CN103987393B - 包括与益生菌联合的n-乙酰半胱氨酸和/或微胶囊化的胃保护性溶菌酶的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包括与益生菌一起的N‑乙酰半胱氨酸和/或溶菌酶；或者N‑乙酰半胱氨酸和微胶囊化的胃保护性溶菌酶的组合物，其用于胃酸过多的药物治疗。所述组合物能够恢复在胃酸过多的药物治疗期间丧失的胃本身的屏障效应，并使由于所述药物治疗造成的副作用最小化。

Description

包括与益生菌联合的N-乙酰半胱氨酸和/或微胶囊化的胃保 护性溶菌酶的组合物
技术领域
本发明涉及用于胃酸过多的药物治疗的包括与益生菌联合的N-乙酰半胱氨酸和/或溶菌酶或者N-乙酰半胱氨酸和微胶囊化溶菌酶的组合物。所述组合物能够恢复在胃酸过多的药物治疗期间丧失的胃本身的屏障效应，并使由于所述药物治疗造成的副作用最小化。此外，优选在所述组合物中为非微胶囊化形式的N-乙酰半胱氨酸的存在能够增加用于应对病原体的益生菌的效力，优选微胶囊化且胃保护性的溶菌酶的存在能够对抗过度的细菌生长并抑制任何存在的梭菌属孢子的萌发，而不产生涉及益生菌菌群的任何类型的抑制。
背景技术
在过去的几十年里，已开发出用于药物治疗胃酸过多的各种药理学方法，胃酸过多为如果以明显程度并长时间存在则可引起各种并发症或病理如消化性溃疡和胃食管返流疾病。
在最广泛使用的药物中，有基于能够抑制组胺受体H2抑制剂的活性要素的那些药物诸如西咪替丁(cimetidine)、法莫替丁(famotidine)、尼扎替丁 (nizatidine)和雷尼替丁(ranitidine)等，或者基于能够抑制前列腺素的活性要素的那些药物诸如米索前列醇等。另一类药物基于起到胃粘膜保护剂功能的活性要素，诸如铋盐、硫糖铝，或者基于呱仑西平(pirenzepine)和哌羟苯酯 (pipenzolate)的抗毒蕈碱的或抗副交感神经的药物等。最后，还有诸如碳酸氢钠、氢氧化铝或氢氧化镁等的抗酸剂，和基于兰索拉唑(Lansoprazole)、埃索美拉唑(Esometazole)、雷贝拉唑(Rabeprazole)、泮托拉唑(Pantoprazole)和奥美拉唑(Omeprazole)的质子泵抑制剂。
质子泵抑制剂(PPI)为其主要作用在于使胃液酸性明显减少相当长的一段时间(18至24小时)的一组分子。
包含PPI的组为H2抗组胺的继承者，且由于PPI抑制剂更大的效力而比后者更为普遍。
上述药品用于各种综合征例如(i)消化不良；和(ii)胃十二指肠溃疡的对症治疗和对因治疗(aetiological treatment)。PPI用于治疗或预防胃和十二指肠溃疡。它们还与一些抗生素联合用于治疗由幽门螺杆菌(Helicobacter pylori) 引起的胃炎；(iii)佐林格-埃利森综合征(Zollinger-Ellison syndrome)和(iv)胃食管返流疾病。
PPI还用于长期用乙酰水杨酸或其它NSAID治疗的患者。通过抑制环加氧酶(cyclooxigenase)1(COX1)的酶功能，这些药物具有减少前列腺素合成 (依赖于该酶的过程)的副作用。由于前列腺素的功能之一为使胃黏膜免受酸性的影响，因此PPI用于减少酸性和保护胃黏膜。
这种药品抑制胃酶H+/K+-ATPase(质子泵)，H+和K+离子交换的催化剂。这造成酸分泌的有效抑制。
在pH低(接近2)的微通道中，这些抑制剂离子化并转变成能够与泵亚单位的半胱氨酸的巯基(SH)建立共价双键的分子。因此，泵不可逆地受到抑制。泵活性的恢复需要新泵的产生，该事件需要平均18至24小时。因此，单一剂量的PPI使得胃液分泌能够被抑制约24小时。
抑制剂仅在酸性环境下是活化的事实解释了为什么它们对处于直肠和结肠水平的胃外部的H+/K+-ATPase的作用最小。
总之，且不说它们具体的作用机制，根据依赖于所采用的特定分子及其剂量的动力学和强度，几乎所有这些类治疗胃酸过多或以上提及的其它病理状态的药物的最终作用都是增加胃的pH。这方面的例外是前列腺素和胃粘膜保护剂药物，它们不是减少管腔内的氢离子浓度，而是通过胃壁细胞增加粘液和碳酸氢根离子的合成，从而增加粘膜免受内腔(lumen)酸性的影响的保护。总之，在消化性溃疡或胃食管返流病例中能够减少胃酸过多的药物构成治疗选项，而粘膜保护剂代表了辅助治疗。
此外，已知正常的胃酸性构成了对正常饮食摄取的潜在有害的生物体或病原体的有效屏障。事实上，它们中的许多对酸性特别敏感，且在低于3的 pH值下不能存活超过5分钟，有时甚至更短。于是其中属于沙门氏菌属 (Salmonella)的那些不会活着到达肠道，撇开由食物中分泌的和已经存在的毒素介导的对人体的有害作用不谈，它们也不能引起肠道感染以及因此的全面爆发的食物中毒。
然而，应该说，在服用药物以减少或治疗胃酸过多的患者中典型地发现胃pH值的提高，使得这些患者更加暴露在尤其是由摄取生食，特别是鱼、肉和蛋所引起的食品毒素感染中。
服用诸如质子泵抑制剂等药物以减少或治疗胃酸过多的患者具有约5的胃pH值。
该pH值使得具有明显的脱羧酶活性的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和大肠杆菌(E.coli)的特定菌株通过退化的胃屏障。饮食中摄取的蛋白质被酶促降解为氨基酸，在脱羧酶作用的存在下这些氨基酸被修饰为一系列从潜在危险到高危险范围内的生物胺，诸如组胺、酪胺、腐胺和尸胺等。这些生物胺可引起的最常见的症状与使用质子泵抑制剂(PPI)引起的副作用完全重叠，副作用为：腹泻、头痛、恶心、腹痛和肠胃气胀。当某些生物胺与亚硝酸盐反应时，我们便形成了N-亚硝胺。这些亚硝胺通过使DNA烷基化而引起基因突变，并且它们的存在与胃癌、肠癌、胰腺癌和膀胱癌以及白血病相关。
这些患者的一个可行解决方案并不明显包括暂停药物治疗，这是由于这会再次使胃或食管粘膜暴露于由胃液介导的有害作用。另一方面，继续药物治疗并使患者暴露于此类感染风险中甚至是不可想象的。
因此，一方面仍有必要使需要的患者服用药物以减少或治疗胃酸过多，另一方面避免暴露于高度危险的病原感染或暴露于病原感染复发的风险中。
发明内容
特别地，仍然需要能够借助下述组合物来响应上述需要，所述组合物为自然来源、无副作用，具有改善的和选择性的对病原体诸如大肠菌类等的抗菌效力，所述大肠菌类为一群属于肠杆菌科且尤其包括以下的细菌：柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，肠杆菌属(Enterobacter)、优选阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，埃希氏杆菌属(Escherichia)、优选包括血清型O157:H7的大肠杆菌，哈夫尼亚菌属(Hafnia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)、优选肺炎克雷伯菌 (Klebsiella pneumoniae)，沙雷氏菌属(Serratia)和耶尔森菌属(Yersinia)，或者其它病原体如梭菌科(Clostridiaceae)，包括艰难梭菌(Clostridium difficile)、沙门氏菌(Salmonella enteriditis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejunii)和幽门螺杆菌。
申请人已利用下述组合物响应了上述需要，所述组合物一方面能够恢复对病原或有害微生物具有保护效应的胃屏障的功能，另一方面能够对病原体本身具有改善的和选择性的效力。
本发明的组合物能够恢复通常通过胃液运行的胃屏障的功能性，而胃液特别在服用药物以减少或治疗胃酸过多的患者中减少。所述组合物能够最小化与基于质子泵抑制剂药物(缩写为PPI)的药物摄入相关联的副作用。此外，所述组合物展示了改善的对病原体或有害微生物的效力。
在深入研究活动后，申请人已惊奇地发现，包括属于下述一个种以上 (one ormore of the species)的至少一种细菌菌株或可选地由属于下述一个种以上的至少一种细菌菌株组成的益生菌的选择性组合(或混合物)能够使需要的患者一方面服用药物来减少或治疗胃酸过多，另一方面避免暴露于高度危险的病原感染或暴露于病原感染复发的风险中。
本发明的主题证明在所述组合物中，由于N-乙酰半胱氨酸和/或溶菌酶；或者N-乙酰半胱氨酸和/或微胶囊化溶菌酶存在的结果，由各单独细菌菌株显示的抗菌效力增加，并且对病原菌更具选择性。在优选的实施方案中，溶菌酶在液态基质中为微胶囊化的。有利地，植物来源的液态基质具有在30℃至80℃之间、优选在40℃至70℃之间、甚至更优选在50℃至60℃之间的熔点。
本发明的主题由具有所附独立权利要求阐明的特征的组合物组成。
本发明的其它优选实施方案以本说明书连续记载并将在所附从属权利要求中要求保护。
表1示例性示出在本发明的背景下有效应用的一组微生物。
表2示出在本发明的背景下有效应用的一组微生物。
表3示出用于鉴定所施用的细菌的种而进行的种特异性PCR试验 (species-specific PCR assays)的结果。
表4示出d0(所有组)和d10(组B)时总细菌细胞和总乳杆菌的定量(值± SEM，胃液，log10CFU/ml；或擦拭十二指肠获得的材料，克)。
表5示出在d0和d10时组B的种特异性PCR试验的结果。相关种的存在用“+”表示，而它们的缺失用“-”表示。
表6示出在d0(所有组)和d10(组B)时排泄物样品中特定微生物组的定量。结果用排泄物的CFU/克的log10(值±SEM)表示。
附图说明
图1是指存在于从临床研究受治疗者采集的样品中的细菌总数(图A和图 B)。
图1A示出用PPI长期治疗的受治疗者(PPI组总计：PPI+“PPI加上益生菌”) 与对照组之间的比较。数据表示为菌落形成单位(CFU)的平均值。图1B示出用PPI长期治疗的受治疗者和用“PPI加上益生菌”治疗的受治疗者和对照组之间的比较。数据表示为菌落形成单位(CFU)的平均值±S.E.M.。
图2示出在胃液中及在治疗的受治疗者的十二指肠擦拭后发现的细菌的定量。
具体实施方式
申请人已进行了深入的研究和选择性活动，最终发现属于选自包括下列菌株或可选地由下列菌株组成的组的至少一个种的益生菌菌株有效地应用于治疗服用质子泵抑制剂(PPI)以减少或治疗胃酸过多的受治疗者：嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、格氏乳杆菌(L.gasseri)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、德氏乳杆菌德氏亚种(L.delbr.subsp.delbrueckii)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、干酪乳杆菌(L.casei)、副干酪乳杆菌(L.paracasei)、植物乳杆菌(L.plantarum)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、罗伊氏乳杆菌(L. reuteri)、短乳杆菌(L.brevis)、布氏乳杆菌(L.buchneri)、发酵乳杆菌(L. fermentum)、乳酸乳杆菌(L.lactis)、戊糖乳杆菌(L.pentosus)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、角形双歧杆菌(B.angulatum)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、短双歧杆菌(B.breve)、链状双歧杆菌(B.catenulatum)、婴儿双歧杆菌(B. infantis)、乳双歧杆菌(B.lactis)、长双歧杆菌(B.longum)、假链状双歧杆菌(B. pseudocatenulatum)和嗜热链球菌(S.thermophilus)。此外，申请人已发现，作为N-乙酰半胱氨酸(NAC)存在于所述组合物中的结果，由作为本发明的主题的细菌菌株展示的抗菌效力增加且对病原体更具选择性。
此外，申请人已发现，作为微胶囊化的胃保护性溶菌酶存在于所述组合物中的结果，由作为本发明的主题的细菌菌株展示的抗菌效力增加且对病原体更具选择性。溶菌酶在液态基质中是微胶囊化的。有利地，液态基质是植物来源的，且具有在30℃和80℃之间、优选在40℃至70℃之间、甚至更优选在50℃至60℃之间的熔点。
此外，申请人已发现，作为N-乙酰半胱氨酸和微胶囊化的胃保护性溶菌酶存在于所述组合物中的结果，由作为本发明的主题的细菌菌株展示的抗菌效力增加且对病原体更具选择性。溶菌酶在液态基质中是微胶囊化的。有利地，液态基质是植物来源的，且具有在30℃和80℃之间、优选在40℃至70℃之间、甚至更优选在50℃至60℃之间的熔点。
本发明的组合物包括与本发明的细菌菌株联合的N-乙酰半胱氨酸：N- 乙酰半胱氨酸为氨基酸半胱氨酸的N-乙酰化衍生物。
本发明的组合物包括与本发明的细菌菌株联合的微胶囊化的胃保护性溶菌酶。
本发明的组合物包括与本发明的细菌菌株联合的N-乙酰半胱氨酸和/或微胶囊化的胃保护性溶菌酶。
申请人已发现，使用与表1和2中或者本文记载的各种优选实施方案中记载的一种或两种或三种或四种或五种或六种细菌菌株联合的N-乙酰半胱氨酸能够溶解病原菌自身产生的并被所述病原体用作保护的细菌生物膜。实际上，已发现病原菌能够在细胞周围形成保护层(生物膜)。生物膜使得病原体的细胞更难攻击并更好保护。N-乙酰半胱氨酸能够穿透细胞的生物膜并将其溶解，促进由作为本发明主题的细菌菌株产生的细菌素和/或代谢物和/或氧合水对病原细胞的攻击。
此外，申请人已发现微胶囊化的胃保护性溶菌酶的使用使得能够穿透胃 -十二指肠屏障并完整到达结肠，由于与一种以上的作为本发明的主题的细菌菌株联合的孢子中酶的裂解作用，所述溶菌酶在结肠成功行使其抑制包括艰难梭菌(C.difficile)的梭菌科的作用。
存在于作为本发明的主题的组合物中的N-乙酰半胱氨酸的量包括在10 至1,000mg/天之间、优选在50至200mg/天之间、甚至更优选在60至150mg/天之间。使用本领域技术人员已知的技术和设备将以非微胶囊化形式和以药学可接受形式、优选以固体形式市售可得的N-乙酰半胱氨酸与优选以固体或冻干形式的益生菌混合以获得均一组成。
存在于作为本发明的主题的组合物中的微胶囊化的胃保护性溶菌酶的量包括在10至2,000mg/天之间、优选在400至1,000mg/天之间、甚至更优选在 500至800mg/天之间，优选为固体形式；使用本领域技术人员已知的技术和设备将其与优选以固体或冻干形式的益生菌混合以获得均一组成。溶菌酶以药学可接受形式市售可得。
细菌菌株由于其能够定殖在pH值在4至5.5之间；优选在4.5至5之间的胃中而被选择。在该pH值下，所选择的菌株借助于生产活性物质如细菌素和/ 或代谢物和/或氧合水来起作用。
本发明的组合物可为饮食组合物例如共生组合物，或增补剂或药物组合物或医疗设备。在一个实施方案中，组合物可包括，或可选地由与N-乙酰半胱氨酸(NAC)和/或溶菌酶、优选微胶囊化溶菌酶联合的表1或可选地表2中列出的那些中的一种或两种或三种或四种或五种或六种所选菌株组成。
表1
组合物包括表1和表2中列出的那些中的1至6种菌株、优选2至5种菌株、甚至更优选四种菌株。特别优选的菌株选自表2所列的那些。
表2
已独立地试验了表2的菌株，为的是鉴定它们能够拮抗(抑制一种以上的有害或病原微生物的种/属的生长或减少其数量)如表2第3栏所示的病原体。
表2示出所述细菌能够产生对一种以上的有害或病原微生物的种/属具有抑制作用的氧合水或至少一种细菌素。
本专利申请所记载的和/或要求保护的所有菌株已根据布达佩斯条约保藏并根据请求由胜任的保藏机构使公众可获取。
本发明的组合物有效地应用于服用药物以减少或治疗胃酸过多的受治疗者的治疗和由粘膜保护性机理的缺陷(例如，如在服用阿司匹林或其它 NSAI的情况下前列腺素E的分泌或对其的响应性降低)或幽门螺杆菌(H. pylori)感染引起的溃疡的治疗二者中的用途。换言之，本发明的组合物还有效地应用于规定服用PPI/其它抗酸剂药物的那些受治疗者，尽管他们未患有胃酸过多，但是患有由胃液酸性/粘膜保护机理之间的比例改变造成的胃和/ 或十二指肠粘膜损伤。
已发现本发明的组合物能够有效地应用于治疗消化性溃疡或胃食管返流。
在一个实施方案中，所述组合物包括选自属于包括下列细菌或可选地由下列细菌组成的组的至少一个种的益生菌菌株的1至6种菌株、优选2至5种菌株、甚至更优选3至4种菌株、或可选地由选自属于包括下列细菌或由下列细菌组成的组的至少一个种的益生菌菌株的1至6种菌株、优选2至5种菌株、甚至更优选3至4种菌株组成：与N-乙酰半胱氨酸和/或溶菌酶；或者N-乙酰半胱氨酸和微胶囊化溶菌酶联合的嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、德氏乳杆菌、德氏乳杆菌德氏亚种、唾液乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、发酵乳杆菌、乳酸乳杆菌、戊糖乳杆菌、青春双歧杆菌、角形双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、链状双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、假链状双歧杆菌和嗜热链球菌。
在一个实施方案中，所述组合物包括选自属于包括下列细菌或可选地由下列细菌组成的组的一个种以上的益生菌菌株的1至6种菌株、优选2至5种菌株、甚至更优选3至4种菌株、或可选地由选自属于包括下列细菌或由下列细菌组成的组的一个种以上的益生菌菌株的1至6种菌株、优选2至5种菌株、甚至更优选3至4种菌株组成：与N-乙酰半胱氨酸和/或溶菌酶；或者N-乙酰半胱氨酸和微胶囊化溶菌酶联合的德氏乳杆菌、德氏乳杆菌德氏亚种、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、戊糖乳杆菌、短双歧杆菌和长双歧杆菌。
在一个实施方案中，所述组合物包括选自包括下列菌株或可选地由下列菌株组成的组的1至6种菌株、优选2至5种菌株、甚至更优选3至4种菌株，或可选地由选自包括下列菌株或可选地由下列菌株组成的组的1至6种菌株、优选2至5种菌株、甚至更优选3至4种菌株组成：
1.戊糖乳杆菌LPS01DSM21980
2.植物乳杆菌LP01LMG P-21021
3.植物乳杆菌LP02LMG P-21020
4.植物乳杆菌LP03LMG P-21022
5.植物乳杆菌LP04LMG P-21023
6.鼠李糖乳杆菌LR06DSM21981
7.德氏乳杆菌LDD01(DSMZ20074)DSM22106
8.长双歧杆菌B1975DSM24709
9.短双歧杆菌B2274DSM24707
10.短双歧杆菌B632DSM24706
11.短双歧杆菌B7840DSM24708
12.长双歧杆菌PCB133DSM24691
13.长双歧杆菌BL06DSM24689
所述菌株与N-乙酰半胱氨酸和/或溶菌酶；或者N-乙酰半胱氨酸和微胶囊化溶菌酶联合。
在一个实施方案中，所述组合物包括选自属于包括下列细菌或可选地由下列细菌组成的组的一个种以上的益生菌菌株的1至6种菌株、优选2至5种菌株、甚至更优选3至4种菌株，或可选地由选自属于包括下列细菌或可选地由下列细菌组成的组的一个种以上的益生菌菌株的1至6种菌株、优选2至5种菌株、甚至更优选3至4种菌株组成：与N-乙酰半胱氨酸和/或溶菌酶；或者N- 乙酰半胱氨酸和/或溶菌酶；或者N-乙酰半胱氨酸和微胶囊化溶菌酶联合的德氏乳杆菌、德氏乳杆菌德氏亚种、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和戊糖乳杆菌。
在一个实施方案中，所述组合物包括选自包括下列菌株或可选地由下列菌株组成的组的1至4种菌株，或可选地由选自包括下列菌株或可选地由下列菌株组成的组的1至4种菌株组成：
-戊糖乳杆菌LPS01DSM21980
-植物乳杆菌LP01LMG P-21021
-鼠李糖乳杆菌LR06DSM21981
-德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii)LDD01(MB386)DSMZ20074DSM22106，
所述细菌与N-乙酰半胱氨酸和/或溶菌酶；或者N-乙酰半胱氨酸和微胶囊化溶菌酶联合。
在本发明的背景下，所述组合物可包括属于以上列出的各独立种的单一菌株，或可选地可包括属于同一种的多于一种菌株，例如全部属于如上所示的同一种的两种菌株、或三种菌株、或四种菌株。
在一个实施方案中，所述组合物包括在1×109至10×109CFU/菌株/剂量之间、优选在3至5×109CFU/菌株/剂之间的量的戊糖乳杆菌LPS01DSM21980 和/或植物乳杆菌LP01LMG P-21021和/或鼠李糖乳杆菌LR06DSM21981 和/或德氏乳杆菌德氏亚种(MB386)LDD01DSMZ20074(DSM22106)；在 10至200mg之间、优选在50至150mg/剂之间、甚至更优选在60至100mg/剂之间的量的NAC；在1至5克/剂之间、优选在2至3克/剂之间的量的马铃薯麦芽糖糊精。
上述组合物用于预防性和/或治愈性治疗由幽门螺杆菌的存在引起的感染、紊乱或疾病，特别用于预防性和/或治愈性治疗由幽门螺杆菌引起的感染复发；它们进一步用于治疗消化性溃疡或胃食管返流。
在另一实施方案中，本发明的组合物包括与菌株发酵乳杆菌LF09 DSM18298和/或菌株乳酸乳球菌NS01DSM19072联合的选自上述1至13 号表示的那些菌株的1至6种菌株、优选2至5种菌株、甚至更优选3至4种菌株，或可选地由与菌株发酵乳杆菌LF09DSM18298和/或菌株乳酸乳球菌NS 01DSM19072联合的选自上述1至13号表示的那些菌株的1至6种菌株、优选2 至5种菌株、甚至更优选3至4种菌株组成。
在另一实施方案中，本发明的组合物包括与选自包括下列菌株或由下列菌株组成的组的至少一种菌株联合的选自上述1至13号表示的那些菌株的1 至6种菌株、优选2至5种菌株、甚至更优选3至4种菌株，或可选地由与选自包括下列菌株或由下列菌株组成的组的至少一种菌株联合的选自上述1至13 号表示的那些菌株的1至6种菌株、优选2至5种菌株、甚至更优选3至4种菌株组成：(a)罗伊氏乳杆菌LRE01DSM23877；(b)罗伊氏乳杆菌LRE02DSM23878；(c)罗伊氏乳杆菌LRE03DSM23879；(d)罗伊氏乳杆菌LRE 04DSM23880。
本发明的所选菌株能够产生细菌素和/或代谢物和/或氧合水，这些为能够有效对抗、抑制或减少病原菌的物质。发现这些菌株有效地应用和用于预防性和/或治愈性治疗与病原革兰氏阴性菌相关联的感染和/或病理。
所述病原菌选自包括大肠菌类的组。所述大肠菌类为属于肠杆菌科的一群细菌。所述组包括超过5个属，其中柠檬酸杆菌属，肠杆菌属、优选阴沟肠杆菌，埃希氏杆菌属、优选包括血清型O157:H7的大肠杆菌，哈夫尼亚菌属，克雷伯氏菌属、优选肺炎克雷伯菌，沙雷氏菌属和耶尔森菌属。本发明背景下的通常感兴趣的其它病原体属于选自包括含艰难梭菌的梭菌科、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和幽门螺杆菌的种。在优选的实施方案中，药物或饮食组合物或增补剂或医疗设备可包括属于选自包括下列细菌或可选地由下列细菌组成的组的一个种以上的至少一种细菌菌株：与N-乙酰半胱氨酸和/或溶菌酶；或者N-乙酰半胱氨酸和微胶囊化溶菌酶联合的德氏乳杆菌、德氏乳杆菌德氏亚种、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、戊糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和短双歧杆菌。所述菌株能够产生细菌素和/或代谢物和/或氧合水。所述组合物有效地用于预防性和/或治愈性治疗与大肠杆菌病原体相关联的感染和/或病理。病原体大肠杆菌选自大肠杆菌O157:H7和大肠杆菌O104:H4。优选地，病原体大肠杆菌选自包括大肠杆菌ATCC8739、大肠杆菌ATCC10536、大肠杆菌ATCC35218和大肠杆菌ATCC25922的组。受本发明细菌菌株拮抗的另外的病原体为艰难梭菌。在优选的实施方案中，所述至少一种细菌菌株选自包括下列菌株或可选地由下列菌株组成的组：短双歧杆菌BR03DSM16604、短双歧杆菌B632DSM24706、鼠李糖乳杆菌LR04DSM16605、鼠李糖乳杆菌LR06DSM21981、植物乳杆菌LP01LMG P-21021、植物乳杆菌LP02LMG P-21020、戊糖乳杆菌LPS01DSM21980、德氏乳杆菌德氏亚种LDD01DSMZ 20074DSM22106。甚至更优选地，所述至少一种菌株选自包括下列菌株或可选地由下列菌株组成的组：鼠李糖乳杆菌LR06DSM21981、植物乳杆菌 LP01LMG P-21021、戊糖乳杆菌LPS01DSM21980和德氏乳杆菌德氏亚种LDD01DSM22106；这些菌株已对血清型O157:H7体外试验，并展示强拮抗活性。
已发现，包括以重量计以1:1:1:1至3:3:3:1的比例(例如1×109CFU/菌株/剂和3×109CFU/菌株/剂)的量的戊糖乳杆菌LPS01DSM21980、植物乳杆菌LP01LMG P-21021、鼠李糖乳杆菌LR06DSM21981和德氏乳杆菌LDD01 (MB386)DSM20074、德氏乳杆菌德氏亚种LDD01DSMZ20074DSM 22106以及以50至150mg之间的量的NAC的组合物发挥强拮抗作用。
在本发明的组合物中，细菌菌株的混合物以与组合物总量之比的0.5重量 %至20重量%之间(优选在2.5重量%至8重量%之间)的量存在。
在优选的实施方案中，组合物可进一步包括至少一种益生纤维(prebioticfibre)和/或具有双歧作用(bifidogenic action)的糖类。应用于本发明组合物中的益生纤维为必须被存在于所述组合物中的菌株所使用，但不被它们意欲拮抗的病原体所使用的纤维。如果要拮抗的病原体属于念珠菌属(genus Candida)，则有效地应用低聚果糖(FOS)和低聚半乳糖(GOS)，这是由于所述纤维不会被念珠菌利用；然而，低聚葡萄糖(GOSα)能够借助几种代谢物直接抑制大肠杆菌。因此，益生纤维可根据病例和要拮抗的病原体的需要而从下列中选择：菊粉，低聚果糖(FOS)，低聚半乳糖和反式低聚半乳糖(GOS和 TOS)，低聚葡萄糖(GOSα)，低聚木糖(XOS)，低聚壳聚糖(COS)，大豆低聚糖(SOS)，低聚异麦芽糖(IMOS)，抗性淀粉，果胶，车前子(Psyllium)，阿拉伯半乳聚糖，葡甘露聚糖，半乳甘露聚糖，木聚糖，乳果糖，乳酮糖，乳糖醇和各种其他种类的橡胶、阿拉伯树胶、巴西棕榈纤维、燕麦纤维、竹纤维、来自柑橘属植物(citruses)的纤维，以及一般来说包含彼此的比例可变的可溶性和不溶性部分的纤维。在本发明的优选实施方案中，所述组合物包括选自上述益生纤维中的至少一种益生纤维和/或其中以任意相对百分比的适合的混合物。如果存在于组合物中，则益生纤维和/或具有双歧作用的糖类相对于组合物总重量的量为0至60重量%、优选5至45重量%和甚至更优选的10至30 重量%。在该情况下，该组合物或增补剂具有共生活性和功能特性。
此外，该组合物还可包括其它活性成分和/或组分，例如维生素、矿物质、生物活性肽、具有抗氧化作用的物质、降胆固醇剂、降血糖剂、抗炎剂或抗甜料剂，在任何情况下依赖于活性组分的种类及其推荐的日剂量，如果限定，相对于组合物的总重量，其含量通常为0.001重量%至20重量%、优选0.01重量%至5重量%。
作为本发明主题的饮食组合物(例如共生组合物，或增补剂或药物组合物)根据本领域技术人员已知的技术和设备来制备。
在优选的实施方案中，所述组合物包含的细菌的浓度包括1×106至 1×1011CFU/g之间的细菌混合物、优选1×108至1×1010CFU/g之间的细菌混合物。
在优选的实施方案中，所述组合物包含的细菌的浓度包括1×106至 1×1011CFU/剂量之间、优选1×108至1×1010CFU/剂量之间。剂量可包括0.2至 10g，例如其为0.25g、1g、3g、5g或7g。用于本发明的益生菌为固体形式，特别是粉末、脱水粉末或冻干形式。本发明的所有组合物根据本领域技术人员已知的技术并通过使用已知的设备制备。
在一个实施方案中，本发明的组合物进一步包括用于减少或治疗胃酸过多的药物。该组合物为药物组合物并形成本发明的主题。所述药物选自包括下列药物或可选地由下列药物组成的组：受体H2抑制剂，优选西咪替丁、法莫替丁、尼扎替丁或雷尼替丁；前列腺素，优选米索前列醇；胃粘膜保护剂，优选铋盐或硫糖铝；抗毒蕈碱的或抗副交感神经的药物，优选呱仑西平和哌羟苯酯；抗酸剂，优选碳酸氢钠、氢氧化铝或氢氧化镁；质子泵抑制剂，优选兰索拉唑、埃索美拉唑、雷贝拉唑、泮托拉唑和奥美拉唑。优选地，所述药物选自包括下列药物或可选地由下列药物组成的组：受体H2抑制剂，优选西咪替丁、法莫替丁、尼扎替丁或雷尼替丁；抗毒蕈碱的或抗副交感神经的药物，优选呱仑西平和哌羟苯酯；抗酸剂，优选碳酸氢钠、氢氧化铝或氢氧化镁；质子泵抑制剂，优选选自包括兰索拉唑、埃索美拉唑、雷贝拉唑、泮托拉唑和奥美拉唑的组。
甚至更优选地，所述药物选自包括下列药物或可选地由下列药物组成的组：受体H2抑制剂，优选西咪替丁、法莫替丁、尼扎替丁或雷尼替丁；质子泵抑制剂，优选选自包括兰索拉唑、埃索美拉唑、雷贝拉唑、泮托拉唑和奥美拉唑的组。在优选的实施方案中，本发明的组合物为包括表1或表2或以上列出的优选实施方案中记载的细菌的药物组合物，所述细菌与如以上列出的显示用于减少或治疗胃酸过多的药物联合。有利地，该药物为选自包括兰索拉唑、埃索美拉唑、雷贝拉唑、泮托拉唑和奥美拉唑的组的质子泵抑制剂。细菌和药物二者紧密存在于所述组合物中。例如，细菌和药物以适用于口服给药的药物形式一起存在于片剂、锭剂(pastille)或颗粒剂中。
细菌和药物必须同时给药并同时起作用，这是因为由于质子泵抑制剂已将pH升高至约4-5.5(优选4.5-5.0)的值的事实而产生细菌素并能够在胃中定殖的本发明的益生菌的作用，而恢复由质子泵抑制剂(PPI)除去的屏障效应。
在另一优选实施方案中，本发明的组合物为医疗设备的形式。在该情况下，细菌存在于适于口服给药的组合物诸如片剂、锭剂或颗粒剂等中，并且单独地，如上所规定的，显示用于减少或治疗胃酸过多的药物存在于另一适于口服给药的组合物中。有利地，该药物为选自包括兰索拉唑、埃索美拉唑、雷贝拉唑、泮托拉唑和奥美拉唑的组的质子泵抑制剂。
因而，例如给药两种片剂，一个包含细菌，另一个包含药物。在任意情况下，两种片剂必须同时给药，条件是需要细菌与质子泵抑制剂同时作用。同样在医疗设备的情况下，细菌和药物在短的时间间隔内给药是必要的，这是因为由于质子泵抑制剂已将pH升高至约4-5.5(优选4.5-5.0)的值的事实而产生能够在肠道中定殖的细菌的作用，而恢复由质子泵抑制剂(PPI)除去的屏障效应。
申请人已发现，所选择的并列于表1或表2或以上优选实施方案中的细菌能够在约5的pH值下的胃中定殖，以便恢复由于在显示用于减少或治疗胃酸过多的药物作用后pH升高而减少或消除的屏障作用，所述药物诸如选自包括兰索拉唑、埃索美拉唑、雷贝拉唑、泮托拉唑和奥美拉唑的组的质子泵抑制剂药物等。
在优选的实施方案中，包含本发明益生菌菌株(所述菌株能够产生特定的细菌素)的组合物还是旨在最终消除幽门螺杆菌和避免其复发的有用的治疗佐剂。
因此，本发明的主题由包括表1或表2或上述实施方案之一中的至少一种细菌菌株的组合物构成，其用于预防性和/或治愈性治疗由幽门螺杆菌的存在所引起的感染、紊乱或疾病，特别是用于预防性和/或治愈性治疗由幽门螺杆菌引起的感染复发。
在该术语的广义中，抗生素定义为由生物体产生并具有抵抗其它生物体生长的活性的分子物质。然而，事实上，抗生素通常被认为是具有低浓度下阻断微生物生长的活性的二次代谢物。代谢的二次产物如有机酸、氨和氧合水不包括在抗生素的范畴中。抗生素是分子，也是肽分子(青霉素)，其由多酶体系来生产且其生物合成不受蛋白合成抑制剂阻断。另一方面，细菌素为核糖体合成的产物。细菌素为由核糖体合成而生产的肽分子，其还可与脂质或糖类相关联。尽管由革兰氏阳性菌(乳酸菌(Lactobacillus)、乳球菌 (Lactococcus))产生的某些细菌素具有局限于属于与生产微生物(producing microorganism)相同种的某些菌株的抑制谱，但它们中的大多数都显示出抵抗各种细菌种(革兰氏阳性和革兰氏阴性二者)的广谱作用。本细菌素的分类基于它们的化学性质和作用谱。
实验部分
A.方法
本试验的临床研究对10名受治疗者进行，其中9名已服用PPI超过一个月。由用PPI治疗的受治疗者组成的组进一步分成两个亚组：在内窥镜检查之前用PPI加上选择的乳杆菌(30亿鼠李糖乳杆菌LR06DSM21981、30亿植物乳杆菌LP01LMG P-21021、30亿戊糖乳杆菌LPS01DSM21980和10亿德氏乳杆菌德氏亚种(L.delbrueckii subsp.delbrueckii)LDD01)的菌株混合物治疗5-10天的患者。在对已禁食12-24小时的患者进行胃镜检查期间取由胃液和十二指肠擦拭材料组成的生物样品。使保存在艾米斯液(Amies liquid)中的生物材料进行适用于评价细菌接种量的微生物分析。非选择性培养基(LaptG) 用于获得细菌接种总量，同时用于选择异型发酵的乳杆菌，使用添加有抗生素万古霉素(2μg/ml)的MRS肉汤培养基制备初始样品的连续稀释。发现对细菌生长呈积极作用的最后的稀释(使用光密度)使得能够减少接种量本身的数量级。
为了证实所给药的益生菌菌株的存在，利用下述引物对进行PCR试验： RhaII/PrI用于鼠李糖乳杆菌；pREV/pentF用于戊糖乳杆菌；pREV/planF用于植物乳杆菌和SS1/DB1用于德氏乳杆菌德氏亚种(L.delbr.subsp.delbruckii) LDD01。
B.结果
细菌接种总量的结果表明，与发现实际上无菌的对照组(无PPI、无益生菌)相比，用PPI(PPI组总计：PPI+“PPI加上益生菌”)治疗的受治疗者在胃液中及在十二指肠擦拭中均显示大量细菌(图1A)。用PPI加上益生菌治疗的受治疗者的细菌接种量的分析揭示了两个分析组之间相当大的差异(1.5Log；图1B)。
图1A示出用PPI(PPI组总计：PPI+“PPI加上益生菌”)长期治疗的受治疗者与对照组之间的比较。数据表示为菌落形成单位(CFU)的平均值。图1B是指用PPI长期治疗的受治疗者与用“PPI加上益生菌”治疗的受治疗者之间的比较。数据表示为菌落形成单位(CFU)的平均值±S.E.M。
通过在连续稀释的添加有抗生素万古霉素的MRS肉汤中生长对异型发酵的乳杆菌的选择使我们证实，发现于用“PPI加上益生菌”治疗的受治疗者中的大多数细菌属于异型发酵组，如图2中重制的饼图中所示，其中面积与总微生物群体成比例。
使用种特异性PCR试验的分析示出了种—鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和德氏乳杆菌德氏亚种在用“PPI加上益生菌”治疗的所有受治疗者中存在，而未发现种—戊糖乳杆菌(表3)。可能该种不具有其在胃环境中存活所必需的特性。在仅用PPI治疗的受治疗者中显示的种—植物乳杆菌的阳性结果可能归因于受治疗者的饮食习惯。
预实验(PILOT STUDY)
材料方法
1.研究
年龄在19至57岁之间并用PPI治疗的总计30个个体(17名男性和13名女性)自发报名(2011年2-3月)。招募年龄在22至64岁之间不使用PPI(质子泵抑制药)的另外10个个体(4名男性和6名女性)作为代表正常胃液的人群的对照组。参与研究的入选标准包括：年龄在18至70岁之间，用PPI长期治疗至少连续3 至12个月(对于前三组)，招募时没有已知的其它健康问题，没有需要用抗生素治疗的病理；通知他们并给予同意他们参与预实验。个体还基于某些排除标准来选择：年龄在30岁以下，怀孕过程中或哺乳期，严重的慢性退行性疾病，严重的认知障碍，之前有腹部外科手术，憩室炎(diverticulitis)，免疫缺陷状态，伴发器质性肠疾病(concomitant organic intestinal disease)，抗生素治疗。获得知情同意后，将个体分成四组(A、B、C和D)。组A和B包括已经受 PPI的长期治疗的患者(至少连续12个月)，而组C包括已经受PPI短期治疗连续 3至12个月的患者。最后，组D包括未用PPI治疗且具有生理胃部屏障效应的对照个体。组A(10个个体)为用PPI长期治疗但不接受治疗的对照组。组B的各受治疗者(10个个体)接受10袋包含30mg(对应于3×109CFU/菌株/袋)各鼠李糖乳杆菌LR06(DSM21981)、戊糖乳杆菌LPS01(DSM21980)和植物乳杆菌LP01(LMG P-21021)，以及10mg(相当于1×109CFU/袋)微生物德氏乳杆菌德氏亚种LDD01(DSM22106)、60mg N-乙酰半胱氨酸(NAC)和2.34克马铃薯麦芽糖糊精的药袋(sachet)。每袋中活细胞总数为100亿(10×109CFU)。组 C(10个个体)为用PPI短期治疗但不接受抗生素的研究组。该组的目的是比较组C与组A的细菌生长，这是因为假定胃内腔中和十二指肠粘膜中的细菌浓度在已经受PPI长期治疗的受治疗者中应大于已经受PPI治疗不超过12个月的患者。组B中的个体在主餐、优选在晚餐期间消耗1袋/天，目的是使细菌在胃内腔中保持更长时间并与N-乙酰半胱氨酸一起均一分布。服用前将药袋的内容物一半溶解在一杯冷水中。给药持续10天。在从最后一次服用益生菌起禁食至少12小时后对受治疗者胃镜检查期间采集胃液和来自十二指肠擦拭的材料。这样，自个体最后一次服用益生菌起已经过不少于半天。更具体地，所有组(A、B、C和D)在零时间(d0)时进行胃镜检查，在10天(d10)后；即仅组B在结束服用益生菌后进行胃镜检查。所有组(A、B、C和D)在d0采集排泄物，在d10仅组B采集排泄物。在整个预实验的持续时间内，组A、B和C中的受治疗者持续以同一剂量用他们特异性PPI药物治疗。
2.采集排泄物样品
所有组(A、B、C和D)在研究之初(d0)采集排泄物，仅组B在d10采集排泄物。从志愿者采集用于肠菌群中特异性细菌群体的计数的排泄物样品(约10 克)置于预先填充有20ml艾米斯液转运培养基(BD Italy,米兰,意大利)的无菌塑料容器中，在志愿者的家中4℃保存并在采集24小时内运送至实验室。
3.胃液和十二指肠擦拭材料的总活菌细胞和总乳酸菌的定量和PCR试验的基因组 分析
在对已禁食12-24小时的患者进行胃镜检查期间采集胃液和十二指肠擦拭材料。胃镜检查在诺瓦拉的马焦雷慈善医院(Ospedale Maggiore della Carità) 的消化科进行。擦拭材料的样品(约1-2克)保存在预先填充有10ml艾米斯液转运培养基(BD Italy,Milan,Italy)的无菌塑料容器中。所有样品保存在4℃并在采集后24小时内运送至实验室。
一旦样品由实验室接收便进行分析，并且无论如何在采集的24小时内进行。对样品称重并转移至无菌容器(Stobag)中，以1:10重量/体积用艾米斯培养基稀释，并用均质设备(Stomacher apparatus)在230rpm下均质化4分钟。以各稀释液使用1ml盐水溶液来对样品进行连续的十进制稀释(乳酸菌的总活菌细胞和总细胞计数为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8)。将样品涂布在特异性琼脂培养基上。在组D中，将10-1至10-6的稀释液涂板，这是因为期望细菌计数明显低于其它组的。非选择性培养基LAPTG用于总活细胞，同时借助乳酸菌醋酸盐培养基(Rogosa Acetate Agar)(Oxoid,Milan,Italy)培养进行总乳酸菌的选择计数。所有接种有乳酸菌的平板用厌氧培养试剂盒 (Anaerocult kit)(Merck,Darmstadt,Germany)在厌氧条件下在37℃下培养 48-72小时，同时含有LAPTg的平板在厌氧条件下在37℃下培养24-48小时。对从处理的胃液样品中和从十二指肠擦拭材料中获得的总基因组DNA提取物进行种特异性PCR试验，目的是验证和定量给药至志愿者的益生菌的存在。特别地，所用引物如下：鼠李糖乳杆菌(Rha/PRI)、戊糖乳杆菌(PENT f/PLAN f/pREV)、植物乳杆菌(LFPR/PLAN II)和德氏乳杆菌德氏亚种 (Ldel7/Lac2)。胃液中及十二指肠擦拭材料中总细菌菌群和总乳酸菌的定量以及种特异性PCR试验在意大利诺瓦拉的Biolab研究有限公司实验室(Biolab Research Srl Laboratory)进行。
4.排泄物样品中特异性微生物菌群(microbe groups)的定量
一旦样品到达实验室便进行检测。对样品称重(约30克)并转移至无菌容器(Stobag)中，用艾米斯液稀释，从而获得1:10重量/体积稀释液，随后在均质设备中在230rpm下均质化4分钟。然后使用无菌盐水溶液和0.1ml适当的稀释液将样品连续十进制稀释(总大肠菌类，大肠杆菌和肠球菌，10-4、10-5、 10-6、10-7和10-8；酵母菌和霉菌，10-1、10-2、10-3、10-4和10-5)。将样品涂布在琼脂培养基上。使用斯拉涅兹-巴特利(Slanetz-Bartley,SB)琼脂(Oxoid, Milan,Italy)对肠球菌计数；在Petrifilm CC(3M,Segrate,Milan,Italy)和在 Chromo IDCPS(BioMerieux,Florence,Italy)上对总大肠菌类和大肠杆菌计数，在酵母提取物右旋糖氯霉素(Yeast Extract Dextrose Chloramphenicol,YGC) 琼脂(Sigma-Aldrech,Milan,Italy)上对总酵母菌和霉菌计数。肠球菌、总大肠菌类和大肠杆菌在厌氧条件下在37℃下培养24-48小时，同时酵母菌和霉菌在厌氧条件下在25℃下培养24-48小时。
排泄物样品中以上列出的微生物菌群的定量在意大利诺瓦拉的Biolab研究有限公司实验室进行。
5.统计学分析
胃液中及十二指肠擦拭材料中总菌群和总乳酸菌的浓度的所有获得的值表示每毫升或每克样品的活细胞平均值±平均标准误差(m±SEM)。所有涉及特定排泄物微生物菌群的浓度的值表示为活细胞/克排泄物的平均值±平均标准误差(m±SEM)。统计学分析的配对或独立t检验用于评价结果并比较组B的d0和d10之间的结果(配对)，以及各组之间的d0的结果(独立)。特别地，
在d0将组A的结果与组B、C和D比较(基线)。p≤0.05，认为差异显著。
6.结果
6.1胃液和十二指肠擦拭材料的总细菌细胞、总乳酸菌的定量和PCR试验的基因组 分析
所有40个个体在时间零(d0)时进行胃镜检查，而组B还在补充益生菌结束时(d10)进行胃镜检查。没有退出记录，这是由于该制剂被组B中的各参与者很好地接纳和接受，只有一例在d0和d10之间接受益生菌补充。
关于胃液中及十二指肠擦拭材料中的总细菌细胞和总乳酸菌的结果示于表4。
表(4)：在d0(所有组)和d10(组B)时的总细菌细胞和总乳酸菌的定量(值±SEM，胃液：log10CFU/ml，十二指肠擦拭材料：克)
a)在d0时四组之间的比较
b)四组中d0时总乳酸菌的百分比
c)组B中时间零(d0)和d10之间的比较
**时间零(d0)的比较参考(Comparison reference)
§(d0)和(d10)之间的比较
令人感兴趣地注意到，与基线相比，总细菌参数的显著减少存在于组B 的d10(表1c)。
6.2种特异性PCR试验结果
与d0相比，d10时组B中种特异性PCR试验结果进一步证实了给药的四种益生菌的种的存在。通用参数示于表5。
表5.d10和d10时组B中种特异性PCR试验结果。相关种的存在用“+”表示，而它们的缺失用“-”表示。
a)胃液
b)十二指肠擦拭
在胃液中，植物乳杆菌和德氏乳杆菌德氏亚种为两种最具代表性的种，由于与基线(d0)的1和0相比，总计10个个体中分别有10个和9个为阳性。在十二指肠擦拭中，与基线(d0)的2和0相比，植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌存在于总计10个个体中的9和10个受治疗者中。
6.3排泄物样品中特定微生物菌群的计数
排泄物样品中总肠球菌、总大肠菌类、大肠杆菌、酵母菌和霉菌的结果示于表6。
表6:d0(所有组)和d10(组B)时排泄物样品中特定微生物菌群的定量。结果表示为log10CFU/克排泄物(值±SEM)。
a)d0时四组之间的比较
b)d0时的四组中和d10时的组B中由大肠杆菌组成的总大肠菌类的百分比
c)基线(d0)与组B的d10之间的比较
**时间零(d0)的比较参考
§组B中(d0)和(d10)之间的比较
结果
本研究证实了在已服用PPI超过连续12个月的受治疗者的上消化道中的显著细菌生长(分别在组A与组D(表示一般性群体)中胃液中及十二指肠擦拭材料中的总细菌：p=0.0011和p=0.0137；类似的统计学结果以相同方式发现于由组B和组D的比较中)。组A和C之间的比较(用PPI治疗3-12个月的受治疗者)证实了4个参数中3个统计学显著。这样，PPI治疗的持续性是可确定上消化道中细菌增殖程度的因素。短期治疗的个体似乎更类似于一般性群体而不是已经历长期PPI治疗的受治疗者。
有趣的方面是与长期治疗的受治疗者(3.06%，6.99log10CFU/ml，组A中； 3.51%，7.15log10CFU/ml，组B中)相比，短期治疗的受治疗者的胃液中总乳酸菌的较高的百分比(34.91%，5.01log10CFU/ml，组C中)。然而，该较高的浓度并不反映十二指肠擦拭的结果(1.58%，4.00log10CFU/ml，组C)。
将包括60mg NAC的以上列出的4种细菌菌株，即鼠李糖乳杆菌LR06、戊糖乳杆菌LPS01、植物乳杆菌LP01和德氏乳杆菌德氏亚种LDD01给药 10天足以显著改变用PPI治疗超过12个月的受治疗者中典型的细菌生长，以至于恢复对食品来源的可能病原体的保护屏障(p=0.0023和p=0.0256，与d0相比，对于d10时组B中分别在胃液和十二指肠擦拭材料中的总细菌，表4c)。
另一有趣的结果为各组中由乳酸菌代表的总细菌的百分比。不服用PPI 的对照受治疗者中，属于乳酸菌属的细菌代表约14%的总胃部微生物菌群，而在用PPI治疗超过12个月的患者，乳酸菌仅代表约3%的总细菌，因此表明，大量胃部微生物由其它潜在有害的微生物群体构成。在组B中补充益生菌的最后时期(d10)，乳酸菌构成胃液中总细菌的98%，记录与时间零相比它们浓度的增加，尽管其并不是统计学上显著的(p=0.074)。缺乏统计学显著性可根据总胃部细菌的显著平行减少来解释(7.71log10CFU/ml，与8.60log10 CFU/ml相比，p=0.0023)。另一方面，与基线相比，d10时十二指肠擦拭材料中乳酸菌的百分比明显较高(p=0.0355)。
此外，种特异性PCR试验结果证实了与NAC一起给药的益生菌有效定殖在用PPI治疗超过连续12个月的受治疗者的胃内腔和十二指肠粘膜的能力(表 5a和5b)。这方面可帮助抑制和代替通常存在于用PPI长期治疗的受治疗者中的可能有害或的确有害的病原菌。如果认为胃镜检查都在最后一次服用益生菌的至少12小时后进行，则该数据更显著，因而证实这些有益菌显著保留在胃中和十二指肠粘膜的表面上的能力。NAC以其对细菌生物膜的机械作用而使用，以便防止进行长期PPI治疗的受治疗者中可能的新的生物膜的形成。
排泄物样品的结果证实，一方面，在用PPI治疗至少12个月的个体中所有考虑在内的微生物参数显著增加(组A和组D之间的比较)：肠球菌属物种、总大肠菌类、大肠杆菌、酵母菌和霉菌分别为p=0.0021、p=0.0147、p=0.0227、 p=0.0223和p=0.0027)。无论如何，短期PPI给药(3-12个月)足以诱导所有五个参数的显著排泄物增加，尽管统计学显著性较低(参见与组D比较的组C的数据：分别为p=0.0479、p=0.0338、p=0.0444、p=0.0051和p=0.0187)(表6)。另一方面，长期和短期PPI治疗的受治疗者之间的统计学比较仅对酵母菌和霉菌显著(分别为p=0.0486和p=0.0078)，因此表明，对于肠球菌属物种和革兰氏阴性菌，服用最小量的PPI三个月足以介导12个月治疗后观察到的大多数增加。酵母菌和霉菌非常可能需要更多时间在改变胃部屏障后来定殖在肠菌群，这是由于在长期受治疗者中记录了与短期受治疗者相比的显著的额外增加(与组C比较的组A)。
总大肠菌类通常代表约1%的总人类排泄物细菌菌群，浓度约109细菌/ 克(37)。另一有趣的结果是，由大肠杆菌构成的总大肠菌类的百分比。事实上，已知该细菌代表了人肠中大多数总大肠菌类菌群，通常总计93-94%(38)。存在于人肠中的总大肠菌群(coliformbacteria)由肠杆菌科的四个属组成，特别是埃希氏杆菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属和柠檬酸杆菌属，其中克雷伯氏菌属通常总计约1%，肠杆菌属/柠檬酸杆菌属物种一起代表约6%。组D的结果基本上证实了该迹象，这是由于92.6%的总大肠菌类由大肠杆菌组成。然而，在已进行长期PPI治疗的受治疗者中，该百分比减少至83.9%(组A)和 77.4%(组B)，因而表明，作为胃部屏障破坏的结果，克雷伯氏菌属和/或肠杆菌属/柠檬酸杆菌属在肠中的异常过度生长。该增加可被认为至有害的，这是由于种如肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和阴沟肠杆菌可对从血液的医院感染 (BSI)直到急性阑尾炎和抗生素相关的血性结肠炎(AAHC)的宿主发挥显著的病原作用。
肠球菌属物种通常以105-107细菌/克的浓度存在于人排泄物中。对照群体获得的数据证实该迹象，这是由于在排泄物样品中计数了6.39log10CFU/ml。长期PPI治疗引起该微生物属在人肠中的显著增加(组A中7.68log10CFU/ml，组B中7.80log10CFU/ml)。
由肠球菌属物种代表的、特别是由屎肠球菌代表的最重要的问题是它们固有的具体对青霉素和万古霉素的抗生素抗性。肠球菌为第三大常见的感染性心内膜炎的成因，并且治疗结果中对青霉素的耐性的作用自20世纪40年代末已经明白。无论如何，流行病学研究已证实，与包括心内膜炎的医院感染相关的屎肠球菌菌株是与定殖在健康人类的消化道的共生菌株不同的序列 (sequences)种类，尽管不能排除某些有害生物型可能已定殖用PPI治疗的受治疗者的人细菌菌群的可能性。
基线时间的排泄物的复分析(complex analyse)证实，减弱或确实完全中断了胃部屏障效应的，这是由于肠菌群的组成显示了在服用PPI至少3个月的人中被极大地修饰。革兰氏阴性菌如总大肠菌类和大肠杆菌显著高于对照，而酵母菌和霉菌增加了约4log10。排泄物的肠球菌多了超过1log10。有趣的是还注意到，在所分析的5种微生物群中服用PPI的持续时间和排泄物的大小之间的相关性增加，选择为潜在的微生物群体失调(dysmicrobism)的迹象。
与NAC联合的所研究的四种益生菌能够减少所有排泄物参数(与基线值相比，在d10时肠球菌属物种、总大肠菌类、大肠杆菌、酵母菌和霉菌分别为 p=0.0155、p=0.0064、p=0.0105、p=0.0066和p=0.0053)。特别地，在补充益生菌的10天后，总大肠菌类、大肠杆菌、酵母菌和霉菌的减少超过1log10。在组B中补充益生菌结束时，总大肠菌类和大肠杆菌的浓度明显低于在一般性群体(组D)中发现的值(分别为p=0.0182和p=0.0229)，因而证实了益生菌对大肠杆菌的相当大的拮抗作用。
总之，还包括有效量的N-乙酰半胱氨酸的特定菌株鼠李糖乳杆菌 LR06、戊糖乳杆菌LPS01、植物乳杆菌LP01和德氏乳杆菌德氏亚种LDD01 的联合给药能够在口服补充10天后显著减少细菌在胃和十二指肠中的增殖水平，减少肠菌群中的革兰氏阴性菌、肠球菌属物种、酵母菌和霉菌，因而迅速再平衡其组成并特别是在胃的水平上恢复对有害细菌的保护屏障。
使用N-乙酰半胱氨酸(NAC)是因为其机械防止细菌生物膜可能形成的能力，由于在胃液中及在从擦拭十二指肠的样品中除乳酸菌以外的各种细菌的浓度显著降低而使N-乙酰半胱氨酸本身显示有效。
本研究中使用的所有益生菌菌株已预先证实对大肠杆菌特定菌株(其中包括肠出血性血清型O157:H7)的显著的体外拮抗作用，并因而可用于有效地防止由这些有害或病原微生物介导的感染。
根据实际情况，更为普遍的使用PPI，伴随如本预实验使用的口服补充益生菌和NAC，代表了能够恢复(至少部分恢复)正常胃部屏障效应的创新策略，因而减少大部分胃内酸度从而减少人群的饮食来源的胃肠感染的威胁。
表3

Claims (10)

1.一种药物或饮食组合物或增补剂或医疗设备，其用于治疗服用药物以减少或治疗胃酸过多的受治疗者，所述药物或饮食组合物或增补剂或医疗设备包括至少以下菌株的组合：
i.戊糖乳杆菌LPS01DSM 21980，
ii.植物乳杆菌LP01LMG P-21021，
iii.鼠李糖乳杆菌LR06DSM 21981，
iv.德氏乳杆菌LDD 01(DSMZ 20074)DSM 22106，
所述药物或饮食组合物或增补剂或医疗设备还包括与所述菌株联合的N-乙酰半胱氨酸；
其中，所述药物或饮食组合物或增补剂或医疗设备包括在1×109至10×109CFU/菌株/剂之间的量的各所述菌株和在10至200mg之间的量的N-乙酰半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的药物或饮食组合物或增补剂或医疗设备，其中所述药物或饮食组合物或增补剂或医疗设备包括下列菌株：
i.戊糖乳杆菌LPS01DSM 21980，
ii.植物乳杆菌LP01LMG P-21021，
iii.鼠李糖乳杆菌LR06DSM 21981，
iv.德氏乳杆菌LDD 01(DSMZ 20074)DSM 22106；
所述菌株与菌株发酵乳杆菌LF 09DSM 18298和/或菌株乳酸乳球菌NS 01DSM 19072联合；或者与下列菌株组成的至少一种菌株联合：
a.罗伊氏乳杆菌LRE 01DSM 23877，
b.罗伊氏乳杆菌LRE 02DSM 23878，
c.罗伊氏乳杆菌LRE 03DSM 23879，
d.罗伊氏乳杆菌LRE 04DSM 23880。
3.根据权利要求1所述的药物或饮食组合物或增补剂或医疗设备，其中所述药物或饮食组合物或增补剂或医疗设备用于治疗服用药物以减少或治疗消化不良、消化性溃疡、由幽门螺杆菌引起的胃炎，和胃食管返流疾病的受治疗者。
4.根据权利要求2所述的药物或饮食组合物或增补剂或医疗设备，其中所述药物或饮食组合物或增补剂或医疗设备用于治疗服用药物以减少或治疗消化不良、消化性溃疡、由幽门螺杆菌引起的胃炎，和胃食管返流疾病的受治疗者。
5.根据权利要求3或4所述的药物或饮食组合物或增补剂或医疗设备，其中，所述消化性溃疡包括胃十二指肠溃疡。
6.根据权利要求5所述的药物或饮食组合物或增补剂或医疗设备，其中，所述胃十二指肠溃疡包括胃溃疡、十二指肠溃疡。
7.根据权利要求3或4所述的药物或饮食组合物或增补剂或医疗设备，其特征在于所述药物或饮食组合物或增补剂或医疗设备还包括属于质子泵抑制剂PPI范畴的药物。
8.根据权利要求7所述的药物或饮食组合物或增补剂或医疗设备，其特征在于所述菌株和药物以口服用药物剂型一起存在。
9.一种药物组合物，其包括至少下列菌株的组合：
i.戊糖乳杆菌LPS01DSM 21980，
ii.植物乳杆菌LP01LMG P-21021，
iii.鼠李糖乳杆菌LR06DSM 21981，和
iv.德氏乳杆菌LDD 01(DSMZ 20074)DSM 22106，
和与所述菌株联合的N-乙酰半胱氨酸，所述菌株能够定殖于pH值在4.0至5.5范围内的胃中，并能够产生细菌素和/或代谢物和/或氧合水，用于预防性和/或治愈性治疗由幽门螺杆菌引起的感染；
其中，所述组合物包括在1×109至10×109CFU/菌株/剂之间的量的所述各菌株和在10至200mg之间的量的N-乙酰半胱氨酸。
10.根据权利要求9所述的组合物，其用于预防性和/或治愈性治疗由幽门螺杆菌引起的感染复发。
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