CN103989878A - 一种治疗激素性股骨头坏死的中药制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗激素性股骨头坏死的中药制剂，是由以下原料药制成的：淫羊藿25～35g，杜仲10～20g，丹参25～35g，川芎10～20g，白芍10～20g，茯苓10～15g，牛膝10～15g，鹿角胶8～12g，香附6～12g，甘草6～12g。制备方法为：取除鹿角胶外的各原料药，混合，加入水，煎煮，过滤，向滤液中加入烊化的鹿角胶，然后加入乙醇，静置，过滤，干燥，加入糊精进行干法制粒，即得。本发明具有以下特点：(1)温补与活血并用，标本兼治，正本清源；(2)温补药与行血、敛阴药合用，使全方温而不燥，刚柔相济，祛瘀而不伤正，补虚而不雍滞，以达温养、通络之效。(3)组方严谨，方义明确，搭配合理，通补并用，气血兼顾。

Description

一种治疗激素性股骨头坏死的中药制剂

技术领域

本发明涉及一种治疗激素性股骨头坏死的中药制剂。

背景技术

中医典籍对股骨头坏死的记载不多，但其对骨病的总体把握至今仍具有重大的指导意义。中医学认为：“肾藏精”、“肾主骨生髓”。《医精经义》曰:“肾藏精,精生髓,髓生骨。髓者,肾精所生,精足则髓足,髓在骨内,髓足则骨强”。肾精的充足是骨骼的生长发育及其生理功能的基础。若先天禀赋不足，肾精亏虚，肾气不足，则骨失所养。故有古代医家将股骨头坏死归为“骨蚀”。根据髋关节疼痛、活动受限等临床表现，也有医家将之归为“骨痹”。《素问·痹论》曰：“风寒湿三气杂至，合而为痹也……以冬遇此者为骨痹。……痹在于骨则重。骨痹不己，复感于邪，内舍于肾”。指出外邪的侵入，阻滞经络，气血不畅为发病的外因。顾松园《医镜》曰：“邪郁病久，风变为火，寒变为热，湿变为痰。”骨痹患者，病久不愈，风寒湿则化为痰热，致骨枯而髓弱。然而“骨痹”易将股骨头坏死与髋骨性关节炎相混淆。亦有将之归于“骨萎”。《素问·痿论篇》云：“肾气热则腰脊不举，骨枯而髓减发为骨痿。……肾者，水藏也，今水不胜火，则骨枯而髓虚故足不任身发为骨痿”。指出骨痿的发病原因为阴津枯竭，阳气过盛，伤于肾，肾不生精则骨髓失养，也强调了肾的生理功能在骨痿发病中的重要性。

当代中医学者对本病进行了广泛、深入的研究，对SANFH有了更全面更系统的认识。邓沂等指出“骨痹”、“骨痿”、“骨蚀”是股骨头坏死的不同发展阶段,不同病理改变,不同证候表现的相应病名。即早期以瘀血、气血闭阻为基本病机,可称为“骨痹”；晚期股骨头失去正常形态、局部缺损,可称为“骨蚀”；早期与晚期之间髓减骨枯而筋骨痿软,则可称为“骨痿”。内因为气血不足、肝肾虚衰，外因为感受外邪毒素、郁而化热致湿热蕴结等，病机为气血不足，热劫血瘀、气血闭阻而筋骨受损、骨骼失养；或肝肾亏虚，筋骨失养，以血瘀、肝肾亏虚为关键。糖皮质激素为辛热燥烈之品，大剂量或久用可耗伤阴精，阴亏血滞，经脉不通，而肾精亏虚，骨髓失充，发为本病。

因当代各医家辨证分型尚不统一，治则治法各有侧重，治疗激素性股骨头坏死的方药众多。许多学者通过科学实验进行了大量的中药方剂的研究，探索其作用机制。张弛通过对活血通络方(鸡内金、丹参、红花、当归、川芎、黄芪、白芍、桑寄生、怀牛膝等)的实验研究，证实活血通络方能够促进PGI₂合成，抑制TXA₂的产生，缓解激素引起的血管内皮损害，保护血管内皮，抑制血管内凝血，改善坏死股骨头局部的血供，阻断导致股骨头坏死的关键环节，改善了激素性股骨头坏死的血瘀状态。杨俊兴等观察通络生骨胶囊对实验性激素性股骨头坏死模型大鼠血清骨钙素(BGP)、降钙素(CT)水平及骨密度的影响。研究结果显示通络生骨胶囊可升高血清BGP、CT水平及骨密度，认为通络生骨胶囊对股骨头坏死的治疗作用与其促进骨钙素、降钙素合成，改善骨密度有关。齐振熙通过实验观察桃红四物汤(桃仁、红花、熟地、当归、白芍、川芎)对激素性股骨头坏死碱性成纤维细胞生长因子表达的影响。研究表明桃红四物汤能促进激素性股骨头缺血坏死模型兔体内碱性成纤维细胞生长因子的表达，明显减少股骨头局部空骨陷窝数，促进坏死股骨头的修复。崔省珍对处于临床观察阶段的中成药仙灵骨葆胶囊的研究证实：该药具有提高体内钙、磷水平，提高骨密度，降低血液粘度，扩张毛细血管，改善微循环及增加雌激素样作用，还具有抗骨吸收、促进骨形成等药理作用。张弛等用家兔造模对活血通络方的进一步研究表明，活血通络方可明显改善激素性股骨头坏死的血液流变学状态，其防治激素性股骨头坏死的机理可能是该方具有改善血液流变性和骨微循环，重建股骨头血液供应，促进骨形成等作用。

综合上述众多医家对激素性股骨头坏死的认识、不同治法及实验研究成果，本申请的发明人认为：激素性股骨头坏死的发生以正虚为本，邪实为标。先天不足，或后天失养造成肝肾亏虚，而致生骨充髓能力降低，出现髓枯骨痿，成为激素性股骨头坏死的内在根源；在外邪(激素)袭入的致病因素作用下，造成经脉气血阻塞不畅，髓海瘀滞，髓死骨枯。另加肝肾亏虚，肾精匮乏，脾胃失养，推动血行能力降低，致血行迟缓瘀滞，股骨头失去气血温煦、濡养而坏死。虚、瘀两大病机在激素性股骨头坏死的发病中贯穿始终。由此确立了补肾益精、活血祛瘀的治则治法。其中补虚重在补肾，补肾又重在温肾壮阳，并提供了一种治疗激素性股骨头坏死的中药制剂——补肾活血胶囊。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种治疗激素性股骨头坏死的中药制剂(补肾活血胶囊)。本发明的补肾活血胶囊，具有以下功效：活血化瘀,补肾壮骨。活血与补肾兼顾，标本同治。与发明人对激素性股骨头坏死的病机认识及治则治法相一致，且大量的临床结果显示补肾活血胶囊对激素性股骨头坏死早期的病例疗效显著，具有坚实的临床实践基础。探讨研究其主要作用机制为中药临床治疗激素性股骨头坏死提供理论依据具有重要的意义。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种治疗激素性股骨头坏死的中药制剂，是由以下原料药制成的：淫羊藿25～35g，杜仲10～20g，丹参25～35g，川芎10～20g，白芍10～20g，茯苓10～15g，牛膝10～15g，鹿角胶8～12g，香附6～12g，甘草6～12g。

优选的，是由以下原料药制成的：淫羊藿30g，杜仲15g，丹参30g，川芎15g，白芍15g，茯苓12g，牛膝12g，鹿角胶10g，香附9g，甘草9g。

所述治疗激素性股骨头坏死的中药制剂的制备方法为：取除鹿角胶外的各原料药，混合，加入12～16倍量的水(重量倍数)，煎煮130～140min，过滤除去滤渣，向滤液中加入烊化的鹿角胶，浓缩滤液至相对密度为1.1，然后加入浓度为80～100％的乙醇(体积百分数)，调整乙醇含量为70％(体积百分数)，静置10～15h，过滤，滤液减压回收乙醇并浓缩至稠膏，60℃减压干燥，加入10％的糊精(质量百分数)进行干法制粒，即得，装入胶囊制成胶囊剂。

本发明的治疗激素性股骨头坏死的中药制剂，配方中，鹿角胶温肾壮阳，益精补血，补虚兼祛瘀，针对肝肾亏虚之本，为君药。丹参活血祛瘀，主治气滞血瘀之标，与川芎、杜仲、淫羊藿协助君药发挥活血通络、补益肝肾之功效，合为臣药。香附、白芍、茯苓具有散瘀消肿、缓急止痛之功，可改善局部疼痛、活动受限等症状，共为佐药。牛膝活血通经，引火下行，助药效抵达患处，为本方中的使药。甘草能清热解毒，润肺止咳，调和诸药性。

本发明的治疗激素性股骨头坏死的中药制剂，各原料药简介如下：

鹿角胶：甘、咸，温。归肾、肝经。鹿角胶成分很多，有氨基酸类成分，包括甘氨酸、谷氨酸、精氨酸等。糖类化合物，有蛋白多糖等以及碱基成分尿嘧啶尿苷等。生物胺类精眯、腐胺和精胺。还有甾体化合物，激素和激素样物质。功效：温补肝肾，益精养血。用于肝肾不足而致的腰膝酸冷，阳痿遗精，虚劳羸瘦，崩漏下血，便血尿血，阴疽肿痛。鹿角胶具有抗氧化、延缓衰老的作用。研究表明鹿茸精能使小鼠肝、脑组织中脂褐质和丙二醛(MDA)的含量明显降低,超氧歧化酶(SOD)活性显著增强，其对羟基自由基有明显的抑制作用。防治骨质疏松作用，研究发现鹿角胶及鹿茸对骨质疏松症能起到拮抗的效果。此外,总鹿茸多肽外涂抹于大鼠皮肤损伤组织,能加速创伤的修复愈合。王志超等发现应用鹿角胶丸后,可增加骨密度,调节AKP、BGP、HOP含量,为鹿角胶丸治疗骨质疏松提供实验依据。对心血管系统的作用，鹿茸可以减轻心肌细胞损伤,增加心肌的血液供应,扩张冠脉血管及保护心肌细胞膜来恢复心肌的功能。可以一定程度的保护缺血心肌的继发性损伤。对神经系统作用，在鹿茸多肽对Bax、BCl-2、caspase-3的影响中发现,鹿茸多肽能对辐射诱导脊髓神经细胞凋亡起到抑制作用。

丹参：苦，微寒。归心、肝经。功效：祛瘀止痛，活血通经。用于血瘀证及风湿痹痛。丹参的有效成分主要分为脂溶性和水溶性两类。脂溶性成分包括多种菲醌衍生物，如丹参酮、隐丹参酮、二氢丹参酮、异丹参酮、异隐丹参酮、丹参新酮等。水溶性成分有原儿茶醛及丹参素等。脂溶性的丹参酮类以改善血液循环、抗菌和抗炎为主，而水溶性的丹酚类则以抗氧化、抗凝血、抗血栓形成、调血脂和细胞保护作用明显。药理学研究显示丹参具有调节血液流变学的作用，能够扩张外周血管，改善微循环；因丹参所含的丹参酮、丹参素等物质能强有力地使纤维蛋白裂解，促进纤维蛋白原溶解，使毛细血管网开放数目增多，调节微血管口径^[9]。丹参对血小板聚集有抑制作用，可降低血液粘度，加速红细胞电泳，从而促进血液的流动性，对瘀血状态起到清除作用^[9]。另外，丹参具有清除氧自由基，防治脂质过氧化的作用。可减轻自由基对线粒体膜流动的影响，保护线粒体。还具有抗炎、镇痛、降血脂，增强细胞对缺氧的耐受力，提高超氧化物歧化酶的活性，减轻缺血再灌注损伤的作用。

杜仲：甘，温。归肝、肾经。功效：补肝肾，强筋骨，安胎。用于肝肾不足，腰膝酸痛，筋骨无力，头晕目眩，妊娠漏血，胎动不安。目前从杜仲皮中分离得到的化合物主要是木脂素类、环烯醚萜类和苯丙素类及黄酮和多糖类。其中木脂素类双环氧木质素类、单环氧木质素类、新木质素类、和倍半木质素等类型。

杜仲主要有降压作用、预防肌肉骨骼老化、抗骨质疏松、抗癌防癌、保肝利胆及利尿作用，并且其可以抗氧化、抗衰老。

淫羊藿：甘、辛，温。归肝、肾经。功效：温肾壮阳，强筋骨，祛风湿。用于肝肾不足的筋骨痹痛，风湿拘挛等证。本品主要含淫羊藿苷等黄酮苷以及甾醇、多糖、生物碱、挥发油、维生素E等成分。其中多糖和黄酮类成分为淫羊藿的主要有效成分。其中黄酮类有朝藿素、朝藿苷、朝鲜淫羊藿苷、朝藿菲苷A、朝藿酮A、异槲皮素、Icariin－3－O－ɑ－rhamnoside、金丝桃苷、箭叶淫羊藿苷等成分。研究证明淫羊藿水煎液可显著提高小鼠DNA的合成率并能促进大鼠的骨生长；还能预防醋酸泼尼松所致的骨质疏松；淫羊藿煎剂能降低实验性高脂血症家兔的β-脂蛋白及胆固醇水平；淫羊藿煎剂可明显降低ADP诱导的血小板聚集率并可促进血小板解聚。

香附：辛、微苦、微甘，平。归肝、脾、三焦经。功效：疏肝解郁，理气宽中，调经止痛。用于肝郁气滞，胸胁胀痛，疝气疼痛，脾胃气滞，脘腹痞满，胀满疼痛，月经不调，经闭痛经。香附中主要含有挥发油类成分，此外还有糖类、生物碱。香附主要有大黄素甲醚、十六烷酸、β-谷甾醇、豆甾醇、Catenarin、胡萝卜苷。以及山柰酚,木犀草素,槲皮素,西黄松黄酮,穗花杉双黄酮，去甲基银杏双黄酮,银杏双黄酮,异银杏双黄酮,金松双黄酮等黄酮类成分。香附有中枢神经系统的作用，香附醇提物有安定作用，使小鼠自发活动减少，迟缓，并可消除大鼠的条件性回避反射，对去水吗啡引起的呕吐有保护作用。对心血管系统的作用，香附水提醇沉物对猫和兔等都具有强心和减慢心率作用。对消化系统的作用，香附水煎液十二指肠给药对正常大鼠有较强利胆作用，可促进胆汁分泌，提高胆汁流量，同时对肝损伤大鼠的肝细胞有保护功能。

白芍:苦、酸、甘，微寒。归肝、脾经。功效：养肝阴，调肝气，平肝阳，缓急止痛。《本草备要》论述白芍曰：“补血，泻肝，益脾，敛肝阴。”白芍中主要含芍药苷、白芍苷、没食子酰芍药苷、6-O-没食子酰基-D-吡喃葡萄糖、邻苯三酚、没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、儿茶素等。白芍甙具有降低红细胞粘度，抑制血小板聚集，降低红细胞压积及抗凝血酶的作用。白芍总甙可抑制人红细胞渗透性溶血，能显著抑制H₂O₂引起的溶血反应。

茯苓：甘、淡，平。归心、脾、肾经。功效：利水渗湿，健脾安神。茯苓中主要含有茯苓多糖和三萜类化合物，各种氨基酸和微量元素、蛋白质。用于各种湿证。茯苓具有良好的利尿作用。其利尿作用与影响肾小管对Na⁺的重吸收有关。大鼠注射茯苓提取液对四氯化碳引起的肝细胞损伤及丙氨酸转氨酶升高有良好防治效果。茯苓还可提高消化系功能，给大鼠口服茯苓水浸膏，可预防轻度胃溃疡的发生。

牛膝：苦、甘、酸，平。归肝、肾经。功效：活血通经，补肝肾，强筋骨，利脉通淋，引火下行。牛膝中的主要成分有齐墩果酸型三萜皂苷类化合物、甾酮类化合物有牛膝甾酮、蜕皮甾酮、旌节花甾酮A、podecdysone C、旌节花甾酮D、漏芦甾酮B、水龙骨甾酮B等。另外还有多糖类化合物以及杜鹃花酸、琥珀酸等有机酸；小檗碱、巴马丁等生物碱还有芦丁等黄酮类成分。药理实验证实，牛膝具有抗骨质疏松作用。牛膝可增加骨小梁密度、面积、总体积及密质骨面积，减小骨髓腔面积。牛膝有显著的活血作用，其煎液对大鼠的血液粘度、红细胞压积及红细胞聚集指数均有显著的降低作用，可延长兔体外凝血时间，对血液流变学除纤维蛋白原含量外的各项指标均有一定的降低作用。牛膝还能降低高胆固醇饲喂所致兔总胆固醇及游离胆固醇的升高，对肝脏脂肪沉着也有改善作用。

甘草：甘，平。归心、肺、脾、胃经。功效：补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药。用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性。甘草中的有效成分包括三萜皂苷类、黄酮类、多糖类、香豆素类、生物碱类和氨基酸等。其中三萜皂苷类有甘草酸、甘草次酸、甘草甜素、甘草内酯及异甘草内酯等。黄酮类成份主要包括甘草苷、甘草苷元、异甘草苷、异甘草苷元。多糖化合物，包括：葡聚糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等。其药理作用主要有抗炎作用、抗肿瘤作用、抗病毒作用。

以上方药分析可以发现：补肾活血胶囊中的多数药物经现代药理学证实具有诸多如调节微血管口径、降低血液粘度、抗血小板聚集、增加钙磷的沉积、抗骨质疏松作用、促进组织愈合、促进骨再生等作用。补肾活血胶囊的作用不仅是其组成药物的作用的简单集合，而是通过药物间的相互作用，相互促进而发挥更显著的效力，使得气血通畅、肝肾得养，骨髓得充，共奏活血补肾、化瘀止痛之功。本方的配伍特点：(1)温补与活血并用，标本兼治，正本清源；(2)温补药与行血、敛阴药合用，使全方温而不燥，刚柔相济，祛瘀而不伤正，补虚而不雍滞，以达温养、通络之效。(3)组方严谨，方义明确，搭配合理，通补并用，气血兼顾。

附图说明

图1：股骨头HE染色的组织形态学观察(×200)示意图(正常组第4周)。

图2：股骨头HE染色的组织形态学观察(×200)示意图(正常组第8周)。

图3：股骨头HE染色的组织形态学观察(×200)示意图(正常组第12周)。

图4：股骨头HE染色的组织形态学观察(×200)示意图(模型组第4周)。

图5：股骨头HE染色的组织形态学观察(×200)示意图(模型组第8周)。

图6：股骨头HE染色的组织形态学观察(×200)示意图(模型组第12周)。

图7：股骨头HE染色的组织形态学观察(×200)示意图(治疗组第4周)。

图8：股骨头HE染色的组织形态学观察(×200)示意图(治疗组第8周)。

图9：股骨头HE染色的组织形态学观察(×200)示意图(治疗组第12周)。

图10：技术路线图。

图11：大鼠成骨细胞培养的倒置相差显微镜观察(×100)示意图，其中，A：原代成骨细胞培养第2天；B：原代成骨细胞培养第5天；C：原代成骨细胞培养第7天；D第2代成骨细胞培养第2天；E：第3代成骨细胞培养第2天；F：第3代成骨细胞培养第3天。

图12：大鼠第3代成骨细胞培养的HE染色观察(×200)示意图，其中，A：第3代成骨细胞培养第2天；B：第3代成骨细胞培养第3天。

图13：大鼠第3代成骨细胞培养的碱性磷酸酶染色染色观察(×200)示意图，其中，A：第3代成骨细胞培养第2天；B：第3代成骨细胞培养第3天。

图14：含药血清干预后成骨细胞形态的相差显微镜观察(×100)示意图，其中，A：生理盐水组培养第3天；B：低剂量组培养第3天；C：中剂量组培养第3天；D：高剂量组培养第3天。

图15：MTT法测各组成骨细胞的OD值。

图16：各组大鼠成骨细胞OPG、RANKL mRNA表达值。

图17：各组大鼠成骨细胞OPG、RANKLmRNA表达电泳图，其中，A：各组大鼠成骨细胞β-actin mRNA表达电泳图；B:各组大鼠成骨细胞OPGmRNA表达电泳图；C各组大鼠成骨细胞RANKLmRNA表达电泳图(图中a:生理盐水组，b：低剂量组，c：中剂量组，d：高剂量组)。

图18：星点设计优化立体图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1 制备补肾活血胶囊

配方为：淫羊藿3000g，杜仲1500g，丹参3000g，川芎1500g，白芍1500g，茯苓1200g，牛膝1200g，鹿角胶1000g，香附900g，甘草900g。

制备方法为：取除鹿角胶外的各原料药，混合，加入14倍量的水(重量倍数)，煎煮136min，过滤除去滤渣，向滤液中加入烊化的鹿角胶，浓缩滤液至相对密度为1.1，然后加入无水乙醇，调整乙醇含量为70％(体积百分数)，静置12h，过滤，滤液减压回收乙醇并浓缩至稠膏，60℃减压干燥，加入10％的糊精(质量百分数)进行干法制粒，即得，装入胶囊制成胶囊剂。

实施例2 制备补肾活血胶囊

配方为：淫羊藿25g，杜仲20g，丹参25g，川芎20g，白芍10g，茯苓15g，牛膝10g，鹿角胶12g，香附6g，甘草12g。

制备方法同实施例1。

实施例3 制备补肾活血胶囊

配方为：淫羊藿35g，杜仲10g，丹参35g，川芎10g，白芍20g，茯苓10g，牛膝15g，鹿角胶8g，香附12g，甘草6g。

制备方法同实施例1。

实验一、补肾活血胶囊对兔激素性股骨头坏死BGP、IL-6、血管内皮四项含量测定

1.实验材料

(1)实验动物

健康的新西兰大白兔20只，体重2.5～3.0Kg，雌雄各半，由山东中医药大学动物房提供，合格证号：scxk(鲁)20030004。标准饲料喂养，室温15～25℃，相对湿度45％～60％，每日正常光照，空气流通，自由摄食、饮水。

(2)实验药品

1.补肾活血胶囊：实施例1制备。

2.仙灵骨葆胶囊：由贵州同济堂制药有限公司生产(国药准字Z20025337)。

3.地塞米松注射液：由山东鲁抗辰欣药业有限公司提供(国药准字H37021969)。

(3)实验仪器及试剂

1.GMJ型全自动放射免疫r计数器(江苏省医疗电子研究所)、DDL-5冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)、721分光光度计(上海第三分析仪器厂)、OLYMPAS光学显微镜等。

2.NO试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；BGP、IL-6、ET、TXB₂、6-Keto-PGFla放免药盒由解放军总医院科技开发中心放免研究所(北京东亚免疫技术研究所公司)提供。

2.实验方法

(1)动物分组及模型制作

随机将20只新西兰大白兔分为四组，A正常组、B模型组、C对照组、D治疗组，每组各5只。所有家兔均在同一条件下单笼饲养,饲养一周后，参照贺式造模法(张弛,何洪阳,杨志伟,等.活血通络法防治激素性股骨头坏死的作用及机制研究[J].成都中医药大学学报,2007,30(1):39-42.)给模型组、对照组、治疗组家兔臀部肌肉注射地塞米松注射液的方法,每次10mg/kg/只,每周2次,共4周,正常组皮下注射生理盐水2ml/kg/只,所有动物肌注青霉素8万U/只,每周1次,以预防感染。

(2)给药剂量设置

根据Meeh-Rubner公式A(体表面积)＝K(系数)·W(体重g)^2/3·10^-4及相关文献的参考，计算出兔服用补肾活血胶囊的剂量为10g/日/只，其浓度为1g/ml；仙灵骨葆胶囊的剂量为5g/日/只，使用时用温开水溶化，含0.5g/ml。

(3)给药方法

造模成功后，一周后起对照组给予10ml/日仙灵骨葆胶囊水溶液灌胃，治疗组给予10ml/日补肾活血胶囊灌胃，正常组、模型组给以生理盐水5ml/kg/日体重灌胃饲养，连续给药8周(两个疗程)后取材。

(4)观察指标

1.肉眼观察包括动物的一般情况，如精神、饮食、体重、毛发光泽度及股骨头大体形态。

2.光学显微镜观察股骨头组织形态。

3.血清骨钙素(BGP)含量测定。

4.血清白介素-6(IL-6)含量测定。

5.血管内皮四项含量测定。

(5)统计学方法

实验数据采用SAS统计软件处理，采用单因素方差分析及q检验。

3.实验结果

(1)一般情况观察及股骨头大体形态

1.一般情况观察：在所有实验动物中，B组、C组、D组在注射激素后出现精神萎糜，饮食减少，大便稀塘，表现营养不良，消瘦，毛发干枯，无光泽。A组精神饱满，饮食及二便正常，体重增加，毛发光泽，至造模结束所有动物均无死亡。治疗开始后，B组(模型组)精神差，饮食尚可，大便较稀，体重变化不大，C组和D组精神逐渐变好，饮食增加，大便逐渐正常，体重增加，毛发逐渐变得有光泽。A组精神良好，饮食及二便正常，体重较前增加，毛发光泽。各组动物治疗后无死亡。如表1所示。

表1  各组动物实验过程中体重变化情况(kg)

各组治疗前后比较，p<0.05。

2.股骨头大体形态

所有动物处死后，正常组动物股骨外观形态正常，和模型组、治疗组、对照组无明显差别，但模型组股骨骨质较脆，易于凿取。

(2)光镜观察

1.组织标本的制备及观察：

实验动物处死后，立即解剖髋关节，取其股骨头，从冠状面剖开，用10％中性福尔马林溶液(0.1M,PH7.4)固定48小时，再置于10％EDTA-Tris缓冲液中(将EDTA溶解于0.1M,PH7.4的Tris缓冲液中)脱钙.隔天更换脱钙液，直至完全脱钙以后，流水冲洗，逐级乙醇脱水，二甲苯透明处理2小时，石蜡包埋切片，切片厚为4um，常规HE染色,用OLYMPAS光学显微镜观察骨组织和骨髓组织的骨小梁，骨细胞、脂肪细胞的病理改变。

2.观察结果：

正常组：关节软骨下区骨小梁结构清晰完整，排列规则。骨小梁中骨细胞清晰可见，骨细胞结构、形态正常，致密饱满，细胞核较大，位于中央，可见散在的空骨陷窝。成骨细胞沿骨小梁分布，可见成串排列。髓腔内可见正常的骨髓细胞和脂肪细胞。骨髓细胞丰富，脂肪细胞相对较小，形态正常(图1、2、3)。

模型组：股骨头软骨层变薄，软骨下区骨小梁变细、稀疏、结构紊乱，可见中间断裂。骨髓细胞大面积减少，骨髓多被脂肪细胞填充，并且脂肪细胞肥大，有的融合成泡状。骨小梁内正常骨细胞数量减少，部分骨陷窝内骨细胞消失，空骨陷窝数明显增多(图4、5、6)。

低剂量中药治疗组：骨小梁结构基本完整，较稀疏，排列较杂乱。脂肪细胞增多。空骨陷窝较多，周沿可见散在的成骨细胞，呈圆柱形，可见较多的骨髓造血细胞。骨小梁表面依稀可见少量新骨形成。高、中剂量中药治疗组：见骨小梁结构基本完整，排列欠规则。可见少许空骨陷窝，周沿的成骨细胞多呈圆柱形，排列较致密，骨髓造血细胞丰富。可见骨小梁表面的新骨形成，成骨细胞被自身分泌的骨基质包围，形成新的骨细胞和骨组织(图7、8、9)。

(3)血清骨钙素(BGP)含量测定

1.概述：骨钙素(Osteocalcin)又称骨γ-羧基谷氨酸蛋白(Boneγ-carboxyg lutamicacid BGP)，其化学本质为蛋白质，叫做骨钙蛋白，由43个氨基酸相连而成，是骨组织的特异性蛋白，它来源于骨组织，由成骨细胞合成并分泌到骨中，是骨组织中非胶原性蛋白的主要成分，约占骨质蛋白的3％。其作用是调节和维持骨钙。骨钙素2/3与羟磷灰石结晶结合，沉积于骨基质，1/3进入血液循环。因此，血清中骨钙素浓度可特异性地反映它的“母体”成骨细胞的活性，用于判断成骨细胞活性受抑制的程度。由于在骨吸收过程中，基质中的骨钙素又可释放到血液，因此，骨钙素水平又可作为判断骨转移的指标。

2.样品收集及测定方法：各组动物均于处死前12小时禁食水，抽取静脉血，每只2ml，注入试管中待凝固后，立即将标本在4℃下，3500rpm离心10min，吸取上层血清，-20℃保存。测定时，试剂混合均匀，室温放置20min，4℃下，3500rpm离心25min，吸弃上清液在GMJ型全自动放射免疫r计数器上测定cpm数。

3.测定结果：所有动物血清BGP的测定值见表5。血清BGP的含量，模型组与正常组比较明显降低，有显著性差异(P＜0.05)；对照组及治疗组血清BGP的含量与正常组比较无显著性差异(P＞0.05)，而与模型组比较均明显升高，有显著性差异(P＜0.05)，且治疗组血清BGP的含量升高较对照组明显，有显著性差异(P＜0.05)。应用中药补肾活血胶囊和仙灵骨葆胶囊均可升高血清BGP的含量，两种药物比较，中药补肾活血胶囊作用更加明显。结果见表2。

表2  血清BGP的含量的测定(μmol/L)

(4)血清白介素-6(IL-6)含量测定

1.概述：白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)主要是由巨噬细胞、T细胞、B细胞等多种细胞产生的一种糖蛋白，同时是一种具有多重免疫调节功能的细胞因子。某些急性炎症、自身免疫性疾病等与病人体内IL-6水平异常增高有关。IL-6高表达能够刺激破骨细胞的骨吸收活性，从而刺激骨吸收，骨吸收超过骨形成导致骨质疏松的发生。

2.样品收集及测定方法：各组动物均于处死前12小时禁食水，抽取静脉血，每只2ml，注入试管中待凝固后，分离血清，-20℃保存。测定前置室温或冷水中复融，混匀后4℃下、3500rpm离心5min，取上清夜，与试剂充分混匀，室温放置20min后，4℃下、3500rpm离心25min，吸弃上清液在GMJ型全自动放射免疫r计数器上测定cpm数。

3.测定结果：所有动物血清IL-6的测定值见表5。血清IL-6的含量，模型组与正常组比较明显升高，有显著性差异(P＜0.05)；对照组及治疗组血清IL-6的含量与正常组比较无显著性差异(P＞0.05)，而与模型组比较均明显降低，有显著性差异(P＜0.05)，且治疗组血清IL-6的含量降低较对照组明显，有显著性差异(P＜0.05)。应用补肾活血胶囊和仙灵骨葆胶囊均可降低血清IL-6的含量，两种药物比较，补肾活血胶囊作用更加明显。结果见表3。

表3  血清IL-6的含量的测定(μmol/L)

(5)血管内皮四项含量测定

1.概述：内皮四项包括内皮素(ET)、血栓素B₂(TXB₂)、6-酮-前列环素F_1a(6-Keto-PGF_1a)、一氧化氮(NO),血液中的这四项指标检测常用反映血管内皮舒缩性，对血管内血流的快慢，血压的大小，血小板的聚集等有重要的影响。

内皮素(ET)它不仅存在于血管内皮，也广泛存在于各种组织和细胞中，是调节心血管功能的重要因子，对维持基础血管张力与心血管系统稳态起重要作用。其基因表达有三种，内皮素-1(ET-1)是迄今为止发现的作用最强的缩血管物质。其引起的血管收缩、心肌缺血、代谢紊乱和细胞增殖是与血管损伤有关疾病的共同致病因素。

血栓素A₂(TXA₂)主要是由血小板微粒合成并释放的一种具有强烈促进血管收缩和血小板聚集的生物活性物质。其半衰期约为30分钟，而迅速代谢为无活性的TXB₂。血管壁内皮细胞合成和释放的另一种抗血小板聚集和舒张血管的活性物质，称之为前列环素(PGI₂)，生物半衰期约为3分钟，迅速代谢为6-Keto-PGF_1a。PGI₂是已知最有效的血小板内源性聚集抑制剂和高效舒张剂,它主要在血管内皮细胞内合成,能刺激腺苷酸环化酶而增加血小板内CAMP的水平,从而降低血小板对刺激的反应能力。PGI₂和TXA₂在深部小血管内血栓形成中有相互拮抗作用,PGI2-TXA2系统的平衡对调节血小板功能,血管张力及血栓形成起重要作用。

一氧化氮(NO)即血管内皮舒张因子，在生物体内作为一种反应性极强的自由基，兼有第二信使和神经递质作用，同时又是一种效应分子，在体内具有广泛的生理作用，如松弛血管平滑肌，抑制血小板聚集，调节血流，介导细胞毒效应和免疫调节等作用。

2.样品收集及测定方法：各组动物均于取血前12小时禁食水，麻醉后，空针心脏抽血，每只先后抽取2ml、3ml、3ml、1.5ml,分别注入备好的内皮素、血栓素、前列环素和一氧化氮试管中。2ml血注入含2ml10％EDTA二钠30μl和抑肽酶40μl的内皮素试管中，混匀，4℃下，3000rpm离心10min，分离血浆(溶血样品影响测定结果)。测定前，使样本置于室温或冰水中复融，再次4℃下，3000rpm离心5min，取上清测定。测定时混匀，4℃下，3500rpm离心20min，吸弃上清液，在γ计数器上测定沉淀cpm数。两组3ml的取血分别注入含2％ED-TA二钠0.2ml的血栓素和前列环素两试管中，混匀，4℃下，3000rpm离心10min，分离血浆，置于-20℃保存备用。测定前取出，冷水中复融，待测血浆中PGI₂和TXA₂的水平。PGI₂在体内37℃时，半衰期短，为3min，所以测其稳定的代谢产物6-Keto-PGF_1a含量；由于TXA₂在正常体温，半衰期只有30min，很快水解为无活性的TXB₂，所以测定其稳定的代谢产物TXB₂的水平。另1.5ml注入测NO的空白试管内，肝素抗凝，2000rpm离心5min，取血浆置于-25℃冰箱内保存备用。采用硝酸盐还原酶还原法，通过测定血浆的NO₃ ^-浓度，间接反映NO的含量。取血浆样品20μl，室温放置10min。应用721分光光度计(上海第三分析仪器厂)进行自动比色读数。

3.测定结果：所有动物内皮四项测定值见表5。血液中内皮素及血栓素的含量，模型组与正常组比较明显升高，有显著性差异(P＜0.05)；对照组及治疗组血液中的含量与正常组比较无显著性差异(P＞0.05)，而与模型组比较均明显降低，有显著性差异(P＜0.05)，且治疗组血液中的含量降低较对照组明显，有显著性差异(P＜0.05)。应用补肾活血胶囊和仙灵骨葆胶囊均可降低血液内皮素及血栓素的含量，两种药物比较，补肾活血胶囊作用更加明显。血液前列环素及一氧化氮的含量，模型组与正常组比较明显降低，有显著性差异(P＜0.05)；对照组及治疗组血液中的含量与正常组比较无显著性差异(P＞0.05)，而与模型组比较均明显升高，有显著性差异(P＜0.05)，且治疗组血液中的含量升高较对照组明显，有显著性差异(P＜0.05)。应用补肾活血胶囊和仙灵骨葆胶囊均可升高血液中前列环素及一氧化氮的含量，两种药物比较，补肾活血胶囊作用更加明显。结果见表4、表5。

表4  血管内皮四项含量的测定

表5  血清BGP IL-6和血管内皮四项测定值

4.小结

在实验研究中，兔血清中BGP、IL-6和血管内皮四项测定结果表明补肾活血胶囊可以明显的升高血清BGP、降低IL-6，降低血浆内皮素、升高血清NO水平、降低血浆血栓素及升高前列环素水平，与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)；通过测定以上血液中的各项指标含量变化，及光镜观察到的骨小梁变细，萎缩，骨髓细胞减少被脂肪细胞填充，并且脂肪细胞肥大，骨小梁内正常骨细胞数量减少。提示激素性股骨头坏死的发生、发展与激素导致的上述变化有密切关系。

中药干预激素性股骨头坏死的实验研究表明，该药物能够提高成骨能力促进骨修复和骨重建，提高骨质量，阻断激素性股骨头坏死的病理改变。其作用机理是通过以下方面实现的:(1)调节骨细胞代谢，促进血清BGP分泌，减少骨质丢失，提高骨密度。(2)降低血清IL-6的分泌，抑制破骨细胞的功能，减少骨吸收。(3)降低血浆内皮素、升高血清NO水平、降低血浆血栓素及升高前列环素水平，减少血管内皮细胞损害，抑制血管痉挛及血小板聚集，减少微血栓形成及血管淤滞引起的缺血性骨坏死。

实验二、补肾活血胶囊含药血清对大鼠成骨细胞OPG/RANKLmRNA表达的影响

一、大鼠的成骨细胞培养

1.实验材料

1.1实验动物

新生SD大鼠(出生1-2天以内)2只，购自山东中医药大学实验动物中心。动物合格证号：SCXK(鲁)20050015。

1.2主要试剂

DMEM高糖培养基(粉剂)：美国Gibco公司；

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)：杭州四季青生物工程材料有限公司；

青、链霉素：山东鲁抗医药股份有限公司；

胰蛋白酶粉(Trypsin)、谷氨酰胺(L-Glutamine)、DMSO、MTT：Amresco公司；

台盼蓝：华美生物工程公司；

RNA酶：美国Sigma公司；

其余各种试剂均为国产分析纯试剂。

1.3主要溶液的配制

(1)高糖DMEM培养基：按说明书用新鲜去离子水配制，添加NaHC033.7g/L，调节溶液pH至7.0～7.2之后，用0.22um微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存备用。使用前融化加入不同浓度的FBS，4℃保存备用。

(2)胰蛋白酶(1：250)：用PBS配成0.25％浓度，0.22um微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。用前37℃下回温。

(3)PBS：NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4·H2O1.56g，KH2PO4 0.2g，加双蒸水至1000ml。调节溶液pH至7.2～7.4，高压蒸汽灭菌20min，室温保存。

(4)胎牛血清灭活：解冻后置56℃恒温水浴30min灭活，配液，剩余分装，-20℃保存。

(5)0.4％台盼蓝染液：研磨台盼蓝后加双蒸水至配成0.4％浓度，之后滤纸过滤，4℃保存。

(6)MTT储存液：用PBS配制，浓度为5mg/ml，0.22um微孔滤膜过滤除菌，-20℃避光保存。

(7)双抗储存液：青、链霉素用PBS稀释均至105u/ml，0.22um微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存。用时1：1000加入培养基，终浓度均为100u/ml。

(8)谷氨酰胺补充液：用去离子水溶解，浓度为200mmol/L(29.22g/L)，0.22um微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存。配制好的培养液在4℃放置2周以上时，1：100加入补充液，谷氨酰胺终浓度为2mmol/L。

(9)细胞冻存液：含10％DMSO、20％FBS和70％DMEM，临用时现配。

(10)硝酸钴：去离子水溶解，浓度为2％，0.22um微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。

(11)硫化胺：去离子水溶解，浓度为1％，0.22um微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。

(12)茜素红溶液：去离子水溶解，浓度为0.1％，0.22um微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。

(13)碱性磷酸酶染色孵育液：3％β-甘油磷酸钠10ml，2％巴比妥纳10ml，2％无水氯化钙20ml，2％硫酸镁1ml，蒸馏水5ml，pH9.4。

1.4主要仪器

CO2培养箱(BB5060UV型)、鼓风干燥箱(热空气Sut6型)、超纯水系统(sgavplus型)：德国Heraeus公司产品；

超净工作台：ClassⅡ2085型，美国Thermo Forma公司；

倒置相差显微镜：1X50S8F型，日本Olympus公司；

低速自动平衡离心机：DT5-3型，北京时代北利离心机有限公司；

电热恒温水浴箱：SGSY2-11型，北京医疗设备有限责任公司；

PH计：DELTA320型，梅特勒—托利多仪器有限公司；

电热压力蒸汽消毒器：YXQG02型，山东安得医疗科技有限公司；

可调式移液器：Thermo型，热电(上海)仪器有限公司；

细胞计数板：上海求精生化试剂仪器有限公司；

细胞培养瓶(25cm2)、冻存管：美国Corning公司产品；

细胞培养板、一次性无菌过滤器(0.22um)：美国Costar公司；

塑料离心管、移液器吸头：浙江黄岩五洲医用塑料厂；

吸管、培养皿、酒精灯、三角瓶、烧杯、锥型瓶、注射器、玻璃培养瓶、盖玻片、载玻片和温度计等由上海五星医用玻璃制品厂、北京玻璃仪器厂、山东玻璃仪器厂等公司生产。

2.实验方法

2.1细胞培养

2.1.1原代细胞培养

将2只新生的SD大鼠放入75％酒精中浸泡消毒10min，无菌操作取下颅盖骨，除去附着的血管及结缔组织，用PBS溶液清洗3次，剪成1×1mm3大小的碎块。用PBS溶液清洗3次，加入8倍于骨碎块体积的0.25％胰蛋白酶，于37℃水浴中预消化20min(其间不时摇动)，然后以1000rpm离心5min，弃去消化液，用PBS溶液清洗干净后，弃去上清，再加入8倍于骨块体积的0.02％Ⅱ型胶原酶，于37℃水浴中消化5次，其间反复振摇，每次15min，弃去前两次消化液。收集最后3次消化液，离心10min(1000rpm)，弃去上清液，所得白色沉淀物即为制得的成骨细胞样细胞团。用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液重悬细胞，吹打均匀，将细胞悬液通过筛网，去除可能存在的非成骨细胞和杂质成分，保留骨粒。将滤过后的细胞悬液调成1×10⁵/ml浓度，吹打均匀后，接种到多个60mm²一次性培养皿中，置于37℃，5％CO₂，饱和湿度的培养箱内进行培养，48h换液，弃去悬浮细胞，每隔2d换液1次。培养7d后细胞密度适中，初见细胞融合趋势。第8天80％细胞(丰度)融合成单层，即进行传代。

2.1.2传代培养

用倒置显微镜逐日观察细胞生长情况和形态特征，细胞(丰度)长至80％单层时，吸去培养液，加0.25％胰蛋白酶2ml，轻轻晃动培养皿，使胰蛋白酶覆盖整个皿底，37℃消化3～5min，镜下见细胞皱缩，间距加大，分离为单个小圆细胞时，滴加含10％FBS的DMEM培养液中止消化，然后吹打细胞，将细胞悬液移入15ml离心管，离心10min，1000rpm，弃上清，沉淀加含10％FBS的DMEM培养液悬浮细胞，吹打均匀后用培养基调整至适宜浓度，分装到不同大小的培养皿，置于37℃，5％CO₂，饱和湿度的培养箱内进行培养。

2.1.3成骨细胞的鉴定

取3代对数生长期成骨细胞爬片，6孔培养板中加入无菌盖玻片，当细胞爬满玻片后，将玻片取出，进行成骨细胞的鉴定：

(1)相差显微镜观察。

(2)HE染色：4％多聚甲醛固定后，常规HE染色。

(3)成骨细胞的碱性磷酸酶(AKP)染色：测定细胞的碱性磷酸酶的表达。Gomori改良钙钴法：6孔培养板中加入无菌盖玻片，取3代对数生长期成骨细胞爬片，当细胞爬满玻片后，将玻片取出，10％中性福尔马林固定10min后，加入新鲜配制的孵育液，于37℃孵育4h，流水洗10min，2％硝酸钴作用5min，蒸馏水洗片刻，1％硫化胺水溶液(现配现用)处理1min，用苏木精复染1min，脱水处理后甘油明胶封片。

2.1.4技术线路图：如图10所示。

3.结果

3.1相差显微镜观察

原代成骨细胞分离出来以后，镜下见细胞均匀分布，呈小圆球形，周边细胞膜透亮，胞内有一个小黑点，为胞核，核仁不可见。培养悬浮12～24h后细胞开始贴附于培养皿底，细胞膨大，呈三角形，核明显增大；接种24～120h左右可见大部分细胞贴壁，伸展，成短梭型，数天后细胞形态多样化，多呈多边形、纺锤型、梭形、三角形，胞浆丰富向外伸展出生长突，生长突逐渐增多、不断扩大。随培养时间延长，细胞伸出较多突起，突触长，而且有的细胞借突起相互连接。培养3～7d后，细胞多见长梭形、多角形、条索形；7～14d细胞几乎满布，形成单层细胞层，细胞聚集成簇，融合成片，细胞分界较为模糊(图11：A～F)。

3.2HE染色

成骨细胞形态同相差显微镜观察所见。细胞轮廓清晰，胞浆丰富，细胞内可见嗜苏木精之蓝色颗粒(为细胞核)。非有丝分裂期细胞为单核，随培养时间延长，胞核逐渐增大、清晰，呈圆形或卵圆形，含1～2个核仁；有丝分裂期细胞为单核或为双核，可以观察到前、中、后、末四个时期细胞形体和结构的变化，细胞密度不大时可见到“孪生姐妹手牵手”细胞，两个细胞紧挨着，形态、大小完全一致(图12：A，B)。

3.3碱性磷酸酶(AKP)染色

细胞合成的碱性磷酸酶经Gomori改良钙钴法染色呈棕黑色细微颗粒，分布在细胞膜上及周围，在胞浆内可见到少量颗粒细胞，轮廓不清，看不见细胞核。经苏木精复染后，细胞轮廓清晰，结构清楚，可见细胞核之蓝色颗粒，棕黑色细微颗粒明显，分布在细胞膜上以及周围，此为AKP阳性细胞，阴性细胞则胞质均匀一致，未见棕黑色颗粒物(图13：A，B)。

通过对成骨细胞的鉴定，证明细胞培养成功，为进一步的实验奠定了基础。

二、补肾活血胶囊含药血清对大鼠成骨细胞OPG/RANKLmRNA表达影响

目的：运用中药血清药理学的方法进行体外实验。大鼠成骨细胞培养成功后，应用RT-PCR技术在基因转录水平检测补肾活血胶囊含药血清对成骨细胞OPG,RANKLmRNA表达的调控作用。

1.实验材料

1.1实验动物

SD大鼠12只，雌雄各半，体重250g左右，清洁级，购自山东中医药大学实验动物中心。动物合格证号：SCXK(鲁)20050015。

1.2试剂

胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；

DMEM高糖培养基(粉剂)：美国Gibco公司产品；

胰蛋白酶：美国GiBco公司产品；

噻唑蓝(MTT)：Sigma公司产品；

二甲基亚砜：Bioml公司产品；

十二烷基磺酸钠(SDS)：Sigma公司产品；

琼脂糖：Promega公司产品；

TritonX-100：北京夏斯生物公司；

Follin酚：Sigma公司产品；

水饱和酚：Sigma公司产品；

RNAisoTM Plus：大连宝生物工程有限公司,TaKaRa Code：D9108A；

TaKaRa PrimeScriptTM 1ST Strand Cdna Synthesis Kit：大连宝生物工程有限公司，TaKaRa Code：D6110A；

TaKaRa PCR Amplification Kit：大连宝生物工程有限公司，TaKaRa Code：DR011。

1.3.主要试剂的配制

D-Hanks液:NaCL8g，KCL0.4g，Na₂HPO₄·H₂O0.06g，KH₂PO₄0.06g,NaHCO₃0.35g，酚红0.02g，三蒸水定容至1L,100kPa/10分钟高压灭菌，4℃保存。

PBS溶液:NaCL8g,KCL0.2g,Na₂HPO₄·12H₂O2.08g,KH₂PO₄0.2g，三蒸水定容至1L,100kPa、10分钟高压灭菌，4℃保存。

胰蛋白酶溶液(0.25％):称取胰蛋白酶0.25g，加100m1高压消毒过的D-Hanks液，搅拌混匀，室温4小时或4℃冰箱中溶涨过夜，pH调至7.2-7.4,0.22um滤膜过滤除菌，小瓶分装，-20℃保存备用。

DMEM培养基：在超净台中，将袋装培养基干粉溶于1L高压消毒过的三蒸水中，搅拌均匀，加入3.7gNaHCO₃,青、链霉素各10万单位，pH调至7.2-7.4,0.22um滤膜过滤除菌，4℃保存。

1.4.仪器

PCR仪：Ependof，德国；

低温高速离心机：Backman，美国；

ZF-90型多功能暗箱式紫外投射仪：上海顾村电光仪器厂；

DYY-1115型稳压稳流电泳仪：北京六一仪器厂；

超低温冰箱：日本三洋公司；

CO₂培养箱：德国Heraeus产品；

倒置相差显微镜：重庆光学仪器厂；

半自动生化分析仪：荷兰；

六泉LQP-B-4型制冰机：上海安亭医疗仪器厂；

电泳仪：BiometraP25，美国；

FR-200A凝胶成像分析系统：上海复日科技有限公司。

2.实验方法

2.1中药的制备(同实验一)

2.2含中药血清的制备

取体重250克左右SD大鼠12只，雌雄各半，随机分为4组(生理盐水对照组、高、中、低剂量中药组)，每组3只。生理盐水对照组大鼠3ml生理盐水灌胃，每天两次，连续3天，于末次灌胃后2h股动脉取血。高、中、低剂量中药组大鼠按不同浓度3m1中药灌胃，分别相当于9.32g、6.94、4.66g生药，每天两次，连续3天，于末次灌胃后2h股动脉取血。静置1小时以上，离心后收集血清，56℃水浴灭活30分钟，经0.22um滤膜过滤除菌，-20℃保存备用。

2.3实验分组及含药血清对成骨细胞的干预

根据中药灌胃的不同浓度将血清分为高、中、低剂量中药组，与生理盐水灌胃后取血的血清相对照，培养基中的血清浓度为20％。选择生长状态良好的大鼠3代成骨细胞，将细胞以5×10³/孔接种入96孔培养板，6h后见细胞完全贴壁，移去完全培养基，用含100ml/L胎牛血清的DMEM培养基培养24h，再用无血清含1％FBS的培养液继续培养24h，细胞饥饿过夜。每瓶成骨细胞分别加入血清浓度为20％的生理盐水对照组大鼠血清及高、中、低剂量中药组大鼠血清。放入三相气体培养箱中，在37℃,5％CO₂及2％O₂条件下培养72h。

2.4细胞形态学观察

通过倒置相差显微镜观察细胞的形态，生长状况及对照组和高、中、低剂量中药血清处理组之间的差别。

2.5MTT法测细胞增殖

细胞经0.25％胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清DMEM培养基稀释到5×10⁴/ml，接种于96孔培养板，每孔200ul,常规培养24小时细胞贴壁后，换低剂量组、中剂量组、高剂量组和对照组的DMEM培养基，每组重复10个孔，继续培养3天。每板做5个复孔，重复两板，共10个复孔。测定时，每孔加入5mg/mlMTT(噻唑蓝)溶液20ul,37℃继续培养4小时，终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150ul二甲基亚飒(DMSO)，震荡10分钟，使结晶物充分溶解。

选择490nm波长，酶标仪上测定各孔吸光度值，记录结果。

2.6成骨细胞OPG及RANKL mRNA表达的检测

2.6.1总RNA提取

(1)加入1mlRNAisoTMPlus到底面积为25cm²培养瓶培养的大鼠成骨细胞中，用移液枪反复吹吸30s，室温静置5分钟；

(2)4℃1200Or/min离心10分钟；

(3)将上清移入新的1.5ml离心管,室温放置10分钟；

(4)加入0.2ml氯仿,用手颠倒剧烈振荡15秒后,室温放置3分钟；

(5)4℃1200Or/min离心10分钟,使混合物成两相；

(6)将上层水相转移入一新的1.5ml离心管中,加入600μl异丙醇,颠倒充分混匀后,于室温放置10分钟；

(7)4℃,12000r/min离心10分钟；

(8)弃尽上清,沉淀中加入lml75％乙醇洗涤一次；

(9)4℃7500r/min离心5分钟后,吸弃上清；

(10)将沉淀在室温下放置干燥10分钟；

(11)加入50μl预热65℃的RNaseFree去离子水,溶解RNA。测定总RNA浓度和纯度后,将总RNA浓度稀释为20Oμg/ml,用于逆转录cDNA。

2.6.2逆转录cDNA

在200μlPCR管中配置下列混合液：

Oligo dT Primer(50μM)：1μl；

dNTP mixture(10μMeach)：1μl；

总RNA：5μl；

RNase Free dH₂O：3μl；

65℃,5分钟,冰上急冷；

在上述200μlPCR管中配置下列反转录反应液：

上述变性、退火后反应液：10μl；

5×PrimeScript Buffer：4μl；

RNase Inhibitor(40U/ul)：0.5μl；

PrimeScript RNase(200U/ul)：1μl；

RNase Free dH₂O：4.5μl；

42℃,60分钟,70℃,15分钟,反应产物用于PCR扩增。

2.6.3PCR扩增

1×PCR反应体系：

RNaseFreedH₂O：14.875μl；

dNTPs(2.5mM)：2.00μl；

10x PCR bufer：2.50μl；

MgCl2(25mM)：2.50μl；

5'-primer(10uM)：0.50μl；

3'-primer(10uM)：0.50μl；

Taq polymerase(5U/ul)：0.125μl；

cDNA：2.0μl；

PCR引物及反应条件如表6所示。

表6  PCR引物及反应条件

2.6.4琼脂糖凝胶电泳

用l×TAE电泳缓冲液制备1.5％琼脂糖凝胶，待凝胶冷却凝固后，在电泳槽内加入l×TAE电泳缓冲液，使电泳缓冲液刚好盖过胶面1mm左右，然后小心取出点样梳板，待测的DNA样品中加入1/6体积溴酚蓝指示剂，混匀后稍离心，点样，电泳电压为100V，电泳1.5小时后，取出凝胶置于EB染液中染色，10分钟后，在FR-200A全自动紫外与可见光分析装置扫描凝胶，照相，用Totallabv1.10软件分析，得到待测RNA扩增产物与内参β-actinRNA扩增产物的光密度值，计算二者的比值，作为RNA的相对表达量，进行数据分析。实验重复三遍。

2.7数据处理

数据采用SPSS13.0For Windows软件处理，以均数±标准差表示，两样本均数比较应用方差齐性检验、t检验，组间比较用多因素方差分析检验。

3.结果

3.1细胞形态学观察

相差显微镜观察:接种24h后见大部分细胞贴壁、伸展，初时细胞形态多样化，呈多边形及梭形，胞浆丰富，为单核，胞核大而清晰，呈圆形或卵圆形，含1～2个核仁。随着培养时间的延长，细胞伸出较多突起，有的突起相互连接。培养3天后，细胞变为长梭形、条索形，有的融合成片，分界较为模糊。高、中、低剂量中药血清处理组与生理盐水对照组相比，细胞数量密集，细胞间隙较少，形态无明显差异(图14：A～D)。

3.2.MTT法测各组血清对细胞活性的影响：如图15所示。

与生理盐水对照组血清干预的细胞相比，高、中、低剂量中药血清组干预的细胞增殖较强，但P＞0.05，无统计学差异(图15)。

3.3.大鼠成骨细胞OPG、RANKLmRNA表达值及OPG/RANKL比值(表7)。

表7  各组大鼠成骨细胞OPG、RANKLmRNA表达值及OPG/RANKL

注：与生理盐水对照组组内比较，^▲P＜0.01，有显著性差异；^△P＜0.05，有统计学差异。与低剂量组组内比较，^*P＜0.01，有显著性差异。^◆P＜0.05，有统计学差异。

OPGmRNA表达值：高、中剂量中药组显著高于生理盐水对照组(P＜0.01)；低剂量中药组高于生理盐水对照组(P＜0.05)。高、中、低剂量中药组之间无统计学差异。

RANKLmRNA表达值：高、中、低剂量中药组显著低于生理盐水对照组(P＜0.01)；高剂量中药组低于低剂量中药组(P＜0.05)。

OPG/RANKL比值：高、中、低剂量中药组显著高于生理盐水对照组(P＜0.01)；高、中剂量组显著高于低剂量组(P＜0.01)。(表7、图16、17)

4.讨论

1.中药血清药理学研究方法的特点

本实验采用了血清药理学研究方法研究补肾活血胶囊对成骨细胞OPG、RANKLmRNA表达的影响。血清药理学是指用含有药物成分的血清施加于体外实验反应体系的一种实验方法，是一种间接添加法。它能够真实地反映中药在胃肠道消化吸收，经生物转化产生药理效应的过程，代表了药物在体内产生作用的真正有效成分，特别适合于中药复方成分复杂的特点。

中药复方制剂因其有效化合物含量较低，作用广泛而缓和，表现为多向性、多层面、多靶点的药理学特点，能调节机体多系统功能，其药效基础除了药物原有效成分外，还有药物作用于机体后产生的内生性有效成分。因而采用血清药理学的实验方法,具有明显的优势：(1)血清不仅是载体，也是药物发挥作用的场所：血清所含成分经过了体内一系列的生物转化，才成为真正发挥作用的有效成分。这在某种程度上能揭示复方中药在体内活性成份的转化和改变；(2)在细胞培养中，血清的理化性质与细胞的内环境基本等同，排除了制剂本身对实验结果的干扰；(3)中药血清克服了复方粗制剂本身理化性质不确定因素对实验结果的干扰，相对接近药物在体内生物转化的真实过程，有助于中药真正有效部位、活性成分的发现。能客观阐明中药的药效和作用机理。采用含中药血清培养细胞可观察到复方经体内胃肠吸收后的综合整体药理效应，同时也可直接观察中药的药物学效应；(4)采用含药血清培养细胞，可使中药研究能在离体实验中直接与分子生物学技术相结合，便于应用细胞学和分子生物学手段，从基因、基因产物、药物受体和酶活性等方面阐述药理机制；(5)有利于应用现代生命科学的技术手段和理论阐述中药复方配伍和相使相须的实质，便于观察和追踪药物的吸收和代谢过程，从而较清楚地认识复方药物中的有效成分及活性部位，发现中药复方发挥药效作用的物质基础。综上所述，本实验采用中药血清药理学的研究方法，为探讨补肾活血胶囊的作用规律提供了正确性、真实性及可靠性的保证。

2.补肾活血胶囊含药血清对OPG、RANKLmRNA表达的调控

OPG/RANKL在激素性股骨头坏死的病理过程中具有重要作用。激素性股骨头坏死与骨形成和骨吸收功能的失平衡密切相关，成骨细胞与破骨细胞在骨形成与骨吸收平衡中起重要的调控作用，维持骨骼的完整性及正常生理功能需要破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨形成作用间的动态平衡，OPG,RANKL,RANK组成系统网络，在调节破骨细胞的形成和活化及骨重建过程中起关键作用。从目前研究现状看，药物调控骨代谢多以破骨细胞为靶点，可通过抑制前体破骨细胞向完全分化的多核细胞转变或调节成熟破骨细胞降解骨速率、改善骨吸收。因此，破骨细胞分化的分子机制及其降解骨基质功能的研究已成为热点。针对破骨细胞形成和活性的药物作用靶包括:AP-1转录因子,OPG/RANKL,pp60^c-sic激酶或通过SH2/SH3结构域干预pp60^c-sic信号通路,组织蛋白酶,碳酸酐酶,p38激酶等。其中OPG主要是由成骨细胞系的各种细胞分泌，是目前己知惟一的与定位于成骨细胞膜上的RANKL结合的饵受体，它通过阻断RANKL与RANK结合从而封闭成骨细胞诱导的破骨细胞前体分化、存活，抑制成熟破骨细胞的活化。已有大量的报道表明：许多种类的中药含药血清能够调控成骨细胞OPG、RANKLmRNA的表达，发挥平衡、调节骨代谢的作用。吴丽萍通过观察不同剂量的三七总甙对体外培养大鼠成骨细胞OPGmRNA表达的影响，发现三七总甙可促进大鼠成骨细胞的OPGmRNA的表达，以50ug/ml时作用最为明显。肖鲁伟等利用血清药理学方法研究补肾复方对大鼠成骨细胞OPG及RANKL表达的影响，发现补肾活血方、补肾健脾方含药血清能增加大鼠成骨细胞OPG表达量，同时可降低成骨细胞RANKL的表达量。胡彬等研究蛇床子素对体外培养的大鼠成骨细胞中OPG、RANKLmRNA表达的影响，发现蛇床子素能够增加大鼠成骨细胞OPGmRNA的表达，且能轻微抑制RANKLmRNA的表达，但早期对RANKLmRNA的表达影响不明显。吴乃中等研究葛根中药含药血清对成骨细胞OPG,RANKLmRNA表达的影响，实验表明葛根通过上调成骨细胞OPGmRNA的表达及下调RANKLmRNA的表达，从而抑制破骨细胞的产生和功能。

本实验结果表明：补肾活血胶囊含药血清能够上调成骨细胞OPGmRNA的表达，同时下调RANKLmRNA的表达，使OPG/RANKL比值增加，以高、中剂量作用更为显著。Hofbauer等的实验研究表明,糖皮质激素对于成骨细胞及骨间质细胞的OPG的转录和表达有强大的抑制作用，在间质细胞中加入地塞米松培养6h后,OPGmRNA的水平即开始减低；另一方面,激素(如地塞米松)也能够促进成骨细胞/间质细胞的RANKLmRNA转录,进而促进RANKL mRNA的表达。补肾活血胶囊显示了对糖皮质激素的这种完全拮抗作用，它通过OPG/RANKL耦联，上调成骨细胞OPGmRNA同时下调RANKLmRNA，最终发挥作用于破骨细胞，抑制破骨细胞的产生和功能而具有促进骨修复的功效。

3.OPG/RANKL之间的作用机制及其与VEGF的联系

补肾活血胶囊具有活血化瘀、补肾壮骨的功效，二者相互促进，密切联系。血液周流通畅使筋骨得充，肝肾得养；而肾精充足，化生阳气，推动血行，脉络畅通。实验结果显示补肾活血胶囊增强VEGF的表达同时升高OPG/RANKL的比值。现代研究表明OPG/RANKL与VEGF之间亦有一定的相关性。

OPG/RANKL之间的作用机制为：(1)蛋白激酶C的活化剂可以激活OPG的分泌,即OPG分泌增加与OPGmRNA的表达增加相一致。蛋白激酶C的拮抗剂可以拮抗OPG表达的增加,但对基础水平OPG的表达没有影响。蛋白激酶C途径在OPG的表达中具有重要的作用。(2)RANKL可以提高NF-kappaB和c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)的活性,也可以增加细胞癌基因c-srcmRNA的表达,但对两种抗凋亡因子bcl-2及bcl-XL(B细胞淋巴瘤肿瘤原基因-2、-XL)mRNA的表达没有影响。骨组织随机械应力和激素水平的变化而不断改建。骨重建过程由破骨细胞激活，从骨吸收开始。破骨细胞活性受多种细胞因子调节，肿瘤坏死因子及其受体超家族成员(RANKL、RANK、OPG)、多种细胞因子和钙调节激素在破骨细胞形成及活化中发挥关键作用。成骨细胞和骨髓基质细胞表达RANKL，其受体RANK表达于前破骨细胞和破骨细胞系的其他细胞。RANKL与RANK的相互作用激活多个调控破骨细胞发生的转录因子，诱发级联反应促进破骨细胞的活化、分化，从而刺激破骨细胞的形成和分化。OPG作为诱饵受体与RANK竞争性结合RANKL，与RANKL结合后可以抑制RANKL与RANK的结合,进而抑制破骨细胞形成和分化，从而最终抑制骨吸收。RANKL和OPG不仅是破骨细胞终末分化的重要调节因子，还调节破骨细胞的吸收功能。研究发现OPG、RANKL在小鼠骨和成骨样细胞的表达随年龄而改变，RANKL在幼年小鼠与成年小鼠的骨细胞中表达增加而在老年小鼠中的表达降低。最新观点认为,OPG不仅通过结合RANKL而发挥作用,而且可直接影响破骨细胞的功能。研究证明OPG的直接作用通过使蛋白酶和蛋白酶抑制因子的表达增加来实现的,OPG调节骨吸收的作用比最初的研究机制更加复杂。

研究表明OPG可能是动脉钙化和内皮细胞存活的一种保护性因子。Hotbauer等指出，OPG可在血管平滑肌细胞中表达。PDGF、血管紧张素Ⅱ和TNF-α以及IL-1β可以增加血管平滑肌细胞中OPG的表达。因此，OPG可能是血管动态平衡中一个重要的作用因子。缺乏OPG的鼠表现为主动脉和肾动脉的钙化。这说明OPG除了调节骨代谢外，也调节血管的钙化。

总之，本研究结果表明：1.兔血清中BGP、IL-6和血管内皮四项测定结果提示，补肾活血胶囊可以明显的升高血清BGP、降低IL-6，降低血浆内皮素、升高血清NO水平、降低血浆血栓素及升高前列环素水平，与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)；通过测定以上血液中的各项指标含量变化，及光镜观察到的骨小梁变细，萎缩，骨髓细胞减少被脂肪细胞填充，并且脂肪细胞肥大，骨小梁内正常骨细胞数量减少。提示激素性股骨头坏死的发生、发展与激素导致的上述变化有密切关系。2.补肾活血胶囊能够提高血清OPG含量，降低RANKL含量，升高OPG/RANKL比值。补肾活血胶囊能够上调OPG mRNA的表达，下调RANKL mRNA的表达，OPG/RANKL是补肾活血胶囊的药物作用靶点之一。本实验是对补肾活血胶囊的初步实验研究，指标的检测仍有待深入。

实验三、制备工艺的研究

1.处方组成：淫羊藿30g，杜仲15g，丹参30g，川芎15g，白芍15g，茯苓12g，牛膝12g，鹿角胶10g，香附9g，甘草9g，共157g。

2.水提取工艺研究

(1)试验设计：按处方精选符合《中国药典》2010年版规定的上述药材，经检验合格。称取处方量的上述药材，按星点试验设计法提取条件提取，以出膏率与淫羊藿中淫羊藿苷和丹参中丹酚酸B的含量的综合评价为指标，计算OD值，对提取效果影响比较显著的因素：加水量(X1)、提取时间(X2)进行考察。

(2)提取工艺：称取处方量药材157g，置圆底烧瓶中，按星点实验设计(如表8、图18所示)，加一定量的水，加热煎煮提取，浓缩干燥，粉碎成细粉，备用。

表8  星点设计 水提取因素水平表

(3)淫羊藿苷含量测定：照高效液相色谱法测定。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈－水(30:70)为流动相；检测波长为270nm。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1500。

对照品溶液的制备：取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1.0ml含一定浓度的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取样品粉末(过三号筛)约0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇10ml，称定重量，超声处理1小时，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，测定，以淫羊藿苷对照品的峰面积为对照，计算淫羊藿苷含量。

(4)丹酚酸B含量测定：照高效液相色谱法测定。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％甲酸水(25：75)为流动相；检测波长为286nm。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备：取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加75％甲醇制成每1ml含丹酚酸B一定浓度的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品粉末(过三号筛)约0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇25ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，测定，即得。

结果如表9所示。

表9  水提取实验设计结果

应用Design-Expert8.0软件对表中的数据进行二次多元回归，得到加水量(X1)与提取时间(X2)与OD值的回归方程：

Y(OD)＝0.4+0.065X1-9.740E-0.03X2-0.17X1X2-0.16X12-0.054X22

显著性检验表明，P＝0.0014<0.01,加水量和提取时间对最终OD值有显著性差异，根据RSM分析得到最佳水提工艺为14倍量水，提取时间为136分钟。

3.醇沉提取工艺研究

试验设计：根据水提试验的结果，结合醇沉工艺研究的主要条件有浸膏浓缩比重、醇沉浓度两大影响因素，采用单因素考察的方法选取适宜的浸膏相对密度和醇沉浓度。

单因素考察浸膏浓缩比重,药液浓缩至表中的相对密度，醇沉至含醇量60％，干燥后得干膏粉进行含量测定，结果见表10、11。

表10  单因素考察浓缩相对密度

由表10可知，在药液浓缩至相对密度1.1左右时有效成分含量最高，故醇沉时选择浓缩至1.1。

表11  单因素考察不同醇沉浓度

由表11可知，醇沉70％，80％的有效成分含量大体一致，从经济学角度考虑，最终选择醇沉至70％。

由此，可以得出补肾活血胶囊的提取工艺为提取2次，加入溶剂14倍量，煎煮136min，将鹿角胶烊化后加入，浓缩至相对密度1.1，醇沉至含醇量70％，然后干燥后制颗粒。

4.浓缩方法的选择

比较常压浓缩和减压浓缩两种方法，发现常压浓缩耗时长，效率低；而采用旋转蒸发仪进行减压浓缩效率高，所需温度低，有利于有效成分的保存。故选用减压浓缩方法对提取液进行浓缩。

取处方量100倍药材，按上述提取工艺提取，醇沉后密封冷藏过夜，滤过，滤液减压回收乙醇，剩余溶液浓缩至稠膏，备用。

5.干燥方法的选择

干燥方法较多，结合实际实验条件，选择60℃减压干燥、微波烘干、常压干燥、喷雾干燥四种方法比较，结果见表12。

表12  稠膏干燥方法的研究

由上表干燥度、外观、黏度、吸湿度综合考虑可知，60℃减压干燥方法干燥最好，干燥时间适当，干膏质地疏松、吸湿度中等。

6.制粒方法的选择

取处方量50倍药材，按上述提取工艺提取、浓缩、干燥，粉碎成细粉，取细粉两份，每份100g用湿法、干法分别制粒。

湿法制粒中，由于药粉吸湿性较强，粘度较大，难以制软材，加入无水乙醇难以制成软材，干浸膏粉末黏结成硬块，无法制备颗粒故不能用湿法制粒。

干法制粒中，在试验中发现，可以直接制颗粒，颗粒均匀，成型较好，但是由于粘度较大出现黏连，并且容易黏连轧轮，故需要加入辅料，因此进一步考察干法制粒辅料种类及用量。

7.辅料种类的选择

辅料常用的较多，综合考虑选用目前常用的糊精、预胶化淀粉、微粉硅胶、微晶纤维素作辅料进行考察，以粉体流动性、颗粒外观、均匀度为评价指标，与不加辅料的干浸膏粉进行比较，结果见表13、表14。

表13  颗粒质量检查表

由上表可知糊精和微粉硅胶的流动性和颗粒的均匀度较好，为了进一步验证，故要进行稳定性试验。

表14  颗粒常温常湿放置一周后物理现象

由上两表可知，加入淀粉制得颗粒流动性和稳定性一般，加入微粉硅胶制得颗粒流动性较好但吸湿性较高，加入微晶纤维素和糊精制得颗粒的流动性吸湿度和粘度差不多但微晶纤维素价格较贵，综合考虑选用糊精作为制颗粒的辅料。

8.辅料用量的选择

由上述可知糊精是最佳加入辅料，本试验主要考虑用量，取步骤(6)的细粉，分别加入5％，10％，20％的糊精，干法制粒，进行相关试验，结果见表15、16。

表15  颗粒质量检查表

表16  颗粒常温常湿放置一周后物理现象

由表15、16可知，糊精用量致使流动性及吸湿率相差不大，但考虑到胶囊剂的服用量问题，选择加入干膏量的10％的糊精进行干法制粒。

Claims (7)

1.一种治疗激素性股骨头坏死的中药制剂，其特征在于：是由以下原料药制成的：淫羊藿25～35g，杜仲10～20g，丹参25～35g，川芎10～20g，白芍10～20g，茯苓10～15g，牛膝10～15g，鹿角胶8～12g，香附6～12g，甘草6～12g。

2.根据权利要求1所述的治疗激素性股骨头坏死的中药制剂，其特征在于：是由以下原料药制成的：淫羊藿30g，杜仲15g，丹参30g，川芎15g，白芍15g，茯苓12g，牛膝12g，鹿角胶10g，香附9g，甘草9g。

3.权利要求1或2所述的治疗激素性股骨头坏死的中药制剂的制备方法，其特征在于：取除鹿角胶外的各原料药，混合，加入12～16倍量的水，煎煮130～140min，过滤除去滤渣，向滤液中加入烊化的鹿角胶，浓缩滤液，然后加入浓度为80～100％的乙醇，调整乙醇含量为70％，静置10～15h，过滤，滤液减压浓缩至稠膏，干燥，加入糊精进行干法制粒，即得。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述浓缩滤液具体为：浓缩滤液至相对密度为1.1。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述干燥为60℃减压干燥。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述糊精的加入量为稠膏干燥后所得物料的10％。

7.根据权利要求3～6中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述治疗激素性股骨头坏死的中药制剂的剂型为胶囊剂，干法制粒后，装入胶囊制成胶囊剂。