具有弹性的多孔壳聚糖海绵的制备 

称取1.5g壳聚糖，其中壳聚糖的脱乙酰度为70％，粘度为150cp·s。将壳聚糖溶于50mL1％(v/v)醋酸中，配制得到3.0％(w/v)的壳聚糖溶液，然后将其倒在十二孔培养板中，于-18℃冰箱中预冷冻。将冻结后的壳聚糖溶液放置于真空冷冻干燥机中冻干22h，其中冷冻干燥机的参数为：冷阱温度<-52℃，真空度<10Pa。 

用移液枪移取100μL的十二醛，溶解在30mL无水乙醇中，超声至十二醛完全溶解，得 到0.015mol/L澄清透明的交联剂溶液。将空白壳聚糖海绵从十二孔培养板中取出，放入交联剂溶液中浸泡，浸泡温度为80℃，浸泡时间为4h。反应完后将壳聚糖海绵从交联剂溶液中取出，用无水乙醇清洗数次，将壳聚糖海绵上残余的交联剂清洗掉。然后将清洗后的海绵在室温下自然风干，即获得一种具有弹性的多孔壳聚糖海绵。 

实施例5：多孔壳聚糖海绵的弹性测试试验 

为了证明本发明产品具有弹性性能，我们将实施例1与传统二次冷冻干燥得到的壳聚糖海绵进行对比。传统二次冷冻干燥的壳聚糖海绵的制备方法为：称取1.0g壳聚糖，其中壳聚糖的脱乙酰度为98％，粘度为100cp·s。把壳聚糖溶于50mL1％(v/v)醋酸中，配制得到2.0％(w/v)的壳聚糖溶液，然后将其倒在十二孔培养板中，于-20℃冰箱中预冷冻。将冻结的壳聚糖溶液放置于真空冷冻干燥机中24h，其中冷冻干燥机的参数为：冷阱温度<-52℃，真空度<10Pa。完全冻干后用1.5mol/L的氨水浸泡4h，再反复用去离子水清洗，直至样品呈中性，将洗至中性的壳聚糖海绵再放置于真空冷冻干燥机中冻干12h，得到传统冻干的壳聚糖海绵。 

分别取实施例1中制得的样品与传统冻干的壳聚糖海绵进行弹性测试。测试方法如下：分别给以上两组样品施加一个等值恒量的外加力，使壳聚糖海绵发生明显的形变，一段时间后撤掉外力，观察样品回复至原来体积的情况。从图中可以看出，实施例1所得的壳聚糖海绵在被挤压后可以马上自行回复到原来的体积大小，如图2(c)/图2(d)所示，且在经过100次的挤压循环后体积也无明显变化，而传统冻干的壳聚糖海绵在一次挤压后就无法恢复原来的体积，发生了明显的塌陷和收缩。 

Claims (6)

1.一种具有弹性的多孔壳聚糖海绵的制备方法，包括以下步骤：将脂肪醛溶于无水乙醇中，配成0.015～0.2mol/L的交联剂溶液，然后把空白壳聚糖海绵浸泡在交联剂溶液中，交联反应后取出壳聚糖海绵，用无水乙醇反复清洗数次，将表面残余的交联剂清洗干净，室温下自然风干，即得到具有弹性的多孔壳聚糖海绵。

2.根据权利要求1所述的具有弹性的多孔壳聚糖海绵的制备方法，其特征在于，空白壳聚糖海绵的制备方法：将壳聚糖粉末溶解在1％(v/v)的醋酸溶液中，制备得到1.0％～3.0％(w/v)的壳聚糖醋酸溶液，然后倒入模具中，进行预冷冻、冷冻干燥即得空白的壳聚糖海绵。

3.根据权利要求2所述的具有弹性的多孔壳聚糖海绵的制备方法，其特征在于，所述的壳聚糖粉末脱乙酰度为70％～100％，粘度为100～200cp·s。

4.根据权利要求1所述的具有弹性的多孔壳聚糖海绵的制备方法，其特征在于，所述的脂肪醛为十二醛、十四醛、十六醛和十八醛中的任意一种。

5.根据权利要求1所述的具有弹性的多孔壳聚糖海绵的制备方法，其特征在于，所述的交联反应条件是在60～80℃下浸泡4～18h。

6.根据权利要求1所述的具有弹性的多孔壳聚糖海绵的制备方法，其特征在于，所述预冷冻的温度为-18℃以下；冷冻干燥机的参数为：冷阱温度<-52℃，真空度<10Pa，冻干时间为16～24h。