CN108129529B - 一种分离纯化甜菊糖单体的方法 - Google Patents

一种分离纯化甜菊糖单体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种分离纯化甜菊糖单体的方法，属于分离提纯技术领域，具体包括：将甜菊糖样品与乙腈水溶液混合得到甜菊糖样品液，以氨基填料为固定相，乙腈水溶液为流动相，将样品液经过三区带模拟移动床色谱分离体系进行分离得到甜菊苷和莱胞迪苷A。本发明运用三区带模拟移动床色谱分离系统，从甜菊糖中离出的甜菊苷和莱胞迪苷A纯度高，且分离工艺简单，流程连续且自动化，产率高，溶剂消耗低且可以重复利用，实现了清洁生产。

Description

一种分离纯化甜菊糖单体的方法
技术领域
本发明涉及分离提纯技术领域，特别涉及一种分离纯化甜菊糖单体的方法。
背景技术
甜菊糖是一种高甜度、低热量的天然甜味剂，甜菊糖拥有多种单体，鲍迪苷A(Rebaoudioside-A，RA)与甜菊苷(Stevioside，ST)是最常见的两种单体，其中莱鲍迪苷A的甜度是蔗糖的350～450倍，甜菊苷的甜度是蔗糖的250～300倍。同时甜菊糖具有耐热、防腐等稳定性能，也可作为甜味剂添加到食品、药品、化妆品等中来增加其保存期。另外，根据大量毒性学研究表明，甜菊糖在人体内很容易被消化排出，同时也有另外的研究显示他还可以降血压、血糖、胆固醇以及调节免疫功能等特殊的生理活性，使它也成为了一种优质的保健品。
现有的甜菊糖分离提纯的方法主要有高速逆流色谱(HSCCC)、制备色谱法和大孔吸附树脂吸附法。Zhenbin Chen等人利用大孔吸附树脂对甜菊糖进行提纯，采用LZ-1+LZ-20+LZ-30+LZ-37+LZ-36的混合树脂，混合比例为m(LZ-1):m(LZ-20):m(LZ-30):m(LZ-37):m(LZ-36)＝2:3:1:3:2，其他操作参数设置为C0＝0.416mg/mL,V＝50mL,pH＝7,T＝65℃,E＝85％,ta＝90min,td＝120min，采用大孔吸附树脂生产，提取纯度较低，不能实现连续性生产(《Preparative separation of Rebaudiana A from commercialized steviolglycosides by macroporous adsorption resins mixed bed》[J],Zhenbin Chen等,Separation and Purification Technology,2012,89:22～30)。
发明内容
有鉴于此，本发明目的目的是在于提供一种分离纯化甜菊糖单体的方法，利用三区带模拟移动床色谱分离系统，从甜菊糖中离出的甜菊苷和莱胞迪苷A纯度高，流程连续且自动化。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种分离纯化甜菊糖单体的方法，包括以下步骤：
1)将甜菊糖样品与乙腈水溶液混合得到甜菊糖样品液，所述甜菊糖样品包括甜菊苷和莱胞迪苷A；
2)将所述甜菊糖样品液经过三区带模拟移动床色谱分离体系进行分离，得到单一组分的甜菊苷和莱胞迪苷A；所述三区带模拟移动床色谱分离体系的固定相为氨基填料，流动相为乙腈水溶液。
优选地，所述步骤1)中乙腈水溶液中乙腈的体积分数为60％～80％。
优选地，所述步骤1)中甜菊糖样品液中甜菊糖的质量浓度为0.1～50g/L。
优选地，所述步骤2)中氨基填料的粒径为5～100μm。
优选地，所述步骤2)中乙腈水溶液中乙腈的体积分数为60％～80％。
优选地，所述流动相的流速为0.1～10mL/min，所述甜菊糖样品液的流速为0.1～2mL/min；所述三区带模拟移动床色谱分离体系的萃取液流速为0.1～2mL/min、萃余液流速为0.1～10mL/min、切换时间为1～100min。
优选地，所述流动相的流速为0.5～5mL/min，样品液的流速为0.5～1.5mL/min；所述三区带模拟移动床色谱分离体系的萃取液流速为0.5～1.5mL/min、萃余液流速为0.5～5mL/min切换时间为5～50min。
优选地，所述三区带模拟移动床色谱分离体系的操作温度为10～40℃。
优选地，三区带模拟移动床色谱分离体系的色谱系统包括I区、II区和III区，所述Ⅰ区、Ⅱ区独立地包括1～6根色谱柱，所述Ⅲ区包括2～12根色谱柱。
有益技术效果：本发明采用三区带模拟移动床色谱分离系统对甜菊糖进行分离，从甜菊糖中离出的甜菊苷和莱胞迪苷A纯度高且分离工艺简单，流程连续且自动化，产率高，溶剂消耗低且可以重复利用，实现了清洁生产。实施例的数据表明，本发明提供的分离纯化甜菊糖单体的方法得到的莱鲍迪苷A(RA)的纯度为99.4％，回收率为96.6％，每公斤固定相每天生产量为3.62kg；甜菊苷(ST)的纯度为96.5％，回收率为99.4％，每公斤固定相每天生产量为3.72kg。
附图说明
图1为三区带模拟移动床色谱分离系统装置的示意图；
11-进样液泵，12-洗脱液泵，41-进样液阀，42-洗脱液阀，2-色谱柱系统，6-单向阀，5-四通，44-萃余液阀，43萃取液阀，13-萃取液泵，3-反压阀；
图2为实施例1中萃取液和萃余液的色谱分析图。
具体实施方式
本发明提供一种分离纯化甜菊糖单体的方法，包括以下步骤：
1)将甜菊糖样品与乙腈水溶液混合得到甜菊糖样品液，所述甜菊糖样品包括甜菊苷和莱胞迪苷A；
2)将所述甜菊糖样品液经过三区带模拟移动床色谱分离体系进行分离，得到单一组分的甜菊苷和莱胞迪苷A；所述三区带模拟移动床色谱分离体系的固定相为氨基填料，流动相为乙腈水溶液。
本发明将甜菊糖样品与乙腈水溶液混合得到甜菊糖样品液，所述甜菊糖样品包括甜菊苷和莱胞迪苷A。
在本发明中，所述甜菊苷和莱胞迪苷A的比例优选为1：1。
在本发明中，用于溶解所述甜菊糖样品的乙腈水溶液的体积分数优选为60％～80％，更优选为70％；所述甜菊糖样品液中甜菊糖的质量浓度优选为0.1～50g/L；更优选为5～25g/L。
本发明对所述混合的方式没有特殊限定，选用本领域技术人员熟知的混合方式即可。
得到甜菊糖样品液后，本发明将得到的甜菊糖样品液经过三区带模拟移动床色谱分离体系进行分离，得到单一组分的甜菊苷和莱胞迪苷A。
本发明将甜菊糖样品液经过三区带模拟移动床色谱分离体系进行分离得到萃取液和萃余液；所述萃取液中含有甜菊苷，所述萃余液中含有莱胞迪苷A。
在本发明中，所述三区带模拟移动床色谱分离体系的固定相为氨基填料，流动相为乙腈水溶液。
在本发明中，所述氨基填料的粒径优选为5～100μm，更优选为10～75μm，最优选为25～50μm；所述氨基填料优选为氨基键合硅胶填料6010-NH2作为流动相的所述乙腈水溶液的体积分数优选为60～80％，更优选为70％。
在本发明中，所述流动相的流速优选为0.1～10mL/min，更优选为0.5～5mL/min；所述甜菊糖样品液的流速优选为0.1～2mL/min，更优选为0.5～1.5mL/min；在本发明中，进样量为连续进样；
在本发明中，所述萃取液流速优选为0.1～2mL/min，更优选为0.5～1.5mL/min；所述萃余液流速为0.1～10mL/min，更优选为0.5～5mL/min。
在本发明中，所述三区带模拟移动床色谱分离体系的切换时间优选为1～100min，更优选为5～50min。
在本发明中，所述三区带模拟移动床色谱分离体系的操作温度优选为10～40℃，更优选为20～30℃。
在本发明中，所述三区带模拟移动床色谱分离体系包括三个恒流泵(进样液泵11、洗脱液泵12、萃取液泵13)、四个切换阀(进样液阀41、洗脱液阀42、萃取液阀43、萃余液阀44)、一个反压阀3和和色谱柱系统2，所述色谱柱系统包括N根色谱柱、N个单向阀6、2*N个四通5。所述进样液A和洗脱液B分别是由进样液泵11和洗脱液泵12输送到进样液阀41和洗脱液阀42，所述进样液阀41和洗脱液阀42均为1进N出的切换阀，任一时刻只有一个出口和进口连通；N根色谱柱2相互串联在一起，每根色谱柱的进口端连接一个四通5，四通5的另外三个口分别连接上一根色谱柱的出口、进样液阀41、洗脱液阀42，每根色谱柱2的出口也连接一个四通5，该四通5的另外三个口分别连接下一根色谱柱的进口、萃取液阀43和萃余液阀44，萃取液阀43和萃余液阀44均为N进1出的切换阀，任一时刻只有一个进口与出口连通，萃取液阀43的出口连接萃取液泵13，萃取液泵13外接一个反压阀3，而后连接萃余液收集瓶；萃余液阀44的出口与萃余液收集瓶相连，相邻四通5之间设有单向阀6；通过控制四个切换阀的位置，可以设置三个区带的色谱柱数目，从而构成一个开环的三区带模拟移动床系统。本发明对所述三区带模拟移动床色谱分离体系的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的三区带模拟移动床色谱分离体系市售商品即可。
在本发明中，所述三区带模拟移动床色谱分离体系的色谱系统优选包括I区、II区和III区，所述I区、II区独立地优选包括1～6根色谱柱，更优选包括2～4根色谱柱；所述III区优选包括2～12根色谱柱，更优选包括4～10根色谱柱。
在本发明中，所述色谱柱的规格优选为(50～500)*(4.6～50)mm，更优选为150*10mm。
在本发明中，所述三区带模拟移动床色谱分离体系分离具体操作过程为：甜菊糖样品液和流动相分别由进样液泵11和洗脱液泵12注入到色谱系统，通过三区模拟移动床色谱系统的切换控制器，定期控制气动阀的开闭，使洗脱液阀42、萃取液阀43、进样液阀41、萃余液阀44沿着单向阀6所指的方向定期切换，使甜菊糖的两个单体分别从萃取液泵13和萃余液阀44流出系统。
得到萃取液和萃余液后，本发明优选将所述萃取液和萃余液分别依次进行浓缩和干燥得到莱鲍迪苷A和甜菊苷。本发明对所述浓缩、干燥的方法没有特殊限制，选用本领域技术人员熟知的浓缩、干燥的方法，能够除去乙腈和水即可。
下面结合实施例对本发明提供的分离纯化甜菊糖单体的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、设备参数选择：采用三区带模拟移动床色谱系统，该系统包括色谱系统分为I区、II区和III区，N＝4，色谱柱数分别为1、1、2。
色谱柱的型号为150*10mm，固定相为氨基键合硅胶填料6010-NH2，填料的粒径为60.4μm，流动相为乙腈体积分数为70％的乙腈水溶液。
2、甜菊糖样品液配置：将甜菊糖与乙腈体积分数为70％的乙腈水溶液混合，得到质量浓度为0.5g/L的甜菊糖样品液。
3、将甜菊糖样品液A和流动相B分别从进样液泵11和洗脱液泵12注入到三区带模拟移动床色谱系统，通过三区带模拟移动床色谱系统的切换控制器，定期控制气动阀的开闭，使洗脱液阀42、萃取液阀43、进样液阀41、萃余液阀44沿着单向阀所指的方向定期切换，使甜菊糖的两个单体分别从萃取液泵13和萃余液阀44流出系统，分别对萃取液和萃余液进行浓缩、干燥得到莱鲍迪苷A和甜菊苷纯品。
具体操作条件如下
流动相：乙腈体积分数为70％的乙腈水溶液
甜菊糖样品液浓度：甜菊糖的浓度为0.5g/L，其中莱鲍迪苷A浓度为0.25g/L，甜菊苷浓度为0.25g/L。
洗脱液入口流速：QD＝2mL/min
萃取液出口流速：QE＝0.511mL/min
进样液入口流速：QF＝0.250mL/min
萃余液液入口流速：QR＝1.739mL/min
切换时间：ts＝12min
用HypersilNH2柱，Agilent1200高效液相色谱，检测波长210nm，流速1ml/min，分析萃取液和萃余液，结果如图2所示；其中萃取液中莱鲍迪苷A(RA)的纯度为99.4％，回收率为96.6％，每公斤固定相每天生产量为3.62g；萃余液中甜菊苷(ST)的纯度为96.5％，回收率为99.4％，每公斤固定相每天生产量为3.72g。
实施例2
1、设备参数选择：采用三区带模拟移动床色谱系统，该系统包括色谱系统分为I区、II区和III区，N＝4，色谱柱数分别为1、1、2。
色谱柱的型号为150*10mm，固定相为氨基键合硅胶填料6010-NH2，填料的粒径为60.4μm，流动相为乙腈体积分数为80％的乙腈水溶液。
4、甜菊糖样品液配置：将甜菊糖与乙腈体积分数为80％的乙腈水溶液混合，得到质量浓度为8.2g/L的甜菊糖样品液。
5、将甜菊糖样品液和流动相分别由进样液泵11和洗脱液泵12注入到三区带模拟移动床色谱系统，通过三区带模拟移动床色谱系统的切换控制器，定期控制气动阀的开闭，使洗脱液阀42、萃取液阀43、进样液阀41、萃余液阀44沿着单向阀所指的方向定期切换，使甜菊糖的两个单体分别从萃取液泵13和萃余液阀44流出系统，分别对萃取液和萃余液进行浓缩、干燥得到莱鲍迪苷A和甜菊苷纯品。
具体操作条件如下
流动相：乙腈体积分数为80％的乙腈水溶液
甜菊糖样品液浓度：甜菊糖的浓度为8.2g/L，其中莱鲍迪苷A浓度为4.1g/L，甜菊苷浓度为4.1g/L。
洗脱液入口流速：QD＝2mL/min
萃取液出口流速：QE＝0.34mL/min
进样液入口流速：QF＝0.125mL/min
萃余液液入口流速：QR＝1.785mL/min
切换时间：ts＝10.1min
用HypersilNH2柱，Agilent1200高效液相色谱，检测波长210nm，流速1ml/min，分析萃取液和萃余液。其中萃取液中莱鲍迪苷A(RA)的纯度为99.7％，回收率为94.1％，每公斤固定相每天生产量为34.6g；萃余液中甜菊苷(ST)的纯度为94.4％，回收率为99.7％，每公斤固定相每天生产量为36.7kg。
本发明以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种分离纯化甜菊糖单体的方法，包括以下步骤：
1)将甜菊糖样品与乙腈水溶液混合得到甜菊糖样品液，所述甜菊糖样品中包括甜菊苷和莱胞迪苷A；
2)将所述甜菊糖样品液经过三区带模拟移动床色谱分离体系进行分离，得到单一组分的甜菊苷和莱胞迪苷A；所述三区带模拟移动床色谱分离体系的固定相为氨基填料，流动相为乙腈水溶液；所述氨基填料的粒径为5～100μm；
所述三区带模拟移动床通过控制四个切换阀的位置，设置三个区带的色谱柱数目，从而构成一个开环的三区带模拟移动床系统；
所述三区带模拟移动床色谱分离体系的色谱系统包括I区、II区和III区，所述I区、II区独立地包括1～6根色谱柱，所述III区包括2～12根色谱柱；
所述三区带模拟移动床色谱分离体系包括三个恒流泵、四个切换阀、一个反压阀(3)和色谱柱系统，所述色谱柱系统包括N根色谱柱(2)、N个单向阀(6)、2*N个四通(5)；所述进样液A和洗脱液B分别是由进样液泵(11)和洗脱液泵(12)输送到进样液阀(41)和洗脱液阀(42)，所述进样液阀(41)和洗脱液阀(42)均为1进N出的切换阀，任一时刻只有一个出口和进口连通；N根色谱柱(2)相互串联在一起，每根色谱柱的进口端连接一个四通(5)，四通(5)的另外三个口分别连接上一根色谱柱的出口、进样液阀(41)、洗脱液阀(42)，每根色谱柱(2)的出口也连接一个四通(5)，该四通(5)的另外三个口分别连接下一根色谱柱的进口、萃取液阀(43)和萃余液阀(44)，萃取液阀(43)和萃余液阀(44)均为N进1出的切换阀，任一时刻只有一个进口与出口连通，萃取液阀(43)的出口连接萃取液泵(13)，萃取液泵(13)外接一个反压阀(3)，而后连接萃余液收集瓶；萃余液阀(44)的出口与萃余液收集瓶相连，相邻四通(5)之间设有单向阀(6)；通过控制四个切换阀的位置，可以设置三个区带的色谱柱数目，从而构成一个开环的三区带模拟移动床系统；
所述三个恒流泵为进样液泵(11)、洗脱液泵(12)和萃取液泵(13)；
所述四个切换阀为进样液阀(41)、洗脱液阀(42)、萃取液阀(43)和萃余液阀(44)；
所述三区带模拟移动床色谱分离体系分离具体操作过程为：甜菊糖样品液和流动相分别由进样液泵(11)和洗脱液泵(12)注入到色谱系统，通过三区模拟移动床色谱系统的切换控制器，定期控制气动阀的开闭，使洗脱液阀(42)、萃取液阀(43)、进样液阀(41)、萃余液阀(44)沿着单向阀(6)所指的方向定期切换，使甜菊糖的两个单体分别从萃取液泵(13)和萃余液阀(44)流出系统；
所述流动相的流速为0.1～0.5mL/min，样品液的流速为0.5～1.5mL/min；所述三区带模拟移动床色谱分离体系的萃取液流速为0.1～2mL/min、萃余液流速为0.1～1.785mL/min、切换时间为10.1～50min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中乙腈水溶液中乙腈的体积分数为60％～80％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中甜菊糖样品液中甜菊糖的质量浓度为0.1～50g/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中乙腈水溶液中乙腈的体积分数为60％～80％。
5.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，所述三区带模拟移动床色谱分离体系的操作温度为10～40℃。
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三区带模拟移动床分离邻香兰素与香兰素;陈金良 等;《厦门大学学报（自然科学版）》;20170731;第56卷(第4期);第492-498页 *
模拟移动床色谱法分离甜叶菊甙的工艺研究;孙大庆 等;《中国食品学报》;20160229;第16卷(第2期);第115-123页 *

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