CN104072628B - 复合酶法提取黄参多糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合酶法提取黄参多糖的工艺，是将黄参干燥、粉碎后加水，先微波提取，再用纤维素酶水解，然后用木瓜蛋白酶水解，灭酶，冷却，离心，取上清液，双层滤纸抽后减压浓缩，最后用乙醇沉淀，冷冻干燥得黄参多糖，多糖得率为18.92~21.35%。用苯酚‑硫酸法测定了提取物中多糖含量在88.33%±0.93%。用考马斯亮蓝法测定蛋白含量在2.17±1.03%。实验表明，本发明黄参多糖对实验性高血糖大鼠的血糖和血脂具有明显的抑制作用，安全无副作用。将冻干的提取物粉碎后制成片剂、硬胶囊、颗粒剂等，是一种具有调节血糖血脂功能的天然保健产品。

Description

复合酶法提取黄参多糖的方法

技术领域

本发明涉及一种黄参多糖的提取方法，尤其涉及一种复合酶法提取黄参多糖的方法。

背景技术

随着现今社会生活节奏加快，生活压力增加，患高血压、高血糖、高血脂症（并称三高症）的人群日益增长。现今，防治三高症主要依赖于西药，如防治高血压的卡托普利片、复方降压片、清脑降压片等，防治高血糖的主要是注射胰岛素或口服降糖药，防治高血脂症的药物如辛伐他丁、普拉固等。这些药物尽管见效较快，但对肝、肾等脏器损害较大。而纯天然植物提取物类药物具有作用温和、无毒副作用等优点，开发利用潜力很大。

黄参，又名黄葑，其形似人参，通体金黄。主要生长于沿祁连山、焉支山（又名大黄山）海拔2400～2900米的高寒湿润草原和丘陵地带，是多年生纯天然植物。据《本草纲目》记载，黄参味甘、性温，具有补气养血、滋阴壮阳、通经活络、健胃舒肝之功效。对中老年人胃气虚寒、神疲乏力，妇女气血失调，儿童发育迟缓、营养不良、挑食厌食效果俱佳，被誉为“小人参”。据北京食品研究所、甘肃农业大学等科研单位对山丹天然黄参检测鉴定，它的肉质直根富含人体必需的16种氨基酸、矿物质和钙、磷、铁、锌等微量元素，是一种经济、药用价值极高、纯天然绿色保健食品。黄参多糖（Sphallerocarpus gracilis polysaccha-ride,SGP）是由甘肃特色植物黄参中提取。近年研究证实，黄参多糖对运动时能量补充、激发糖代谢和能量代谢酶系活性有积极作用，同时在提高机体免疫能力及抗疲劳方面也有作用，能够有效地减小四氧嘧啶对胰岛细胞的损伤作用，提高细胞的存活率，促进胰岛素分泌，增强细胞内SOD的活性，降低细胞内MDA的含量。

专利CN101463094公开了一种黄参多糖制备方法，是将黄参粉碎成0.5cm大小的颗粒后，以水浸泡后煮沸提取，减压真空浓缩提取液，用乙醇静置沉淀，离心过滤去除上清液，收集沉淀物后喷雾干燥即得黄参多糖提取物。黄参多糖提取物的产率为15～30％，采用硫酸-苯酚法测定提取物中多糖含量为72％。《食品工业科技》 2012年09期 “波辅助提取黄参多糖的工艺研究”（杨小舟 张继 杨晓龙 王俊龙 高峰）公开了用微波辅助提取黄参多糖的工艺，首先通过单因素实验选取影响因素与水平，然后在单因素实验的基础上采用三因素三水平的Box-Benhnhen设，依据回归分析确定最佳提取工艺条件为：微波作用时间11.2min，微波功率375W，料液比1︰43g/mL，实多糖得率为11.7%，明显大于常规法得率6.2%。与常规提取方法相比，该方法在多糖得率和提取效率上有了大幅度提高，但是提取得到的多糖含量为68.82%，蛋白质含量为13.1%，虽然提取效率高但得到的产物中多糖含量低。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种复合酶法提取黄参多糖的方法。本发明复合酶法提取黄参多糖的方法，包括以下工艺步骤：

（1）微波提取：将黄参干燥、粉碎成粉末，过60目筛，以1﹕30～1﹕40 g/mL料液比加水，调节pH =5～7后，于55～65℃、微波功率为200～300W下微波提取8～13min；

（2）复合酶水解：微波提取后，在搅拌下（搅拌速度为800～1200r/min）先用干燥黄参质量1.5%～2.5%的纤维素酶（活力为5 万U/g）水解2～4h，再用干燥黄参质量0.3%～0.5%的木瓜蛋白酶（活力为65 万U/g）水解2～4h，然后于 90～95℃灭酶10～15min，冷却至室温，得提取液；

（3）浓缩、沉淀：提取液离心，取上清液，双层滤纸抽滤1～2次后，减压浓缩至体积为提取液体积的1/4～1/5，再加入体积为浓缩液3～4倍体积量的乙醇，充分搅拌后静置过夜；离心，取下层沉淀，冷冻干燥得黄参提取物。该工艺中，离心速度为4000～4500 r/min，离心时间为10～15min；减压浓缩的工艺条件为：压力0.07～0.09Mpa，温度60～70℃；冷冻干燥的工艺条件为：冷井温度为-60～-70℃，真空度为1～10pa，冷冻时间为5～8h，连续抽真空12～16h。黄参多糖的得率为18.92~21.35%。

本发明地方法是用微波提取后应用纤维素酶能使细胞壁破裂，细胞内物质充分流出，木瓜蛋白酶能使得提取物中的蛋白质从多糖分子上解离下来，从而大大提高了提取物中的多糖含量。用苯酚-硫酸法测定了本发明黄参提取物的多糖含量，测定五次，多糖含量在88.33%±0.93%。用考马斯亮蓝法测定了本发明产品的蛋白含量，测定五次，蛋白含量在2.17±1.03%。

为进一步证明本发明中提取的黄参多糖产品的主要成分及其药理作用，同时为了保证其安全性能，对本发明所提取的黄参多糖产品做了成分分析及其药理实验，具体的实验材料、试验方法和实验结果阐述如下：

实验材料：Wistar大鼠(160±20)g，雄性，甘肃省中医学院提供；四氧嘧啶(alloxan)，Sigma公司提供。

糖尿病大鼠模型的建立：Wistar大鼠适应喂养6天后，禁食24h，按200mg/(kg·Bw)的剂量经左腹腔一次性注射四氧嘧啶 (临用前用0.86%生理盐水新鲜配制)。3天后用尿糖试纸检测鼠尿，用血糖仪测空腹血糖，尿糖呈阳性(+++)、BG≥12.0mmol/L为糖尿病大鼠。

试验分组及处理方法：Wistar大鼠60只，共分5组，每组12只，如表1所示：空白对照组、模型对照组、高血糖+产品组(高、中、低3个剂量)。空白对照组和模型对照组灌胃生理盐水，体积均为1.5ml。高血糖+产品分为高（500mg/(kg·bw)）、中（250mg/(kg·bw)）、低（125mg/(kg·bw)）三个剂量组灌胃产品溶液。实验时间为4周，各组取空腹静脉血，用血糖仪测血糖浓度，实验数据用spss17.0处理。具体实验结果见表2~ 4。

上述实验结果表明，在腹腔注射注射四氧嘧啶72小时后，大鼠血糖均升高，呈现出糖尿病症状，给药4周以后，模型组大鼠血糖和产品组血糖均呈降低趋势，但产品组血糖均降低至正常水平，该产品可显著降低四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠的血糖水平，降低糖尿病大鼠血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDT-C)，提高糖尿病大鼠血清高密度脂蛋白(HDT-C)水平，能提高机体抗氧化功能，提高糖尿病大鼠血清SOD和CAT活性，降低MDA含量，清除体内的自由基，减小自由基对机体损伤作用，促进胰岛素分泌，降低血清葡萄糖水平。实验结果表明本产品对实验性高血糖大鼠的血糖和血脂具有明显的抑制作用，进而说明本发明提取的黄参提取物中多糖含量高，无副作用，安全可靠。将冻干的提取物粉碎后制成片剂、硬胶囊、颗粒剂等，是一种具有调节血糖血脂功能的天然保健产品。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明黄参多糖的提取工艺做进一步说明。

实施例1

（1）微波提取：取多年生的黄参，60℃干燥12h，粉碎机粉碎，过60目筛；按照1﹕30g/mL的料液比加水，调节pH值=5，设定温度为60℃，微波功率为200W，微波提取10min；

（2）双酶提取：调节搅拌速度为1200r/min，先用黄参质量1.5%的纤维素酶（5 万U/g）水解4h，再用黄参质量0.3%的木瓜蛋白酶（65万U/g）水解4h，90℃灭酶10min，冷却至室温，得提取液；

（3）浓缩、沉淀：将提取液在4500 r/min下离心10min，取上清液，双层滤纸抽滤2次，压力为0.07Mpa，60℃减压浓缩至体积为提取液体积的1/5，加入体积为浓缩后液体4倍体积95%的乙醇，充分搅拌，静置过夜；

（4）冷冻干燥：静置后在4000 r/min下离心10min，取下层沉淀，冷冻干燥得黄参提取物。冷冻条件：冷井温度为-65℃，真空度为1～10pa，冷冻8h，连续抽真空12h，干燥后得到黄参提取物。得率为20.67%

该提取物主要成分中含多糖88.16%，蛋白2.04%。

实施例2

（1）微波提取：取多年生的黄参，60℃干燥12h，粉碎机粉碎，过60目筛；按照1﹕34g/mL的料液比加水，调节pH值=5.5，设定温度为55℃，微波功率为220W，微波提取8min；

（2）双酶提取：调节搅拌速度为800r/min，先用黄参质量1.5%的纤维素酶（5 万U/g）水解3.5h，再用黄参质量0.3%的木瓜蛋白酶（65万U/g）水解3.5h，92℃灭酶12min，冷却至室温，得提取液；

（3）浓缩、沉淀：将提取液在4500 r/min下离心12min，取上清液，双层滤纸抽滤2次，压力为0.08Mpa，65℃减压浓缩至体积为提取液体积的1/5，加入体积为浓缩后液体3倍体积95%的乙醇，充分搅拌，静置过夜；

（4）冷冻干燥：静置后在4500 r/min下离心12min，取下层沉淀，冷冻干燥得黄参提取物。冷冻条件：冷井温度为-65℃，真空度为1～10pa，冷冻8h，连续抽真空16h，干燥后得到黄参提取物。得率为19.32%

该提取物主要成分中含多糖89.06%，蛋白1.76%。

实施例3

（1）微波提取：取多年生的黄参，60℃干燥12h，粉碎机粉碎，过60目筛；按照1﹕38g/mL的料液比加水，调节pH值=6.5，设定温度为58℃，微波功率为250W，微波提取12min；

（2）双酶提取：调节搅拌速度为1000r/min，先用黄参质量1.5%的纤维素酶（5 万U/g）水解3h，再用黄参质量0.3%的木瓜蛋白酶（65万U/g）水解3h，94℃灭酶15min，冷却至室温，得提取液；

（3）浓缩、沉淀：将提取液在4000r/min下离心15min，取上清液，双层滤纸抽滤2次，压力为0.09Mpa，70℃减压浓缩至体积为提取液体积的1/4，加入体积为浓缩后液体4倍体积95%的乙醇，充分搅拌，静置过夜；

（4）冷冻干燥：静置后在4000 r/min下离心15min，取下层沉淀，冷冻干燥得黄参提取物。冷冻条件：冷井温度为-70℃，真空度为1～10pa，冷冻8h，连续抽真空16h，干燥后得到黄参提取物。得率为20.04%

该提取物主要成分中含多糖88.76%，蛋白2.84%。

实施例4

（1）微波提取：取多年生的黄参，60℃干燥12h，粉碎机粉碎，过60目筛；按照1﹕40g/mL的料液比加水，调节pH值=7，设定温度为65℃，微波功率为300W，微波提取13min；

（2）双酶提取：调节搅拌速度为1000r/min，先用黄参质量1.5%的纤维素酶（5 万U/g）水解4h，再用黄参质量0.3%的木瓜蛋白酶（65万U/g）水解4h，90℃灭酶10～15min，冷却至室温，得提取液；

（3）浓缩、沉淀：将提取液在4500 r/min下离心15min，取上清液，双层滤纸抽滤1～2次，压力为0.09Mpa， 70℃减压浓缩至体积为提取液体积的1/5，加入体积为浓缩后液体4倍体积95%的乙醇，充分搅拌，静置过夜；

（4）冷冻干燥：静置后在4500 r/min下离心15min，取下层沉淀，冷冻干燥得黄参提取物。冷冻条件：冷井温度为-60℃，真空度为1～10pa，冷冻8h，连续抽真空16h，干燥后得到黄参提取物。得率为21.28%

该提取物主要成分中含多糖89.27%，蛋白1.94%。

Claims (6)

1.复合酶法提取黄参多糖的方法，包括以下工艺步骤：

（1）微波提取：将黄参干燥、粉碎成粉末后以1﹕30～1﹕40 g/mL料液比加水，调节pH =5～7后，于55～65℃、微波功率为200～300W下微波提取8～13min；

（2）复合酶水解：微波提取后，在搅拌下先用黄参干质量1.5%～2.5%的纤维素酶水解2～4h，再用黄参干质量0.3%～0.5%的木瓜蛋白酶水解2～4h，然后于 90～95℃灭酶10～15min，冷却至室温，得提取液；纤维素酶的活力为5 万U/g，木瓜蛋白酶的活力为65 万U/g；

（3）浓缩、沉淀：提取液离心，取上清液，双层滤纸抽滤1～2次后，减压浓缩至体积为提取液体积的1/4～1/5，再加入体积为浓缩液3～4倍体积量的乙醇，充分搅拌后静置过夜；离心，取下层沉淀，冷冻干燥得黄参多糖。

2.如权利要求1所述复合酶法提取黄参多糖的方法，其特征在于：黄参粉末的粒度为60目以上。

3.如权利要求1所述复合酶法提取黄参多糖的方法，其特征在于：复合酶水解工艺中，搅拌速度为800～1200r/min。

4.如权利要求1所述复合酶法提取黄参多糖的方法，其特征在于：浓缩、沉淀工艺中，离心的速度为4000～4500 r/min，离心时间为10～15min。

5.如权利要求1所述复合酶法提取黄参多糖的方法，其特征在于：浓缩、沉淀工艺中，减压浓缩的工艺条件为：压力0.07～0.09MPa，温度60～70℃。

6.如权利要求1所述复合酶法提取黄参多糖的方法，其特征在于：浓缩、沉淀工艺中，冷冻干燥的工艺条件为：冷井温度为-60～-70℃，真空度为1～10Pa，冷冻时间为5～8h，连续抽真空12～16h。