CN104159909A - 产生用于癌症治疗的t细胞持续性群体的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供产生包括嵌合抗原受体(CAR)的基因修饰的T细胞的组合物和方法，所述嵌合抗原受体具有抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，其中T细胞在培养中显示延长的指数扩张，其是不依赖配体的和不依赖添加外源细胞因子或饲养细胞。

Description

产生用于癌症治疗的T细胞持续性群体的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年2月22日提交的美国临时申请系列号61/601,890的优先权，其内容以其全部通过引用被并入本文。

发明背景

通过遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CARs)的肿瘤特异的T淋巴细胞的产生正作为产生强大抗肿瘤效应的合成生物学的形式而获得动力(Jena et al.,2010,Blood.116:1035-1044；Bonini et al.,2011,Biol Blood Marrow Transplant 17(1 Suppl):S15-20；Restifo et al.,2012,Nat Rev Immunol 12:269-281；Kohn et al.,2011,Mol Ther19:432-438；Savoldo et al.,2011,J Clin Invest 121:1822-1825；Ertl et al.,2011,CancerRes 71:3175-3181)。因为特异性由抗体片段给予，所以CAR T细胞不是MHC限制的，并因此较基于需要MHC匹配的T细胞受体的方法更实用。

来自用CD19特异的CAR⁺T细胞治疗的患者的临床数据表明输入的T细胞的强大体内增殖是肿瘤免疫消融(immunoablation)的关键要求(Porter et al.,2011,NEngl J Med 365:725-733；Kalos et al.,2011,Sci Transl Med 3:95ra73)。因此，人们已作出努力将共刺激分子如CD28、OX40和4-1BB的信号传导内结构域(endodomains)并入CARs。1998年首次报道了表达能共同递送CD28共同刺激和T细胞受体/CD3ζ链(CD3ζ)活化信号的嵌合单链(scFv)受体的基因改造T细胞的应用增加了CAR T细胞的功能和增殖(Krause et al,1998,J Exp Med 188:619-626；Finney et al.,1998,Journal of Immunology 161:2791-2797)。许多实验室已证实与CD3ζ或FcεR1相比，CD28信号传导结构域的并入提高临床前研究中CARs的功能(Geiger et al.,2001,Blood 98:2364-2371；Arakawa et al.,2002,Anticancer Research4285-4289；Haynes et al.,2002,J Immunol 169(10):5780-6；Maher et al.,2002,NatureBiotechnology 20:70-75；Finney et al,2004,J Immunol 172:104-113；Gyobu et al.,2004,Cancer Res 64:1490-1495；Moeller et al.,2004,Cancer Gene Ther 11:371-379；Teng et al.,2004,Hum Gene Ther 15:699-708；Friedmann-Morvinski et al.,2005,Blood 105:3087-3093；Pule et al.,2005,Molecular Therapy 12:933-941；Westwood etal.,2005,Proc Natl Acad Sci USA 102:19051-19056；Willemsen et al.,2005,JImmunol 174:7853-7858；Kowolik et al,2006,Cancer Res 66:10995-11004；Loskog etal.,2006,Leukemia 20:1819-1828；Shibaguchi et al.,2006,Anticancer Res26:4067-4072；Brentjens et al.,2007,Clin Cancer Res 13:5426-5435；Teng et al.,2006,Human Gene Therapy 17:1134-1143)。在患有B细胞恶性肿瘤的患者的研究中，与只赋予CD3ζ信号传导结构域的CARs相比，CD28:CD3ζCARs已提高存活(Savoldoet al.,2011,J Clin Invest 121:1822-1825)。

然而，本领域仍然存在更好地改进允许广泛T细胞增殖的CARs构建的需要。本发明满足本领域中的该需要。

发明内容

本发明提供编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中CAR包括抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，并且另外其中当CAR转导进T细胞时，CAR对以下中的至少一个有贡献：转导的T细胞的不依赖抗原的活化增加、转导的T细胞的平均细胞体积(MCV)增加、转导的T细胞的细胞群体扩张增加、转导的T细胞的增殖增加、转导的T细胞的子代数目增加、效应器细胞因子分泌增加、粒酶的表达持续、转导的T细胞群体的体外持久性增加、或转导的T细胞群体的体内持久性增加。

在一个实施方式中，铰链结构域是IgG4铰链结构域。

在一个实施方式中，抗原结合结构域是抗cMet结合结构域，铰链结构域是IgG4，跨膜结构域是CD28跨膜结构域，和共刺激信号传导区是CD28信号传导区。在一个实施方式中，CAR包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在一个实施方式中，抗原结合结构域是抗间皮蛋白结合结构域，铰链结构域是IgG4铰链结构域，跨膜结构域是CD28跨膜结构域，和共刺激信号传导区是CD28信号传导区。在一个实施方式中，CAR包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

在一个实施方式中，抗原结合结构域是抗CD19结合结构域，铰链结构域是IgG4铰链结构域，跨膜结构域是CD28跨膜结构域，和共刺激信号传导区是CD28信号传导区。在一个实施方式中，CAR包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

在一个实施方式中，抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段。

本发明还提供包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列的T细胞，CAR包括抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，其中当CAR转导进T细胞时，CAR对以下中的至少一个有贡献：转导的T细胞的不依赖抗原的活化增加、转导的T细胞的平均细胞体积(MCV)增加、转导的T细胞的细胞群体扩张增加、转导的T细胞的增殖增加、效应器细胞因子分泌增加、粒酶的表达持续、转导的T细胞的子代数目增加、转导的T细胞群体的体外持久性增加、或转导的T细胞群体的体内持久性增加。

本发明还提供包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列的载体，CAR包括抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，其中当CAR转导进T细胞时，CAR对以下中的至少一个有贡献：转导的T细胞的不依赖抗原的活化增加、转导的T细胞的平均细胞体积(MCV)增加、转导的T细胞的细胞群体扩张增加、转导的T细胞的增殖增加、转导的T细胞的子代数目增加、转导的T细胞群体的体外持久性增加、或转导的T细胞群体的体内持久性增加。

本发明还提供基因修饰的T细胞的持续性群体，其中T细胞包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，CAR包括抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，其中当CAR转导进T细胞时，CAR对以下中的至少一个有贡献：转导的T细胞的不依赖抗原的活化增加、转导的T细胞的平均细胞体积(MCV)增加、转导的T细胞的细胞群体扩张增加、转导的T细胞的增殖增加、转导的T细胞的子代数目增加、转导的T细胞群体的体外持久性增加、或转导的T细胞群体的体内持久性增加。

在一个实施方式中，当抗原结合结构域结合其相应的抗原时，基因修饰的T细胞显示抗肿瘤免疫性。

在一个实施方式中，基因修饰的T细胞的持续性群体显示包括选自以下的至少一种细胞因子的细胞因子标签：IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B、穿孔蛋白和其任何组合。

在一个实施方式中，T细胞在缺少外源细胞因子或饲养细胞的情况下增殖。

附图说明

当与附图结合阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方式的以下详细描述。为了说明本发明的目的，在附图中显示了目前优选的实施方式。然而，应当理解本发明不限于附图显示的实施方式的精确布置和手段。

图1，包括图1A至1B，是描述嵌合抗原受体构建物和相对表达水平的一系列图。图1A显示描述多种scFv、铰链区、跨膜和细胞质结构域的CAR构建物的图示。除CART19 CAR外的所有CARs含有CD28和CD3ζ细胞内信号传导结构域，CART19 CAR含有4-1BB而不是CD28细胞内结构域。图1B显示慢病毒转导之后6天分析每个CAR构建物的表面表达(图1A)以定量相对表达水平。

图2，包括图2A至2D，是描述组成型、不依赖配体的CD4 CAR T细胞增殖的诱导的一系列图。图2A显示αCD3/CD28包被的磁性珠刺激和指示的CAR构建物的慢病毒转导5天之后人CD4+T细胞的体外增殖(左图)。c-Met IgG4 CAR和两个SS1 CARs显示组成型增殖60天。在扩张期间任何点都不将细胞因子加入培养基。具有组成型增殖的CAR T细胞还保持较大的平均细胞体积(右图)。结果代表n>10正常人供体。图2B和2C显示用或不用外源IL-2刺激CD4+和CD8+T细胞(图2A)。图2D显示将来自3个健康供体的CD4+T细胞分离、刺激和用编码c-MetIgG4、CD19 CD8-α和CART19 CAR构建物的慢病毒转导或模拟转导(mocktransduced)，并培养，添加新鲜培养基而无外源细胞因子。误差棒表示标准差。

图3，包括图3A和3B，是显示具有连续T细胞增殖的CAR T细胞具有组成型细胞因子分泌的一系列图。图3A描述αCD3/CD28刺激和扩张之后多种CAR构建物引起的细胞因子产生的连续测量。在每个记录的时间点，将c-Met IgG4、CD19 CD8-αCAR转导和未转导的CD4+T细胞从培养物收集、清洗和以1×10⁶/mL再铺板。细胞在培养物中保持24hrs，在该时间从每个培养物收集上清液。将上清液通过luminex测定进行分析并将值绘制为刺激前的细胞的log(10)倍数改变(基线)。每个分析物的基线值(pg/ml)是：IFN-γ：3.66pg/mL；TNF-α：0.29pg/mL；IL-2：0.51pg/mL；GM-CSF：4.58pg/mL；IL13：4.79pg/mL；IL-10：1.29pg/mL。图3B显示来自显示生长表型的CARs的上清液引起天然的未受刺激的T细胞的活化。在培养56天收获的c-Met IgG4 CAR T细胞培养物的培养物上清液以相对于起始培养基12.5％、25％或50％的c-Met IgG4的上清液终浓度加入未受刺激的天然CD4+T细胞。作为对照，还包括具有和没有100IU IL-2的培养基，以及将CD3/CD28珠刺激的细胞保持在培养物中，在第0天开始刺激和在第12天再-刺激。每两天测定MCVs并加入细胞培养基以将上清液浓度和IL-2浓度保持在对照组内，如本文别处所描述的。

图4，包括图4A和4B，是显示具有组成型生长表型的CARs显示独特的基因标签的一系列图。图4A描述细胞因子、穿孔蛋白和粒酶表达。微阵列分析比较在基线和在培养的第6、22和24天c-Met IgG4、CD19 CD8-α、CART19 CARs和未转导的T细胞的细胞因子表达；只在第24天分析c-Met IgG4培养物，因为其它培养物由于细胞死亡而终止。没有外源细胞因子加入培养基。针对IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B和穿孔蛋白绘制归一化的绝对log2基因表达强度，图4B显示具有组成型生长表型的CAR T细胞显示不同的转录因子。对T细胞极化、生长和存活重要的基因表达：T-bet、Eomes、GATA-3、RORc、FoxP3、Bcl-xL、KLRG1和hTERT。绘制归一化的绝对log(2)基因表达强度。数据是在刺激之前，和在第6、11和24天分析的正常供体一式三份的编辑；只在第24天分析c-Met IgG4培养物，因为其它培养物由于细胞死亡而终止。每个点表示每个时间点内表达c-Met IgG4 CAR、CD19 CD8α CAR的单个供体或未转导的对照。盒状图表示具有中值的上75^th和下25^th百分位数。须表示上90^th和下10^th百分位数。在第11天通过ANOVA的c-Met IgG4 CAR对CD19 CD8αCAR(红色)的比较：T-bet(p＝0.888)；Eomes(p＝0.003)；GATA-3(p<0.001)；FoxP3(p＝0.122)；RORc(p＝0.089)；KLRG1(P＝0.076)；hTERT(p＝0.405)；和Bcl-xL(p<0.001)。

图5，包括图5A和5B，是显示AKT、NF-kB和MAPK信号传导途径的组成型活化与CAR T细胞增殖表型相关的一系列图。图5A显示代表性的FACS直方图，其显示培养期间从培养的第10天至第30天c-Met IgG4 CAR(+)T细胞的富集。图5B描述用c-Met IgG4或CD19 CD8αCARs刺激和转导的CD4+T细胞的PhosFlow图。在第6、10和25天将细胞固定、可渗透化处理和利用PE抗Erk1/2(pT202/pY204)、PE抗Akt(pS473)、PE抗NF-kB p65(pS529)和PE抗S6(pS235/pS236)染色；CD19 CD8αCAR培养物不继续增殖到第25天，因此只在第6和10天分析。阳性对照取样自在固定之前利用PMA/离子霉素刺激10min的每个条件，而阴性对照细胞是利用PE结合的IgG2bκ同种型对照染色的完全刺激的T细胞。

图6，包括图6A至6C，是概括来自具有组成型增殖的CAR T细胞的基因组宽的微阵列分析结果的一系列图。图6A显示从培养的第0天至第24天将来自3个供体的表达连续c-Met IgG4或典型的CD19 CD8α的CARsCD4+T细胞、或模拟转导的细胞进行微阵列分析和分级聚类。聚类利用中值归一化的绝对log(2)基因表达强度——具有平均连接——的欧几里德距离进行。图基于无偏的全部基因组聚类。在第11天，CD19 CD8αCAR T细胞和未转导的细胞簇与静息T细胞更相似地聚集，而第11天和第24天c-Met IgG4 CAR T细胞保持活化的和紧密的簇。图6B显示具有组成型增殖的CAR T细胞的不同的基因表达标签。将来自3个供体T细胞培养物在第6天的基因表达标签与在第11天和第24天培养物的基因表达标签进行比较。在第6天的CAR T细胞与模拟转导的T细胞相似。相比之下，第11天和第24天连续的c-Met IgG4细胞显示独特的RNA标签，其不同于完全活化的第6天表型。图6C显示c-Met CAR和CD19 CAR之间的基因表达差异。

图7，包括图7A至7C，是显示转基因表达水平足以传递组成型CAR生长表型的一系列图。抗CD3加CD28刺激和用在指出的启动子下表达CARs的c-MET的慢病毒转导5天之后人CD4+T细胞的体外增殖。CMV(1)和CMV(2)表示在同一个人供体中慢病毒载体产生的复制。图7A显示群体倍增针对CMV和EF-1α驱动的c-MET CAR细胞测定。在培养物中～12天之后，CMV-c-MET CAR细胞不能维持增殖并且死亡，而EF-1αc-MET CAR T细胞继续增殖。图7B显示还测定平均细胞体积(MCV)。10天之后CMV-c-MET CAR T细胞的细胞大小减少，表明细胞静息下来。图7C描述在转导后第6天用CMV和EF-1α启动子表达的CARs之间表达水平的比较。表明平均荧光强度。

图8是显示具有组成型增殖的CAR T细胞保持特异性细胞毒性的图。M30肿瘤系(c-Met的内源表达)和NCI-H522肿瘤系(缺少c-Met表达)以指出的效应器与靶标的比率与c-Met IgG4 CAR T细胞一起培养。CD19 CD8αCAR T细胞用作特异性对照以排除同种异体效应。插图盒：M108和NCI-H522上的c-Met表达。

图9是显示c-Met和间皮蛋白表达未在人CD4+T细胞上检测到的图。CD4+T细胞不表达可检测水平的c-Met或间皮蛋白。比较样品与L55——非细胞肺肿瘤细胞系，以及未染色的CD4+T细胞。活化之后，将人CD4+T细胞和肿瘤系针对c-Met(PE)或间皮蛋白(PE)染色。直方图描述未染色的活化的CD4+T细胞、针对描述的抗原染色的活化的CD4+T细胞和L55肿瘤。表明平均荧光强度。

图10是具有组成型或可诱导的增殖表型的CARs的蛋白质印迹分析的图。蛋白质印迹在还原和非还原条件下进行，在来自转导后8天样品的裂解物上利用以0.250ug/mL的小鼠抗人CD3ζ之后是以1:5000的抗小鼠HRP探测CD3ζ。在还原条件下的CAR单体(50至70kD)(左)和在非还原条件下的二聚体和单体(右)。内源CD3ζ作为内部负荷对照。

图11是显示具有组成型生长表型的CAR T细胞保持多种TCR Vβ所有组成部分的图。将人CD4 T细胞分离、用抗CD3/CD28刺激、用c-Met IgG4 CAR转导，和保持在没有外源细胞因子的培养基中，如所描述的。将供体匹配的模拟转导的细胞作为对照同时刺激和扩增，然而这些培养物需要另外的刺激以在培养中维持。细胞在第0、13和34天冷冻保存，其后将它们同时解冻和利用IOTest Beta MarkTCR V试剂盒进行TCR Vβ分析。

图12是显示具有组成型增殖的CAR T细胞具有不依赖配体的NFAT活化的图。将被改造以在NFAT启动子控制下表达GFP的Jurkat T细胞用编码针对连续的c-Met IgG4、SS1 IgG4、SS1 CD8　的CARs，和编码CD19 IgG4、CD19 CD8和SS1 CD8aΔ尾的典型的CARs的慢病毒转导。转导之后3天分析细胞的GFP和CAR表达。

图13是显示组成型CAR T细胞增殖导致不同细胞表面表型的分化和进展的图。将CD4 T细胞用c-Met IgG4 CAR构建物刺激和转导，如先前所描述的。将刺激之前的细胞冷冻保存用于以后的分析。将细胞样品在第6、14、23、38和70天分离和冷冻保存。将细胞同时解冻和允许放置一晚上，不添加细胞因子。针对CAR以及CD25、CD70、PD-1、CD27、CD28、CD62L、CCR7和Crtam对细胞进行染色。

图14是描述刺激和细胞培养对非转导的T细胞分化的效应的图。伴侣CD4 T细胞通过消极的消耗(negative depletion)而分离和同时用图12所示的CAR T细胞刺激。将刺激之前的细胞冷冻保存用于以后的分析。细胞样品在第6天、珠去除之后24小时和在第14天分离用于分析。将细胞与CAR T细胞同时解冻和放置一晚上，不添加生长因子或细胞因子。分析细胞的CAR表达以及CD25、CD70、PD-1、CD27、CD28、CD62L、CCR7和Crtam。

图15是描述连续的CAR T细胞和模拟转导的T细胞中端粒限制性片段长度(TRF)的时间模式的图。将用连续的c-Met IgG4 CAR转导的CD4 T细胞或模拟转导的细胞培养指示的持续时间。将DNA从T细胞分离，末端端粒限制性片段长度通过HinfI/RsaI消化的DNA的电泳分离然后与端粒重复探针在胶中杂交来评价。连续的CAR T细胞在培养物中增殖至少61天，而模拟转导的T细胞31天之后停止增殖。梯状物是32P-标记的全长和HindIII-消化的λDNA的混合物。

图16是描述NSG小鼠中连续的CAR T细胞的移入和增殖的图。将表达连续c-Met IgG4 CAR、典型的CD19 CD8αCAR的人CD4 T细胞(10⁶)(调节到50％CAR阳性)或模拟转导的T细胞注入NSG小鼠(n＝10只小鼠每组)。注入之后60天通过外周血TruCounts分析小鼠以定量小鼠血液每uL的huCD45+细胞。样品平均值并非不同(双尾Mann-Whitney p＝0.39)；棒表示S.D。

具体实施方式

本发明涉及这样的发现：转导进T细胞的特定的嵌合抗原受体(CARs)至少对以下有贡献：转导的T细胞的不依赖抗原的活化增加、转导的T细胞的平均细胞体积(MCV)增加、转导的T细胞的细胞群体扩张增加、转导的T细胞的增殖增加、转导的T细胞的子代数目增加、和转导的T细胞群体的体外和体内持久性都增加。因此，本发明涉及通过施用用CARs转导的T细胞治疗癌症的组合物和方法，所述癌症包括但不限于血液学恶性肿瘤和实体瘤，所述CARs有助于增加转导的T细胞群体的活化和持久性。本发明涉及转导T细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)的过继细胞转移的策略。CAR是这样的分子，其将基于抗体的针对期望的抗原(例如，肿瘤抗原)的特异性与T细胞受体-激活细胞内结构域结合以产生展示特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白。

本发明提供识别允许无外源细胞因子施用或饲养细胞情况下的广泛T细胞增殖的CAR设计的方法。一方面，本发明提供用于产生赋予T细胞经历长期自主增殖能力的CARs的组合物和方法。一方面，CAR T细胞的长期增殖和扩张不依赖抗原刺激和不需要添加外源细胞因子或饲养细胞。

一方面，CAR T细胞的长期增殖和扩张部分地由组成型细胞因子产生来介导。因此，本发明提供具有组成型增殖表型的CAR T细胞的独特的分子标签。一方面，CAR T细胞的独特的分子标签包括以下中一个或多个的表达：IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B和穿孔蛋白。

在另一个实施方式中，本发明提供产生显示连续生长表型的CAR T细胞的方法。一方面，连续生长表型包括连续的不依赖配体的信号转导，其包括标准的TCR和CD28信号转导途径。另一方面，CAR T细胞的连续增殖表型可通过评价CAR T细胞上scFv表面表达水平来识别，因为在细胞表面鲜明表达的CARs持久增殖，而以较低的scFv表面表达水平表达的CARs不显示持久增殖和细胞因子分泌。

在一个实施方式中，本发明的CAR包括具有抗原识别结构域的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在另一实施方式中，跨膜结构域可被选择或通过氨基酸替代修饰，以避免此类结构域与相同的或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域的结合以使得与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。优选地，铰链结构域是IgG4或CD8α铰链结构域。

在各种实施方式中，本发明的持续性CAR T细胞可通过引入包括期望的CAR的慢病毒载体而产生，所述CAR对以下中的至少一个有贡献：转导的T细胞不依赖抗原的活化增加、转导的T细胞的平均细胞体积(MCV)增加、转导的T细胞的细胞群体扩张增加、转导的T细胞的增殖增加、转导的T细胞的子代数目增加、和转导的T细胞群体的体外和体内持久性都增加。通过实例，本发明的CAR包括抗c-Met、IgG4铰链、CD28跨膜和CD28和CD3ζ信号传导结构域。通过另一个实例，本发明的CAR包括抗间皮蛋白(SS1)、IgG4铰链、CD28跨膜和CD28和CD3ζ信号传导结构域。通过另一个实例，本发明的CAR包括抗间皮蛋白、CD8a铰链、CD28跨膜结构域和CD28和CD3ζ信号传导结构域。通过另一个实例，本发明的CAR包括抗CD19、IgG4铰链、CD28跨膜、和CD28和CD3ζ信号传导结构域。通过另一个实例，本发明的CAR包括抗CD19、CD8a铰链结构域、CD28跨膜和CD28和CD3ζ信号传导结构域。本发明的CAR T细胞能够在体内复制产生可导致持续的肿瘤控制的长期持久性。

在一个实施方式中，本发明涉及施用基因修饰的表达CAR的T细胞用于利用淋巴细胞注入治疗患有癌症或处在患有癌症风险的患者。优选地，自体淋巴细胞注入用于治疗。自体PBMCs收集自需要治疗的患者并且使用本文所述的和本领域已知的方法将T细胞活化和扩张并且然后注入回到患者。

定义

除非另有定义，本文使用的所有的技术和科学术语具有与本发明涉及领域的技术人员通常理解的相同的含义。尽管可在测试本发明的实践中和/或用于本发明的测试中使用类似于或等于本文描述的那些的任何方法和物质，但优选的材料和方法在本文中进行描述。在描述和要求保护本发明中，以下术语将根据它被如何定义而使用，其中提供定义。

也应理解本文使用的术语仅是为了描述具体实施方式的目的，并不意欲是限制性的。

本文使用冠词“一个(a)”和“一个(an)”，指的是该冠词语法对象的一个或多于一个(即，指的是至少一个)。以例子说明，“一个元件”表示一个元件或多于一个的元件。

如本文使用的“大约”，当指的是可测量的值诸如量、时间期间等时，表示包括给定值±20％或在一些情况中±10％的变化，或在一些情况中±5％，或在一些情况中±1％，或在一些情况中±0.1％的变化，只要这种变化适于实施公开的方法。

“活化”，如本文所用的，指的是已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化也可与诱导的细胞因子产生和可检测的效应器功能相关。术语“活化的T细胞”等指的是经历细胞分裂的T细胞。

术语“抗体”，如本文所用的，指的是与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可为源于自然源或源于重组源的完整的免疫球蛋白，并可为完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚物。本发明中的抗体可以以多种形式存在，其中抗体的抗原结合部分被表示为部分邻近的多肽链，包括例如，单个结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)和人源化抗体(Harlow等，1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等，1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等，1988,Science242:423-426)。

术语“抗体片段”指的是完整抗体的至少一部分，并指的是完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段、sdAb(V_L或V_H)、骆驼V_HH结构域、scFv抗体、和由抗体片段形成的线性抗体、scFv抗体和多特异性抗体。术语“scFv”指包括至少一个包括轻链可变区的抗体片段和至少一个包括重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区通过短的柔性多肽连接体连续地连接，和能表示为单链多肽，和其中scFv保持其来自的完整抗体的特异性。除非制定，如本文所用，scFv可具有以任何顺序——例如，关于多肽的N端和C端末端——的V_L和V_H可变区，scFv可包括V_L-连接体-V_H或可包括V_H-连接体-V_L。

“抗体重链”，如本文所用的，指的是以它们自然存在构象存在于抗体分子的两种类型的多肽链中较大的链，并且其通常决定抗体属于的类别。

“抗体轻链”，如本文所用的，指的是以它们自然存在构象存在于所有抗体分子的两种类型的多肽链中较小的链，κ和λ轻链指的是两种主要的抗体轻链同种型。

如本文所用的，术语“合成抗体”，指利用重组DNA技术产生的抗体，诸如例如，由如本文所述的噬菌体表达的抗体。该术语也应当被解释为指已经由DNA分子的合成产生的抗体，所述DNA分子编码抗体并且该DNA分子表达抗体蛋白或具体说明抗体的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列已经利用本领域可用和公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。

如本文所用的，术语“抗原”或“Ag”被定义为激发免疫反应的分子。该免疫反应可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或两者。技术人员将理解任何大分子——实际上包括所有的蛋白质或肽，可用作抗原。此外，抗原可源自重组或基因组DNA。技术人员将理解任何DNA——其包括编码引起免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列，因此编码如本文使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不必单独地由基因的全长核苷酸序列编码。容易显而易见的是本发明包括但不限于，多于一个的基因的部分核苷酸序列的用途，并且这些核苷酸序列以不同的组合进行布置，以编码引起期望的免疫反应的多肽。此外，技术人员将理解抗原根本不必由“基因”进行编码。容易显而易见的是抗原可被产生、合成或可源自生物学样本。这种生物学样本可包括但不限于组织样本、肿瘤样本、细胞或生物学流体。

如本文所用的，术语“抗肿瘤效应”，指的是生物学效应，其可由肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的减少、转移数的减少、预期寿命的增加或与癌性状况相关的各种生理症状的改善清楚表示。“抗肿瘤效应”也可由本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤在第一位置发生的能力清楚表示。

根据本发明，术语“自体抗原”指由免疫系统错误识别为外源(foreign)的任何自身抗原。自体抗原包括但不限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。

如本文所用的，术语“自身免疫疾病”被定义为由自身免疫反应产生的病症。自体免疫疾病是对自身抗原的不适当和过度反应的结果。自身免疫疾病的例子包括但不限于阿狄森氏疾病、斑秃(alopecia greata)、强直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克罗恩氏疾病、糖尿病(1型)、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯氏疾病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏疾病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、脊椎关节病变、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等等。

如本文所用的，术语“自体”指关于源自相同个体的任何物质，它随后被再次引入该个体。

“同种异基因(allogeneic)”指的是源自相同物种的不同动物的移植物。

“异种(xenogeneic)”指的是源自不同物种的动物的移植物。

如本文所用的，术语“癌症”被定义为以畸变细胞的快速和失控生长为特征的疾病。癌细胞可局部蔓延或通过血流和淋巴系统蔓延至身体的其他部分。各种癌症的例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。

如本文使用的术语“共刺激配体”包括特异性结合T细胞上的关联(cognate)共刺激分子的抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等等)上的分子，由此除了通过例如将TCR/CD3复合物与用肽负载的MHC分子结合提供的初级信号之外，还提供介导T细胞反应的信号，所述T细胞反应包括但不限于增殖、活化、分化等等。共刺激配体可包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体也包括，特别是与存在于T细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体，和与CD83特异性结合的配体，所述共刺激分子诸如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3。

“共刺激分子”指的是与共刺激配体特异性结合的T细胞上的关联结合伴侣，由此介导T细胞的共刺激反应，诸如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHCI类分子、BTLA和Toll配体受体。

如本文所用的，“共刺激信号”指的是与初级信号结合，诸如TCR/CD3连接作用，导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。

“疾病”是动物的一种健康状态，其中动物不能保持稳态，和其中如果不改善该疾病，则动物的健康继续恶化。与之相比，动物中的“病症”是一种健康状态，其中动物能够保持稳态，但其中动物的健康状态与它没有处于该病症相比不太有利。保持不治疗，病症不必定引起动物健康状态的进一步降低。

如本文所用的，“有效量”，指提供治疗性或预防性益处的量。

“编码”指的是多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特异性序列用作模板合成在生物学过程中的其他多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一个和由其产生的生物学性质。因此，如果相应于那个基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物学系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。核苷酸序列等同mRNA序列并通常提供在序列表中的编码链，和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链两者，都可被称为编码那个基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

如本文所用的，“内源的”指的是来自有机体、细胞、组织或系统的或在有机体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。

如本文所用的，术语“外源的”指的是任何从有机体、细胞、组织或系统引入的或在有机体、细胞、组织或系统外产生的物质。

如本文所用的，术语“表达”被定义为由它的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

“表达载体”指的是包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括所有本领域已知的那些，诸如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。

“同源的”指的是两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时，例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则所述分子在那个位置上是同源的。两个序列之间的同源性百分比为由两个序列共有的匹配或同源的位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个是匹配或同源的，则两个序列是60％同源的。以例子说明，DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50％的同源性。通常，当比对两个序列以给出最大同源性时，进行比较。

如本文所用的，术语“免疫球蛋白”或“Ig”被定义为起到抗体作用的一类蛋白质。由B细胞表达的抗体有时被称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。包括在该类蛋白质中的五个成员为IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA为存在于身体分泌物诸如唾液、泪液、母乳、胃肠分泌物和呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的初级抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM是在多数对象的初级免疫反应中产生的主要免疫球蛋白。它在凝集反应、补体结合和其他抗体反应中是最有效的免疫球蛋白，并且在抵御细菌和病毒方面是很重要的。IgD是不具有已知抗体功能的免疫球蛋白，但可用作抗原受体。IgE是在暴露于过敏原后，通过引起从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体，介导速发过敏性的免疫球蛋白。

如本文所用的，“指导材料”包括出版物、记录、图表或任何其他可用于传达本发明组合物和方法的有用性的表达媒介。本发明的试剂盒的指导材料可例如被附加在包含本发明的核酸、肽和/或组合物的容器上，或与包含核酸、肽和/或组合物的容器一起运送。可选地，指导材料可与容器分开地运送，目的是指导材料和化合物由接受者配合使用。

“分离的”指从自然状态改变或移出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但部分或完全与它的自然状态的共存物质分离的同一核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以基本上纯化的形式存在，或例如，可存在于非自然环境，诸如宿主细胞。

在本发明的内容中，对于通常发生的核酸碱基使用以下缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，和“U”指的是尿苷。

除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，就此而言，编码该蛋白质的核苷酸序列可在某些版本中包含内含子(一个或多个)。

如本文所用的，“慢病毒”指的是逆转录病毒科的属。在逆转录病毒中慢病毒是唯一能够感染非分裂细胞的；它们可传递显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA，所以它们是基因传递载体的最有效的方法之一。HIV、S1V和FIV都是慢病毒的例子。源自慢病毒的载体提供了完成显著水平基因体内转移的工具。

术语“微阵列”和“阵列”广义地指“DNA微阵列”和“DNA芯片(一个或多个)”，和包括所有技术认可的固体载体，和所有技术认可的用于将核酸分子附于其或用于其上核酸合成的方法。优选的阵列通常包括多个不同的核酸探针，其与不同的已知位置的底物表面结合。这些阵列，也被描述为“微阵列”或通俗地“芯片”已在本领域被通常地描述，例如，美国专利号5,143,854、5,445,934、5,744,305、5,677,195、5,800,992、6,040,193、5,424,186和Fodor et al.,1991,Science,251:767-777，其每个以其全部通过引用被并入用于所有目的。阵列可通常利用许多种技术产生，如机械合成方法或光定向的合成方法，其掺入光刻法和固相合成方法的组合。用于利用机械合成方法合成这些阵列的技术在，例如，美国专利号5,384,261,和6,040,193中被描述，其以其全部通过引用被并入本文用于所有目的。虽然平面阵列表面式优选的，但是阵列可被制造在事实上任何形状的表面或甚至多样性表面上。阵列可以是珠、凝胶、多聚体表面、纤维如纤维光学、玻璃或任何其它合适的基质上的核酸。(参见美国专利号5,770,358、5,789,162、5,708,153、6,040,193和5,800,992，其在此以其全部通过引用被并入用于所有目的。)阵列可以以这样的方式被包装以考虑诊断用途或可以是包括所有的装置；例如，美国专利号5,856,174和5,922,591，其以其全部通过引用被并入用于所有目的。阵列商业上可获自，例如，Affymetrix(Santa Clara,Calif.)和Applied Biosystems(Foster City,Calif.)，并涉及许多种目的，包括基因分型、诊断学、突变分析、标记表达、和针对许多种真核和原核有机体的基因表达监测。固体载体上探针的数目可通过改变个别部件的尺寸而变化。在一个实施方式中，部件尺寸是20×25平方微米，在其它实施方式中部件可以是，例如，8×8、5×5或3×3平方微米，导致约2,600,000、6,600,000或18,000,000个单独的探针部件。

如本文所用的，术语“调节”指与缺少治疗或化合物的对象中的反应水平相比，和/或与以其他方式相同但未治疗的对象中的反应水平相比，介导对象中反应水平的可检测的增加或减少。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或反应，由此介导对象优选人的有益的治疗性反应。

除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。

术语“可操作地连接”指的是调节序列和异源核酸序列之间的功能连接，其产生后者的表达。例如，当第一核酸序列位于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子被可操作地连接至编码序列。通常地，可操作地连接的DNA序列是邻近的，其中在相同的阅读框中必须连接两个蛋白质编码区。

术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”意欲表明相对于来自组织或器官的正常细胞的表达水平，来自疾病区如患者的特定组织或器官内的实体瘤的细胞中肿瘤抗原表达的异常水平。具有以肿瘤抗原过表达为特征的实体瘤或血液学恶性肿瘤的患者可由本领域已知的标准测定确定。

免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)或胸骨内注射，或注入技术。

术语“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，并指的是服从本文描述方法的任何动物或其细胞，不论是体外或原位。在一些非限制性实施方式中，患者、对象或个体为人。

如本文所用的，术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸为核苷酸的多聚体。因此，如本文所用的，核酸和多核苷酸是可交换的。本领域技术人员具有核酸为可被水解成单体“核苷酸”的多核苷酸的一般常识。单体核苷酸可被水解成核苷。如本文所用的，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有的核酸序列，所述手段包括但不限于重组手段，即，从重组文库或细胞基因组，利用普通克隆技术和PCR^TM等等克隆核酸序列，和合成手段。

如本文所用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可交换使用，并指的是由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，和对可构成蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括任何肽或蛋白质，所述肽或蛋白质包括通过肽键相互连接的两个或多个氨基酸。如本文所用的，该术语指的是短链，其在本领域中也例如通常被称为肽、寡肽和寡聚体；和较长链，其在本领域中通常被称为蛋白质，其具有很多类型。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

如本文所用的，术语“启动子”被定义为开始多核苷酸序列的特异性转录需要的，由细胞的合成机器或引入的合成机器识别的DNA序列。

如本文所用的，术语“启动子/调节序列”指可操作地连接至启动子/调节序列的基因产物表达所需的核酸序列。在一些例子中，该序列可为核心启动子序列，并且在其他例子中，该序列也可包括基因产物表达所需的增强子序列和其他调节元件。启动子/调节序列可例如为以组织特异方式表达基因产物的序列。

“组成型”启动子为核苷酸序列，其当与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得在细胞的多数或所有生理学条件下在细胞中产生基因产物。

“诱导型”启动子为核苷酸序列，其当与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得在基本上仅当相应于启动子的诱导物存在于细胞中时，在细胞中产生基因产物。

“组织-特异性”启动子为核苷酸序列，其当与编码基因或由基因规定的多核苷酸可操作地连接时，使得基本上只要细胞为相应于启动子的组织类型的细胞，则在细胞中产生基因产物。

如本文所用的，关于抗体的术语“特异性结合”指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样本中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可结合来自一个或多个物种的抗原。但是，这种跨种反应性本身不改变抗体的类别成为特异性的。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不改变抗体的类别成为特异性的。在一些例子中，术语“特异性的结合”或“特异性地结合”可参考抗体、蛋白质或肽与第二化学种类的相互作用使用，用于指该相互作用依赖化学种类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体通常识别和结合特异性蛋白质结构而不是一般地识别和结合蛋白质。如果抗体对表位“A”是特异性的，则在包含标记的“A”和抗体的反应中存在包含表位A(或游离的、未标记的A)的分子，将降低结合至抗体的标记的A的量。

术语“刺激”指通过结合刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与它的关联配体，由此介导信号转导事件——诸如但不限于经TCR/CD3复合物的信号转导——诱导的初级反应。刺激可介导某些分子的改变的表达，诸如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的再组织等等。

“刺激分子”，作为本文使用的术语，指与存在于抗原呈递细胞上的关联刺激配体特异性结合的T细胞上的分子。

如本文所用的，“刺激配体”指如此配体，其当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B-细胞等等)上时，可与T细胞上的关联结合伴侣(在本文中被称为“刺激分子”)特异性结合，由此介导T细胞的初级反应，其包括但不限于，活化、免疫反应的开始、增殖等等。刺激配体在本领域中是公知的，并包括，特别是利用肽、抗CD3抗体、超激动剂抗CD28抗体和超激动剂抗CD2抗体负载的MHC I类分子。

如本文所用的，“基本上纯化的”细胞为基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指的是已经与以其天然发生状态与其正常相关联的其他细胞类型分离的细胞。在一些例子中，基本上纯化的细胞群指的是均质细胞群。在其他例子中，该术语简单地指的是已经与以其天然状态与其正常相关联的细胞分离的细胞。在一些实施方式中，体外培养细胞。在其他实施方式中，不在体外培养细胞细胞。

如本文所用的，术语“治疗的”表示治疗和/或预防。治疗效应通过疾病状态的抑制、缓和或根除获得。

术语“治疗有效量”指的是将引起由研究者、兽医、医学医生或其他临床医生正在寻找的组织、系统或对象的生物学或医学反应的对象化合物的量。术语“治疗有效量”包括以下的化合物的量：当被施用时，其足以防止治疗的病症或疾病的迹象或症状中的一个或多个的发展，或以一定程度减轻治疗的病症或疾病的迹象或症状中的一个或多个。治疗有效量将根据化合物、疾病和其严重性、和待治疗的对象的年龄、重量等而变化。

“治疗”疾病，作为本文使用的术语，指降低对象经历的疾病或病症的至少一种迹象或症状的频率或严重性。

如本文所用的，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指的是如此过程，通过该过程外源的核酸被转移或引入宿主细胞。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经由外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代对象细胞和它的子代。

如本文所用的，短语“转录控制下”或“可操作地连接”指启动子处于与多核苷酸有关的正确的位置和朝向，以控制通过RNA聚合酶进行的转录的开始和多核苷酸的表达。

“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。很多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的例子包括但不限于，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体等等。

范围：贯穿本公开，本发明的多个方面可以以范围形式中示出。应当理解范围形式中的描述仅是为了方便和简洁，并不应被解释为对本发明范围不可动摇的限制。因此，范围的描述应被考虑为已具体公开了所有可能的子范围以及处于那个范围内的单个数值。例如，范围诸如从1至6的描述应被考虑为已具体公开了子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及那个范围内的单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这一点是适用的。

描述

本发明涉及用嵌合抗原受体(CARs)转导T细胞的组合物和方法，所述CARs产生T细胞的持续性群体，与它们未转导的相对物相比，其显示增加的不依赖抗原的活化、增加的平均细胞体积(MCV)、增加的细胞群体扩张、增加的增殖、增加的子代数目、组成型细胞因子分泌的诱导、和增加的转导的T细胞群体的体外和体内持久性。因此，本发明提供治疗癌症等疾病的组合物和方法。癌症可以是血液学恶性肿瘤、实体瘤、原发或转移性肿瘤。使用本发明的组合物和方法可治疗的其他疾病包括病毒、细菌和寄生虫感染以及自身免疫病。

在一个实施方式中，本发明提供改造的表达有助于增加转导的T细胞的活化或增殖的CAR的细胞(例如，T细胞)，其中CAR T细胞展示抗肿瘤性质。本发明的CAR可被改造以包括细胞外结构域，所述细胞外结构域具有融合至T细胞抗原受体复合物ζ链(例如，CD3ζ)的细胞内信号传导结构域的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性改变(redirect)抗原识别。示例性抗原包括cMet、间皮蛋白和CD19。然而，本发明不限于靶向cMet、间皮蛋白和CD19。而是，本发明包括任何抗原结合部分，当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，以便肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，以便患者的肿瘤负荷(tumor burden)缩小或消除。抗原结合部分优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合部分与选自CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域和其任何组合的一个或多个细胞内结构域融合。

组合物

本发明提供了包括细胞外结构域和细胞内结构域的嵌合抗原受体(CAR)。细胞外结构域包括靶-特异性结合元件，其另外被称为抗原结合部分。在一些实施方式中，细胞外结构域也包括铰链结构域。细胞内结构域或另外的细胞质结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的细胞内结构域的部分CAR。共刺激分子为除抗原受体或它们的配体外淋巴细胞对抗原有效反应所需要的细胞表面分子。

在CAR的细胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的细胞质结构域和跨膜结构域之间，可并入间隔结构域。如本文所用的，术语“间隔结构域”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的细胞外结构域或细胞质结构域作用的任何寡肽或多肽。间隔结构域可包括上至300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸和最优选地25至50个氨基酸。

抗原结合部分

在一个实施方式中，本发明的CAR包括另外被称为抗原结合部分的靶-特异性结合元件。部分的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可选择抗原结合结构域，以识别用作与具体疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记的配体。因此，可用作本发明的CAR的抗原部分结构域的配体的细胞表面标记的例子包括与病毒、细菌和寄生虫感染，自身免疫疾病和癌细胞相关的那些标记。

在一个实施方式中，本发明的CAR可经由改造特异性结合至肿瘤细胞上抗原的期望抗原结合部分而被改造，以便靶向兴趣肿瘤抗原。在本发明的内容中，“肿瘤抗原”或“过度增生性病症(hyperproliferative disorder)抗原”或“与过度增生性病症相关的抗原”指的是对于特定过度增生性病症诸如癌症共同的抗原。本文讨论的抗原仅以实例的方式被包括。该列举不意欲是穷尽的，并且更多的实例对于本领域技术人员将是容易显而易见的。

肿瘤抗原是由引起免疫反应特别是T-细胞介导的免疫反应的肿瘤细胞产生的蛋白质。本发明的抗原结合部分的选择将取决于待治疗癌症的具体类型。肿瘤抗原在本领域中是公知的，并包括例如神经胶质瘤相关的抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺素、α-胎蛋白(AFP)、凝集素-反应的AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶反转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺-特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺-癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性白细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮蛋白。

在一个实施方式中，肿瘤抗原包括与恶性肿瘤相关的一个或多个抗原癌症表位。恶性肿瘤表达可用作免疫攻击的靶抗原的许多蛋白。这些分子包括但不限于组织-特异性抗原诸如MART-1、黑素瘤中的酪氨酸酶和GP 100、和前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺-特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子诸如癌基因HER-2/Neu/ErbB-2的组。而另一组的靶抗原为胎性癌抗原诸如癌胚抗原(CEA)。在B-细胞淋巴瘤中，肿瘤-特异性个体基因型免疫球蛋白构成对个体肿瘤唯一的真正的肿瘤-特异性免疫球蛋白抗原。B-细胞分化抗原诸如CD19、CD20和CD37是B-细胞淋巴瘤中靶抗原的其他候选物。这些抗原中的一些(CEA、HER-2、CD19、CD20、个体基因型)已经有限成功地用作利用单克隆抗体的被动免疫疗法的标靶。

本发明中提及的该类型肿瘤抗原也可为肿瘤-特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA为对肿瘤细胞唯一的，并不出现在身体的其他细胞上。TAA相关的抗原不是对肿瘤细胞唯一的，并且相反，其在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的状况下，也在正常细胞上进行表达。肿瘤上的抗原表达可在使免疫系统能够响应抗原的状况下发生。TAA可为在胚胎发育期间，当免疫系统不成熟并且不能响应时，在正常细胞上表达的抗原，或它们可为在正常细胞上以极低的水平正常存在的抗原，但其在肿瘤细胞上以高得多的水平进行表达。

TSA或TAA抗原的非限制性例子包括以下：分化抗原诸如MART-l/MelanA(MART-1)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤-特异性多谱系抗原诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原诸如CEA；过表达的致癌基因和突变的肿瘤-抑制基因诸如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位产生的独特的肿瘤抗原诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、1GH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，诸如Epstein Barr病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的、基于蛋白的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-Met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV 18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。

在优选的实施方式中，CAR的抗原结合部分靶向下述抗原，其包括但不限于c-Met、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮蛋白、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、MY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR等等。

取决于期望的待靶向的抗原，本发明的CAR可被改造以包括适当的对期望的抗原靶特异的抗原结合部分。例如，如果CD19是期望的待靶向的抗原，那么CD19的抗体可用作用于并入本发明的CAR的抗原结合部分。

跨膜结构域

对于跨膜结构域，CAR可被设计以包括融合至CAR的细胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸替代进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

跨膜结构域可源于天然来源或合成来源。在天然来源中，该结构域可源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。具体用于本发明的跨膜区可源于T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154(即至少包括上述中的跨膜区(一个或多个))，或源于免疫球蛋白如IgG4。可选地，跨膜结构域可为合成的，在该情况下，它将包括占主导的疏水残基诸如亮氨酸和缬氨酸。优选地，将在合成跨膜结构域的每一端上发现苯基丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸之间，可在CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。

细胞质结构域

本发明的CAR的细胞质结构域或另外的细胞内信号传导结构域是造成其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应器功能的活化的原因。术语“效应器功能”指的是细胞的特化功能。例如，T细胞的效应器功能可为包括细胞因子分泌的细胞溶解活性或辅助活性。因此术语“细胞内信号传导结构域”指的是转导效应器功能信号并指导细胞实施特化功能的蛋白质部分。尽管通常可使用整个细胞内信号传导结构域，但在很多例子中，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可用于代替完整的链，只要它转导效应器功能信号。术语细胞内信号传导结构域因此指包括足以转导效应器功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。

用于本发明的CAR的细胞内信号传导结构域的优选例子包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列和协同行动以在抗原受体结合后开始信号转导的共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同的功能能力的任何合成序列。

已知通过TCR单独产生的信号不足以完全活化T细胞，并且也需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可认为由两个不同类的细胞质信号传导序列介导：通过TCR开始抗原-依赖性初级活化的那些(初级细胞质信号传导序列)和以抗原-非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级细胞质信号传导序列)。

初级细胞质信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可包含信号传导基序，其已知为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。

包含在本发明中具有具体用途的初级细胞质信号传导序列的ITAM的例子包括源于TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。特别优选地，本发明的CAR中的细胞质信号传导分子包括源于CD3-ζ的细胞质信号传导序列。

在优选的实施方式中，CAR的细胞质结构域可被设计以本身包括CD3-ζ信号传导结构域，或可与在本发明的CAR的情况下有用的任何其他期望的细胞质结构域(一个或多个)联合。例如，CAR的细胞质结构域可包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的细胞内结构域的部分CAR。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效反应所需的除抗原受体或它的配体外的细胞表面分子。这种分子的例子包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等等。因此，尽管本发明主要以4-1BB作为共刺激信号传导元件的例子，但其他共刺激元件也在本发明的范围内。

本发明的CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质信号传导序列可以随机或以规定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸，可形成该连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。

在一个实施方式中，细胞质结构域被设计以包括CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一个实施方式中，细胞质结构域被设计以包括CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。还在另一个实施方式中，细胞质结构域被设计以包括CD3-ζ的信号传导结构域和CD28和4-1BB的信号传导结构域。

载体

本发明包括DNA构建体，其包括CAR的序列，其中该序列包括抗原结合部分的核酸序列，其可操作地连接至细胞内结构域的核酸序列。可用于本发明的CAR的示例性细胞内结构域包括但不限于CD3-ζ、CD28、4-1BB等等的细胞内结构域。在一些情况下，CAR可包括CD3-ζ、CD28、4-1BB等等的任何组合。

在一个实施方式中，本发明的CAR包括抗cMet、IgG4铰链结构域、和CD28跨膜和CD28和CD3ζ信号传导结构域。在另一个实施方式中，本发明的CAR包括抗间皮蛋白、IgG4铰链结构域、和CD28和CD3ζ信号传导结构域。在进一步的实施方式中，本发明的CAR包括抗间皮蛋白、CD8a铰链结构域、和CD28跨膜和CD28和CD3ζ信号传导结构域。在再一个实施方式中，本发明的CAR包括抗CD19、IgG4铰链结构域、和CD28跨膜和CD3ζ信号传导结构域。在仍然另一个实施方式中，本发明的CAR包括抗CD19、CD8a铰链结构域、和CD28跨膜和CD28和CD3ζ信号传导结构域。

在一个实施方式中，本发明的CAR包括SEQ ID NO：1表示的核酸序列。在另一个实施方式中，本发明的CAR包括SEQ ID NO：2表示的核酸序列。在进一步的实施方式中，本发明的CAR包括SEQ ID NO：3表示的核酸序列。

编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如利用标准的技术，通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产，而不被克隆。

本发明也提供了其中插入本发明的DNA的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖(propagation)。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的额外优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的额外优点。

简单概括，通常通过可操作地连接编码CAR多肽或其部分的核酸至启动子，并将构建物并入表达载体，实现编码CAR的天然或合成核酸的表达。该载体颗适于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建物也可利用标准的基因递送方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因递送的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloing:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管近来已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是可变的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于应用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达——当这样的表达是期望的时，或关闭表达——当表达是不期望的时。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色萤光蛋白基因(例如，Ui-Tei等，2000 FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建物被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞并表达的方法在本领域中是已知的。在表达载体的情况下，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、显微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组成相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

适于使用的脂质可从商业来源中获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma,St.Louis,MO中获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可从K&KLaboratories(Plainview，NY)中获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Beh环中获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)中获得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂质原液可被保存在大约-20℃。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”为通用术语，其包括通过产生封闭的脂双层或聚集体而形成的多种单一和多层脂质工具。脂质体可以以具有含有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构为特征。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水性溶液中时，它们自发形成。在形成封闭的结构和使水和溶解的溶质陷入脂双层之间前，该脂质成分经历自身重排(Ghosh等，191 Glycobiology 5：505-10)。然而，也包括与正常的囊泡结构相比具有溶液中的不同结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的非均一聚集体而存在。同样考虑的是脂质转染胺-核酸复合物。

不管用于将外源核酸引入宿主细胞，或以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法，为了证实在宿主细胞中存在重组DNA序列，可实施多种测定。这样的测定包括例如本领域技术人员公知的“分子生物学”测定，诸如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，诸如例如通过免疫学手段(ELlSA和蛋白质印迹)或通过本文描述的鉴定落入本发明范围内的试剂的测定，检测特定肽的存在或不存在。

T细胞的来源

在本发明的T细胞的扩张和基因修饰之前，从对象获得T细胞的来源。T细胞可获得自许多来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施方式中，可使用本领域可用的任何数量的T细胞系。在本发明的某些实施方式中，T细胞可使用技术人员已知的任何数量的技术，比如ficoll分离从受试者收集的单位血液获得。在一种优选的实施方式中，通过单采血液成分术获得来自个体的循环血液的细胞。单采血液成分术产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞，其他成核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方式中，可清洗通过单采血液成分术收集的细胞，以移除血浆部分并将细胞放置在适当的缓冲液或培养基中，用于随后的处理步骤。在本发明的一个实施方式中，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗。在可选实施方式中，清洗溶液缺少钙并可缺少镁或可缺少很多——如果不是全部——二价阳离子。而且，令人惊讶地，在缺少钙的情况下的最初活化步骤导致放大的活化。本领域技术人员将容易理解冲洗步骤可通过本领域已知的方法，如根据制造者说明书通过利用半自动化的“流通”离心机(例如，Cobe 2991毛细腔式洗片器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)完成。冲洗之后，细胞可重新悬浮在各种生物相容性缓冲液中，比如，例如，无Ca²⁺、无Mg²⁺PBS、PlasmaLyte A、或其它具有或没有缓冲液的盐溶液。可选地，可移除单采血液成分术样本的不期望成分和细胞直接重新悬浮在培养基中。

在另一实施方式中，通过溶解红细胞和耗减单核细胞从外周血分离T细胞，例如，通过利用PERCOLL^TM梯度的离心或通过对流离心洗脱法。特定的T细胞亚群，如CD3⁺、CD28⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD45RA⁺和CD45RO⁺T细胞可通过阳性或阴性选择技术而进一步分离。例如，在一个实施方式中，T细胞通过与抗CD3/抗CD28(即，3x28)-结合的珠，如M-450 CD3/CD28 T温育足以用于期望的T细胞阳性选择的时期而分离。在一个实施方式中，所述时期是30分钟。在进一步的实施方式中，所述时期的范围是30分钟至36小时或更长和它们之间的所有整数值。在进一步的实施方式中，所述时期是至少1、2、3、4、5或6小时。在再一个优选实施方式中，所述时期是10至24小时。在一个优选实施方式中，温育时期是24小时。对于T细胞从具有白血病的患者的分离，使用更长的温育时间，如24小时，可增加细胞产率。更长的温育时间可用于在存在与其它细胞类型相比几乎很少的T细胞的任何情况中分离T细胞，如在从肿瘤组织或从缺乏免疫的个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中。进一步，使用更长的温育时间可增加CD8+T细胞的捕获效率。因此，通过只是缩短或延长允许T细胞结合CD3/CD28珠的时间和/或通过增加或减少珠与T细胞的比(如本文所进一步描述的)，T细胞亚群可在培养开始或在所述过程期间的其它时间点优先选择。另外，通过增加或减少珠或其它表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比例，T细胞亚群可在培养开始或在其它期望的时间点优先选择(selected for或against)。技术人员将认识到多轮选择还可用于本发明的上下文中。在某些实施方式中，可期望在活化和扩张过程中进行选择操作和使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞还可进行进一步的轮次选择。

通过阴性选择的T细胞群的富集可利用涉及对阴性选择的细胞独特的表面标记的抗体的组合完成。一种方法为细胞分选和/或选择，其经阴性磁性免疫粘附或使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物的流式细胞术进行。例如，为了通过阴性选择富集CD4⁺细胞，单克隆抗体混合物通常包括对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方式中，可期望或对调节T细胞富集或阳性选择通常表达CD4⁺、CD25⁺、CD62L^hi、GITR⁺和FoxP3⁺。可选地，在某些实施方式中，T调节细胞通过抗C25结合的珠或其它相似的选择方法排除。

对于通过阳性或阴性选择分离期望的细胞群，可改变细胞和表面(例如，颗粒诸如珠)的浓度。在某些实施方式中，可期望显著减少其中珠和细胞被混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用20亿细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，使用10亿细胞/ml的浓度。在进一步的实施方式中，使用多于1亿细胞/ml。在进一步的实施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50×10⁶细胞/ml的细胞浓度。还在另一个实施方式中，使用75、80、85、90、95或100×10⁶细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方式中，可使用125或150×10⁶细胞/ml的浓度。使用高浓度可产生增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩张。进一步，高细胞浓度的使用允许更有效的细胞捕获，所述细胞可微弱表达感兴趣的靶抗原，如CD28-阴性T细胞，或来自存在许多细胞的样品(即，白血病的血、肿瘤组织等)。这样的细胞群体可具有治疗价值和将期望获得。例如，利用高细胞浓度允许更有效的通常具有较弱CD28表达的CD8⁺T细胞的选择。

在相关的实施方式中，可期望使用更低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒诸如珠)的混合物，颗粒和细胞之间的相互作用被最小化。这选择表达高数量的结合至颗粒的期望抗原的细胞。例如，在稀浓度，CD4⁺T细胞比CD8⁺T细胞表达更高水平的CD28并更有效地被捕获。在一个实施方式中，使用的细胞浓度是5×10⁶/ml。在其它实施方式中，使用的浓度可以是约1×10⁵/ml至1×10⁶/ml，和其间的任何整数值。

在其它实施方式中，细胞可在旋转器上以不同的速度在2-10℃或在室温温育不同长度的时间。

用于刺激的T细胞可也在冲洗步骤之后冷冻。尽管不希望被理论限制，通过去除细胞群体中的粒细胞和在某种程度上去除单核细胞，冷冻和随后的解冻步骤提供了更均一的产物。在移除血浆和血小板的冲洗步骤之后，细胞可悬浮在冷冻液中。尽管许多冷冻液和参数是本领域已知的并且在该背景下是有用的，但是一种方法包括使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％右旋糖酐40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO、或31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％右旋糖酐40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白、和7.5％DMSO的培养基，或含有例如，Hespan和PlasmaLyte A的其他适当的细胞冷冻媒介物，然后细胞以每分钟1°的速度被冷冻至-80℃并且存储在液氮储罐的蒸汽相中。可使用受控冷冻的其他方法以及在-20℃下或液氮中不受控的即刻冷冻。

在某些实施方式中，将冷冻保存的细胞解冻和冲洗，如本文所描述的，和允许在利用本发明的方法活化之前在室温放置1小时。

在本发明的背景中还考虑在当如本文所描述的扩张的细胞可能需要时之前的时期来自对象的血液样品的采集或单采血液成分术产物。像这样，将被扩张的细胞来源可在需要的任何时间点采集，并且将期望的细胞，如T细胞，分离和冷冻用于以后用于任何数目的将获益于T细胞治疗的疾病或状况——如本文描述的那些——的T细胞治疗。在一个实施方式中，血液样品或单采血液成分术取自通常健康的对象。在某些实施方式中，血液样品或单采血液成分术取自通常健康的对象，其处于发展疾病的危险，但是其尚未发展疾病，并将感兴趣的细胞分离和冷冻用于以后使用。在某些实施方式中，可将T细胞扩张、冷冻和在以后的时间使用。在某些实施方式中，样品采集自如本文描述的具体疾病的诊断之后不久但是在任何治疗之前的患者。在进一步的实施方式中，细胞分离自来自在任何数目的相关治疗形式之前对象的血液样品或单采血液成分术，所述治疗形式包括但不限于用剂的治疗，所述剂如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒药，化学疗法，辐照，免疫抑制剂，如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯和FK506、抗体、或其它免疫烧蚀剂如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228，和辐照。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶——钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等，Cell 66:807-815,1991；Henderson等，Immun.73:316-321,1991；Bierer等，Curr.Opin,Tmmun.5:763-773,1993)。在进一步的实施方式中，将细胞分离用于患者与冷冻用于以后与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体诸如OKT3或CAMPATH的T细胞烧蚀疗法结合(例如，之前、同时或之后)使用。在另一个实施方式中，将细胞在之前分离并可冷冻用于以后用于在B-细胞烧蚀疗法诸如与CD20反应的试剂例如Rituxan后的治疗。

在本发明进一步的实施方式中，T细胞获自治疗之后不久的患者。从这一点上，已观察到以下某些癌症治疗，特别是用损害免疫系统的药物的治疗之后，当患者将正常地从治疗恢复时的时期期间治疗之后不久，获得的T细胞质量可以是最佳的或提高它们离体扩张的能力。同样，利用本文描述的方法离体操作之后，这些细胞可处于优选状态用于提高的移入和体内扩张。因此，在本发明的背景内考虑在该恢复期期间采集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其它细胞。进一步，在某些实施方式中，动员(例如，用GM-CSF的动员)和条件处理计划可用于在对象中产生条件，其中偏爱特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩张，特别是在治疗之后的限定的时间窗期间。例证性的类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其它细胞。

T细胞的活化和扩张

不论在T细胞基因修饰以表达期望的CAR之前或之后，都可通常使用下述中所述的方法活化和扩张T细胞：例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公布号20060121005。

通常地，本发明的T细胞通过与表面的接触进行扩张，所述表面具有附着于其的刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，T细胞群可如本文所述的诸如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原-结合片段或抗CD2抗体接触，或通过和与钙离子载体组合的蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑制素)接触进行刺激。对于T细胞表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群可在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4⁺T细胞或CD8⁺T细胞的增殖，抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,France)，可用作本领域通常已知的其它方法(Berg etal.,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen et al.,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland et al.,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。

在某些实施方式中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可通过不同的方案提供。例如，提供每个信号的试剂可在溶液中或连接至表面。当连接至表面时，试剂可被连接至同一表面(即，以“cis”形式)或分开的表面(即，以“trans”形式)。可选地，一种试剂可被连接至表面和另一种试剂处于溶液中。在一个实施方式中，提供共刺激信号的试剂被结合至细胞表面，并且提供初级活化信号的试剂在溶液中或被连接至表面。在一些实施方式中，两种试剂可都在溶液中。在另一个实施方式中，试剂可处于可溶形式，随后被交联至表面，诸如表达Fc受体或抗体的细胞或将结合试剂的其他结合剂。在这点上，见例如用于人造抗原呈递细胞(aAPC)的美国专利申请公布号20040101519和20060034810，其被考虑用于活化和扩张本发明的T细胞。

在一个实施方式中，两种试剂被固定在珠上，在同一珠上，即“cis”，或分开的珠上，即“trans”。作为例子，提供初级活化信号的试剂为抗CD3抗体或其抗原-结合片段，和提供共刺激信号的试剂为抗CD28抗体或其抗原-结合片段；并且两种试剂都以相等的分子数量被共固定至同一珠。在一个实施方式中，使用结合至用于CD4+T细胞扩张和T细胞生长的珠的每种抗体的1:1比率。在本发明的某些方面中，使用结合至珠的抗CD3:CD28抗体的比率，以便与利用1:1比率观察到的扩张相比，观察到T细胞扩张的增加。在一个实施方式中，与利用1:1比率观察到的扩张相比，观察到约1至约3倍增加。在一个实施方式中，结合至珠的CD3:CD28抗体的比率处于100:1至1:100的范围中和其间的所有整数值。在本发明的一个方面中，比抗CD3抗体更多的抗CD28抗体被结合至颗粒，即CD3:CD28的比率小于1。在本发明的某些实施方式中，结合至珠的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个具体的实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:100的CD3:CD28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:75的CD3:CD28比率。在进一步的实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:50的CD3:CD28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:30的CD3:CD28比率。在一个优选实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:10的CD3:CD28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:3的CD3:CD28比率。还在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的3:1的CD3:CD28比率。

从1:500至500:1和其间任何整数值的颗粒与细胞的比率可用于刺激T细胞或其他靶细胞。因为在本领域技术人员可容易地领会到，颗粒与细胞的比率可取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，小尺寸的珠仅可结合一些细胞，而较大的珠能结合很多。在某些实施方式中，细胞与颗粒的比率在从1:100至100:1的范围内和其间任何整数值，在进一步的实施方式中，该比率包括1:9至9:1和其间任何整数值，也可用于刺激T细胞。抗CD3-和抗CD28-结合的颗粒与产生T细胞刺激的T细胞的比率可如以上记录的变化，然而某些优选的值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，一个优选的比率为至少1:1颗粒每个T细胞。在一个实施方式中，使用1:1或更小的颗粒与细胞的比率。在一个具体的实施方式中，优选的颗粒:细胞比率为1:5。在进一步的实施方式中，颗粒与细胞的比率可根据刺激天数而改变。例如，在一个实施方式中，颗粒与细胞的比率在第一天为从1:1至10:1，和额外的颗粒此后每天或每隔一天直至10天，以从1:1至1:10的最终比率(基于添加日的细胞计数)被添加至细胞。在一个具体的实施方式中，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天为1:1并在刺激的第三和第五天被调节至1:5。在另一个实施方式中，颗粒在每天或每隔一天的基础上添加，以在第一天最终比率为1:1，并在刺激的第三和第五天最终比率为1:5。在另一个实施方式中，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天为2:1并在刺激的第三和第五天被调节至1:10。在另一个实施方式中，颗粒在每天或每隔一天的基础上添加，以在第一天最终比率为1:1，和在刺激的第三和第五天最终比率为1:10。本领域技术人员将理解多种其他比率可适于用于本发明。特别地，比率将根据颗粒大小和细胞大小和类型而变化。

在本发明的进一步的实施方式中，细胞诸如T细胞，与包被试剂的珠结合，随后分离该珠和细胞，并且随后培养该细胞。在一个可选实施方式中，在培养前，不分离包被试剂的珠和细胞，而是在一起进行培养。在进一步的实施方式中，珠和细胞首先通过施加力诸如磁力被聚集，产生增加的细胞表面标记的连接作用，由此诱导细胞刺激。

作为例子，可通过允许附接抗CD3和抗CD28的顺磁珠(3×28珠)接触T细胞，来连接细胞表面蛋白。在一个实施方式中，细胞(例如，10⁴至10⁹个T细胞)和珠(例如，以1:1比率的M-450 CD3/CD28 T顺磁珠)在缓冲液优选PBS(没有二价阳离子诸如，钙和镁)中结合。此外，本领域技术人员可容易理解可使用任何细胞浓度。例如，靶细胞可在样本中非常稀少并仅占0.01％的样本，或整个样本(即，100％)可包括感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数量都在本发明的内容内。在某些实施方式中，可期望显著降低其中颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用大约20亿细胞/ml的浓度，在另一个实施方式中，使用多于1亿细胞/ml。在进一步的实施方式中，使用细胞浓度10、15、20、25、30、35、40、45或50×10⁶细胞/ml。还在另一个实施方式中，使用75、80、85、90、95或100×10⁶细胞/ml的细胞浓度，在进一步的实施方式中，可使用125或150×10⁶细胞/ml的浓度。利用高浓度可产生增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩张。进一步地，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可微弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，诸如CD28-阴性T细胞。这样的细胞群可具有治疗价值并将在某些实施方式中期望获得。例如，利用高浓度的细胞允许更有效选择正常具有更弱CD28表达的CD8+T细胞。

在本发明的一个实施方式中，混合物可被培养数个小时(大约3个小时)至大约14天或其间任何个小时的整数值。在另一个实施方式中，混合物可被培养21天。在本发明的一个实施方式中，珠和T细胞在一起培养大约八天。在另一个实施方式中，珠和T细胞在一起培养2-3天。也可期望数个周期的刺激，以便T细胞的培养时间可为60天或更多天。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPM1培养基1640或X-vivo 15，(Lonza))，其可包含增殖和存活必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFp和TNF-α或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)、和还原剂诸如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo15和X-Vivo 20、优化物(Optimizer)，具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或限定组的激素，和/或足够T细胞的生长和扩张量的细胞因子(一个或多个)。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅被包括在实验培养物中，而不包括在注入对象的细胞培养物中。靶细胞被保持在支持生长必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO₂)。

已经暴露于变化刺激时间的T细胞可显示不同的特性。例如，典型的血液或单采的(apheresed)外周血单核细胞产物具有比细胞毒性或抑制T细胞群(Tc，CD8⁺)更多的辅助T细胞群(T_H，CD4⁺)。刺激CD3和CD28受体引起的T细胞的离体扩张产生T细胞群体，其在约8-9天之前主要由T_H细胞组成，而在约8-9之后，T细胞群体包括渐增的更大的T_C细胞群体。因此，取决于治疗目的，用主要包括T_H细胞的T细胞群注入对象可为有利的。类似地，如果已经分离了Tc细胞的抗原-特异性亚型，则它可有益于以更大的程度扩张该亚型。

进一步地，除了CD4和CD8标记，其他表型标记在细胞扩张过程的进程期间，也显著地但以大部分可重复地变化。因此，这种重复性使针对具体目的调节活化的T细胞产物的能力能够实现。

治疗应用

本发明包括用慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)。例如，LV编码CAR，该CAR将特异性抗体的抗原识别结构域与CD3-ζ、CD28、4-1BB或其任意组合的细胞内结构域结合。因此，在一些例子中，转导的T细胞可引起CAR-介导的T-细胞反应。

本发明提供了CAR改变初级T细胞对肿瘤抗原的特异性的用途。因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫反应的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用表达CAR的T细胞，其中CAR包括特异性地与预定标靶相互作用的结合部分，包括例如人CD3ζ的细胞内结构域的ζ链部分，和共刺激信号传导区。

在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达CAR并且CAR T细胞被注入至需要其的受试者中。注入的细胞能够杀死受试者中的肿瘤细胞。不像抗体疗法，CAR T细胞能够在体内复制，产生可导致持续的肿瘤控制的长期持久性。

在一个实施方式中，本发明的CAR T细胞可经历稳固的体内T细胞扩张并可持续延长量的时间。在另一个实施方式中，本发明的CAR T细胞发展成可被重新活化以抑制任何额外肿瘤形式或生长的特异性记忆T细胞。例如，料想不到的是本发明的CAR T19细胞可经历强大的体内T细胞扩张和在血液和骨髓中以高水平持续延长量的时间和形成特异的记忆T细胞。不希望被任何具体理论限制，在遇到并随后消除表达替代抗原的靶细胞后，CAR T细胞可体内分化成中心记忆样状态。

不希望被任何具体理论限制，由CAR-修饰T细胞引起的抗肿瘤免疫性反应可以是主动或被动免疫反应。另外，CAR介导的免疫反应可以是过继免疫疗法的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导特异性针对CAR中抗原结合部分的免疫反应。例如，CAR T19引起特异地针对表达CD19的细胞的免疫反应。

尽管本文公开的数据具体公开了慢病毒载体包括来自FMC63鼠单克隆抗体的抗CD19 scFv、人CD8α铰链、和跨膜结构域、和人4-1BB和CD3ζ信号传导结构域，本发明应解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化，如本文其他地方所述的。即，本发明包括CAR中任何抗原结合部分产生特异地针对抗原结合部分的CAR-介导的T-细胞反应的用途。例如，本发明CAR的抗原结合部分可靶向肿瘤抗原，用于治疗癌症的目的。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、早幼粒细胞性、粒-单核细胞性、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒膜癌、维尔姆斯氏肿瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(诸如神经胶质瘤(诸如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也已知为多形性成胶质细胞瘤)星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。

在一个实施方式中，本发明CAR的抗原结合部分部分被设计以治疗具体的癌症。例如，设计为靶向CD19的CAR可用于治疗癌症和病症，包括但不限于前-BALL(儿童指征)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、扩散大B-细胞淋巴瘤，同种骨髓移植后的补救等等。

在另一实施方式中，CAR可设计为靶向CD22，以治疗扩散大B-细胞淋巴瘤。

在一个实施方式中，癌症和病症包括但不限于前-B ALL(儿童指征)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、扩散大B-细胞淋巴瘤，同种骨髓移植后的补救等等可使用靶向CD19、CD20、CD22和ROR1的CAR的组合进行治疗。

在一个实施方式中，CAR可设计为靶向间皮蛋白，以治疗间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等等。在另一实施方式中，CAR可设计为靶向CD33/IL3Ra，以治疗急性骨髓性白血病等等。在进一步的实施方式中，CAR可设计为靶向c-Met，以治疗三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌等等。

在一个实施方式中，CAR可设计为靶向PSMA，以治疗前列腺癌等等。在另一实施方式中，CAR可设计为靶向糖脂F77，以治疗前列腺癌等等。在进一步的实施方式中，CAR可设计为靶向EGFRvIII，以治疗胶质母细胞瘤等等。

在一个实施方式中，CAR可设计为靶向GD-2，以治疗成神经细胞瘤，黑素瘤等等。在另一实施方式中，CAR可设计为靶向NY-ESO-1 TCR，以治疗骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等等。在进一步的实施方式中，CAR可设计为靶向MAGE A3 TCR，以治疗骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等等。

然而，本发明不应被解释为仅限于本文公开的抗原标靶和疾病。相反地，本发明应被解释为包括任何与可使用CAR治疗的疾病相关的抗原标靶。

本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩张细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

在此通过引用并入的在美国专利号5,199,942中描述的造血干细胞和祖细胞的离体扩张程序，可被应用至本发明的细胞。其他合适的方法在本领域中是已知的，因此本发明不限于细胞离体扩张的任何具体方法。简单地说，T细胞的离体培养和扩张包括：(1)从外周血收获物或骨髓外植体收集来自哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩张这样的细胞。除了美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子，其他因子诸如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体，也可用于培养和扩张细胞。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫反应的组合物和方法。

通常地，如本文所述活化和扩张的细胞可用于治疗和预防无免疫反应的个体中产生的疾病。特别地，本发明的CAR-修饰的T细胞用于治疗CCL。在某些实施方式中，本发明的细胞用于治疗处于形成CCL风险中的患者。因此，本发明提供了治疗或预防CCL的方法，其包括给需要其的对象施用治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。

本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2或其他细胞因子或细胞群组合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的状况、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和状况的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量——包括那些范围内的所有整数值——施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

在某些实施方式中，可期望向对象施用活化的T细胞，并随后重新抽取(redraw)血液(或实施单采血液成分术)，根据本发明活化来自其中的T细胞，和用这些活化和扩张的T细胞再注入该患者。该过程可每几个周进行多次。在某些实施方式中，T细胞可从10cc至400cc的血液抽取中进行活化。在一些实施方式中，T细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的血液抽取中进行活化。不被理论所束缚，利用多份血液抽取/多个再输注方案可用于选出某些T细胞群。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤、淋巴结或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的CARs和方法或本领域已知的其他将T细胞扩张至治疗性水平的方法活化和扩张的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用试剂进行治疗，诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫烧蚀剂诸如CAM PATH、抗-CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇类、FR901228、细胞因子和照射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶——钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等，Cell 66:807-815,1991；Henderson等，Immun.73:316-321,1991；Bierer等，Curr.Opin,Tmmun.5:763-773,1993)。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体诸如OKT3或CAMPATH的T细胞烧蚀疗法结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的细胞组合物在B-细胞烧蚀疗法诸如与CD20反应的试剂例如Rituxan后进行施用。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗，之后进行外周血干细胞移植的标准治疗。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩张的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩张的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗状况的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。例如，CAMPATH的剂量对于成人患者将通常在1至大约100mg的范围中，通常每天施用，持续1和30天之间的时期。尽管在一些例子中可使用上至40mg每天的较大剂量(美国专利号6,120,766中描述)，但优选的日剂量为1至10mg每天。

实验实施例

本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。

没有进一步的描述，相信利用先前的描述和以下的说明性实施例，本领域技术人员可制造和利用本发明的化合物，并实践请求保护的方法。以下工作实施例因此具体指出本发明的优选实施方式，并不解释为以任何方式限制本公开背景的剩余部分。

实施例1：组成型CAR T细胞增殖

过继免疫疗法具有有效的抗肿瘤作用，其依赖宿主中转移的T细胞的移入和增殖。本文呈现的结果显示某些嵌合抗原受体(CARs)赋予T细胞经历长期自主增殖的能力。用编码CD28和CD3ζ内结构域的第二代CARs转导人T细胞导致通过TCR的单个刺激之后持续增殖达三个月。该数字的扩张不依赖抗原刺激和不需要添加外源细胞因子或饲养细胞。基因阵列和功能测定已鉴定延长的生长部分地由组成型细胞因子产生介导。微阵列分析鉴定具有组成型增殖表型的CAR T细胞的独特的分子标签。内源IL-2基因座的持续表达先前在初级T细胞中未报道。CD28和CD3ζ内结构域似乎是关键性的，因为观察到通过NFkB、Akt、Erk和NFAT的组成型信号传导。进一步，不是所有通过CD28和CD3ζ发信号的CARs可维持不依赖配体的T细胞增殖。增殖的CAR+T细胞保持不同的TCR所有组成成分和未观察到转化。在细胞表面CAR表达的密度是在确定CAR是否具有组成型或可诱导的生长表型中的重要变量。允许广泛的T细胞增殖而无需外源细胞因子施用或饲养细胞的CAR设计的鉴定可对利用或避免具有组成型活性的CARs具有含意。

现在描述用于该实施例的材料和方法。

材料和方法

具有不同真核启动子和CARs的慢病毒载体的构建

图1A显示用于该研究的CARs示意图。所有CARs含有scFv，其识别人CD19、间皮蛋白或c-Met抗原。来自先前发表的工作的慢病毒载体用于编码抗CD19FMC63 CD8α(Tammana et al.,2010,Hum Gene Ther 21:75-86)、抗间皮蛋白SS1CD8α和抗间皮蛋白SS1 CD8αΔt尾CAR构建物(Carpenito et al.,2009,Proc NatlAcad Sci USA 106:3360-3365)。c-Met 5D5 IgG4构建物用作模板以通过PCR剪接和重叠延伸而产生SS1 IgG4和CD19 IgG4 CAR构建物。限制位点通过PCR引物引入，这允许克隆进第三代自身灭活慢病毒质粒。巨细胞病毒(CMV)和延伸因子-1(EF-1？启动子序列通过PCR从先前构建的质粒扩增并利用标准的分子生物学技术引入预先存在的含有CAR的构建物(Milone et al.,2009,Mol Ther 17:1453-1464)。代表性的CARs在下面描述。

cMet IgG4 28z

atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgtgagctgccccaccccgcctttctgctgatccccgacatccagatgacccagagccccagcagcgtgagcgccagcgtgggcgaccgggtgaccatcacctgccgggccagccagggcatcaacacctggctggcctggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgccagcagcctgaagagcggcgtgcccagccggtttagcggctctggctctggcgccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcaggccaacagcttccccctgacctttggcggcggaacaaaggtggagatcaagggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggccaggtgcagctggtgcagagcggagccgaggtgaagaagcctggcgcctccgtcaaggtgtcctgcgaggccagcggctacaccttcaccagctacggcttcagctgggtgcggcaggcaccaggccagggcctcgaatggatgggctggatcagcgccagcaacggcaacacctactacgcccagaagctgcagggcagggtcaccatgaccaccgacaccagcaccagcagcgcctacatggaactgcggagcctgagaagcgacgacaccgccgtgtactactgcgccagggtgtacgccgactacgccgattactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgagagcaagtacggccctccctgccccccttgccctgcccccgagttcctgggcggacccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagccccgggaggagcagttcaatagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggaatacaagtgtaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagcctcgggagccccaggtgtacaccctgccccctagccaagaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagccggctgaccgtggacaagagccggtggcaggagggcaacgtctttagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgtccctgggcaagatgttctgggtgctggtcgttgtgggcggcgtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttttgggtgaggagcaagcggagcagactgctgcacagcgactacatgaacatgaccccccggaggcctggccccacccggaagcactaccagccctacgcccctcccagggatttcgccgcctaccggagccgggtgaagttcagccggagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggccggagggaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagccccggagaaagaacccccaggagggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcggggcaagggccacgacggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgccccccagatga(SEQ ID NO:1)

SS1 IgG4 28z

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CD19 IgG4 28z

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微阵列研究

样品采集。来自三个正常供体的人CD4+T细胞用c-Met IgG4或CD19 CD8αCAR构建物刺激和转导。在刺激之前第0天，对于所有样品静止下来的第6天和第11天和对于c-Met IgG4 CAR在第24天将细胞沉淀物收集和冷冻。

微阵列靶标制备和杂交。通过UPenn微阵列设施提供微阵列服务，包括通过Agilent Bioanalyzer和Nanodrop分光光度法的总RNA样品的质量对照测试。如在Affymetrix GeneChip表达分析技术手册中描述进行所有的方案。简单地说，使用poly(T)启动的逆转录酶和并入T7启动子序列的随机寡聚物将100ng的总RNA转化成第一链cDNA。使用用于线性扩增每个转录体的T7 RNA聚合酶体外转录，之后进行第二链cDNA合成，并且将所得cRNA转化成cDNA，片段化，通过Bioanalyzer评估，并且通过末端转移酶末端标记生物素化。cRNA产量范围从36-89ug，并且将cDNA添加至Affymetrix杂交混合物，在99℃下加热5min并且在45℃下与人基因1.0ST GeneChips(Affymetrix Inc.，Santa Clara CA)杂交16h。然后在低(6×SSPE)和高(100mM MES，0.1M NaCl)严格性下冲洗微阵列并且用链霉抗生物素-藻红蛋白染色。在570 nm激发之后共焦扫描仪用于收集荧光信号。

最初的数据分析。Affymetrix命令控制台和表达控制台用于量化靶向基因的表达水平；Affymetrix提供的默认值用于所有分析参数。移除边界像素，并且对每个探针计算75％内的平均强度像素。将出现在每个16微阵列区域的平均最低2％的探针强度设置为背景并且减去该区域的所有特征。在表达控制台中检测阳性和阴性对照的探针组，并且设施质量控制参数被确认落入正常范围。平均每个靶向基因的探针并且使用RMA算法进行阵间归一化。

末端端粒限制性片段长度分析

末端端粒限制性片段长度分析基本上如所描述的进行(Lukens et al.,2009,Alzheimers Dement 5:463-469)。简单地，2μg基因组DNA用RsaI+HinfI消化并在0.5％琼脂糖凝胶上分辨，然后将其干燥和用³²P-标记的(CCCTAA)4寡核苷酸探查。冲洗之后，样品用磷显像仪可视化。

统计分析

获自微阵列核心的原始数据用稳健的多芯片平均(RMA)归一化。分析利用3向混合模型ANOVA——因子是样品日期、治疗组和供体ID——进行。加入样品和采集日期之间的交互作用项。连同多个配对对照测定，所述对照被看作p值和倍数变化。对于所有p值，我们利用Benjamini和Hochberg的方法计算FDR校正的p值，如by Partek Genomic Suite(Partek)所实现的。对于转录因子和细胞因子点图，绘制归一化的绝对log(2)基因表达强度。聚类分析利用中值归一化的log(2)基因表达强度——具有平均连接——的欧几里德距离进行。所有的生长曲线、MFI和移入图利用Prism(GraphPad Software)绘制。所有的误差棒代表标准差。双尾Mann-Whitney检验针对体内移入研究进行。

细胞系和培养

血液样品获自宾夕法尼亚大学人类免疫学中心，其中外周血CD4+T细胞利用RosetteSep Kits(Stem cell Technologies)阴性分离。细胞在R10(RPMI 1640培养基——补充有10％FCS、100-U/ml青霉素、100μg/ml青霉素、10 mM Hepes)中在37℃和5％CO2培养箱中培养。对于刺激，将CD4+T细胞与包被有针对CD3和CD28的抗体的激活珠以1:3的细胞与珠的比进行培养。刺激之后大约24hrs，细胞用含有CAR构建物的慢病毒载体转导。监测T细胞，保持在0.75×10⁶/mL的浓度，当MCV<175时认为是静息的。M30和NCI-H522肿瘤系用于细胞杀伤试验。M30细胞系(Crisantiet al.,2009,Mol Cancer Ther 8:2221-2231)是得自宾夕法尼亚大学来自个体患者间皮瘤组织的间皮肿瘤，并在E-培养基(RPMI中10％FCS、1×ITES、10mM HEPES、0.5mM丙酮酸钠、0.1mMMEM NEAAs、100ug/mL青霉素/链霉素、1ng/mL EGF、18ng/mL HC、0.1nM T3)中培养，而NCI-H522(腺癌)获自国家癌症研究所并在R10中培养。用含有d2EGFP的质粒在带有NFAT共有结合序列的最小启动子控制下(pNFAT-d2EGFP)稳定转染的Jurkat细胞系由Arthur Weiss(在旧金山的加利福尼亚大学)友好地提供。

流式细胞术和抗体

CAR表面染色利用生物素结合的多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch)在FACS缓冲液(具有3％胎牛血清的PBS)中进行。兔抗人IgG(H+L)用于cMet IgG4、SS1 IgG4和CD19 IgG4，而山羊抗小鼠(Fab’)2用作SS1 CD8a、CD19 CD8a和SS1Δ尾的一抗。CAR的二次染色利用链菌抗生素(streptavadin)-APCeFluor780(eBioscience)进行。细胞表面标记分析利用以建议的浓度的CD25PerCp-Cy5.5(eBioscience，克隆BC96)、CD70 PE(BD，克隆Ki-24)、PD-1PerCP-eFluor710(eBioscience，克隆J105)、CD45RO eFluor450(eBioscience，克隆UCHL1)、CD27 v450(BD，克隆M-T271)、CD28 FITC(eBioscience，克隆CD28.2)、CD62L PE(eBioscience，克隆DREG-56)、CCR7 FITC(BD，克隆150503)、CrtamAPC(Biolegend，克隆Cr24.1)和c-Met PE(R&D systems，克隆95106)进行。c-Met抗原染色利用单克隆抗人HGF R/c-MET-PE(R&D，克隆#95106)进行，间皮蛋白表达用以1:50的初级单克隆小鼠抗人CAK1(Covance)，之后是以1:100的多克隆山羊抗小鼠PE(BD)进行分析。样品在LSR II(BD)上分析和用FlowJo软件(TreeStar)分析。

PhosFlow在第6、10和25天进行。细胞利用BD细胞固定缓冲液(BD)在37C固定10min，之后利用BD Phosflow Perm缓冲液III(BD)在4C渗透化30分钟。将细胞在RT在暗处利用以产品建议浓度的PE抗Erk1/2(pT202/pY204)(BD，克隆20A)、PE结合的抗Akt(pS473)(BD，克隆M89-61)、PE结合的抗NF-kB p65(pS529)(BD，克隆K10-895.12.50)或PE结合的抗S6(pS235/pS236)(BD，克隆N7-548)染色30min。阳性对照是来自在固定之前利用PMA/离子霉素刺激10min的每个组的样品，而阴性对照是完全刺激的利用PE结合的IgG2bκ同种型对照(BD，克隆27-35)染色的T细胞。样品在LSR II(BD Bio-sciences)上进行和用FlowJo软件(TreeStar)分析。

细胞因子测量

CD4+T细胞用如本文别处所描述的CAR构建物转导。在第6、10、和30天，一百万细胞取自每组、制成小球形、在R10中冲洗和以在新鲜培养基中1×10^6/mL铺板。在24hrs，将上清液收集并在-80℃冷冻。可溶细胞因子的定量利用Luminex珠阵列技术和购自Life Technologies(Invitrogen 30-plex)的试剂盒进行。测定按照制造者协议和根据实验室SOP进行，9点标准曲线利用3倍稀释系列产生。每个样品以1:3稀释一式二份进行评价；针对双份测量的计算的％CV大多数情况下小于5％并总是小于15％。数据在FlexMAP-3D上获得和利用XPonent 4.0软件和5参数逻辑回归分析进行分析。标准曲线定量范围由80-120％(观察到的/期望值)范围确定。

条件培养液转移

在第56天收集来自c-Met IgG4转导的T细胞培养物的上清液，通过70μm滤器过滤并以10mL等分部分在-80℃冷冻。将第56天的培养基解冻并加入到培养基中未受刺激的天然CD4+T细胞以达到相对开始培养基12.5％、25％和50％c-Met IgG4上清液的终浓度。作为对照，还包括具有和没有100IU IL-2的培养基，以及保持在培养物中的CD3/CD28珠刺激细胞，在第0天最初刺激和在第12天再刺激。每两天测定均细胞体积，并且重新调整细胞培养基以将IL-2浓度保持在对照组内和本文别处描述的适当的c-Met IgG4培养基转移率。

Vβ多样性测定

将CD4+人T细胞分离、用c-Met IgG4 CAR刺激和转导，如本文别处所描述的。同时刺激和扩张供体配对的未转导的细胞作为对照。未转导的对照需要两个另外的珠刺激以在培养物质中维持。细胞在D0、D13和D34冷冻保存。细胞同时解冻和允许放置一晚上。TCR Vβ分析利用IOTest Beta Mark TCR V试剂盒(BeckmanCoulter)进行，所述试剂盒含有对以下Vβ家族特异的直接结合的抗体：1、2、3、4、5.1、5.2、5.3、7.1、7.2、8、9、11、12、13.1、13.2、13.6、14、16、17、18、20、21.3、22和23。样品在LSR II(BD)上进行，随后在FlowJo(TreeStar)中分析以测定全部群体的百分比。

细胞毒性测定

用编码指示的CAR的mRNA电穿孔的CD4+和CD8+人T细胞的混合物用于体外杀伤。将CD19 CD8α和c-Met IgG4 CARs亚克隆进先前描述的基于pGEM.64A的载体(Zhao et al.,2006,Mol Ther 13:151-159)。如所描述的制备SS1 CD8αCARmRNA(Zhao et al.,2010,Cancer Res 70:9062-9072)。替换的CAR cDNAs通过直接测序来证实并在RNA IVT之前通过SpeI消化而线性化。mScript RNA System(Epicentre,Madison,WI)用于产生加帽的IVT RNA。IVT RNA利用RNeasy Mini Kit(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)纯化，并将纯化的RNA在无RNA酶的水中以1–2 mg/ml洗脱。如所描述的将人T细胞通过CD3/CD28珠刺激(Carpenito et al.,2009,Proc Natl Acad SciUSA106:3360-3365)。在第0天将刺激的T细胞用Opti-MEM冲洗三次并在电穿孔之前在Opti-MEM中以1–3×10⁸/ml的终浓度重悬浮。随后，将刺激的T细胞与10μg/0.1ml IVT RNA(如所指示的)混合并在2-mm比色杯(Harvard Apparatus BTX,Holliston,MA)中利用ECM830 Electro Square Wave Porator(Harvard Apparatus BTX)电穿孔。然后将肿瘤系用胰蛋白酶收获和以0.2×10^6/mL铺在6孔皿中。T细胞电穿孔和肿瘤平板接种后24小时将T细胞与靶细胞以渐增的效应器:靶(E:T)比率也在6孔板中混合，在无T细胞对照旁边。细胞在37℃温育18hrs。温育之后将细胞收集，将孔重新进行胰蛋白酶作用和重复冲洗以收集所有的肿瘤和T细胞。将细胞混合物针对肿瘤用抗EpCAM(BD，克隆EBA-1)染色，针对T细胞用抗CD45(BD，克隆2D1)和用7-AAD(Invitrogen)染色。将细胞在400uL含有计数珠的FACS缓冲液(Invitrogen)中重悬浮以归一化跨样品的数据获取。然后将样品通过35μm滤器(BD Falcon)过滤和置于冰上用于分析。将细胞在LSR II(BD)上运行和对于所有样品通过收集1500个珠事件而进行收集。分析通过在FlowJo(TreeStar)中在EpCAM(+)、CD45(-)和7-AAD(-)细胞上选通(gating)而进行。百分比溶胞通过将渐增的E:T比率的每个实验条件除无T细胞对照组中总的活细胞来计算。

体内T细胞持久性实验

所有的动物实验由宾夕法尼亚大学协会动物护理和使用委员会批准。NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ)用于移入和持久性实验。小鼠圈养在微型隔离笼中的无病原体条件下并且给予自由采食高压灭菌的食物和酸化的水的自由。两种性别的动物在大约20周龄用于实验。将人CD4+T细胞分离、刺激和转导，如先前所描述的。将总共10×10⁶细胞/小鼠通过尾静脉注射剂外周注射，在c-Met IgG4组中，其50％是CAR(+)。60天之后，抽取外周血并利用抗人CD45 APC-H7染色进行TruCounts(BD)用于绝对定量。样品在LSR II(BD Bioscience)上分析和利用FlowJo(TreeStar)进行定量。

DNA分离和Q-PCR分析

Q-RT/PCR分析：RNA利用RNAqueous RNA分离试剂盒(Ambion)分离自细胞系，并利用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)合成cDNA。样品的c-met、间皮蛋白和PP1B(管家转录物)表达利用ABI Taqman基技术和下面的ABI建议的跨越外显子/内含子边界的基因特异引物探针组分析：c-met：Hs01565584_m1*；间皮蛋白：HS00245879_m1*和PP1B：Hs00168719_m1*。所有扩增反应利用ABI 7500 FAST仪器(ABI-Life technologies)和建立的实验室规程进行。评价每个转录物一式三份。每个扩增反应的Ct值利用预先建立的试验特异的阈值来测定，2/3的最小值与记录Ct值需要的％CV<15％重复。计算和记录平均Ct值。每个转录物的RQ(相对定量)值根据以下公式测定：RQ＝2--ΔCt，其中-ΔCt＝-ΔCt样品--ΔCt参考，其中-ΔCt样品＝Ct样品-Ct样品归一化子和-ΔCt参考＝Ct参考-Ct参考归一化子(Pfaffl,2001,NucleicAcids Res 29(9):e45)。对于所有的分析，卵巢癌细胞系OV79(对于两个MAGE-A3都是阳性的)充当参考样品。来自卵巢癌的细胞系OV-79先前已被描述(Bertozzi etal.,2006,In Vitro Cell Dev Biol Anim 42(3-4):58-62)。

现在描述该实验实施例的结果。

嵌合抗原受体的构建和表征

已产生过多的CARs，其表达抗体片段下游的CD28和CD3ζ，其介导替代物抗原识别(Geiger et al.,2001,Blood 98:2364-2371；Arakawa et al.,2002,AnticancerResearch 4285-4289；Haynes et al.,2002,J Immunol 169(10):5780-6；Maher et al.,2002,Nature Biotechnology 20:70-75；Finney et al,2004,J Immunol 172:104-113；Gyobu et al.,2004,Cancer Res 64:1490-1495；Moeller et al.,2004,Cancer Gene Ther11:371-379；Teng et al.,2004,Hum Gene Ther 15:699-708；Friedmann-Morvinski et al.,2005,Blood 105:3087-3093；Pule et al.,2005,Molecular Therapy 12:933-941；Westwood et al.,2005,Proc Natl Acad Sci USA 102:19051-19056；Willemsen et al.,2005,J Immunol 174:7853-7858；Kowolik et al,2006,Cancer Res 66:10995-11004；Loskog et al.,2006,Leukemia 20:1819-1828；Shibaguchi et al.,2006,Anticancer Res26:4067-4072；Teng et al.,2006,Human Gene Therapy 17:1134-1143；Brentjens et al.,2007,Clin Cancer Res 13:5426-5435)。假定这些转基因被不同地和通过不同研究者在不同研究所构建，依然不知道这些CARs将如何用通常的表达系统和已针对临床使用优化的标准化的培养系统进行。因此，靶向c-Met、间皮蛋白和CD19的一组CARs在原代人CD4+T细胞中表达(图1A)。CARs编码IgG4或CD8α铰链结构域、CD28或CD8α跨膜结构域，和信号传导结构域由CD28和CD3ζ组成。具有截短的信号传导结构域的CAR和先前临床试验中使用的CD194-1BB:CD3ζCAR(Porter etal.,2011,N Engl J Med 365:725-733)充当对照。所有CARs利用EF-1α启动子组成型表达，并且在典型的实验中50％的细胞最初表达CAR和到转导之后6天具有表面上相似的表达水平(图1B)。c-Met CAR T细胞具有特异和有效的细胞毒性(图8)，并且先前的研究已显示对CD19和间皮蛋白特异的CARs具有相似的有效的效应器功能(Carpenito et al.,2009,Proc Natl Acad Sci USA 106:3360-3365；Milone et al.,2009,Mol Ther 17:1453-1464)。

具有CD28和CD3ζ的嵌合抗原受体可诱导组成型T细胞增殖

先前的研究提示CAR T细胞注入之后的抗肿瘤作用需要过继转移之后CAR T细胞的持续体内扩张(Kalos et al.,2011,Sci Transl Med 3:95ra73)。为了测定CAR T细胞的增殖能力，将CD4+T细胞用抗CD3和CD28珠活化，用编码CAR的慢病毒载体转导和然后在缺少外源细胞因子或饲养细胞的情况下增殖而没有进一步刺激。料想不到地，观察到CAR T细胞群体中一些的组成型增殖(图2A，左)。在用编码CD28和CD3ζ信号传导结构域的c-Met IgG4构建物转导的CAR T细胞中观察到指数生长持续60至90天(图2A和2B)。相似地，表达通过嵌合CD28和CD3ζ结构域发信号的抗间皮蛋白SS1:IgG4和SS1:CD8αCARs的T细胞也具有不依赖补充外源生长因子的持续增殖。还观察到不依赖抗原刺激和不需要添加外源细胞因子或饲养细胞的CD8+T细胞的长期增殖(图2C)。然而，为了最小化实验变量，该研究剩余的实验利用大量CD4+T细胞进行。

相比之下，具有其它CAR T细胞群体的培养物具有以相同速度的初期指数增殖，10天之后，生长速度渐降，之后是在20天内培养物死亡(图2A和2B)。为了简单和清楚，诱导组成型增殖的CAR构建体自此以后称作“连续的CARs”，而显示与先前报道相似的可诱导的增殖的CARs称作“典型的CARs”。

平均细胞体积以频繁的间隔监测，作为代谢状态和细胞周期的测量(图2A，右)。所有的用各种CAR构建物转导的T细胞培养物从～190fl的静息(G0)细胞体积增加到培养第6天几乎600fl，与DNA合成的诱导和细胞数目的指数增加一致。然而，典型的CAR T细胞和非转导的T细胞迅速恢复到静息细胞体积，而连续的CAR T细胞(c-Met IgG4,SS1 IgG4和SS1 CD8α)不能恢复到静息细胞体积，与连续的细胞增殖一致。在培养的第20天，连续的CARs和典型的CARs培养物中的平均细胞体积分别是～400fl和180fl。值得注意地，CAR T细胞的长期增殖不依赖配体，因为替代物配体cMet和间皮蛋白不以可检测的水平在活化的人CD4+T细胞表面上表达(图9)，与先前的报道一致(Skibinski et al.,2001,Immunology 102:506-514)。Q-PCR分析不检测静息CD4 T细胞中间皮蛋白或c-Met的转录物。然而，活化的T细胞——模拟转导的或用连续的CAR转导和在导致长期生长的条件下培养的——表达非常低的但是可检测的对c-Met特异的转录物，而间皮蛋白转录物仍然不能检测。假定c-Met和间皮蛋白(mesothlelin)特异的CARs显示连续生长表型，活化的T细胞中低水平的c-Met表达不太可能是T细胞持久生长所需要的。此外，培养物中缺少自相残杀与不依赖配体的连续生长一致。

连续的和典型的CARs以预期的大小移动，如用抗CD3ζ抗体探查的蛋白质印迹所测定的。编码较长IgG4铰链的CARs移动较编码CD8α铰链的CARs更慢(图10)。在非还原条件下，这些CARs作为同型二聚体和单体存在。由CD28:CD3ζCARs介导的连续的不依赖细胞因子的多克隆CD4+T细胞增殖不依赖内源TCR的特异性，并且不是克隆的向外生长的结果，因为T细胞群体在培养期间保持多样的(图11)。最后，以上结果在获自至少10个不同健康供体的T细胞上是可重现的。

IL-2的组成型表达和不同的细胞因子和趋化因子阵列

趋化因子

不希望被任何具体理论束缚，认为能介导初级T细胞长期组成型增殖的CARs的观察先前未被报道。为了开始理解该现象的机制，设计实验以测定来自培养物的上清液中各种细胞因子和其它免疫相关因子的水平可在培养中维持它们罕见的长寿。蛋白质水平的分析显示来自连续的CARs的培养物上清液含有高水平的Th1和Th2 CD4+T细胞特征性的细胞因子(图3A)。相比之下，典型的CAR T细胞的培养物具有低水平细胞因子，其随着培养时间而降低。所述差别在数量上是巨大的，因为连续的CARs的培养物中细胞因子浓度较典型的CAR培养物中的浓度高100至>1000倍。细胞因子可能有助于增殖，因为第56天来自连续的CAR T细胞培养物的条件培养基的转移诱导未受刺激的天然CD4+T细胞活化(图3B)。这些结果在转录水平被证实，与典型的CAR T细胞相比，分离自组成型增殖CAR T细胞的细胞中具有针对IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-13、IL-3和GM-CSF的转录物的显著表达(图4A)。与该发现一致，观察到最初由CAR T细胞和不表达CAR的T细胞混合物组成的培养物中连续的CAR T细胞比正常的T细胞生长得快(图5A)。除了细胞因子和趋化因子的持续转录和分泌，连续的CAR CD4+T细胞具有升高水平的粒酶B和穿孔蛋白(图4A)，与观察到的(图8)和先前报道的(Carpenito et al.,2009,Proc Natl AcadSci USA 106:3360-3365)有效的细胞毒性效应器功能一致。

组成型CAR T细胞增殖的分子标签

为了进一步研究长期CAR T细胞增殖的机制，设计实验以进行基因阵列分析。T细胞极化、生长和存活中涉及的关键转录因子和基因的分子标签显示在图4B中。连续的CAR CD4+T细胞中主要转录因子T-bet(TBX21)、Eomes和GATA-3被诱导和保持在高水平。相比之下，连续的CAR T细胞中FoxP3和RORC以可与未转导的活化的T细胞和具有短暂T细胞增殖表型的T细胞相当的水平表达。早至第11天，与典型的CAR和其它对照T细胞群体相比，Bcl-xL在连续的CAR T细胞中高表达(p<0.001)，提示对凋亡的抵抗以及提高的增殖对CAR T细胞的长期增殖有贡献。连续的CAR T细胞还保持KLRG1——常常在末端分化的和衰老的CD4+T细胞中表达的基因——的低水平表达(Voehringer et al.,2002,Blood 100:3698-3702)，进一步强调它们的增殖能力。

微阵列数据组的分级聚类分析指出具有组成型T细胞增殖的CAR T细胞具有独特的分子标签(图6)。值得注意的，到第11天，具有长期生长表型的cMet IgG4 CART细胞在树形图中紧密聚集。相比之下，在培养的第11天天然的T细胞大部分与未转导的T细胞和具有未持续生长表型的典型的CARs紧密相关(图6A)。相似地，来自所有组的完全活化的第6天T细胞聚集在一起，而表达连续的CAR构建体的T细胞到第11天出现差异，显示独特的RNA标签，其区别于在第6天在未转导或典型的CAR T细胞中表达的基因(图6B)。

将连续的CAR(c-Met IgG4)和典型的CAR(CD19 CD8α)T细胞中差异表达的基因绘制为热图以描述两个群体的关系(图6C)。当利用严格的5倍截止值在培养的第11天分析时，与典型的CAR T细胞相比，连续的CARs中183个基因向上调节和36个基因向下调节。最显著地，连续的CAR T细胞富有与细胞周期的控制有关的基因和种类不同组的细胞因子。

连续的CARs引起的信号转导的组成型诱导

为了进一步研究连续的CAR依赖的和不依赖配体的T细胞生长的机制，设计实验以询问T细胞活化和生长中牵涉的标准的信号转导途径(图5B)。表达经典的或连续的CARs的T细胞在培养的第6天具有对Akt、ERK1/2、NF-κB p65(RelA)和S6的相似水平磷酸化。相比之下，只有连续的CAR T细胞在培养的第10和25天具有AktpS473、ERK1/2 pT202和pY204和RelA pS529的持续活化。然而，细胞中连续的CARs的表达对S6 pS240磷酸化只具有较小的作用，指示CARs不导致T细胞信号传导途径的普遍活化。组成型信号转导加上证明持续的细胞因子分泌的以上结果提示CAR的细胞内在和外在作用可导致初级人T细胞的长期扩张。

在以上实验中，对初级人T细胞用抗CD3和CD28珠进行单轮活化，然后进行培养而不添加外源细胞因子。选择该培养方法，因为它已用于临床试验，并且最初的活化是介导高效CAR表达必需的。为了测定是否抗CD3和抗CD28信号传导引起的T细胞的最初活化是随后CARs引起的组成型信号传导所需要的，我们在NFAT启动子的控制下稳定表达GFP的Jurkat T细胞系中表达了多种CARs(图12)。在转导之后3天分析细胞，只有连续的CARs——如在初级T细胞中生长表型所分类的——导致在Jurkat细胞中的组成型NFAT活化。该作用是细胞固有的，因为只有在表面上表达CARs的Jurkat细胞具有GFP表达。相比之下，典型的CARs(具有截短的细胞质结构域的SS1 CAR和CD19 CARs)的表达不导致Jurkat细胞中组成型NFAT活化。

表面表达水平对经典的或连续的CAR T细胞表型有贡献

已显示在初级T细胞中不同真核启动子控制下表达的CARs具有很大程度上变化的表面表达水平(Milone et al.,2009,Mol Ther 17:1453-1464)。为了测定表面表达水平是否对连续的CAR表型有贡献，利用EF-1α或CMV启动子表达CARs，导致更高或更低的表达(图7A)。当在EF-1α的控制下，c-Met CAR显示连续表型(图7B和7C)。相比之下，当在CMV启动子的控制下表达时，相同的CAR恢复典型的CAR表型，导致表面表达大约5倍减少。然而，不希望被任何具体理论束缚，认为鲜明的表面表达对连续的CAR表型可以不是足够的。因此在细胞表面的高水平表达可以是必需的，但是对连续的CAR表型不是足够的。

连续的CARs诱导T细胞分化和增殖而没有转化

多色流式细胞术用于进一步表征具有组成型增殖的CAR T细胞。在表达或不表达CAR的细胞培养物上检查与活化和分化相关的T细胞分子的表达(图13)。另外，在用抗CD3和CD28珠的单轮刺激之后，未转导的T细胞随着时间跟随着(图14)。结果显示观察到针对CAR T细胞的渐进的富集，以至于到培养的第23天，基本上所有的细胞表达CAR。这与CAR T细胞上所有时间CD25的鲜明表达相关，而CD25到第14天在非转导的陪伴对照培养中变得不可检测(图14)。相似地，CD70以渐进地更高频率在CAR T细胞培养中表达，在对照培养中未观察到该特征。相比之下，CD27，CD70的配体，在对照培养中表达，而CD27在CAR T细胞培养中渐进地降低。CD28、CD62L和CCR7表达在对照培养中保持，而连续的CAR T细胞中的许多对这些分子变得暗淡或阴性。相比之下，PD-1在对照培养中在第6天短暂表达，而CAR T细胞具有显著的保持PD-1表达的细胞亚群。最后，Crtam，与细胞极性调节相关的分子(Yeh et al.,2008,Cell 132:846-859)，在连续的CAR T细胞培养中被诱导，并且Crtam的表达显著限于在表面表达CARs的T细胞。

CAR T细胞转化的可能性通过观察长期体外培养物和通过将CAR T细胞转移到免疫缺陷小鼠来评价。长期培养的CAR T细胞不具有端粒末端转移酶的组成型表达，如通过hTERT表达所评价的(图4B)，并且端粒长度在连续的CAR T细胞的培养中随着时间降低(图15)。相比之下，已报道转化的人T细胞具有组成型端粒末端转移酶活性(Hsu et al.,2007,Blood 109:5168-5177)。迄今为止，在超过20个实验中，对于用连续的CARs转导的T细胞，尚未观察到转化。

作为检测转化可能性的潜在更敏感的测定，利用NSG(NOD-SCID-γc-/-)小鼠，因为前研究所已显示过继转移的转化的和恶性T细胞可在免疫缺陷小鼠中形成肿瘤(Newrzela et al.,2011,Mol Med 17:1223-1232)。多组小鼠用完全活化的T细胞或用连续的CAR T细胞组注入，通过小鼠中T细胞定量来评价增殖，和通过小鼠中异种移植物抗宿主病的诱导来评价效应器功能(图16)。到第60天，与c-Met IgG4 CAR组中的3/10相比，异种反应性(等级1-3 xGVHD)在未转导组的5/10小鼠中观察到。肿瘤形成在尸检未观察到，并且T细胞移入水平在用连续的CAR T细胞或用抗CD3和CD28刺激的未转导的初级T细胞移入的小鼠中相似(p＝0.39)。

嵌合抗原受体可维持长期T细胞增殖而没有转化

本文呈现的结果涉及料想不到的发现：一些含有CD28和CD3ζ串联信号传导结构域的CARs的表达导致初级人T细胞的组成型活化和增殖。观察到一些CAR T细胞显示大量种类不同的细胞因子的组成型分泌和因此不需要添加外源细胞因子或饲养细胞来保持增殖。这是令人惊讶的，因为在描述赋予CD28结构域的CARs的众多先前的报道(Krause et al,1998,J Exp Med 188:619-626；Finney et al.,1998,Journalof Immunology 161:2791-2797；Geiger et al.,2001,Blood 98:2364-2371；Arakawa etal.,2002,Anticancer Research 4285-4289；Haynes et al.,2002,J Immunol169(10):5780-6；Maher et al.,2002,Nature Biotechnology 20:70-75；Finney et al,2004,J Immunol 172:104-113；Feldhaus et al.,1997,Gene Ther 4:833-838；Moeller et al.,2004,Cancer Gene Ther 11:371-379；Teng et al.,2004,Hum Gene Ther 15:699-708；Friedmann-Morvinski et al.,2005,Blood 105:3087-3093；Westwood et al.,2005,ProcNatl Acad Sci USA 102:19051-19056；Pule et al.,2005,Molecular Therapy 12:933-941；Willemsen et al.,2005,J Immunol 174:7853-7858；Loskog et al.,2006,Leukemia20:1819-1828；Kowolik et al,2006,Cancer Res 66:10995-11004；Shibaguchi et al.,2006,Anticancer Res 26:4067-4072；Teng et al.,2006,Human Gene Therapy17:1134-1143；Brentjens et al.,2007,Clin Cancer Res 13:5426-5435；Alvarez-Vallinaet al.,1996,Eur J Immunol 26:2304-2309；Gyobu et al.,2004,Cancer Res64:1490-1495)中，这样的串联CARs的增殖已经是配体依赖性的，并且需要CAR T细胞的再刺激以保持增殖。这里，结果显示可导致具有连续T细胞增殖的CARs的表型的一个机制是在细胞表面的CAR的密度。

据认为这是“连续的CARs”，即，在培养中显示延长的指数扩张的初级T细胞是不依赖配体的和不依赖添加外源细胞因子或饲养细胞的首次描述。未转化的T细胞引起的持续几个月的细胞因子的大量组成型分泌是意料不到的。连续的CAR T细胞在培养期间渐进地向着终末效应器细胞分化，并且尚未观察到转化。生长表型的机制包括连续的不依赖配体的信号转导——包括标准的TCR和CD28信号转导途径。鉴定的导致连续的CAR T细胞的一个机制是scFv表面表达的水平，因为在细胞表面鲜明表达的CARs具有持续增殖，而以较低水平表达的CARs不显示持续增殖和细胞因子分泌。

因为几个原因，这些结果是值得注意的。scFv的性质在表型中起作用，因为我们已观察到具有scFv的连续的CAR表型，所述scFv对c-Met和间皮蛋白是特异的，但是至于对CD19特异的FMC63不是这样。该发现的含义是人们不能假设当表达有不同的scFv时，与给定的scFv连接的信号传导结构域的行为将是相同的。CAR表达的方法还对生长表型具有料想不到的贡献。迄今为止，当CARs通过编码睡美人转座子的mRNA或质粒的电穿孔表达时，尚未观察到T细胞的组成型生长(Zhao et al.,2010,Cancer Res 70:9062-9072；Huang et al.,2006,Blood 107:483-491；Singh et al.,2008,Cancer Research 68:2961-2971)。当利用慢病毒载体表达时，仅已观察到利用EF-1α启动子的载体中的连续生长。在比较慢病毒载体中几个启动子的先前的研究中，发现该启动子导致在初级CD4和CD8 T细胞中更稳定和更高水平表达(Milone etal.,2009,Mol Ther 17:1453-1464)。铰链和细胞外结构域的特定设计似乎对连续生长表型不具有重要贡献，因为已观察到具有编码较长IgG4铰链或较短CD8α支架的CARs的该现象。CAR的高水平表达似乎对连续生长表型是必需的。

据认为这是在初级非转化的T细胞中内源IL-2基因的组成型表达的首次报道。先前的研究已显示IL-2和CD25的组成型表达发生在导致T细胞转化的条件下，更显著地在HTLV-1感染中(McGuire et al,1993,J Virol 67(3):1590-1599)。可能是CAR编码的CD28细胞质结构域的持续的信号传导是IL-2和众多其它细胞因子的组成型分泌的原因。有意思的是已报道由tax引起的HTLV-1介导的IL-2表达和内源CD28途径驱动的IL-2分泌抵抗环孢菌素(Good et al.,1997,J Biol Chem 272(3):1425-1428；June et al.,1987,Mol Cell Biol 7(12):4472-4481)，其是抑制钙神经素磷酸酶的免疫抑制剂。

本文呈现的结果提示在一些CARs的情况下，CD28跨膜和细胞质结构域的过度表达可导致组成型信号传导。因此，可能的是，内源CD28基因表达的调节是T细胞稳态的关键性决定因素，与显示CD28配体的过度表达导致小鼠中T细胞增生的研究(Yu et al.,2000,J Immunol 164:3543-3553)一致。

对于为什么人T细胞随着年龄和细胞分裂而渐进地向下调节CD28表达的理解不多(Goronzy et al,.2012,Semin Immunol 24(5):365-72)。组成型CAR T细胞以鲜明水平保持CAR表达并具有较典型的CARs或未转导的T细胞更迅速的内源CD28分子下调。CD28中双亮氨酸基序对小鼠T细胞上CARs的限制性表达有贡献，并且突变该序列导致CAR表达增加(Nguyen et al.,2003,Blood 102(13):4320-5)。已被测试的组成型CAR T细胞利用CD28内结构域中野生型双亮氨酸基序。

本文呈现的数据指示给定随意的scFv，表达水平的5倍变化可导致连续的CAR表型。这可解释为什么其它实验室尚未利用其它表达系统检测到该现象。

先前的研究已测试了被转导以组成型表达IL-2的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，并且在具有转移性黑素瘤的患者中IL-2 TIL不具有较传统TIL更好的有效性(Heemskerk et al.,2008,Human Gene Therapy 19:496-510)。相似地，在用IL-15基因逆转录病毒转导之后，人CD8 T细胞中IL-15的组成型表达导致在缺少外源细胞因子的情况下克隆的向外生长(Hsu et al.,2007,Blood 109:5168-5177)。

使用4-1BB信号传导结构域的CD19 CARs的安全性和临床益处已被报道(Porter et al.,2011,N Engl J Med 365:725-733；Kalos et al.,2011,Sci Transl Med3:95ra73)。表达该CAR的T细胞具有提高的不依赖配体的增殖(Milone et al.,2009,Mol Ther 17:1453-1464)但是不具有本文已描述的长期连续生长表型。含有CD28信号传导结构域的CARs现在已在几个临床试验中测试安全性(Savoldo et al.,2011,JClin Invest 121:1822-1825；Brentjens et al.,2011,Blood 118:4817-4828；Kochenderfer et al.,2010,Blood 116:4099-4102；Till et al.,2012,Blood119:3940-3950；Kochenderfer et al.,2012,Blood 119:2709-2720)。然而重要的是，指出在用不同表培养系统和用逆转录病毒载体而不是用于目前工作的慢病毒载体制造之后，那些试验表达CARs。可进行实验以测定是否连续的CARs如这里报道的那些将是有用和安全的临床情况。

本文引用的每一和每个专利、专利申请和出版物的公开内容在此都通过引用全文并入本文。尽管已经参考具体实施方式公开了本发明，但显而易见的是可由本领域技术人员想出本发明的其他实施方式和变形，而不脱离本发明的真实精神和范围。所附权利要求意欲被解释为包括所有这样的实施方式和等同变形。

Claims (32)

1.编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述CAR包括抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，并且进一步其中当所述CAR转导进T细胞时，所述CAR对以下中的至少一个有贡献：所述转导的T细胞的不依赖抗原的活化增加、所述转导的T细胞的平均细胞体积(MCV)增加、所述转导的T细胞的细胞群体扩张增加、所述转导的T细胞的增殖增加、所述转导的T细胞的子代数目增加、效应器细胞因子分泌增加、粒酶的表达持续、所述转导的T细胞群体的体外持久性增加、或所述转导的T细胞群体的体内持久性增加。

2.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述铰链结构域是IgG4铰链结构域。

3.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述抗原结合结构域是抗cMet结合结构域，所述铰链结构域是IgG4，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域，和所述共刺激信号传导区是CD28信号传导区。

4.权利要求3所述的分离的核酸序列，其中所述CAR包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

5.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述抗原结合结构域是抗间皮蛋白结合结构域，所述铰链结构域是IgG4铰链结构域，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域，和所述共刺激信号传导区是CD28信号传导区。

6.权利要求5所述的分离的核酸序列，其中所述CAR包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

7.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述抗原结合结构域是抗CD19结合结构域，所述铰链结构域是IgG4铰链结构域，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域，和所述共刺激信号传导区是CD28信号传导区。

8.权利要求7所述的分离的核酸序列，其中所述CAR包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

9.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段。

10.T细胞，其包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，所述CAR包括抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，并且其中当所述CAR转导进T细胞时，所述CAR对以下中的至少一个有贡献：所述转导的T细胞的不依赖抗原的活化增加、所述转导的T细胞的平均细胞体积(MCV)增加、所述转导的T细胞的细胞群体扩张增加、所述转导的T细胞的增殖增加、效应器细胞因子分泌增加、粒酶的表达增加、所述转导的T细胞的子代数目增加、所述转导的T细胞群体的体外持久性增加、或所述转导的T细胞群体的体内持久性增加。

11.权利要求10所述的T细胞，其中所述铰链结构域是IgG4铰链结构域。

12.权利要求10所述的T细胞，其中所述抗原结合结构域是抗cMet结合结构域，所述铰链结构域是IgG4铰链结构域，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域，和所述共刺激信号传导区是CD28信号传导区。

13.权利要求12所述的T细胞，其中所述CAR包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

14.权利要求10所述的T细胞，其中所述抗原结合结构域是抗间皮蛋白结合结构域，所述铰链结构域是IgG4铰链结构域，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域，和所述共刺激信号传导区是CD28信号传导区。

15.权利要求14所述的T细胞，其中所述CAR包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

16.权利要求10所述的T细胞，其中所述抗原结合结构域是抗CD19结合结构域，所述铰链结构域是IgG4铰链结构域，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域，和所述共刺激信号传导区是CD28信号传导区。

17.权利要求16所述的T细胞，其中所述CAR包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

18.权利要求10所述的T细胞，其中所述抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段。

19.权利要求10所述的T细胞，其中当所述抗原结合结构域结合其相应的抗原时，所述细胞显示抗肿瘤免疫。

20.载体，其包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，所述CAR包括抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，并且其中当所述CAR转导进T细胞时，所述CAR对以下中的至少一个有贡献：所述转导的T细胞的不依赖抗原的活化增加、所述转导的T细胞的平均细胞体积(MCV)增加、所述转导的T细胞的细胞群体扩张增加、所述转导的T细胞的增殖增加、所述转导的T细胞的子代数目增加、所述转导的T细胞群体的体外持久性增加、或所述转导的T细胞群体的体内持久性增加。

21.权利要求20所述的载体，其中所述铰链结构域是IgG4铰链结构域。

22.权利要求20所述的载体，其中所述抗原结合结构域是抗cMet结合结构域，所述铰链结构域是IgG4铰链结构域，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域，和所述共刺激信号传导区是CD28信号传导区。

23.权利要求22所述的载体，其中所述CAR包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

24.权利要求20所述的载体，其中所述抗原结合结构域是抗间皮蛋白结合结构域，所述铰链结构域是IgG4铰链结构域，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域，和所述共刺激信号传导区是CD28信号传导区。

25.权利要求24所述的载体，其中所述CAR包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

26.权利要求20所述的载体，其中抗原结合结构域是抗CD19结合结构域，所述铰链结构域是IgG4铰链结构域，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域，和所述共刺激信号传导区是CD28信号传导区。

27.权利要求26所述的载体，其中所述CAR包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

28.权利要求20所述的载体，其中所述抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段。

29.基因修饰的T细胞的持续性群体，其中所述T细胞包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，所述CAR包括抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，并且其中当所述CAR转导进T细胞时，所述CAR对以下中的至少一个有贡献：所述转导的T细胞的不依赖抗原的活化增加、所述转导的T细胞的平均细胞体积(MCV)增加、所述转导的T细胞的细胞群体扩张增加、所述转导的T细胞的增殖增加、所述转导的T细胞的子代数目增加、所述转导的T细胞群体的体外持久性增加、或所述转导的T细胞群体的体内持久性增加。

30.权利要求29所述的基因修饰的T细胞的持续性群体，其中当抗原结合结构域结合其相应的抗原时，所述基因修饰的T细胞显示抗肿瘤免疫。

31.权利要求29所述的基因修饰的T细胞的持续性群体，其中所述T细胞显示包括至少一个选自以下的细胞因子的细胞因子标签：IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B、穿孔蛋白、和其任何组合。

32.权利要求29所述的基因修饰的T细胞的持续性群体，其中所述T细胞在缺少外源细胞因子或饲养细胞的情况下增殖。