CN104739896A - 一种具有保肝功能的复合菌物胞内多糖组合物及制备方法 - Google Patents

Abstract

一种具有保肝功能的复合菌物胞内多糖组合物及制备方法。复合菌物胞内多糖组合物包括毛头鬼伞胞内多糖10-45重量份、银耳胞内多糖20-50重量份、黄灵菇胞内多糖20-45重量份。制备方法包括：菌物发酵，分离出的菌丝体粉碎，加酶反应，分离固、液相。固相加蒸馏水后超声波处理，再加乙醇液，收集沉淀物，干燥。液相浓缩后乙醇，静置，离心分取沉淀物。合并固、液相处理后所得沉淀物。得均物胞内多糖。将分别用上述方法得到是毛头鬼伞胞内多糖、银耳胞内多糖、黄灵菇胞内多糖混合，得具有保肝功能的复合菌物胞内多糖组合物。本发明的有益效果是：能够有效降低血清ALT、AST水平，明显降低肝损伤后肝中丙二醛含量，明显促进胆汁分泌，使受损的肝功能恢复。

Description

一种具有保肝功能的复合菌物胞内多糖组合物及制备方法

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种具有保肝功效的复合菌物胞内多糖组合物。

背景技术

菌物多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出的一类可以控制细胞分裂分化、调节细胞生长和衰老的活性多糖，一般都是由十个分子以上的单糖通过糖苷键连接而成的高分子多聚物。真菌多糖分子单体之间，大量地以β(1-3)与β(1-6)糖苷键结合，形成链状分子，具有螺旋状的立体构型。菌物胞内多糖，就是存在于细胞内部的多糖，存在于菌物的菌丝体中，其活性高，大量的科学实验表明真菌胞内多糖具有多种活性。因而被称为一种重要的生物效应调节剂。

现有技术中也存在一些真菌多糖的复合制剂的报道，但多数都是针对菌物子实体粗多糖的提取，其作用大致为增强免疫力修复胃肠黏膜、抗肿瘤、抗病毒、抗血脂、抗血小板凝集、抗基因突变、抗艾滋病等，对保肝功效少有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有保肝功能的复合菌物胞内多糖组合物及制备方法。克服现有技术中多数都是针对菌物子实体粗多糖的提取及未用作保肝的不足。

本发明的复合菌物胞内多糖组合物包括毛头鬼伞、银耳、黄灵菇发酵后得胞内多糖的混合物；其中，毛头鬼伞胞内多糖10-45重量份、银耳胞内多糖20-50重量份、黄灵菇胞内多糖20-45重量份。

本发明复合菌物胞内多糖组合物优选成分用量比例为：毛头鬼伞胞内多糖30重量份、银耳胞内多糖45重量份、黄灵菇胞内多糖25重量份。

复合菌物胞内多糖组合物及制备方法包括：

1、将毛头鬼伞、银耳、黄灵菇分别经下述步骤制备菌物胞内多糖。

（1）菌物发酵，完成发酵后分离出菌丝体；

（2）将步骤（1）得到的菌丝体烘干，烘干后的菌丝体研磨粉碎，过60目筛；

（3）将经步骤（2）得到的菌丝体粉加入2~3倍体积的蒸馏水,调pH为7.0，浸泡30~60分钟，温度保持55℃，加入0.5% 的纤维素酶，混合反应1~2h，离心20分钟，沉淀再加入0.3%果胶酶溶液，混合反应1~2h，离心20分钟，沉淀最后加入0.5%蛋白酶各作用1~2h，离心分离固、液相。

（4）将步骤（3）得到的复合酶解后的菌丝体粉末，加蒸馏水，料液重量比1:50，在功率700W的超声条件下处理三次，每次60min，80℃浸提3h，抽滤，浓缩至原体积的1/5，然后加6倍体积的无水乙醇，4℃静置12 h，10000 rpm，离心20 min，再加入3~6倍体积的无水乙醇，混匀，静置12h，合并乙醇液，收集沉淀物，干燥。

（5）将经步骤（3）得到的液相，浓缩后加入3~6倍量的乙醇，充分混合沉淀，静置12h，离心分取沉淀，分离出的乙醇浓缩，再向醇相中加入无水乙醇3~6倍体积量，充分混合后，静置12h，离心分取沉淀物，干燥。

（6）合并步骤4和5所得沉淀物。得菌物胞内多糖；

2、将分别用上述步骤取得的毛头鬼伞胞内多糖10-45重量份、银耳胞内多糖20-50重量份、黄灵菇胞内多糖20-45重量份混合，得具有保肝功能的复合菌物胞内多糖组合物。

本发明所得的复合菌物胞内多糖，通过常规工艺，可以制成药剂学上所说的多种剂型，如胶囊剂、片剂、粉剂、颗粒剂或口服液等。

本发明是基于：毛头鬼伞，又称鸡腿蘑（河北、山西）、毛鬼伞。鸡腿蘑还是一种药用蕈菌，味甘性平，有益脾胃、清心安神、治痔等功效，经常食用有助消化、增进食欲和治疗痔疮的作用。银耳为银耳科银耳的子实体。《中华本草》记载，银耳性甘、淡、平，具有滋补生津，润肺养胃之功。银耳中含银耳多糖、银耳孢子多糖、糖蛋白、酸性杂多糖等成分。银耳多糖具有抑制肿瘤生长、提高机体免疫、延缓衰老、抗突变及抗放射等，且银耳多糖能够具有激活和提高特异性和非特异性杀伤细胞的抗肿瘤作用,能够有效抑制移植行肝癌的扩散，降低肝肿瘤的质量和体积。黄灵菇，勺状亚侧耳。别名： 冬蘑、元蘑(黑龙江)、黄蘑(吉林) 、冻蘑、晚生北风菌、剥茸（日本）。黄灵菇入药，具有舒筋活络、强筋壮骨的功能，主治腰腿疼痛、手足麻木、筋络不舒等症。

本发明的有益效果是：复合菌物胞内多糖能够有效降低血清ALT、AST水平，明显降低肝损伤后肝中丙二醛含量，通过降低脂质过氧化作用保护肝脏。此外，该复合菌物胞内多糖还能明显促进胆汁分泌，加速肝内某些有毒物质的排泄，使受损的肝功能恢复，促进肝细胞生长，加之能提高机体的能量贮备，能抵御外来有害物质对肝脏的损害。该复合菌物胞内多糖的特点是以富含活性多糖的食(药)菌为主料，利用各种多糖成分合理组合、配合共用，达到保肝的作用。

具体实施方式:

实施例1

取毛头鬼伞、银耳、黄灵菇分别经下述相同步骤：

发酵培养，发酵后分离，将得到的菌丝体干燥，将烘干后的菌丝体研磨粉碎，过60目筛。加入3倍体积的蒸馏水,调pH为7.0，浸泡40分钟，温度保持55℃，加入0.5% 的纤维素酶，混合反应2h，离心20分钟，沉淀再加入0.3%果胶酶溶液，混合反应1.5h，离心20分钟，沉淀最后加入0.5%蛋白酶各作用1h。超声：⑴复合酶解后的菌丝体粉末，加蒸馏水，料液比1:50，在功率700W的超声条件下处理60min ；再重复上述操作两次，80℃热水浸提2h，抽滤，浓缩至原体积的1/5，然后加3倍体积的无水乙醇，4℃静置12 h，10000 rpm，离心20 min，再加入3倍体积的无水乙醇，混匀，静置12h，合并乙醇液，收集沉淀，干燥。⑵酶解后离心得到的水相，浓缩后加入4倍体积的乙醇，充分混合沉淀，静置12h，离心分取沉淀，分离出的乙醇浓缩，再向醇相中加入3倍体积无水乙醇，充分混合后，静置12h，离心分取沉淀，干燥。合并酶解后的⑴、⑵的沉淀。得菌物胞内多糖。

取以上方法得到的毛头鬼伞胞内多糖10重量份、银耳胞内多糖35重量份、黄灵菇胞内多糖45重量份粉碎，分别过80目筛并加入适量糊精、羧甲基纤维素钠混合均匀，制粒、干燥，再加入适量硬脂酸镁混合均匀，压片即得片剂。

实施例2

取毛头鬼伞、银耳、黄灵菇分别经下述相同步骤：

发酵培养，发酵后分离，将得到的菌丝体干燥，将烘干后的菌丝体研磨粉碎，过60目筛。加入4倍体积的蒸馏水,调pH为7.0，浸泡60分钟，温度保持55℃，加入0.5% 的纤维素酶，混合反应2h，离心20分钟，沉淀再加入0.3%果胶酶溶液，混合反应1.5h，离心20分钟，沉淀最后加入0.5%蛋白酶各作用1h。超声：⑴复合酶解后的菌丝体粉末，加蒸馏水，料液比1:40，在功率700W的超声条件下处理60min ；再重复上述操作两次，80℃热水浸提2h，抽滤，浓缩至原体积的1/5，然后加5倍体积的无水乙醇，4℃静置12 h，10000 rpm，离心20 min，再加入5倍体积的无水乙醇，混匀，静置12h，合并乙醇液，收集沉淀，干燥。⑵酶解后离心得到的水相，浓缩后加入6倍体积的乙醇，充分混合沉淀，静置12h，离心分取沉淀，分离出的乙醇浓缩，再向醇相中加入4倍体积无水乙醇，充分混合后，静置12h，离心分取沉淀，干燥。合并酶解后的⑴、⑵的沉淀。得毛头鬼伞胞内多糖或银耳胞内多糖或黄灵菇胞内多糖。

取上述方法制备的毛头鬼伞胞内多糖20重量份、银耳胞内多糖50重量份、黄灵菇胞内多糖30重量份粉碎，分别过80目筛，加入适量糊精、蔗糖，混匀制粒，干燥即得颗粒剂。

实施例3

取毛头鬼伞、银耳、黄灵菇分别经下述相同步骤：

发酵培养，发酵后分离，将得到的菌丝体干燥，将烘干后的菌丝体研磨粉碎，过60目筛。加入5倍体积的蒸馏水，调pH为7.0，浸泡60分钟，温度保持55℃，加入0.5% 的纤维素酶，混合反应2h，离心20分钟，沉淀再加入0.3%果胶酶溶液，混合反应1.5h，离心20分钟，沉淀最后加入0.5%蛋白酶各作用1h。超声：⑴复合酶解后的菌丝体粉末，加蒸馏水，料液比1:80，在功率700W的超声条件下处理60min ；再重复上述操作两次，80℃热水浸提2h，抽滤，浓缩至原体积的1/5，然后加3倍体积的无水乙醇，4℃静置12 h，10000 rpm，离心20 min，再加入5倍体积的无水乙醇，混匀，静置12h，合并乙醇液，收集沉淀，干燥。⑵酶解后离心得到的水相，浓缩后加入6倍体积的乙醇，充分混合沉淀，静置12h，离心分取沉淀，分离出的乙醇浓缩，再向醇相中加入无水乙醇5倍体积无水乙醇，充分混合后，静置12h，离心分取沉淀，干燥。合并酶解后的⑴、⑵的沉淀。得毛头鬼伞胞内多糖或银耳胞内多糖或黄灵菇胞内多糖。

取上述方法制备的毛头鬼伞胞内多糖45重量份、银耳胞内多糖20重量份、黄灵菇胞内多糖20重量份粉碎。分别过80目筛毛病加入适量辅料混合均匀，装入胶囊中制成胶囊剂。

肝损伤疗效实验

1.实验目的

复合菌物胞内多糖的保肝作用。

实验材料

2.1试验样品

实施例2中所制得的颗粒，外观为棕黄色粉末，有本品特有的香味。

2.2试验鼠

昆明种大鼠160只，雌雄兼用。

2.3试剂

四氯化碳(CCl4)(分析纯)化学试剂厂；

谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)测定试剂盒；

脂多糖(LPS): Sigma公司产品；

AST试剂盒:美国Randox公司产品；

其他试剂均为国产分析纯。

实验方法

3.1对CCl ₄ 致大鼠肝损伤模型的保护作用

大鼠80只随机分5组：正常对照组、模型组、复合菌物多糖高、中、低剂量组。正常对照组用生理盐水按10 ml/kg皮下注射，其余各组于实验第1天开始用0.2% CCl₄花生油(10 ml/kg)行皮下注射，隔日1次，共3次，首剂加倍；复合菌物胞内多糖灌胃给药(大剂量组300 mg/kg，中剂量组200 mg/kg，低剂量组100 mg/kg)，每天1次。第14天实验结束时大鼠均在麻醉平卧状态下从心脏取血，离心取血清，低温保存。采用速率法以全自动生化分析仪测定大鼠血清ALT和AST活性，具体操作按说明书步骤进行。上述各项指标均计算均数(X)与标准差(SD)，用统计软件SPSS11.5进行方差分析。结果见表1。

对正常大鼠胆汁分泌的影响

取鼠40只，随机均分4组。给药组每天灌胃复合胞内多糖100 mg/kg 、200mg/kg、300mg/kg。每天1次，连续6d，对照组给等量生理盐水，末次给药后12h，将大鼠用乙醚麻醉，自剑突下打开腹腔结扎胆总管，缝合腹壁，立即再给药1次。6h以后，拉颈处死大鼠，摘除胆囊称重，剪破胆囊令胆汁流尽，用滤纸吸干胆汁后再称胆囊重量，以前后两次重量之差作为胆汁分泌量。

对部分肝切除大鼠肝再生能力的影响

取大鼠40只，乙醚麻醉，自剑突下打开腹腔，将大鼠肝切除70%左右，缝合腹壁。于术后4h，将大鼠随机均分4组。给药组按100 mg/kg 、200mg/kg、300mg/kg灌胃，对照组给等量生理盐水。每隔12h给药1次，连续7d。末次给药后12h拉断颈椎处死鼠，摘取肝脏称重，按肝重mg/10g（体重）表示肝再生能力。

表1复合菌物胞内多糖对CCl₄肝损伤鼠ALT、AST活性的影响 (  x ±s，n=10)

注：与正常对照比较，*P<0.001；与模型组比较，^# P<0.01、^## P<0.001

从表1中可见，模型组血清ALT和AST两种转氨酶活性均明显高于正常对照(P<0.001)，说明模型建立成功。复合菌物多糖高、中、低剂量组血清ALT、AST水平均较模型组明显降低。

表2　复合菌物胞内多糖对CCl₄肝损伤鼠肝糖原及丙二醛含量的影响( x±s，n=10)

注：与正常对照比较，*P<0.001；与模型组比较，^# P<0.01、^## P<0.001

复合多糖100 mg/kg 、200mg/kg、300mg/kg剂量组均可使CCl₄肝损伤大鼠血清肝糖元含量显著升高，并明显降低肝组织丙二醛含量。

表3　复合菌物胞内多糖对鼠胆汁分泌及肝再生能力的影响( x±s，n=10)

注：与正常对照比较，*P<0.01、**P<0.001

结果表明，复合多糖100 mg/kg 、200mg/kg、300mg/kg剂量均能显著促进正常小鼠的胆汁分泌，并对部分肝切除大鼠肝再生具有显著的促进作用。

人体的服用剂量按照动物模型用量折算：按大鼠的高剂量300mg/kg折算，人体日服用单位剂量为48mg/kg，即：成人体重（60kg）日服用剂量为2.88g。

　  CCl₄中毒可使细胞膜脂质过氧化，引起膜通透性增高，最终导致肝细胞变性、坏死，大量ALT从肝细胞中释放入血。由于CCl₄造成肝损伤，肝中糖元贮量显著减少。复合菌物胞内多糖可使CCl₄肝损伤大鼠升高的ALT明显下降，并明显降低肝损伤大鼠肝中丙二醛含量，表明复合菌物胞内多糖可能通过降低脂质过氧化作用保护肝脏。此外，该多糖还能明显促进大鼠胆汁分泌，加速肝内某些有毒物质的排泄，使受损的肝功能恢复，促进肝细胞生长，加之能提高机体的能量贮备，能抵御外来有害物质对肝脏的损害。

结论

综合上述保肝及机体免疫力实验可知，该复合菌物多糖具有很好的保肝护肝功能，并且可有效提高机体的免疫力。

Claims (3)

1.一种具有保肝功能的复合菌物胞内多糖组合物，其特征是：包含毛头鬼伞、银耳、黄灵菇发酵后得胞内多糖；其中，毛头鬼伞胞内多糖10-45重量份、银耳胞内多糖20-50重量份、黄灵菇胞内多糖20-45重量份。

2.根据权利要求1所述的一种具有保肝功能的复合菌物胞内多糖组合物，其特征是：包含毛头鬼伞胞内多糖30重量份、银耳胞内多糖45重量份、黄灵菇胞内多糖25重量份。

3.一种具有保肝功能的复合菌物胞内多糖组合物的制备方法，包括：

（1）将毛头鬼伞、银耳、黄灵菇分别经下述步骤制备菌物胞内多糖；

①菌物发酵，完成发酵后分离出菌丝体；

②将步骤①所得的菌丝体烘干，烘干后的菌丝体研磨粉碎，过60目筛；

③将经步骤②所得的菌丝体粉加入2~3倍体积的蒸馏水,调pH为7.0，浸泡30~60分钟，温度保持55℃，加入0.5% 的纤维素酶，混合反应1~2h，离心20分钟，沉淀再加入0.3%果胶酶溶液，混合反应1~2h，离心20分钟，沉淀最后加入0.5%蛋白酶各作用1~2h，离心分离固、液相；

④将步骤③得到的复合酶解后的菌丝体粉末，加蒸馏水，料液重量比1:50，在功率700W的超声条件下处理三次，每次60min，80℃浸提3h，抽滤，浓缩至原体积的1/5，然后加6倍体积的无水乙醇，4℃静置12 h，10000 rpm，离心20 min，再加入3~6倍体积的无水乙醇，混匀，静置12h，合并乙醇液，收集沉淀物，干燥；

⑤将经步骤③得到的液相，浓缩后加入3~6倍体积的乙醇，充分混合沉淀，静置12h，离心分取沉淀，分离出的乙醇浓缩，再向醇相中加入无水乙醇3~6倍体积无水乙醇，充分混合后，静置12h，离心分取沉淀物，干燥；

⑥合并步骤④和⑤所得沉淀物，得菌物胞内多糖；

（2）取分别用上述方法所得的毛头鬼伞胞内多糖10-45重量份、银耳胞内多糖20-50重量份、黄灵菇胞内多糖20-45重量份粉碎、混合，得具有保肝功能的复合菌物胞内多糖组合物。