CN104069455B - 预防及治疗肝癌的药物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预防及治疗肝癌的药物及其制备方法，所述药物选用青皮、木香、陈皮、人参、猪苓、白茯苓、神曲、泽泻、干生姜、白术、白豆蔻仁、葛花、砂仁及辅料制备而成。所述药物具有理气健脾的功效，对于预防和治疗肝癌有确切的疗效，制成的药物疗效显著，无毒副作用。

Description

预防及治疗肝癌的药物及其制备方法

发明领域

本发明涉及一种预防及治疗肝癌的药物及其制备方法，属于药品技术的领域。

技术背景

肝细胞癌(HCC)作为全球第5位常见恶性肿瘤，同时也是癌症死亡的第三大原因，具有发展迅速、恶性程度高、预后差、生存期短等特点。其发病率正在逐年上升，每年有超过60万人死于肝癌，中国的发病率在世界各国及地区中位居第一，并逐年上升。肝癌防治的关键在于早发现、早诊断、早治疗，预防和阻断肝癌前病变的继续发展是一个不错的突破口，这与中医学“治未病”思想不谋而合。西医在阻断或逆转癌变的防治方面，仍缺少较为理想的手段，且副作用往往较大。

中医学上肝癌可以归属于“鼓胀”、“黄疸”、“积聚”、“胁痛”、“肝积”、“肥气”、“积气”、“伏梁”等范畴。中医文献对此有较多阐发:《灵枢·邪气脏腑病形篇》曰“肝脉微急为肥气，在胁下。若覆杯，微缓为水瘕痹”。《诸病源候论》论肝积则为“诊得肝积，脉弱细而两胁下痛”。《圣济总录》论述“积气在腹中，久不瘥，牢固推之不移者，癥也，饮食不节，致脏腑气虚弱，饮食不消，按之其状如杯盘牢结，久不已，令人身瘦而腹大，至死不消”等。这些记载表明中医对肝癌已有一定认识。多由正气不足而诸邪留着经络，深入脏腑，遂成痃癖，癥瘕，积聚之疾。可因六淫外袭、情志所伤、饮食水土失宜、痰浊凝聚、瘀血阻滞、热毒内蕴及正气亏损等起病，为本虚标实之证。其治疗有“虚者补之”、“劳者温之”、“结者散之”、“坚者削之”以及“活血化淤、扶正培本、软坚散结、清热解毒、利湿逐水”等治疗大法。随着对肝癌认识的深入，众医家深化研究了脾虚与肝癌关系。近年来，又出现“瘀、毒、虚”、“因虚受邪”、“脏虚络痹”等学说。

随着中医药抗癌作用的研究不断发展和更新，正显现出独特的优势。高效、低毒的抗癌药物成为目前肝癌防治研究的热点之一。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种预防及治疗肝癌的药物及其制备方法。所述药物对于防治肝癌具有确切的疗效。

为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案实现：

一种预防及治疗肝癌的药物，按照重量组份计算，由青皮15-50份、木香30-60份、陈皮100-150份、人参100-150份、猪苓100-150份、白茯苓100-150份、神曲150-200份、泽泻150-200份、干生姜150-200份、白术150-200份、白豆蔻仁300-500份、葛花300-500份、砂仁300-500份及辅料制备而成。

具体地说，所述预防及治疗肝癌的药物，按照重量组份计算，由青皮27份、木香45份、陈皮135份、人参135份、猪苓135份、白茯苓135份、神曲180份、泽泻180份、干生姜180份、白术180份、白豆蔻仁450份、葛花450份、砂仁450份及辅料制备而成。

前述预防及治疗肝癌的药物还可以为：按照重量组份计算，由青皮15-50份、木香30-60份、陈皮100-150份、人参100-150份、猪苓100-150份、白茯苓100-150份、神曲150-200份、泽泻150-200份、干生姜150-200份、白术150-200份、白豆蔻仁300-500份、葛花300-500份、砂仁300-500份、葵花籽200-600份、胡椒200-500份及辅料制备而成。

具体地说，前述预防及治疗肝癌的药物按照重量组份计算：由青皮27份、木香45份、陈皮135份、人参135份、猪苓135份、白茯苓135份、神曲180份、泽泻180份、干生姜180份、白术180份、白豆蔻仁450份、葛花450份、砂仁450份、葵花籽400份、胡椒350份及辅料制备而成。

上述预防及治疗肝癌的药物的制备方法为：取白豆蔻仁、砂仁、干生姜、木香、青皮、陈皮分别粉碎为40目的颗粒，加8倍量的水，用水蒸气蒸馏法提取挥发油3小时，收集挥发油，药渣与方中剩余的药材合并，加8倍量水，提取3次，每次1小时，过滤，药渣压榨，合并3次提取液，静置过夜，上清液高速离心除杂，药液浓缩成浸膏，与上述挥发油及药物中可以接受的药用辅料进行组合，并按照常规的制备方法进行加工，制成相应的药物制剂。

所述药物制剂为煎膏剂、硬胶囊剂、软膏剂、片剂、颗粒剂、丸剂、口服液、糖浆剂、散剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射液、冻干粉针、大容量注射剂、栓剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂或贴剂。

具体地说，所述药物制剂为：煎膏剂、胶囊剂、颗粒剂或口服液。

所述煎膏剂这样制备：取白豆蔻仁、砂仁、干生姜、木香、青皮、陈皮分别粉碎为40目的颗粒，加8倍量的水，用水蒸气蒸馏法提取挥发油3小时，收集挥发油，药渣与方中剩余的药材合并，加8倍量水，提取3次，每次1小时，过滤，药渣压榨，合并3次提取液，静置过夜，上清液高速离心除杂，药液浓缩至60℃时相对密度为1.15-1.20的浸膏；另取制成量40％的红糖，加入同倍量的开水，加热至全部溶解，滤过，加热用文火炼至糖成深红色时，停止加热，慢慢将浸膏加入其中，搅拌均匀，继续用文火加热收膏，待取少许能平拉成丝，或滴于纸上不见水迹时，加入挥发油，搅匀，即得。

所述胶囊剂这样制备：取白豆蔻仁、砂仁、干生姜、木香、青皮、陈皮分别粉碎为40目的颗粒，加8倍量的水，用水蒸气蒸馏法提取挥发油3小时，收集挥发油，药渣与方中剩余的药材合并，加8倍量水，提取3次，每次1小时，过滤，药渣压榨，合并3次提取液，静置过夜，上清液高速离心除杂，药液浓缩至60℃时相对密度为1.15-1.20的浸膏，70℃减压干燥成干浸膏，粉碎，加入上述挥发油、制成量10％的糖粉、10％的糊精混合均匀后，以85％-90％的乙醇作为润湿剂，湿法制粒，干燥，整粒，填装胶囊，即得。

所述颗粒剂这样制备：取白豆蔻仁、砂仁、干生姜、木香、青皮、陈皮分别粉碎为40目的颗粒，加8倍量的水，用水蒸气蒸馏法提取挥发油3小时，收集挥发油，药渣与方中剩余的药材合并，加8倍量水，提取3次，每次1小时，过滤，药渣压榨，合并3次提取液，静置过夜，上清液高速离心除杂，药液浓缩至60℃时相对密度为1.15-1.20的浸膏，浸膏于60℃干燥，并粉碎成细粉，加入制成量15％的蔗糖粉、15％的糊精及上述挥发油混匀，用80％乙醇为润湿剂制颗粒，制成颗粒后于60℃干燥，再过12目筛1次，并用60目筛分出细粉，即得。

所述口服液这样制备：取白豆蔻仁、砂仁、干生姜、木香、青皮、陈皮分别粉碎为40目的颗粒，加8倍量的水，用水蒸气蒸馏法提取挥发油3小时，收集挥发油，药渣与方中剩余的药材合并，加8倍量水，提取3次，每次1小时，过滤，药渣压榨，合并3次提取液，静置过夜，上清液高速离心除杂，药液浓缩至60℃时相对密度为1.10-1.15的浸膏，另取制成量40％的蔗糖加入煮沸的水中使溶解均匀，过滤，制成单糖浆；将单糖浆加入备用的浸膏中，加入制成量0.2％的苯甲酸钠，煮沸溶解，加入上述挥发油搅匀，用纯净水定容至全量，搅匀，滤过，灌封，即得口服液。

本发明所述药物组合物在制成药剂时，单位剂量的药剂可含有本发明的药物活性物质0.1-1000mg，其余为药学上可接受的辅料。药学上可接受的辅料以重量计可以是制剂总重量的0.1-99.9％。

本发明所述药物由青皮、木香、陈皮、人参、猪苓、白茯苓、神曲、泽泻、干生姜、白术、白豆蔻仁、葛花、砂仁及辅料制备而成。其中青皮为芸香利植物福橘或朱橘等多种橘类的未成热的果皮或幼果。其性味苦辛，微温，入肝、胆经，有疏肝破气，散结消痰。常用于治疗胸胁胃脘疼痛，疝气，食积，乳肿，乳核，久疟癖块等症。木香是菊科植物木香的干燥根。其性味辛，苦，温，归脾，大肠、三焦经。有行气，止痛，健脾，消食的功效。常用于行气止痛；调中导滞；主胞胁胀满足；脘腹胀痛；嗳吐泄泻；痢疾后重，胸脘胀痛、泻痢后重、食积不消、不思饮食；中气不省；突发耳聋；蛇虫咬伤；牙痛等症。陈皮为芸香科植物橘及其栽培变种的成熟果皮。性味温，辛、苦；归脾、肺经。有理气健脾，调中，燥湿，化痰的功效。常用于脾胃气滞之脘腹胀满或疼痛、消化不良。湿浊阻中之胸闷腹胀、纳呆便溏。痰湿壅肺之咳嗽气喘等症。人参为五加科、人参属多年生草本植物的干燥根；其味甘、微苦，性微温，归脾、肺、心、肾经。有补气固脱，健脾益肺，宁心益智，养血生津的功效；常用于治疗大病、久病、失血、脱液所致元气欲脱，神疲脉微；脾气不足之食少倦怠，呕吐泄泻；肺气虚弱之气短喘促，咳嗽无力；心气虚衰之失眠多梦，惊悸健忘，体虚多汗；津亏之口渴，消渴；血虚之萎黄，眩晕；肾虚阳萎，尿频，气虚外感等症。猪苓为多孔菌科真菌猪苓的干燥菌核。性味甘淡平，归肾、膀胱经。有利水渗湿的功效。用于治疗小便不利，水肿，泄泻，淋浊，带下等症。白茯苓为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核。性味甘、淡，平。归心、肺、脾、肾经。有利水渗湿，健脾宁心得功效。用于水肿尿少，痰饮眩悸，脾虚食少，便溏泄泻，心神不安，惊悸失眠等症。神曲为辣蓼、青蒿、杏仁等药加入面粉或麸皮混和后，经发酵而成的曲剂。性味甘辛，温。入脾、胃经。有健脾和胃，消食调中的功效。用于治饮食停滞，胸痞腹胀，呕吐泻痢，产后瘀血腹痛，小儿腹大坚积等症。泽泻为泽泻科多年生沼生草本植物泽泻的干燥块茎。性味甘，寒。归肾、膀胱经。有利小便，清湿热的功效。用于小便不利，水肿胀满，泄泻尿少，痰饮眩晕，热淋涩痛；现代研究课用于高血脂等症。干生姜为姜科植物姜的干燥根茎。性味辛，热。归脾、胃、肾、心、肺经。干姜温中散寒，回阳通脉，燥湿消痰。用于脘腹冷痛，呕吐泄泻，肢冷脉微，痰饮喘咳。白术属多年生草本植物，根状茎结节状。茎直立，通常自中下部长分枝，全部光滑无毛。喜凉爽气候，以根茎入药，具有多项药用功能。白术具有健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎的功效，用于脾虚食少，腹胀泄泻，痰饮眩悸，水肿，自汗，胎动不安。《医学启源》记载：“除湿益燥，和中益气，温中，去脾胃中湿，除胃热，强脾胃，进饮食，安胎。”白豆蔻仁为姜科为姜科多年生草本植物白豆蔻的干燥成熟果实。其性味辛温，入肺、脾、胃经，有化湿温中、行气止呕之功，尤以“温化”见长。常用于治疗湿阻脾胃、气机失调或脾胃虚寒所致胸脘胀满、不思饮食、反胃呕吐、舌苔浊腻等症。葛花为豆科植物葛的干燥花。性味甘，平。有解酒醒脾的功效。用于饮酒过度，头痛，头晕，烦渴。胸膈饱胀，呕吐酸水等伤及胃气之症。在中医领域里就有“千杯不醉葛藤花”之说。砂仁为姜科植物缩砂密春砂壳砂的果实或种子性味：味辛，性温。归脾经、胃经、肾经。有化湿开胃，温脾止泻，理气安胎的功效。用于湿浊中阻，脘痞不饥，脾胃虚寒，呕吐泄泻，妊娠恶阻，胎动不安。以上各药共奏理气健脾之功效。对于预防和治疗肝癌有确切的疗效。

发明人在研究中发现，在本发明药物处方中加入葵花籽和胡椒后，能明显增强本发明的药物功效。应该是药物产生了协同增效的结果。葵花籽是菊科草本植物向日葵的种子。又称葵花子、葵子。葵花籽含丰富的脂肪油，其中有多量亚油酸，尚有磷脂，β谷固醇等甾醇；又含蛋白质、糖类和柠檬酸、酒石酸、绿原酸等有机酸及胡萝卜素等。磷脂对大鼠有预高血脂症和高胆固醇血症的作用。葵花籽的脂肪油，特别是亚油酸部分，能抑制大鼠实验性血栓形成。胡椒，拉丁学名：Piper nigrum L属胡椒目，胡椒科、胡椒属木质攀援藤本。含有挥发油、胡椒碱、粗脂肪、粗蛋白等。温中，下气，消痰，解毒；治寒痰食积，脘腹冷痛，反胃，呕吐清水，泄泻，冷痢，并解食物毒。

方中白豆蔻仁、砂仁、干姜、陈皮、青皮、木香等六味中药含有丰富的挥发性成分，如砂仁中的乙酸龙脑酯、豆蔻中的桉树脑等都是有效活性成分，故在制剂工艺中，采用水蒸气蒸馏法先将挥发油提取、分离后，药渣再与其它药材共同提取的制剂工艺方法。因考虑到大生产的需要，从临床应用角度出发，考虑采用水提取工艺得到提取液，药材经过两次提取基本上能把有效成分溶解出来，但水提工艺在一定程度上受很多条件的影响。如加水量、煎煮次数、煎煮时间等。为此，我们采用正交试验设计法，筛选出最佳的提取工艺条件。

本发明进行了大量的实验研究，以下为本发明实验研究的结果：

实验例1：药理实验

1实验材料

1.1实验动物

清洁级6～8周龄雄性Balb/c小鼠32只(北京华阜康生物科技股份有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2009-0007)。体重19～23g，饲养环境：清洁无尘，空气新鲜，温度17～23℃，相对湿度50～65％，噪音85分贝以下。每周更换3次垫料，添加4次饲料，确保垫料清洁干燥，饲料充足新鲜。适应性喂养1周后进入实验状态。

1.2实验药物

药物A:青皮27g、木香45g、陈皮135g、人参135g、猪苓135g、白茯苓135g、神曲180g、泽泻180g、干生姜180g、白术180g、白豆蔻仁450g、葛花450g、砂仁450g。

药物B:青皮27g、木香45g、陈皮135g、人参135g、猪苓135g、白茯苓135g、神曲180g、泽泻180g、干生姜180g、白术180g、白豆蔻仁450g、葛花450g、砂仁450g、葵花籽400g、胡椒350g。

按原方比例浓缩制备(生药浓度均为2g/mL)，4℃保存。

1.3实验仪器

高速电动匀浆机：

恒温水浴摇床：

低温冷冻离心机：

Xiang Yi-L600型离心沉淀机：德国Hettich公司

电转移装置和垂直电泳系统：

1.4主要试剂、试剂盒与溶液配制

1.4.1主要试剂

H22细胞：中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心

胎牛血清：美国Gibico(批号911585)

DMEM培养基：美国Gibico(批号8112239)

胰蛋白酶：美国Hyclone(批号NWM0527)

青霉素-链霉素：美国Hyclone(批号J121981)

PBS缓冲液：美国CORNING(批号R21040248)

兔抗小鼠SOD-1(FL-154)多克隆抗体：美国Santa Cruz(批号sc-11407)

兔抗小鼠Malondialdehyde多克隆抗体：英国Abcam(批号ab6463)

兔抗小鼠Glutathione Peroxidase-1单克隆抗体：英国Abcam(批号EPR3312)

兔抗小鼠Telomerase(AB-2)单克隆抗体：美国millipore(批号582005)

预染marker：美国fermentas(批号)

内参beta-actin：美国millipore(批号)

丽春红染液：中国solarbio(批号)

脱脂奶粉：中国solarbio(批号)

通用二抗：美国KPL公司(批号)

Western及IP细胞裂解液：中国碧云天(批号)

蛋白酶抑制剂：中国碧云天(批号)

其余试剂均为分子生物学专用或国产分析纯

1.3.2试剂盒

超氧化物歧化酶(SOD)Elisa试剂盒:美国R&D

丙二醛(MDA)Elisa试剂盒:美国R&D

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)Elisa试剂盒：美国R&D

免疫组化染色超敏二步法试剂盒：中国中杉金桥(批号：PV-9001)

DAB显色试剂盒：中杉金桥公司

BCA蛋白浓度测定试剂盒:中国碧云天

凝胶制备试剂盒：中国康为试剂

ECL显色试剂盒：美国millipore

1.3.3主要溶液配制

15％高糖培养液：15ml胎牛血清：84ml DMEM培养基：1ml青霉素-链霉素

4％水合氯醛：2g水合氯醛：50ml蒸馏水

4％多聚甲醛：40g多聚甲醛粉末：29g磷酸氢二钠：2.965g磷酸二氢钠：1000ml蒸馏水(于60℃水浴锅中加热充分溶解冷却后，4℃保存)

PBS缓冲液：氯化钠8g：氯化钾0.2g：磷酸二氢钾0.2g：磷酸氢二钠3.48g：1000ml蒸馏水

枸橼酸盐缓冲液：枸橼酸二钠3g：枸橼酸0.4g：1000ml蒸馏水

细胞裂解液：0.1ml PMSF：10ml细胞裂解液

8％分离胶(2块胶)：蒸馏水4.8ml：ACR-Bis2.7ml：分离胶缓冲液2.5ml：

APS 0.1ml：0.006ml(加TEMED后,立即混匀灌胶)

5％浓缩胶(2块胶)：蒸馏水2.28ml：ACR-Bis 0.68ml：浓缩胶缓冲液1ml：

APS 0.04ml：0.004ml(加TEMED后,立即混匀灌胶)

电泳缓冲液：Tris 3.03g：Glycine 18.77：SDS 1g：1000ml蒸馏水

转移缓冲液：Tris 2.9g：Glycine 5.8：SDS 0.37g：200ml甲醇：800ml蒸馏水

PBST缓冲液：PBS缓冲液1000ml：Tween20 1ml

封闭液：1.5g脱脂奶粉：30mlPBST

2实验方法

2.1H22肝癌细胞复苏及培养：

从-80℃冰箱取出H22细胞株冻存管，迅速放入盛37℃纯水的水浴箱中保持摇动，使之尽快融化，无菌条件下吸出细胞悬液，移入离心管中，补加含15％胎牛血清的DMEM细胞培养液至10ml，1000rpm离心5min，弃上清液，加入新培养液，重新悬浮细胞，移入培养瓶中，CO₂培养箱(37℃，5％CO₂)中培养。复苏细胞培养12h后，在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，进行细胞传代换液。H22肝癌细胞株是腹水型细胞株，悬浮生长，待细胞计数达1×l0⁶个/ml浓度时，采用第4代H22肿瘤细胞进行下一步操作。

2.2小鼠肝癌腹水瘤模型(供瘤体)：

将H22细胞成功培养及细胞传代。取4只6～8周龄雄性Balb/c小鼠，75％酒精消毒小鼠下腹部，以1ml注射器刺入小鼠腹腔后回抽无血性液体，遂注射H22细胞悬液0.5mL。每天观察小鼠腹水情况，7天后腹部明显隆起，抽取黄色腹水瘤细胞悬液待用。

2.3小鼠肝癌细胞原位移植瘤模型：

小鼠以4％水合氯醛0.05ml/10g麻醉，在左腹腔做一长约1cm横断面小切口。用手轻轻按压胸骨及腰部将肝左叶挤出切口。取30μl细胞悬液缓慢注射入通过切口暴露的左肝叶中。注射成功后，以纱布按压止血，逐层缝合切口，注意保暖及防止感染，约60min后小鼠苏醒。

2.4实验分组及处理：

手术造模后1d，将造模成功(注射细胞时，肝左叶出现苍白色变化)的小鼠分别称量、标记，并随机分成4组，经口腔灌胃给药，分别为空白对照组(0.9％生理盐水，n＝7)，模型对照组(0.9％生理盐水，n＝6)，药物A组(2g/ml)，n＝7)，药物B组(2g/ml)，n＝8)。每次灌胃量为0.1ml/10g，每天上午灌胃1次，共14天。停药、禁食12h后称体重、处死解剖小鼠，完整切取肝脏并称重。将一部分肝左叶固定于4％多聚甲醛中，其余部分液氮冻透后迅速冻存于-80℃，用于后续指标检测。

2.5一般情况：

主要包括:(1)小鼠实验前后的生长情况；(2)体重、肝脏指数；(3)小鼠肿瘤大小、形态。

2.6常规病理切片：

肝左叶经4％多聚甲醛固定48h后，进行常规石蜡包埋：流水冲洗1h→70％乙醇24h→80％乙醇24h→95％乙醇12h→100％乙醇4h→二甲苯I20min→二甲苯II20min→浸蜡4h→石蜡包埋。石蜡切片机切片，组织切片厚度为4μm，置于防脱载玻片上，保存于4℃冰箱中。一部分石蜡切片进行HE染色：二甲苯I脱蜡10min→二甲苯II脱蜡10min→无水乙醇I水化5min→无水乙醇II水化5min→95％乙醇I水化5min→95％乙醇II水化5min→80％乙醇I水化5min→80％乙醇II水化5min→70％乙醇II水化5min→蒸馏水1min→Harris苏木精染色5min→蒸馏水洗5s→盐酸酒精分化5s→蒸馏水过洗→0.5％氨水返蓝20s→蒸馏水洗5s→伊红染色8min→蒸馏水洗5s→80％乙醇I脱水10s→80％乙醇II脱水10s→95％乙醇I脱水1min→95％乙醇II脱水1min→100％乙醇I脱水5min→100％乙醇II脱水5min→二甲苯I透明5min→二甲苯II透明5min→二甲苯III透明5min→中性树胶封片。风干后观察其病理变化。

染色结果：细胞核呈蓝紫色，细胞浆呈红色。

观察指标：于肉眼下、200倍光学显微镜下观察肿瘤组织弥散程度，坏死情况和形态变化。

2.7SOD、MDA、GSH-Px的定位及定量：

2.7.1血清ELISA测定

小鼠摘取眼球采血，取血量约1-2ml。室温静置2h后，4℃，3000rpm离心15min，分离约100微升血清。保存于-80℃冰箱中。采用双抗夹心法统一测定SOD、MDA和GSH-Px含量。实验时严格按照ELISA试剂盒说明书要求进行操作，全自动酶标仪检测小鼠血清SOD、MDA和GSH-Px含量。

2.7.2肝组织免疫组化超敏二步法染色

2.7.2.1染色评估

4℃冰箱中取出石蜡切片进行免疫组化染色。阴性对照片用PBS代替。每批阴性对照片应显示为阴性。每个切片在200倍视野下计数100个肿瘤细胞，计算总细胞数不少于1000个。以细胞核出现棕黄色染色为阳性细胞，观察计算阳性细胞数，按阳性细胞所占百分数积分，0分(<5％)；1分(5％-25％)；2分(26％-50％)；3分(51％-75％)；4分：>76％-100％。同时结合染色强度：0分(无染色)，1分(浅黄色)，2分(浅棕色)或3分(深棕色)。按两种评分方法相加，分为4个等级：(-)1分；2(+)；3-4分(++)；＞5分(+++)，阳性表达率的评判以等级＞3分为阳性表达，反之为表达缺失。具体如表1。

表1.免疫组化结果评估

2.7.2.2脱蜡水化：

室温静置30min→60℃烘箱中烤片60min→二甲苯I浸泡10min→二甲苯II浸泡10min→100％乙醇I5min→100％乙醇II5min→95％乙醇I5min→80％乙醇5min→70％乙醇5min→50％乙醇5min→蒸馏水5min。

2.7.2.3抗原修复

将切片放入枸橼酸盐缓冲液中于微波炉中中高火(99℃)5min→断电冷却10min→中高火加热5min→避光自然冷却至室温→蒸馏水洗1min×3次→PBS洗5min×3次→甩干。

2.7.2.4封闭

3％过氧化氢酶封闭10min→蒸馏水洗1min×3次→PBS洗5min×3次→甩干。

2.7.2.5孵育

滴加相应一抗，浓度分别为SOD：1:300；MDA：1:500；GSH-Px：1:200。置于湿盒中4℃过夜→室温平衡30min→PBS洗5min×3次→滴加试剂1,37℃孵育20min→PBS洗5min×3次→滴加试剂2,37℃孵育20min→PBS洗5min×3次。

2.7.2.6显色

配制适量DAB(1:50)显色剂避光保存→每个标本上滴加一滴覆盖避光反应10～30min→镜下观察显色即终止反应→蒸馏水洗2min×3次→苏木精复染5min→蒸馏水洗2min×3次→盐酸酒精分化10s→蒸馏水洗2min×3次→氨水泛蓝30s→80％乙醇I脱水10s→80％乙醇II脱水10s→95％乙醇I脱水1min→95％乙醇II脱水1min→100％乙醇I脱水5min→100％乙醇II脱水5min→二甲苯I透明5min→二甲苯II透明5min→二甲苯III透明5min→中性树胶封片。风干后对染色结果进行分析。

2.8端粒酶蛋白表达水平：

2.8.1肝组织蛋白的提取

将组织从-80℃冰箱中取出，将组织按照10％裂解液匀浆，在电子天平上称取50mg肝脏组织加入500μl含1％PMSF的细胞裂解液→剪碎、充分匀浆后混匀→冰上静置20min→低温离心机4℃，14000rpm离心20min→取上清装入新的EP管，加入蛋白上样缓冲液→沸水100℃煮5min变性→分装保存待用。

2.8.2蛋白含量的测定

按照BCA蛋白定量试剂盒使用说明操作，测定蛋白浓度。根据样品数量，试剂A：B＝50:1配制适量BCA工作液，充分混匀(BCA工作液室温24小时内稳定)→完全溶解蛋白标准品，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml→将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μl加至96孔板的标准品孔中，并用标准品稀释液补足20μl→将待测样品滴加至样品孔中，用标准品稀释液补足20μl→各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30min→测定A570nm，绘制标准曲线图并计算蛋白浓度。

2.8.3蛋白浓度调整

以细胞裂解液调整蛋白浓度，样品终浓度为4.0ug/ul(不同样品具体确定)，加入5×蛋白样品缓冲液，95℃煮沸5min。见表2。

表2.蛋白含量测定表

2.8.4凝胶电泳

将玻璃板固定于灌胶台上→按说明书配制8％分离胶→混匀后立即灌胶，并以75％酒精封胶，静置30min→充分凝固后吸去上层酒精，加入5％浓缩胶，制备加样孔→样品煮沸5min后，计算蛋白上样量为32μg/孔进行上样，上样体积为20μl，同时加入预染蛋白marker→浓缩胶以恒压90V，约30min；分离胶以恒压120V，约60min进行电泳，待溴酚蓝刚跑出即终止电泳，进行转膜。

2.8.5转膜

裁剪大小合适的0.45um孔径PVDF膜、滤纸及海绵垫浸于甲醇中1min、转膜缓冲液中15min充分活化→→将凝胶取下置于滤纸上，形成海绵垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫的“三明治”结构→于4℃预冷的转膜液中恒流300mA100min转膜→电转结束后用1×丽春红染色5-10min，纯水稍洗后可见膜上蛋白即表明转膜成功。

2.8.6免疫反应

将膜以PBST漂洗4min×3次→5％脱脂奶粉于摇床上37℃震荡封闭1h→PBST清洗4min×3次→加入相应的一抗(浓度分别为TERT：1:200、beta actin：1:500)，4℃过夜(14h)→次日室温平衡30min→弃一抗，以PBST漂洗5min×3次→加入相应二抗(浓度分别为TERT：1:20000、beta actin：1:10000)于摇床上37℃孵育90min→弃二抗，以PBST漂洗5min×3次。

2.8.7化学发光显影及图象分析

将化学发光显色剂中A、B两种试剂取适量等体积于保鲜膜上混匀→将膜蛋白面朝下与之充分接触，避光反应5-10min→胶片曝光：10s-5min(曝光时间随不同光强度而调整)→显影2min，定影。能够检测到目的蛋白相应大小的特异性条带。通过Image-Pro Plus软件进行光密度(IOD)分析。

2.9统计学分析：

采用SPSS19.0统计软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差表示，多组比较采用方差分析，其中两两比较采用LSD法比较，两组均数比较用t检验。以P<0.05作为具有明显差异的标准。

3结果

3.1动物模型的建立及原位移植瘤的生长情况：

造模前各组小鼠体重无明显差异(P〉0.05)，表明各组小鼠体重相当，具有可比性。术中小鼠无死亡，原位移植瘤模型成功24例，成功率为100％。实验过程中死亡4只。正常对照组1只因灌胃时药物误入气管死亡；模型对照组2只死于脏器衰竭；药物A组1只死于腹水过多。各模型小鼠均出现不同程度被毛蓬松散乱，毛色萎黄，精神差，活动少，消瘦等状况。其中以模型对照组最为显著，给药组一般状况明显优于模型组。小鼠各症状随用药时间延长而明显改善。造模结束后各模型组小鼠与空白组相比，体重及肝脏系数差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)；与模型对照组相比，差异显著(P＜0.01)。药物A、药物B造模结束后体重无明显差异(P〉0.05),但肝脏指数显著降低(P＜0.01)。见表3，空白组体重增加最多，药物B组体重增加其次，药物A组体重增加最少，模型组体重减轻。肝脏系数变化与之相似。给药14天，停药1天后处死并解剖小鼠，各模型组小鼠肝左叶均可见肿瘤生长，其中模型对照组有2只小鼠腹腔转移，其余各组均可见大量腹水，未发现明显侵犯或转移。

表3.对治疗前后小鼠体重的影响

注：n为各组除去死亡动物之后实际检测数(动物死亡原因包括脏器衰竭和操作意外死亡)；与空白对照组比较：aP<0.05，bP<0.01；与模型对照组比较：○P<0.05，●P<0.01；与药物A组比较▲P<0.01。

3.2病理切片HE染色观察结果：

肉眼观：正常组肝组织形态大小正常，呈棕红色，质地柔软而脆弱，肝略呈楔形，模型组小鼠肝体积增大，质地较韧，肝组织切面呈鱼肉状，可见不同程度乳白色结节、肿块，经药物组干预后缩小。如图1-4：

镜下观：正常对照组小鼠肝组织结构清晰，细胞排列整齐，肝细胞无明显病变；模型对照组肝左叶可见小叶结构消失，汇管区消失，可见大块片状纤维化及坏死灶。细胞结构紊乱，细胞肿大，细胞核出现固缩、碎裂或溶解，胞核模糊不清，核质比例大，核染色深且异型性明显。药物A组肝组织切片显示坏死及癌变区域缩小，正常组织与异常组织边界较明显，细胞排列参差不齐，局部区域可见坏死；药物B组肝脏组织与细胞异型性明显改善，病理性核分裂、变形减轻，细胞异型性不明显。图5-8为小鼠肝组织HE染色图片。

3.3对抗氧化作用的影响

3.3.1血清SOD、MDA、GSH-Px的变化

肝癌移植瘤小鼠灌服本发明药物后，发现其血清SOD、MDA、GSH-Px的含量与空白对照组比较，药物A组差异显著(P＜0.01)，药物B组差异明显：SOD、MDA(P＜0.01)、GSH-Px(P＜0.05)；与模型对照组比较，药物A组差异明显：MDA、GSH-Px(P＜0.05)、SOD(P＜0.01)，药物BSOD、MDA变化显著(P＜0.01)，GSH-Px含量明显升高(P＜0.05)；药物B组与药物A组比较，SOD含量显著升高。见表4。

表4.ELISA测定各组小鼠血清SOD、MDA、GSH-Px水平

注：n为各组除去死亡动物之后实际检测数(动物死亡原因包括脏器衰竭和操作意外死亡)；与空白对照组比较：aP<0.05，bP<0.01；与模型对照组比较：○P<0.05，●P<0.01；与药物A组比较▲P<0.01。

3.3.2肝组织SOD、MDA、GSH-Px的变化

免疫组织化学染色切片中可见各组肝组织散在不同程度SOD、MDA、GSH-Px阳性灶，阳性细胞表现为棕黄色，阳性灶与周围黄色或淡黄色的阴性背景形成鲜明对比，肿瘤灶及其周围肝细胞有明显的异型性改变。SOD、GSH-Px在正常组肝组织细胞膜及胞浆内均匀一致大量表达，正常组可见汇管区周边及肝小叶中可见深棕黄色反应区域；对比相同肿瘤区域的HE染色切片，模型组肝组织为正常细胞弱阳性表达，肝癌细胞胞膜及胞浆淡紫色阴性反应，分布不均匀；模型组经本发明药物干预后阳性区域的面积及着色深度均有不同程度增加。本发明药物治疗组SOD、GSH-Px阳性表达率与模型对照组比较均显著上升(P<0.01)；与此同时，MDA表现则正好相反，即本发明药物治疗组阳性表达率与模型对照组比较，显著下降(P<0.01)；与空白对照组相比，SOD、GSH-Px、MDA的表达率在药物A组显著变化(P<0.01)，药物B组GSH-Px、MDA差异明显(P<0.05)，但SOD表达率无明显差异(P〉0.05)；。

表5.SOD、MDA、GSH-Px在肝脏组织的表达情况

注：n为各组除去死亡动物之后实际检测数(动物死亡原因包括脏器衰竭和操作意外死亡)；与空白对照组比较：aP<0.05，bP<0.01；与模型对照组比较：●P<0.01。

3.4对端粒酶蛋白表达水平的影响

通过蛋白含量曲线的分析，组织蛋白总提取物的蛋白含量约为:1.049/m。经凝胶电泳后，各组均在标准蛋白质分子量125KDA的区域出现条带。正常组表现为一条细长端粒酶条带，表达水平正常；模型组表现为明亮条带，表达水平明显升高；而模型高、药物A组条带稍暗淡，端粒酶表达受到抑制。相对光密度值(IOD)＝TERT(IOD)/Actin(IOD)。分别为空白组：0.27，模型对照组：0.70，药物B组：0.39，药物A组：0.21。

4.结论

(1)本发明药物可减少癌变、坏死的组织和细胞，恢复肝脏的正常形态和结构。

(2)本发明药物在在一定程度上具有抗氧化损伤，可抑制肝癌细胞永生化的作用。

(3)本发明药物可通过抑制端粒酶蛋白表达，进而抑制由端粒酶的异常激活引起的细胞永生化改变。

(4)本方所述药物可通过对肝癌变时抗氧化作用与端粒酶蛋白表达水平的影响，起到早期防治肝癌的作用。

(5)本发明药物中，药物B优于药物A。

实验例2：急毒实验研究

1实验方法

昆明种小鼠，经预试，给小白鼠一次灌胃本发明药物组合物膏剂均1mL/20g，未引起死亡，限于药物的浓度与给药体积不能增大，不能测出半数致死量(LD50)，故进行最大耐受量测定实验。

选择健康昆明种小鼠20只，体质量(20±2)g，雌雄各半，与24小时内分2次灌服本发明药物A、药物B，分别制成膏剂，1mL/次，总计量达到100mL/kg，相当于163g/kg生药。此剂量相当于成人日服量的200倍。

2实验结果

小鼠给药后观察7天，药物A与药物B均未见不良反应，全部健康活泼，体质量增加，无死亡。

附图说明

图1.正常组病理切片HE染色肉眼观察图

图2.模型对照组病理切片HE染色肉眼观察图

图3.药物A组病理切片HE染色肉眼观察图

图4.药物B组病理切片HE染色肉眼观察图

图5.正常组病理切片HE染色镜下观察图

图6.模型对照组病理切片HE染色镜下观察图

图7.药物A组病理切片HE染色镜下观察图

图8.药物B组病理切片HE染色镜下观察图

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

具体实施方式：

实施例1：

处方：青皮27g、木香45g、陈皮135g、人参135g、猪苓135g、白茯苓135g、神曲180g、泽泻180g、干生姜180g、白术180g、白豆蔻仁450g、葛花450g、砂仁450g。

工艺：取白豆蔻仁、砂仁、干生姜、木香、青皮、陈皮分别粉碎为40目的颗粒，加8倍量的水，用水蒸气蒸馏法提取挥发油3小时，收集挥发油，药渣与方中剩余的药材合并，加8倍量水，提取3次，每次1小时，过滤，药渣压榨，合并3次提取液，静置过夜，上清液高速离心除杂，药液浓缩至60℃时相对密度为1.15-1.20的浸膏；另取制成量40％的红糖，加入同倍量的开水，加热至全部溶解，滤过，加热用文火炼至糖成深红色时，停止加热，慢慢将浸膏加入其中，搅拌均匀，继续用文火加热收膏，待取少许能平拉成丝，或滴于纸上不见水迹时，加入挥发油，搅匀，即得煎膏剂。

用法用量：口服，早晚各一次(饭前饭后均可)，每次15g，放入热水中化开后口服；亦可直接吞服。

实施例2：

处方：青皮27g、木香45g、陈皮135g、人参135g、猪苓135g、白茯苓135g、神曲180g、泽泻180g、干生姜180g、白术180g、白豆蔻仁450g、葛花450g、砂仁450g、葵花籽400g、胡椒350g。

工艺：工艺：取白豆蔻仁、砂仁、干生姜、木香、青皮、陈皮分别粉碎为40目的颗粒，加8倍量的水，用水蒸气蒸馏法提取挥发油3小时，收集挥发油，药渣与方中剩余的药材合并，加8倍量水，提取3次，每次1小时，过滤，药渣压榨，合并3次提取液，静置过夜，上清液高速离心除杂，药液浓缩至60℃时相对密度为1.15-1.20的浸膏，70℃减压干燥成干浸膏，粉碎，加入上述挥发油、制成量10％的糖粉、10％的糊精混合均匀后，以85％-90％的乙醇作为润湿剂，湿法制粒，干燥，整粒，填装胶囊，即得胶囊剂。

用法用量：口服，一次3粒，一日3次。

实施例:3：

处方：青皮50g、木香60g、陈皮150g、人参150g、猪苓150g、白茯苓150g、神曲200g、泽泻200g、干生姜200g、白术200g、白豆蔻仁500g、葛花500g、砂仁500g。

工艺：取白豆蔻仁、砂仁、干生姜、木香、青皮、陈皮分别粉碎为40目的颗粒，加8倍量的水，用水蒸气蒸馏法提取挥发油3小时，收集挥发油，药渣与方中剩余的药材合并，加8倍量水，提取3次，每次1小时，过滤，药渣压榨，合并3次提取液，静置过夜，上清液高速离心除杂，药液浓缩至60℃时相对密度为1.15-1.20的浸膏，浸膏于60℃干燥，并粉碎成细粉，加入制成量15％的蔗糖粉、15％的糊精及上述挥发油混匀，用80％乙醇为润湿剂制颗粒，制成颗粒后于60℃干燥，再过12目筛1次，并用60目筛分出细粉，即得颗粒剂。

用法用量：用开水冲服，一次10g，一日3次。

实施例:4：

处方：青皮15g、木香30g、陈皮100g、人参100g、猪苓100g、白茯苓100g、神曲150g、泽泻150g、干生姜150g、白术150g、白豆蔻仁300g、葛花300g、砂仁300g、葵花籽200g、胡椒200g。

工艺：取白豆蔻仁、砂仁、干生姜、木香、青皮、陈皮分别粉碎为40目的颗粒，加8倍量的水，用水蒸气蒸馏法提取挥发油3小时，收集挥发油，药渣与方中剩余的药材合并，加8倍量水，提取3次，每次1小时，过滤，药渣压榨，合并3次提取液，静置过夜，上清液高速离心除杂，药液浓缩至60℃时相对密度为1.10-1.15的浸膏，另取制成量40％的蔗糖加入煮沸的水中使溶解均匀，过滤，制成单糖浆；将单糖浆加入备用的浸膏中，加入制成量0.2％的苯甲酸钠，煮沸溶解，加入上述挥发油搅匀，用纯净水定容至5L，搅匀，滤过，灌封，即得口服液。

用法用量：口服，一次15ml，一日3次。

Claims (8)

1.一种预防及治疗肝癌的药物，其特征在于：按照重量组份计算，由青皮15-50份、木香30-60份、陈皮100-150份、人参100-150份、猪苓100-150份、白茯苓100-150份、神曲150-200份、泽泻150-200份、干生姜150-200份、白术150-200份、白豆蔻仁300-500份、葛花300-500份、砂仁300-500份、葵花籽200-600份、胡椒200-500份及辅料制备而成。

2.如权利要求1所述预防及治疗肝癌的药物，其特征在于：按照重量组份计算，由青皮27份、木香45份、陈皮135份、人参135份、猪苓135份、白茯苓135份、神曲180份、泽泻180份、干生姜180份、白术180份、白豆蔻仁450份、葛花450份、砂仁450份、葵花籽400份、胡椒350份及辅料制备而成。

3.制备权利要求1或2所述预防及治疗肝癌的药物的方法，其特征在于：取白豆蔻仁、砂仁、干生姜、木香、青皮、陈皮分别粉碎为40目的颗粒，加8倍量的水，用水蒸气蒸馏法提取挥发油3小时，收集挥发油，药渣与方中剩余的药材合并，加8倍量水，提取3次，每次1小时，过滤，药渣压榨，合并3次提取液，静置过夜，上清液高速离心除杂，药液浓缩成浸膏，与上述挥发油及药物中可以接受的药用辅料进行组合，并按照常规的制备方法进行加工，制成相应的药物制剂。

4.如权利要求3所述预防及治疗肝癌的药物的制备方法，其特征在于：所述药物制剂为煎膏剂、硬胶囊剂、软膏剂、片剂、颗粒剂、丸剂、口服液、糖浆剂、散剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射液、冻干粉针、大容量注射剂、栓剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂或贴剂。

5.如权利要求4所述预防及治疗肝癌的药物的制备方法，其特征在于：所述煎膏剂这样制备：取白豆蔻仁、砂仁、干生姜、木香、青皮、陈皮分别粉碎为40目的颗粒，加8倍量的水，用水蒸气蒸馏法提取挥发油3小时，收集挥发油，药渣与方中剩余的药材合并，加8倍量水，提取3次，每次1小时，过滤，药渣压榨，合并3次提取液，静置过夜，上清液高速离心除杂，药液浓缩至60℃时相对密度为1.15-1.20的浸膏；另取制成量40％的红糖，加入同倍量的开水，加热至全部溶解，滤过，加热用文火炼至糖成深红色时，停止加热，慢慢将浸膏加入其中，搅拌均匀，继续用文火加热收膏，待取少许能平拉成丝，或滴于纸上不见水迹时，加入挥发油，搅匀，即得。

6.如权利要求4所述预防及治疗肝癌的药物的制备方法，其特征在于：所述胶囊剂这样制备：取白豆蔻仁、砂仁、干生姜、木香、青皮、陈皮分别粉碎为40目的颗粒，加8倍量的水，用水蒸气蒸馏法提取挥发油3小时，收集挥发油，药渣与方中剩余的药材合并，加8倍量水，提取3次，每次1小时，过滤，药渣压榨，合并3次提取液，静置过夜，上清液高速离心除杂，药液浓缩至60℃时相对密度为1.15-1.20的浸膏，70℃减压干燥成干浸膏，粉碎，加入上述挥发油、制成量10％的糖粉、10％的糊精混合均匀后，以85％-90％的乙醇作为润湿剂，湿法制粒，干燥，整粒，填装胶囊，即得。

7.如权利要求4所述预防及治疗肝癌的药物的制备方法，其特征在于：所述颗粒剂这样制备：取白豆蔻仁、砂仁、干生姜、木香、青皮、陈皮分别粉碎为40目的颗粒，加8倍量的水，用水蒸气蒸馏法提取挥发油3小时，收集挥发油，药渣与方中剩余的药材合并，加8倍量水，提取3次，每次1小时，过滤，药渣压榨，合并3次提取液，静置过夜，上清液高速离心除杂，药液浓缩至60℃时相对密度为1.15-1.20的浸膏，浸膏于60℃干燥，并粉碎成细粉，加入制成量15％的蔗糖粉、15％的糊精及上述挥发油混匀，用80％乙醇为润湿剂制颗粒，制成颗粒后于60℃干燥，再过12目筛1次，并用60目筛分出细粉，即得。

8.如权利要求4所述预防及治疗肝癌的药物的制备方法，其特征在于：所述口服液这样制备：取白豆蔻仁、砂仁、干生姜、木香、青皮、陈皮分别粉碎为40目的颗粒，加8倍量的水，用水蒸气蒸馏法提取挥发油3小时，收集挥发油，药渣与方中剩余的药材合并，加8倍量水，提取3次，每次1小时，过滤，药渣压榨，合并3次提取液，静置过夜，上清液高速离心除杂，药液浓缩至60℃时相对密度为1.10-1.15的浸膏，另取制成量40％的蔗糖加入煮沸的水中使溶解均匀，过滤，制成单糖浆；将单糖浆加入备用的浸膏中，加入制成量0.2％的苯甲酸钠，煮沸溶解，加入上述挥发油搅匀，用纯净水定容至全量，搅匀，滤过，灌封，即得口服液。