CN104086610A

CN104086610A - 利用模拟移动床纯化莱鲍迪a苷的方法

Info

Publication number: CN104086610A
Application number: CN201410355039.5A
Authority: CN
Inventors: 李云峰
Original assignee: LIAONING QIANQIAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: LIAONING QIANQIAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2014-07-24
Filing date: 2014-07-24
Publication date: 2014-10-08
Anticipated expiration: 2034-07-24
Also published as: CN104086610B

Abstract

本发明公开了一种利用模拟移动床纯化莱鲍迪A苷的方法：取甜菊糖粗提取物，进行模拟移动床色谱分离，条件为：所用固定相为选购自德国MERCKLiChroprepNH₂的制备级填料；移动相为80.7%乙醇水溶液；分离后，得纯化的莱鲍迪A苷。实验室条件时，应具备如下条件：管柱为8根管柱，均为直径10mm、长度15cm的不锈钢管柱，流速为：Q_D=5.0mL/min，Q_F=0.1mL/min，Q_E=3.0mL/min，Q_R=2.1mL/min；切换时间为8.0～8.25分钟。本发明的利用模拟移动床纯化莱鲍迪A苷的方法，可将莱鲍迪A苷的纯度由54%（甜菊糖粗提取物中莱鲍迪A苷的纯度）提高至97%，而回收率也可达到80%以上，提纯效果显著。

Description

利用模拟移动床纯化莱鲍迪A苷的方法

技术领域

本发明涉及一种利用模拟移动床纯化莱鲍迪A苷的方法。

背景技术

模拟移动床(Simulated Moving Bed, SMB)系属连续式色谱的一种，由于固定相与移动相不断逆向流动连续接触，因而使得固定相的使用效率提高，亦可达到连续进料提高产量的目的。SMB在操作上系藉由进、出料口位置不断切换，以模拟固定相与移动相逆向流动之现象，图1、图2为SMB系统示意图，系统系由8支填充管柱串联而成。图1共设有4个进、出料口，分别为进料(Feed)与流动相(Desorbent)的进料口，以及萃出液(Extract)、萃馀液(Raffinate)出料口。当固定四个进出料口流速以及回流的液体流速，并操作一段时间以后，再将所有进出料口的位置同时向右移动一根管柱，并再一次持续一段时间以后再一次将进出料口再向右移动一根管柱，经过不断切换管柱的进出料口之后，便可模拟固体向左流动的行为。因此，本技术被称之为模拟移动床技术。

若以进、出料口位置切分8支管柱成为4个不同功能的区段，则图中Section I主要系利用干净的移动相将固定相上的残留物完全去除，以便固定相继续循环至Section IV；Section IV则是利用干净的固定相将移动相中残留物去除，以便移动相回流继续使用；Section II与Section III则分别用以浓缩提纯待分离物中强滞留性成份及弱滞留性成分。如果以4区段的SMB来说明操作方式，则进料会由C4、C5间以定量泵注入系统，其中滞留性较弱之成份会被由左向右流动的流动相所冲涤，并从萃馀液出料口流出，因此可在萃馀液得到纯的弱滞留性物质，而滞留性较强的物质会被固定相携带前往左边然后从萃出液出料口流出。在某些情况下，移动相也可不回收，此时系统则被分成3个区段，如图2。

在一个既定的SMB设备上，如图1的SMB，则控制模拟移动床的参数计有各区段与回流的流速以及切换时间。假设溶质在固定相与流动相之间的吸附为线性吸附，而且在两相间可快速达到吸附平衡，则可分离两成分的操作条件必须满足以下的不等式：

（1）

其中K_A与K_B则为强滞留成分A与弱滞留成分B的亨利吸附常数，而m_j为在j区段内流动相体积流速与固体体积流速的比值，定义为：

（2）

Q_j为液体在第j区段的流速，t_sw为管柱切换时间，V_C为空管柱体积，ε为管柱总孔隙度，V^D为每一根管柱的平均死角体积。

因此若以第二区段的m₂为横轴，第三区段的m₃为纵轴，则可以完全分离的操作条件正好座落于(m₂, m₃)平面的直角三角形内。在三角形的顶点则具有最佳的分离效果以及分离效率。除了第二与第三区段的相对流速要坐落于三角形之内以外，第一与第四区段也必须同时满足(1)式。

甜菊糖苷又称作甜菊糖（Stevia sugar，SS），甜叶菊叶子提取物，不含糖分和热量；色泽白色至微黄色，口感适宜、无异味，是发展前景广阔的新糖源。甜菊糖苷是目前世界已发现并经我国卫生部批准使用的甜味剂，其天然低热值并且非常接近蔗糖口味。是继甘蔗、甜菜糖之外第三种有开发价值和健康推崇的天然甜味剂，被国际上誉为“世界第三糖源”。目前为止,已从甜叶菊中分离得到8种糖苷，一般市售的甜菊粗糖含有大约5种不同成分的糖苷(总含苷量在90%以上)，其中甜菊苷(SS)的含量最高，甜度约为蔗糖的200倍，略带苦味；莱鲍迪A苷(RA)甜度约为蔗糖的300～450倍，无苦味且味道接近蔗糖，是甜菊糖苷的高端产品，可被欧美国家认可作为食品添加剂。如何从甜菊糖苷中提取纯化高纯度的莱鲍迪A苷，是当前研究的热点。现有技术中存在多种从甜菊糖苷中提取纯化莱鲍迪A苷的方法，但在莱鲍迪A苷的纯度，以及回收率方面，不甚理想，尚有改进的余地。

由于莱鲍迪A苷与甜菊苷的化学结构极为接近，目前产业以甲醇为主要溶剂进行多次结晶以纯化莱鲍迪A苷，学术界则使用甲醇或乙腈等溶剂利用吸附或色谱等方法进行纯化。结晶法回收率偏低，同时也大量使用甲醇作为溶剂，不但制程易燃易爆，产品也有残留甲醇之疑虑。吸附或是色谱方法则因为产物被严重稀释所以能耗大，同时也必须使用有害人体健康的溶剂。采用高速逆流色谱(high speed countercurrent chromatography)虽然可以同时获得高纯度的莱鲍迪A苷与甜菊苷，但是使用了多种溶剂，而且放大生产的工艺仍然不可行。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种利用模拟移动床纯化莱鲍迪A苷的方法，本发明使用对人体无害的乙醇与水作为溶剂的色谱方法纯化甜菊粗糖中菜鲍迪A苷，可连续生产制造，且提纯得到的莱鲍迪A苷的纯度高，可达97%以上。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种利用模拟移动床纯化莱鲍迪A苷的方法：取甜菊糖粗提取物，进行模拟移动床色谱分离，条件为：所用固定相为选购自德国MERCK LiChroprep NH₂的制备级填料；移动相为80.7%乙醇水溶液（体积百分数）；分离后，得纯化的莱鲍迪A苷。

进一步地，实验室条件时，应具备如下条件：管柱为8根管柱，均为直径10 mm、长度15 cm的不锈钢管柱，流速为：Q_D = 5.0 mL/min，Q_F = 0.1 mL/min，Q_E = 3.0 mL/min，Q_R = 2.1 mL/min；切换时间为8.0～8.25分钟（优选8.25分钟）。

所述甜菊糖粗提取物为市售甜菊糖，进行分离时，用水稀释至莱鲍迪A苷的浓度为25～30g/L，再进料。

本发明的利用模拟移动床纯化莱鲍迪A苷的方法，可将莱鲍迪A苷的纯度由54%（甜菊糖粗提取物中莱鲍迪A苷的纯度）提高至97%，而回收率也可达到80%以上，提纯效果显著。

附图说明

图1：四区段SMB系统示意图。

图2：三区段SMB系统示意图。

图3：市售甜菊糖苷层析图谱。

图4：甜菊苷与莱鲍迪A苷的制备级色谱图。

图5： SMB长时间操作之莱鲍迪A苷(图5A)与萃馀物(图5B)。

图6：各实验操作条件在(m₂, m₃)座标平面与三角形理论所定义的可分离区域。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1 甜菊苷与莱鲍迪A苷的定量分析方法

本实施例所使用之化学药品：

乙腈(AcN)：HPLC分析级(ChromAR)，MACRON CHEMICALS。

甜菊苷：HPLC分析级(≧96%)，成都曼斯特生物科技有限公司。

莱鲍迪A苷：HPLC分析级(≧96%)，SIGMA。

本发明以HPLC进行莱鲍迪A苷之定量分析。使用之色谱管柱为Supelcosil LC-NH2 ( 250 × 4.6 mm, 5 um)管柱。HPLC系由HITACHI L-2130液泵，20微升取样迴圈，HITACHI L-2455 Diode Array Detector所构成，而面积积分所使用的UV波长为210 nm。移动相组成为AcN/DIW=75/25(V/V)。本研究同时制作了RA与SS的检量线：

（3）

图3即为此次试验所用甜菊粗糖之层析图谱。图3中滞留时间在9.4 min之波峰即为本研究拟纯化的莱鲍迪A苷(Rebaudioside A，RA)，4 min左右之波峰则为溶剂，其馀滞留时间在5～8.5 min之波峰则被视为不纯物。不纯物当中，在7.4 min出现的讯号峰则是甜菊苷(Stevioside，SS)的波峰。另依据所制备的检量线，分析从市场购得之甜菊粗糖样品，发现所含之RA与SS分别为54 wt%与25 wt%，其余则为其它糖苷或杂质。

实施例2 利用模拟移动床纯化莱鲍迪A苷

一种选购自MERCK LiChroprep NH₂的制备级填料，粒径40～60微米，以干式方法填充于直径10 mm而长度为15 cm的不锈钢管柱内。以流速为3.0 mL/min的80.7%乙醇水溶液（体积百分数）作为移动相，分别进行800与1000 mg/L的甜菊苷与莱鲍迪A苷之色谱分析，如图4。图4中展示甜菊苷色谱图以及莱鲍迪A苷的色谱图。

图4的色谱显示两种成分的讯号峰相当对称，因此甜菊苷与莱鲍迪A苷在所选购的填料与80.7%乙醇水溶液之间的吸附行为接近线性的吸附行为。依据色谱理论，线性吸附的溶质之亨利吸附常数可以使用下式进行估算：

（4）

式中t_R与t_o系溶质与不滞留成分在色谱的滞留时间(Retention Time)，ε则是管柱孔隙度(Pororsity)。本研究所使用的管柱之孔隙度测定为0.52。依据图4的色谱图，甜菊苷与莱鲍迪A苷的滞留时间分别为8.29与8.92分钟，而不滞留成分的滞留时间则假定为图4中的负吸收峰位置，3.16分钟。据此，甜菊苷与莱鲍迪A苷的线性吸附常数分别为1.76与1.98。

实施例3 利用模拟移动床纯化莱鲍迪A苷

本发明以图2的SMB纯化甜菊粗糖（购自台湾市场）中的莱鲍迪A苷，所采用的8根管柱与实施例2相同。

为了方便说明SMB的操作条件对纯化莱鲍迪A苷含量的影响，本发明定义在萃出端的莱鲍迪A苷纯度如下：

（5）

其中A代表色谱图的面积，上标E代表在萃出端的样品，而下标RA与imp分别代表莱鲍迪A苷与其余不含莱鲍迪A苷的所有溶质成分。本发明仅使用面积比定义纯度，而未直接使用第(3)式的检量线来定义纯度。第(3)式的检量线显示甜菊苷的响应(2778.2)高于莱鲍迪A苷的响应(2383.6)，所以真正的纯度估计应略高于以面积比所计算之纯度。

同时为了了解莱鲍迪A苷的回收率，本发明定义莱鲍迪A苷的制程回收率如下：

（6）

式中Q_R与Q_E分别代表萃馀端与萃出端的液体流速。

本发明在固定的进料与出料流速下，Q_D = 5.0 mL/min(流动相流速)，Q_F = 0.1 mL/min(进料流速)，Q_E = 3.0 mL/min，Q_R = 2.1 mL/min，试验了一系列不同切换时间的分离试验，如表1。实验的结果显示当切换时间在8.0与8.25 min分钟时纯度最高，莱鲍迪A苷的回收率也可以达80%以上。所以，本发明继续以切换时间为8.25 min的操作条件进行4天的操作连续操作，也确认了SMB系统的稳定性与可靠性。长时间操作所收集的样品，也显示莱鲍迪A苷的纯度高达97%以上，如图5。

表1 SMB操作条件及实验结果

Run	t_sw (min)	Purity	Recovery	Remark
					1	6.00	0.65	1.00
2	7.50	0.95	1.00
					3	7.75	0.94	1.00
4	8.00	0.96	0.82
					5	8.25	0.97	0.51
6	8.50	0.95	0.54
					7	8.83	0.84	0.11

如果把甜菊苷与莱鲍迪A苷当作待分离的两个成分，则依据三角形理论，可分离甜菊苷与莱鲍迪A苷的SMB操作条件，其第二区段与第三区段的液体与固体之相对体积流速，必须满足以下的不等式：

（7）

依据三角形理论，在(m₂, m₃)的座标平面上，可分离的操作条件将形成一个直角三角形。如果同时将表1的各实验条件在第二与第三区段之相对体积流速也同时标示于(m₂, m₃)座标平面之上，可以发现切换时间为8.0与8.25分钟时最接近三角形，因此可以获得最佳的分离效果，如图6。

Claims

1.一种利用模拟移动床纯化莱鲍迪A苷的方法：其特征在于：取甜菊糖粗提取物，进行模拟移动床色谱分离，条件为：所用固定相为选购自德国MERCK LiChroprep NH₂的制备级填料；移动相为80.7%乙醇水溶液；分离后，得纯化的莱鲍迪A苷。

2.根据权利要求1所述的利用模拟移动床纯化莱鲍迪A苷的方法：其特征在于：所述条件还包括：管柱为8根管柱，均为直径10 mm、长度15 cm的不锈钢管柱，流速为：Q_D = 5.0 mL/min，Q_F = 0.1 mL/min，Q_E = 3.0 mL/min，Q_R = 2.1 mL/min；切换时间为8.0～8.25分钟。

3.根据权利要求2所述的利用模拟移动床纯化莱鲍迪A苷的方法：其特征在于：所述切换时间为8.25分钟。

4.根据权利要求1所述的利用模拟移动床纯化莱鲍迪A苷的方法：其特征在于：进行模拟移动床色谱分离时，先用水将甜菊糖粗提取物稀释至莱鲍迪A苷的浓度为25～30g/L，再进料。