CN104059115A - 一种从獐芽菜中提取苦龙胆酯甙的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从獐芽菜中提取苦龙胆酯甙的方法，属于生物医药技术领域。包括以下步骤：1)将中性磷酸盐缓冲液与獐芽菜粉混合冻融，离心除去杂质；2)将滤液除水后离心分离得到苦龙胆酯甙粗品；3)加入氯仿、甲醇入玻璃层析柱中，沉降，得到硅胶层析柱。4)将苦龙胆酯甙粗提取物用乙醇溶解、洗涤、纯化、干燥即得到苦龙胆酯甙。本发明的方法应用范围广泛、方便快捷、成本低、操作简单、分离量大，适合大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种从螺旋藻中提取藻蓝蛋白的方法。
背景技术
獐牙菜(学名：Swertia bimaculata(Sieb.et Zucc.)Hook.Thoms.ex Clarke，英文名：Swertia)，一年生草本，高10～40厘米。茎单一或分枝，四棱形，带紫色。叶对生，无柄，线状披针形，长2～4厘米，先端渐尖，基部狭，全缘。
圆锥状聚伞花序顶生或腋生；萼片5，线状披针形；花冠蓝紫色，直径达2厘米，5深裂，开展，裂片狭卵形，内侧基部有2腺窝，腺窝边缘的毛具瘤状突起；雄蕊5，花药暗紫色。蒴果椭圆形。花期秋季。生于山坡、草地、林边。分布东北、华北、河南、山东等地。
苦龙胆酯甙，一种存在于獐芽菜中的稀有环烯醚萜，CAS21018-84-8，不但具有清肝利胆的功效，还可用来治疗胃溃疡。该物质在獐芽菜中的含量很低，通常不高于万分之八，因此分离与纯化相当困难。
苦龙胆酯甙属环烯醚萜苷类化合物，有清肝解毒、消食健胃的功效。龙胆苦苷已被中国药典2005版作为龙胆HPLC方法含量测定的定量化学指标同时还是龙胆及其制品指纹图谱的标志性成分。因此苦龙胆酯甙用途广泛，需求量大。
目前报道的苦龙胆酯甙的分离方法，主要有两种：一种是运用大孔吸附树脂法，该方法分离量较大，但纯度不够高；另一种采用高速逆流色谱仪，该方法上样量小，不适合大量产品制备使用，且仪器较昂贵，使用时受限制。
目前报道的苦龙胆酯甙的分离方法，主要有两种：一种是运用大孔吸附树脂法，该方法分离量较大，但纯度不够高；另一种采用高速逆流色谱仪，该方法上样量小，不适合大量产品制备使用，且仪器较昂贵，使用时受限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种苦龙胆酯甙分离的方法，本发明是通过以下技术方案来实现：
从獐芽菜中提取苦龙胆酯甙的方法，包括以下步骤：
1)取獐芽菜粉，加入其质量8～12倍的中性磷酸盐缓冲液，充分混匀后得到獐芽菜粉悬浊液，将獐芽菜粉悬浊液冻融2～4次，在15～20℃下，离心除去杂质，得到滤液；
2)将滤液除水后，在15～20℃下，向除水后的剩余物中加入硫酸铵饱和溶液，沉降5～8h后，离心分离得到苦龙胆酯甙粗品；
3)柱层析硅胶的预处理：取200-300目柱层析硅胶，加入氯仿、甲醇体积比为9:1的混合溶剂，搅拌至没有气泡后倒入玻璃层析柱中，沉降，得到硅胶层析柱。
4)将苦龙胆酯甙粗提取物用乙醇溶解，加入3倍粗提取物重量的200-300目硅胶，拌匀，挥去溶剂晾干，粉碎过200目筛，加入到含有粗提取物30倍重量柱层析硅胶的硅胶层析柱上，采用氯仿、甲醇体积比为9：1的混合溶剂做洗脱剂洗脱，以苦龙胆酯甙纯品做对照，采用薄层层析法跟踪检测，待苦龙胆酯甙呈现单一斑点时收集洗脱液，直至洗脱液中再次出现其它斑点时停止收集。
5)将收集的洗脱液挥干溶剂得到纯化的苦龙胆酯甙。
上诉步骤2)中洗脱完毕后采用乙醇冲柱，柱层析硅胶可重复使用两次。
本发明采用硅胶柱层析的方法，其中对柱层析硅胶的粒度、洗脱液、硅胶及柱层析硅胶的用量进行了优化，针对苦龙胆酯甙的结构特点，使苦龙胆酯甙能够被大量的单独的从硅胶层柱上洗脱下来，提高了苦龙胆酯甙的提取量。本发明的方法应用范围广泛、方便快捷、成本低、操作简单、分离量大，适合大规模推广应用。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
从獐牙菜中提取苦龙胆酯甙的方法，包括以下步骤：
1)200Kg獐芽菜，粉碎，2000L甲醇煮沸提取1.5h，再用1500L甲醇提取二次，1.5小时，合并两次滤液，浓缩至少量；加入去离子水400L，搅拌分散均匀，静置，过滤，将滤渣用200L水洗涤一次，合并两次滤液；
2)1000L乙酸乙酯分3次萃取所得水相，合并乙酸乙酯相，并加入10Kg无水硫酸钠脱除乙酸乙酯中的水分，该过程需静置6-8h；将乙酸乙酯相过滤， 除去硫酸钠后，浓缩至稠膏状，用甲醇溶解后，上硅胶柱层析，梯度洗脱，硅胶用量120Kg，流动相流速2-3L/min，先用氯仿：甲醇10：1洗脱至苦龙胆酯甙成分出现，换流动相氯仿：甲醇5：1，直到该组分完全洗脱，收集所有含有苦龙胆酯甙的洗脱液，浓缩至干，得苦龙胆酯甙。
3)用甲醇重结晶后，得白色粉末107g，经鉴定为苦龙胆酯甙，熔点180-182度。
实施例2
从獐牙菜中提取苦龙胆酯甙的方法，包括以下步骤：
1)100Kg獐芽菜，粉碎，1000L乙醇煮沸提取1.5h，再用750L乙醇提取二次，1.5小时，合并两次滤液，浓缩至少量；加入去离子水200L，搅拌分散均匀，静置，过滤，将滤渣用100L水洗涤一次，合并两次滤液；
2)500L乙酸乙酯分3次萃取所得水相，合并乙酸乙酯相，并加入5Kg无水硫酸钠脱除乙酸乙酯中的水分，该过程需静置6-8h；将乙酸乙酯相过滤，除去硫酸钠后，浓缩至稠膏状，用乙醇溶解后，上硅胶柱层析，梯度洗脱，硅胶用量60Kg，流动相流速2-3L/min，先用氯仿：乙醇10：1洗脱至苦龙胆酯甙成分出现，换流动相氯仿：乙醇5：1，直到该组分完全洗脱，收集所有含有苦龙胆酯甙的洗脱液，浓缩至干，得苦龙胆酯甙。
3)用乙醇重结晶后，得白色粉末107g，经鉴定为苦龙胆酯甙，熔点180-182度。
实施例3
从獐牙菜中提取苦龙胆酯甙的方法，包括以下步骤：
1)取獐芽菜粉，加入其质量8～12倍的中性磷酸盐缓冲液，充分混匀后得到獐芽菜粉悬浊液，将獐芽菜粉悬浊液冻融2～4次，在15～20℃下，离心 除去杂质，得到滤液；
2)将滤液除水后，在15～20℃下，向除水后的剩余物中加入硫酸铵饱和溶液，沉降5～8h后，离心分离得到苦龙胆酯甙粗品；
3)称取280目柱层析硅胶600g，加入氯仿、甲醇体积比为9:1的混合溶剂，搅拌至没有气泡后倒入玻璃层析柱中，沉降，得到硅胶层析柱。
4)称取粗提取物20g，用少量乙醇溶解，加入60g280目硅胶拌匀，挥去溶剂，晾干研碎过200目筛，加到步骤3)的硅胶层析柱上。
5)用氯仿、甲醇体积比为9:1的混合溶剂做洗脱剂洗脱，苦龙胆酯甙纯品做对照，薄层层析法跟踪检测，待苦龙胆酯甙呈现单一斑点时收集洗脱液，一直到洗脱液中再次出现其它斑点时停止收集。收集的洗脱液旋转蒸发、浓缩得到苦龙胆酯甙4.10g。
本发明公开了一种苦龙胆酯甙分离提纯的方法，采用硅胶柱层析的方法，其中柱层析硅胶的粒度为200-300目，用量为苦龙胆酯甙粗提取重量的30倍，洗脱液采用氯仿和乙醇体积比为9:1混合溶剂，以苦龙胆酯甙纯品为对照，采用薄层层析法跟踪检测，选择性的收集洗脱液，挥干溶剂得到苦龙胆酯甙纯品。本发明采用硅胶柱层析的方法，其中对柱层析硅胶的粒度、洗脱液、硅胶及柱层析硅胶的用量进行了优化，针对苦龙胆酯甙的结构特点，使苦龙胆酯甙能够被大量单独的从硅胶层析柱上洗脱下来，提高了苦龙胆酯甙的提取量。
本发明的提取方法，工艺精简，原料螺旋藻来源广泛，成本低廉，提取制备过程环境友好，本发明为开发苦龙胆酯甙开辟了广阔的市场。
Claims (9)
1.一种从獐芽菜中提取苦龙胆酯甙的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取獐芽菜粉，加入其质量8～12倍的中性磷酸盐缓冲液，充分混匀后得到獐芽菜粉悬浊液，将獐芽菜粉悬浊液冻融2～4次，在15～20℃下，离心除去杂质，得到滤液；
2)将滤液除水后，在15～20℃下，向除水后的剩余物中加入硫酸铵饱和溶液，沉降5～8h后，离心分离得到苦龙胆酯甙粗品；
3)柱层析硅胶的预处理：取200-300目柱层析硅胶，加入氯仿、甲醇体积比为9:1的混合溶剂，搅拌至没有气泡后倒入玻璃层析柱中，沉降，得到硅胶层析柱。
4)将苦龙胆酯甙粗提取物用乙醇溶解，加入3倍粗提取物重量的200-300目硅胶，拌匀，挥去溶剂晾干，粉碎过200目筛，加入到含有粗提取物30倍重量柱层析硅胶的硅胶层析柱上，采用氯仿、甲醇体积比为9：1的混合溶剂做洗脱剂洗脱，以苦龙胆酯甙纯品做对照，采用薄层层析法跟踪检测，待苦龙胆酯甙呈现单一斑点时收集洗脱液，直至洗脱液中再次出现其它斑点时停止收集。
5)将收集的洗脱液挥干溶剂得到纯化的苦龙胆酯甙。
2.根据权利要求1所述的一种从獐芽菜中提取藻蓝蛋白的方法，其特征在于：将干燥后的獐芽菜粉碎，过20目筛，得到獐芽菜粉。
3.根据权利要求1所述的一种从獐芽菜中提取苦龙胆酯甙的方法，其特征在于：所述中性磷酸盐缓冲液为水、氢氧化钠和磷酸二氢盐组成的缓冲液，调节缓冲液pH值为6.8～7.5。
4.根据权利要求3所述的一种从獐芽菜中提取苦龙胆酯甙的方法，其特征在于：所述的磷酸二氢盐为磷酸二氢钾或磷酸二氢钠。
5.根据权利要求1所述的一种从獐芽菜中提取苦龙胆酯甙的方法，其特征在于：步骤1)所述的充分混匀为搅拌1～3h。
6.根据权利要求1所述的一种从獐芽菜中提取苦龙胆酯甙的方法，其特征在于：步骤2)所述硫酸铵饱和溶液的用量为除水后的剩余物质量的0.5～2倍。
7.根据权利要求1所述的一种从獐芽菜中提取苦龙胆酯甙的方法，其特征在于：步骤2)所述的除水采用冰冻除水法。
8.根据权利要求7所述的一种从獐芽菜中提取苦龙胆酯甙的方法，其特征在于：所述的冰冻除水是采用缓慢降温的方法，降温速率为4～6℃/h，在降温过程中将形成的冰块除去，降温的温度最低极值设定为0℃。
9.根据权利要求1所述的一种从獐芽菜中提取苦龙胆酯甙的方法，步骤2)中洗脱完毕后采用乙醇冲柱，柱层析硅胶可重复使用两次。
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