CN103937904B - 包含优良事件ee-gh6的抗虫棉花植物及其鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供特定的转基因棉花植物、植物材料和种子，其特征在于这些产品在棉花基因组的特定位置包含特定优良转化事件。本发明也提供允许快速和明确鉴定生物样品中的该事件的工具。

Description

包含优良事件EE-GH6的抗虫棉花植物及其鉴定方法
本申请是发明人于2008年6月9日提交的题为“包含优良事件EE-GH6的抗虫棉花植物及其鉴定方法”的中国专利申请200880019547.9的分案申请。
发明领域
本发明涉及转基因棉花植物、植物材料及种子，其特征在于包含一个特定的转化事件，尤其涉及在棉花基因组的特定部位存在编码可赋予昆虫抗性的蛋白质的基因。本发明的棉花植物组合了昆虫抗性表型、农学性状、遗传稳定性以及对不同遗传背景的适应性(等同于非转化棉花品系在无昆虫状况下)。本发明进一步提供了在生物样品中鉴定特别包含了转化事件EE-GH6的植物材料的存在的方法和试剂盒。
发明背景
植物中转基因的表型表达取决于：基因本身的结构以及其在植物基因组中的位置。同时，在基因组不同位置的转基因(作为外源DNA)的存在将以不同的方式影响植物的整体表型。通过遗传操作，在农学上或工业上成功地将商业上感兴趣的性状引入到植物中是一个长期的过程，这取决于不同的因素。基因转化的植物的实际转化和再生仅仅是一系列选择步骤的第一步，选择步骤包括广泛的遗传表征、育种和田间试验评价，最终实现优良事件(elite event)的选择。
棉纤维是全世界最重要的纺织原料。全球每年收获大约八千万英亩棉花。就面积产量而言，棉花是美国第五大作物，2000年其种植超过了一千五百万英亩。
以棉花为食的最具破坏性的昆虫物种有：谷实夜蛾(Helicoverpa zea (玉米果穗螟蛉或棉铃虫))、棉铃虫(Helicoverpa armigera(美洲棉铃虫))、烟芽夜蛾(Heliothisvirescens(烟青虫))及斑实夜蛾(Helicoverpa punctigera)。
鉴于对新型食品和新型饲料的关注，GMO和非GMO产品的分开，以及对专利材料的鉴别，优良事件的明确鉴定正变得愈加重要。理想的是，该鉴定方法既快捷又简单，还不需要大量的实验室设备。此外，该方法应提供不需专家解释就能使优良事件明确确定的结果，但是如果必要的话，在专家仔细审查下，结果被证明有效。本文描述了用于在生物样品中鉴定优良事件EE-GH6的特定工具。
在开发棉花(Gossypium hirsutum)过程中，从转基因棉花植物群体中将EE-GH6鉴定作为优良事件，其包含编码来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫晶体蛋白的基因。转基因棉花植物包含编码Bt杀虫晶体蛋白(如WO02/057664所述)的嵌合基因，其处于植物可表达启动子的控制之下。
包含抗虫基因的棉花植物已经在本领域中公开。但是，并没有任何现有技术公开内容教导或提示了本发明。
发明概述
本发明涉及转基因棉花植物，或其种子、细胞或组织，其包含稳定整合在其基因组中的表达盒，该表达盒包含含有cry2Ae基因编码序列的抗虫基因(如本文实施例1.1所述)，其为抗虫的，在无昆虫压力下，该转基因植物及其种子、细胞或组织具有与非转基因的同基因系基本上相当的农学性能。在有昆虫压力下，该转基因植物将具有比非转基因植物优越的农学表型。
根据本发明，棉花植物，或其种子、细胞或组织包含优良事件EE-GH6。
更确切地说，本发明涉及转基因棉花植物、其种子、细胞或组织，其基因组DNA的特征在于，当使用两个分别针对EE-GH6的5’或3’侧翼区和外源DNA的引物，用本文所述的PCR鉴定方法分析时，得到EE-GH6特异的片段。所述引物可以分别针对SEQ ID No：1或SEQ IDNo：11内的5’侧翼区和外源DNA，例如引物可以分别包含SEQ ID No：5和SEQ ID No：7的核苷酸序列或由其组成，得到100-700bp的DNA片段，优选大约197bp。该引物也可以分别针对SEQID No：2内的3’侧翼区和外源DNA，例如引物可以分别包含SEQ ID No：4和SEQ ID No：3的核苷酸序列或由其组成，得到100-700bp的DNA片段，优选是大约189bp。
包含本发明的优良事件的参考种子已经保藏在ATCC，保藏号为PTA-8398。本发明的一个实施方案是，以ATCC保藏号PTA-8398保藏的包含优良事件EE-GH6的种子，它可以长成对昆虫(特别是对实夜蛾属物种(Helicoverpa sp.)或铃夜蛾属物种(Heliothis sp.))有抗性的棉花植物。ATCC保藏号为PTA-8398的种子是一个种子库，其中包含的至少大约95％的转基因籽粒对于所述转基因是纯合的，包含本发明的优良事件，这些种子可以长成抗虫植物，因而这些植物也可以是草铵膦(glufosinate)耐受植物。可播种种子，且生长的植物可以用本文所述的草铵膦处理，从而得到含有本发明的优良事件的百分之百耐受草铵膦的植物。本发明进一步涉及由以保藏号PTA-8398保藏在ATCC的种子长成的包含本发明的优良事件的植物而来的细胞，组织及子代和后代。本发明进一步涉及通过以保藏号PTA-8398保藏在ATCC的种子长成的包含本发明的优良事件的棉花植物的繁殖和/或育种可以得到的植物。本发明也涉及包含优良事件EE-GH6的棉花植物。
本发明进一步涉及鉴定包含优良事件EE-GH6的转基因植物、或其细胞或组织的方法，该方法是基于对转基因植物、细胞或组织中的特征DNA序列或由该DNA序列编码的氨基酸的存在进行鉴定。根据本发明优选的实施方案，这样的特征DNA序列是15bp的序列，优选是20bp，最优选是30bp或更多，这些序列包含该事件的插入位点，即部分外源DNA和部分与之相邻的棉花基因组(5’或3’侧翼区)，这使得优良事件可以被特别鉴定。
本发明进一步涉及在生物样品中鉴定优良事件EE-GH6的方法，该方法基于可以特异识别EE-GH6的5’和/或3’侧翼序列的引物或探针。
更确切地说，本发明涉及包括扩增生物样品中存在的核酸序列的方法，该方法使用至少两条引物进行聚合酶链式反应，一条引物识别EE-GH6的5’或3’侧翼区，另一条引物识别外源DNA内的序列，优选得到一个100-500bp的DNA片段。该引物可以分别识别EE-GH6的5’侧翼区内的序列(SEQ ID No.1的1-140位的序列，或SEQ ID No.11的1-463位的序列)或EE-GH6的3’侧翼区内的序列(SEQ ID No.2的113-438位的互补序列)，以及外源DNA内的序列(SEQ ID No.1的141-192位的互补序列，或SEQ ID No.2的1-112位的序列)。识别5’侧翼区的引物可以包含SEQ ID No.7的核苷酸序列，识别外源DNA内的序列的引物可以包含本文所述的SEQ ID No.5的核苷酸序列。识别3’侧翼区的引物可以包含本文所述的SEQ ID No.3或SEQ ID No.6的核苷酸序列，识别外源DNA内的序列的引物可以包含本文所述的SEQ IDNo.4的核苷酸序列。
本发明更特别地涉及鉴定生物样品中的优良事件EE-GH6的方法，该方法包括利用分别具有SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的核苷酸序列的两条引物通过聚合酶链式反应扩增生物样品中的核酸序列，得到大约189bp的DNA片段；或利用分别具有SEQ ID No.5和SEQ IDNo.7的核苷酸序列的两条引物通过聚合酶链式反应扩增生物样品中的核酸序列，得到大约197bp的DNA片段。
本发明进一步涉及本文所述的EE-GH6的特异侧翼序列，其可以用来开发特定的鉴定方法来鉴定生物样品中的EE-GH6。此类特定的侧翼序列在鉴定试验中也可以用作参考对照材料。更特别的是，本发明涉及可以用来开发如本文进一步所述的特异引物和探针的EE-GH6的5’和/或3’侧翼区。也适合作为参考材料的是优选为大约180-200bp的核酸分子，其包含可以被具有SEQ ID No.7和SEQ ID No.5，或SEQ ID No.4和SEQ ID No.3的核苷酸序列的引物扩增的序列。
本发明进一步涉及，基于这些特异引物和探针的使用，从而对生物样品中EE-GH6的存在进行鉴定的方法。引物可以由17至大约200个连续核苷酸的核苷酸序列组成，其选自SEQ ID No.1的1-140位核苷酸的核苷酸序列、SEQ ID No.11的1-463位核苷酸的核苷酸序列、或者SEQ ID No.2的113-438位核苷酸的核苷酸序列的互补序列；与由17至大约200个连续核苷酸的核苷酸序列组成的引物相组合，所述引物选自SEQ ID No.1的141-192位核苷酸的核苷酸序列的互补序列，及SEQ ID No.2的1-112位核苷酸的核苷酸序列。引物也可以包含定位在3’末端的核苷酸序列，进一步包含无关序列，或来源于所述核苷酸序列但包含错配的序列。
本发明进一步涉及鉴定生物样品中的优良事件EE-GH6的试剂盒，所述试剂盒包含至少一个可以特异识别EE-GH6的5’或3’侧翼区或者可以特异识别EE-GH6中外源DNA序列内的特异重排的引物或探针。
除了可以特异识别EE-GH6的5’或3’侧翼区的引物外，本发明的试剂盒可以包含特异识别EE-GH6的外源DNA内的序列的第二条引物，以便用在PCR鉴定方案中。本发明的试剂盒可以包含至少两个特异引物，一个识别EE-GH6的5’侧翼区内的序列，另一个识别外源DNA内的序列。识别5’侧翼区的引物可以包含SEQ ID No.3的核苷酸序列，识别转基因的引物可以包含SEQ ID No.4的核苷酸序列或本文所述的任何其他的引物或引物组合。
本发明进一步涉及鉴定生物样品中的优良事件EE-GH6的试剂盒。所述的试剂盒包含具有SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的核苷酸序列的PCR引物，用于本文所述的EE-GH6PCR鉴定方案中。
本发明也涉及鉴定生物样品中的优良事件EE-GH6的试剂盒。该试剂盒包含特异探针，其具有相应于(或互补于)与EE-GH6的特定区域具有80-100％序列同一性的序列。优选地，该探针的序列相应于包含EE-GH6的5’或3’侧翼区的部分的特定区域。最优选地，该特异探针具有(或互补于)与SEQ ID No.1的120-160位核苷酸序列或SEQ ID No.2的102-123位核苷酸序列有80-100％的序列同一性的序列。
根据本发明的另一方面，所公开的DNA序列包含了事件的插入位点，以及足够长的棉花基因组DNA和外源DNA(转基因)的多核苷酸，以至于可以用作引物或探针来检测EE-GH6。此类序列在插入位点的每一侧可以分别包含棉花基因组DNA的至少9个核苷酸以及EE-GH6的外源DNA(转基因)的相似数量的核苷酸。最优选地，此类DNA序列包含棉花基因组DNA的至少9个核苷酸以及外源DNA的相似数量的核苷酸(与SEQ ID No.1或2的插入位点相邻)。
本发明所包括的方法和试剂盒可以用在不同的目的，例如但不仅限于下列：鉴定植物，植物材料或产品(例如但不仅限于：包含或源于植物材料的新鲜或加工的食品或饲料)中是否存在EE-GH6；另外地或备选地，本发明的方法和试剂盒可用来鉴定转基因植物材料，目的在于将转基因或非转基因材料分离；另外地或备选地，本发明的方法和试剂盒可以用来确定包含EE-GH6的植物材料的品质(即纯材料的百分比)。
本发明进一步涉及EE-GH6的5’和/或3’侧翼区，还涉及从EE-GH6的5’和/或3’侧翼序列开发的特异引物和探针。
本发明也涉及从包含优良事件EE-GH6的植物中得到的基因组DNA。该基因组DNA可在本文所述的鉴定试验中用作参考对照材料。
附图简述
下面的实施例，不是为了将本发明限制于所述的特定实施方案，而是可以结合着附图(并入本文作为参考)来理解。这些图中：
图1图示了引用的核苷酸序列与引物之间的关系。黑色条形：外源DNA；带条纹的黑色条形：EE-GH6特异的外源DNA中的重排；浅色条形：植物来源的DNA；带条纹的浅色条形：预插入靶位点缺失；箭头：寡核苷酸引物，条形下的数字代表核苷酸位置；(c)代表的是所指的核苷酸序列的互补序列；NA：未使用。
图2显示为EE-GH6开发的PCR鉴定方案的结果。凝胶的上样顺序：泳道1：分子量标记(100bp序列梯)；泳道2-5：来自包含转基因事件EE-GH6的棉花植物的DNA样品；泳道6和7：来自不包含优良事件EE-GH6但包含类似抗虫基因的转基因棉花植物的DNA样品；泳道8：无模板DNA对照；泳道9：分子量标记。
图3显示为EE-GH6开发的接合性评分PCR方案得到的结果。凝胶的上样顺序：泳道1：分子量标记(100bp序列梯)；泳道2和3：来自包含纯合形式的转基因事件EE-GH6的棉花植物的DNA样品；泳道4-6：来自包含杂合形式的转基因事件EE-GH6的棉花植物的DNA样品；泳道7：来自野生型棉花植物的对照DNA样品；泳道8：无模板DNA对照；泳道9：分子量标记。
发明详述
在植物基因组中掺入重组DNA分子典型地是由细胞或组织的转化实现的。掺入的特定位点通常是由于―随机‖整合决定的。
通过用重组DNA或―转化DNA‖转化植物细胞或组织而引入到植物基因组中并源于该转化DNA的DNA在下文中称为―外源DNA‖，它包含一个或多个―转基因‖。本发明文中的―植物DNA‖指的是源于被转化植物的DNA。植物DNA通常见于相应野生型植物的相同的基因座。外源DNA可通过在植物基因组中重组DNA分子的掺入位点处的位置和结构来表征。植物基因组中重组DNA插入的位点也称为―插入位点‖或―靶位点‖。重组DNA插入到被称为―预插入植物DNA‖的植物基因组的区域与植物DNA的缺失相关，称之为―靶位点缺失‖。本文使用的―侧翼区‖或―侧翼序列‖指的是不同于引入的DNA的至少20bp的DNA序列，优选是至少50bp，多可至5000bp；优选地，源于植物基因组的DNA，它要么位于外源DNA的紧上游区并与之相邻，要么位于外源DNA的紧下游区并与之相邻。导致外源DNA随机整合的转化程序会产生具有不同侧翼区的转化体，这些侧翼区对每个转化体而言是特征性的且是独特的。当通过传统杂交将重组DNA引入到植物中时，其在植物基因组中的插入位点，或其侧翼区一般不再改变。本文使用的―插入区‖所指的区域对应于至少40bp的区域，优选是至少100bp，多可至10000bp，该区域包含在包含植物基因组中外源DNA的上游和/或下游侧翼区的序列内。考虑到由于种内突变而引起的微小差异，插入区当杂交到同种植物中时将会保持与转化植物中包含外源DNA的上游和下游侧翼区的序列有至少85％的序列同一性，优选是90％，更优选是95％，最优选是100％序列同一性。
事件的定义是：(人工)基因座，由于基因工程方法，其携带了包含至少一个拷贝的目的基因的转基因。事件的典型的等位状态是外源DNA的存在或不存在。事件在表型上的特征是转基因的表达。在基因水平上，事件是植物的基因组成的一部分。在分子水平上，事件的特征在于限制图谱(比如可以通过Southern印迹法确定)，转基因的上游和/或下游侧翼区，以及转基因的分子标记的位置和/或分子结构。通常，用包含至少一个目的基因的转化DNA转化植物可以得到一个转化体群体，其包含大量独立的事件，其中每个都是独特的。
本文使用的优良事件，是选自一组事件的事件。该事件的获得是基于转基因的表达和稳定性以及与包含优良事件的植物的最优农学性状的相容性，用相同的转化DNA进行转化或用转化得到的植物进行回交。因此，优良事件选择标准为一个或多个，优选地两个或多个，优选地所有下列标准:
a)外源DNA的存在不损害植物的其他期望的特征，例如那些与农学性能或商业价值相关的特征；
b)事件的特征在于稳定遗传的明确的分子结构，并可为其开发出合适的鉴定对照的工具；
c)在事件的杂合的(或半合子的)和纯合的条件下，并在环境条件范围内的商业可接受的水平上(其中携带该事件的植物可能用在正常的农业环境中)，目的基因显示出正确的，适当的和稳定的时空表型表达。
外源DNA优选与植物基因组中的一个位置相关，这可允许其轻易地渐渗入到期望的商业性遗传背景中。
作为优良事件的事件状态，通过将优良事件渐渗入到不同的相关遗传环境中并观察其与上述标准(例如a,b,c)中的一个，两个或所有的符合来进行确认。
因此，―优良事件‖指的是一个包含外源DNA的基因座，其符合上述标准。植物，植物材料或其子代(例如种子)在其基因组中含有一个或多个优良事件。
开发出来用于鉴定优良事件，或包含优良事件的植物，植物材料，或由包含优良事件的植物材料生产的产品的工具，是基于优良事件的特定基因组特征，例如包含外源DNA的基因组区、分子标记或外源DNA的侧翼区序列特定的限制性图谱。
一旦外源DNA的一个或两个侧翼区已经测序，借助分子生物学技术，可以设计出特异识别样品的核酸(DNA或RNA)中的这个(些)序列的引物和探针。例如，可开发PCR方法鉴定生物样品(例如植物，植物材料，或包含植物材料的产品)中的优良事件。这种PCR方法是基于至少两个特异―引物‖，一个识别优良事件的5’或3’侧翼区内的序列，另一个识别外源DNA内的序列。优选地，引物具有一个15-35个核苷酸的序列，其在优化的PCR条件下，分别可以―特异识别‖优良事件的5’或3’侧翼区内的序列和该优良事件的外源DNA，从而可以从包含该优良事件的核酸样品中扩增出特异片段(―整合片段‖或鉴别扩增子)。这意味着，在优化PCR条件下，只可以扩增出靶向整合片段，而不会扩增出植物基因组内的其他序列或外源DNA。
适于本发明的PCR引物可以是下面的：
-具有17nt至大约100nt长度的寡核苷酸，在其3’末端包含至少17个连续核苷酸，优选20个连续核苷酸的核苷酸序列，其选自5’侧翼序列(SEQ ID No1的1-140位核苷酸的核苷酸序列，或SEQ ID No11的1-463位核苷酸的核苷酸序列)(识别5’侧翼序列的引物)；或
-具有17nt至大约200nt长度的寡核苷酸，在其3’末端包含至少17个连续核苷酸，优选20个连续核苷酸的核苷酸序列，其选自3’侧翼区(SEQ ID No2的113-438位核苷酸的核苷酸序列的互补序列)(识别3’侧翼序列的引物)；或
-具有17nt至大约200nt长度的寡核苷酸，在其3’末端包含至少17个连续核苷酸，优选20个核苷酸的核苷酸序列，其选自插入DNA序列(SEQ ID No1的141-192位核苷酸的核苷酸序列的互补序列)(识别外源DNA的引物)；或
-具有17nt至大约40nt长度的寡核苷酸，包含至少17个连续核苷酸，优选20个核苷酸的核苷酸序列，其选自插入DNA序列(SEQ ID No2的1-112位核苷酸的核苷酸序列)。
引物当然可以比提到的17个连续核苷酸更长，例如，可以是20,21,30,35,50,75,100,150,200nt的长度或更长。引物可以完全由选自提到的侧翼序列和外源DNA序列的核苷酸序列所组成。但是，引物的核苷酸序列在5’末端(即位于3’端的17个连续核苷酸之外)是不太关键的。所以，引物的5’序列可以由选自侧翼序列或外源DNA的核苷酸序列所组成，但是还可以适当地包含一些(例如1,2,5,10个)错配。引物的5’序列甚至可以完全由与侧翼序列或外源DNA无关的核苷酸序列所组成，例如，代表限制性酶识别位点的核苷酸序列。优选地，这种具有错配的不相关序列或侧翼DNA序列应该优选不长于100个核苷酸，更优选地，不长于50或甚至25个核苷酸。
此外，如果所述的3’末端的17个连续核苷酸不只是源自外源DNA或SEQ ID No1或2中的植物衍生序列，则合适的引物在其3’末端可以包含跨越植物DNA衍生序列和外源DNA序列之间的连接区域(位于SEQ ID No1的140-141位核苷酸和SEQ ID No2的112-113位核苷酸)的核苷酸序列或由该核苷酸序列组成。
对于本领域技术人员来说，立刻就可以明白的是，适当选择的PCR引物对不应该包含互相互补的序列。
出于本发明的目的，―SEQ ID No:X代表的核苷酸序列的互补序列‖是这样的核苷酸序列，其是根据Chargaff规则将核苷酸用互补核苷酸替换而从所代表的核苷酸序列得到的核苷酸序列，并沿着5’-3’的方向阅读，即所代表的核苷酸序列的反方向。
合适的引物的例子有：SEQ ID No7的寡核苷酸序列(识别5’侧翼序列的引物),SEQID No5的寡核苷酸序列(识别外源DNA的引物，与识别5’侧翼序列的引物一起使用),SEQ IDNo4的寡核苷酸序列(识别外源DNA的引物，与识别3’侧翼序列的引物一起使用),SEQ IDNo3、SEQ ID No6的寡核苷酸序列(识别3’侧翼序列的引物)。
合适的寡核苷酸引物的其他例子在其3’末端包括下列序列或由这些序列组成：
a.识别5’侧翼序列的引物:
-SEQ ID No1的111-130位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的104-123位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的106-125位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的112-130位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的103-123位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的109-125位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的109-130位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的113-130位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的99-116位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的102-123位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的104-125位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的108-130位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的114-130位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的100-116位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的101-123位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的103-125位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的110-129位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的109-129位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的111-129位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的108-129位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的112-129位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的107-129位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的113-129位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的287-306位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的288-306位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的289-306位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的290-306位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的264-281位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的265-281位核苷酸的核苷酸序列
b.识别外源DNA序列的引物，与识别5’侧翼序列的引物一起使用:
-SEQ ID No1的140-159位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No1的140-158位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No1的139-158位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No1的140-160位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No1的167-184位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No1的136-157位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No1的139-157位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No1的140-157位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No1的139-159位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No1的140-161位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No1的140-156位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No1的139-156位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No1的136-158位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No1的139-160位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No1的139-155位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No1的139-161位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
c.识别3’侧翼序列的引物:
-SEQ ID No2的366-385位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No2的366-384位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No2的366-386位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No2的366-383位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No2的366-387位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No2的125-142位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No2的366-382位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No2的94-115位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
d.识别外源DNA序列的引物，与识别3’侧翼序列的引物一起使用:
-SEQ ID No2的95-114位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No2的96-115位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No2的95-115位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No2的96-114位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No2的97-115位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No2的93-114位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No2的94-115位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的98-115位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的92-114位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的93-115位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的98-114位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No1的99-115位核苷酸的核苷酸序列
本文所用的―SEQ ID No.Z的X-Y位核苷酸的核苷酸序列‖表示的是包括两个核苷酸端点在内的核苷酸序列。
优选地，扩增的片段具有50-500个核苷酸的长度，例如100-350个核苷酸的长度。特异引物可以具有分别与优良事件的5’或3’侧翼区及其外源DNA内的序列有80-100％的同一性的序列，条件是在优化的PCR条件下利用这些引物，错配仍可以使优良事件得到特异鉴定。但是，允许错配的范围可以容易地通过实验确定并为本领域技术人员所知。
整合片段的检测可以通过各种方式进行，例如凝胶分析后的大小估计。整合片段也可以直接测序。其他检测扩增DNA片段的序列特异性方法也是本领域公知的。
因为引物的序列及其在基因组中的相对位置对于优良事件而言是独特的，所以只在包含优良事件(的核酸)的生物样品中才能发生整合片段的扩增。优选地，当进行PCR以鉴定未知样品中EE-GH6的存在时，在一组引物中应包含对照引物，用对照引物可以扩增含有该事件的植物品种的―持家基因‖内的序列。持家基因是一些在大多数细胞类型中表达并参与所有细胞共同的基本代谢活动的基因。优选地，从持家基因扩增得到的片段是比扩增整合片段更大的片段。根据所分析的样品，还可以包括其他对照。
本领域中描述了标准PCR方案，例如―PCR应用手册‖(Roche MolecularBiochemicals,第2版,1999)和其他参考书。PCR的优化条件，包括特异引物的序列，在每个优良事件的―PCR鉴定方案‖中进行了规定。但是，可以理解的是，PCR鉴定方案的许多参数可能需要根据特定的实验室条件进行调整，并进行些许修改以得到相似的结果。例如，采用不同制备DNA的方法可能需要调节下列参数，例如引物的用量，聚合酶，以及使用的退火条件。类似地，其他引物的选择可能支配PCR鉴定方案的其他优化条件。但是，这些调整对于本领域技术人员而言是显而易见的，此外，在现有的PCR应用手册(例如上面引用的之一)中对此也进行了详述。
备选地，特异引物可以用来扩增用作鉴定生物样品中EE-GH6的―特异探针‖的整合片段。在允许探针与核酸中其对应的片段杂交的条件下，将生物样品的核酸与探针接触，导致形成核酸/探针杂合体。杂合体的形成可以进行检测(例如：标记核酸或探针)，其中杂合体的形成表明存在EE-GH6。基于与特异探针进行杂交(在固相载体上或在溶液中)的此类鉴定方法在本领域已有描述。优选地，特异探针是在优化条件下能与位于优良事件的5’或3’侧翼区内的区域和(优选地)也包含与之相邻的部分外源DNA的区域(下文中称之为―特异区域‖)特异杂交的序列。优选地，特异探针包含50-500bp、优选100-350bp的序列，其与特定区域的核苷酸序列有至少80％，优选为80-85％，更优选为85-90％，特别优选为90-95％，最优选为95-100％同一性(或互补性)。优选地，特异探针将包含与优良事件的特异区域相同(或互补)的大约15-100个连续核苷酸的序列。
适合于作为检测优良事件EE-GH6的PCR引物的寡核苷酸也可以用来开发基于PCR的方案来确定优良事件的接合性状态。为此，两个识别野生型(wt)基因座的引物是这样设计的：它们互相指向并在其间有插入位点。这些引物可以是分别特异识别包含在SEQ IDNo1(SEQ ID No11)或SEQ ID No2内的5’和3’侧翼序列的引物。这些引物也可以是特异识别5’或3’侧翼序列的引物(例如具有SEQ ID No7或SEQ ID No6的核苷酸序列的引物)。这组引物，连同互补于转化DNA序列的第三条引物(例如具有SEQ ID No5的核苷酸序列的引物)一起允许诊断性PCR方法同时扩增EE-GH6特异的基因座和wt基因座。如果植物的转基因基因座或相应的wt基因座是纯合的，则诊断PCR将产生针对转基因基因座或wt基因座典型的、优选典型长度的单一PCR产物。如果植物对于转基因基因座是半合子的，则将出现两个基因座特异的PCR产物，这反映了转基因基因座和wt基因座均得到了扩增。
此外，利用本文提供的优良事件特异的序列信息，也可以开发不同于基于PCR的扩增方法的特异于优良事件EE-GH6的检测方法。这些备选的检测方法包括基于特殊核酸结构的侵袭性切割的线性信号扩增检测法，也叫做InvaderTM技术(例如记载于美国专利5,985,557―Invasive Cleavage of Nucleic Acids‖,和6,001,567―Detection of NucleicAcid sequences by Invader Directed Cleavage‖,此处将二者并入作为参考)。为此，靶序列可以与包含SEQ ID No1的141-148位核苷酸的核苷酸序列或其互补序列的标记的第一寡核苷酸或者包含SEQ ID No2的95-112位核苷酸的核苷酸序列或其互补序列的所述标记核酸探针进行杂交，或可以与包含SEQ ID No1的123-140位核苷酸的核苷酸序列或其互补序列的第二寡核苷酸或者包含SEQ ID No2的113-130位核苷酸的核苷酸序列或其互补序列的所述的标记核酸探针进行进一步杂交，其中，第一和第二寡核苷酸至少重叠一个核苷酸。通过杂交获得的双链体或三链体结构可以用酶进行选择性探针切割，以留下完整的靶序列。切割的标记探针随后被检测，并可能通过中间步骤产生进一步的信号增强。
本文使用的―试剂盒‖指的是用于完成本发明的方法的一组试剂，更特别地，是用于进行生物样品中的优良事件EE-GH6的鉴定或者对包含EE-GH6的植物材料的接合性状态进行确定的一组试剂。更特别地，本发明的试剂盒的一个优选实施方案包括上述的用于鉴定优良事件的至少一个或两个特异引物，或者用于确定接合性状态的三个特异引物。备选地，该试剂盒进一步包括在PCR鉴定方案中提到的任何其他试剂。备选地，根据本发明的另一个实施方案，该试剂盒可以包括上面提到的特异探针，它可以特异地与生物样品的核酸杂交以鉴定EE-GH6的存在。备选地，该试剂盒进一步可以包括用特异探针对生物样品中的EE-GH6进行鉴定所用到的任何其他试剂(例如但不仅限于：杂交缓冲液，标记物)。
为了进行质量控制(例如种子批次的纯度)、检测植物材料或包含或源自植物材料的材料(例如但不仅限于：食物产品或饲料产品)中是否存在优良事件，可使用本发明的试剂盒，并可对其成分进行特别地调节。
本文使用的有关核苷酸序列(DNA或RNA)的―序列同一性‖指是用具有相同核苷酸的位置数除以两个序列中较短的那个序列的核苷酸数目。两个核苷酸序列的比对根据Wilbur-Lipmann算法(Wilbur and Lipmann,1983,Proc.Nat.Acad.Sci.USA80:726)进行，该算法使用20个核苷酸的窗口大小，4个核苷酸的字长，空位罚分为4。对序列数据(包括上述的序列比对)进行计算机辅助分析和解释可以采用，例如Genetics Computer Group的序列分析软件包(GCG,University of Wisconsin Biotechnology center)方便地进行。分析的序列被认为―基本上相似‖是基于：这些序列具有至少大约75％的序列同一性，特别是至少大约80％，更特别是至少大约85％，非常特别是大约90％，特别是大约95％，更特别是大约100％同一性。当将RNA序列表述为与DNA序列基本上相似或具有一定的序列同一性时，DNA序列的胸腺嘧啶(T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)，这一点是清楚的。
本文使用的术语―引物‖包含在模板依赖的方法(如PCR)中能够引发新生核酸合成的任何核酸。典型地，引物是含有10-30个核苷酸的寡核苷酸，但也可以用更长的序列。尽管优选使用单链形式的引物，但引物也可以是双链的形式。探针可以用作引物，但其是被设计用来结合靶DNA或RNA，并且不必用在扩增过程中。
当提及特异引物时本文使用的术语―识别‖，是指这样一个事实：特异引物在该方法中给出的条件下(例如PCR鉴定方案的条件)与优良事件中的核酸序列特异地杂交，其中，特异性是由阳性和阴性对照的存在来确定的。
当提及特异探针时，本文使用的术语―杂交‖是指这样一个事实：在标准的严紧性条件下，探针结合到优良事件的核酸序列中的特异区域。本文所述的标准的严紧性条件是指本文所述的杂交条件，或常规的杂交条件(见Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbour Laboratory Press,NY)。例如，所述杂交可以包括以下步骤：1)固定植物基因组DNA片段于滤纸上，2)在42℃下于50％甲酰胺，5X SSPE,2X Denhardt’s试剂和0.1％SDS中预杂交滤纸1-2小时，或在68℃下于6XSSC,2X Denhardt’s试剂和0.1％SDS中预杂交滤纸1-2小时，3)加入已标记的杂交探针，4)孵育16-24小时，5)在室温下于1X SSC,0.1％SDS中洗涤滤纸20分钟，6)在68℃下于0.2XSSC,0.1％SDS中洗涤滤纸三次，每次20分钟，7)使用一个增感屏在－70℃下将滤纸暴露于X-射线胶片24-48小时。
本文使用的―生物样品‖是植物，植物材料或包含植物材料的产品的样品。术语―植物‖包含在任意成熟阶段的棉花(Gossypium hirsitum)植物组织，也包含采自或源于此类植物的任何细胞，组织或器官，包括但不限于：种子，叶，茎，花，根，单细胞，配子，细胞培养物，组织培养物或原生质体。本文使用的―植物材料‖是指从植物得到的材料。包含植物材料的产品涉及食物，饲料，或用植物材料制造的或者可以被植物材料污染的其他产品。可以理解的是，在本发明上下文中，测试这些生物样品中特异于EE-GH6的核酸的存在，表明样品中存在核酸。因此，这里涉及到的鉴定生物样品中的优良事件EE-GH6的方法，涉及鉴定生物样品中包含所述优良事件的核酸。
本文使用的―包含‖可以解释为：明确所表述的特征，整数，步骤，试剂或成分的存在，但不排除一个或多个特征，整数，步骤，成分或其组的存在或加入。因而，举例说，包含某核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白质可以包含比实际引用的更多的核苷酸或氨基酸，即包含于更大的核酸或蛋白质。包含功能上或结构上确定的DNA序列的嵌合基因可以包含额外的DNA序列等。
本发明还涉及将棉花中的优良事件EE-GH6发育成包含该事件的植物，从这些植物得到的子代，植物细胞，或源自该事件的植物材料。包含优良事件EE-GH6的植物可以按照实施例1所述得到。
包含EE-GH6的棉花植物或植物材料可以按照实施例2中关于EE-GH6所述的PCR鉴定方案来确定。简言之，存在于生物样品中的棉花基因组DNA通过PCR扩增，使用的引物分别是：特异识别EE-GH6的5’或3’侧翼序列中序列的引物(例如具有序列SEQ ID No:3的引物)，以及识别外源DNA中序列的引物(例如具有序列SEQ ID No:4的引物)。扩增部分内源棉花序列的DNA引物可以用作PCR扩增的阳性对照。如果进行PCR扩增时，材料产生了预期大小的片段，则该材料包含来自含有优良事件EE-GH6的棉花植物的植物材料。
含有EE-GH6的植物的特征在于其昆虫抗性，及其草铵膦耐受性。含有EE-GH6的植物的特征还在于其农学性状(与美国商业上可获得的品种在无昆虫压力下的农学性状相当)。已经观察到，本文所述的在棉花植物基因组的插入区域中外源DNA的存在可以赋予包含该事件的植物尤其感兴趣的表型和分子特征。
下面的实施例描述了优良事件EE-GH6的鉴定以及在生物样品中对优良事件EE-GH6进行特异鉴定的工具的开发。
除非在实施例中另有说明，所有重组技术都是依照记载于―Sambrook J andRussell DW(编)(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York‖和―Ausubel FA,Brent R,Kingston RE,Moore DD,Seidman JG,Smith JA和Struhl K(eds.)(2006)Current Protocols in MolecularBiology.John Wiley&Sons,New York‖的标准程序完成的。
标准材料和参考文献记载于―Croy RDD(编)(1993)Plant Molecular BiologyLabFax,BIOS Scientific Publishers Ltd.,Oxford和Blackwell ScientificPublications,Oxford‖和―Brown TA,(1998)Molecular Biology LabFax,第2版,Academic Press,San Diego‖。聚合酶链式反应(PCR)的标准材料和方法见―McPherson MJ和SG(2000)PCR(The Basics),BIOS Scientific Publishers Ltd.,Oxford‖和―PCR Applications Manual,第3版(2006),Roche Diagnostics GmbH,Mannheim或www.roche-applied-science.com‖。
在详述和实施例中，参考下列序列：
SEQ ID No.1: 包含EE-GH6的5’侧翼区的核苷酸序列
SEQ ID No.2: 包含EE-GH6的3’侧翼区的核苷酸序列
SEQ ID No.3: 引物GHI058
SEQ ID No.4: 引物GHI059
SEQ ID No.5: 引物DPA286
SEQ ID No.6: 引物NEL115
SEQ ID No.7: 引物NEL117
SEQ ID No.8: 用于扩增对照片段的引物1
SEQ ID No.9: 用于扩增对照片段的引物2
SEQ ID No.10: EE-GH6插入之前植物基因组靶序列的核苷酸序列
SEQ ID No.11: 包含EE-GH6的5’侧翼区的核苷酸序列(长)
实施例
1.优良事件EE-GH6的鉴定
用包含处于花椰菜花叶病毒35S启动子控制下，与Rubisco小亚基转运肽有效连接的经修饰cry2Ae基因的编码序列的载体转化棉花得到的抗虫棉花。
优良事件EE-GH6是通过基于抗虫基因的良好表达和稳定性的广泛的选择程序而筛选出来的，它与最佳的农学性状(例如植物高度、节高、棉铃保持力、直立能力、活力、纤维长度、纤维强度和棉绒产量)之间的相容性也经过了评价。
将筛选的事件引入到了不同的商业遗传背景，并对不同地区的田间试验的结果进行了比较。通过不同的处理方式，用害虫攻击植物。植物表现出良好的昆虫控制力。
另外，所述事件具有正常的叶，花和棉铃形态，优秀的繁殖力，而且在多种遗传背景中没有表现出疾病或异常的昆虫易感性。在渐渗入到多种遗传背景的过程中，没有发现异常问题或异常状况。
2.优良事件EE-GH6的侧翼区域的鉴定
利用Liu等介绍的热不对称交错(TAIL-)PCR方法(1995,Plant J.8(3):457-463)对位于优良事件EE-GH6中的外源DNA两侧的区域序列进行了测定。该方法在连续的反应中使用三种嵌套引物和一种较短的任意简并引物，从而特异和非特异产物的相对扩增效率可以进行热控制。特异引物被选择出来用于在外源DNA的边界发生退火反应并基于其退火条件。少量(5μl)未纯化的二级和三级PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行分析。对三级PCR产物进行纯化并测序。
2.1右(5’)侧翼区域
鉴定为包含5’侧翼区的片段进行了测序(SEQ ID No.1)。核苷酸1-140的序列对应于植物DNA，而核苷酸141-192的序列对应于外源DNA。对一个包含5’侧翼区的更长的片段也进行了测序(SEQ ID No.11)。核苷酸1-463之间的序列对应于植物DNA，而464-555之间的序列对应于外源DNA。
2.2左(3’)侧翼区
对通过TAIL-PCR方法得到的鉴定为包含3’侧翼区的片段进行了测序(SEQ IDNo.2)。核苷酸1-112之间的序列对应于外源DNA，而核苷酸113-438之间的序列对应于植物DNA。
2.3鉴定预插入植物DNA
使用寡核苷酸NEL115(SEQ ID No6)和NEL117(SEQ ID No7)，利用PCR扩增来扩增预插入植物DNA。鉴定扩增的片段的核苷酸序列(SEQ ID No.10)。当与优良事件EE-GH6的5’和3’侧翼区中的植物来源的核苷酸序列进行比较时，可以鉴定141-148位核苷酸之间的区域为被重排(靶位点缺失)。
3.EE-GH6的聚合酶链式反应鉴定方案的开发
3.1.引物
开发特异引物，其识别优良事件内的序列。
开发了识别EE-GH6的3’侧翼区内的序列的引物。之后在外源DNA的序列内选择第二条引物，以便该引物跨越大约189个核苷酸的序列。下列引物被证实在EE-GH6DNA的PCR反应中产生特别清晰和可再现的结果：
GHI058:5’-gAA.ATT.gCg.TgA.CTC.AAA.TTC.C-3’(SEQ ID No.:3)
(靶序列:植物DNA)
GHI059:5’-ggT.TTC.gCT.CAT.gTg.TTg.AgC-3’(SEQ ID No.:4)
(靶序列:插入DNA)
靶向内源序列的引物优选被包括在PCR混合物中。这些引物作为未知样品和DNA阳性对照中的内部对照。用内源引物对得到阳性结果(存在445bp的PCR扩增片段)，表明在用于生成PCR产物的基因组DNA制备物中含有足够的具有适当质量的DNA。选择内源引物以识别棉花中的持家基因：
GHI001:5’-AAC.CTA.ggC.TgC.TgA.Agg.AgC-3’(SEQ ID No.:8)
GHI002:5'-CAA.CTC.CTC.CAg.TCA.TCT.CCg-3'(SEQ ID No.:9)
3.2扩增的片段
PCR反应中预期的扩增片段为：
对于引物对GHI001-GHI002:445bp(内源对照)
对于引物对GHI058-GHI059:189bp(EE-GH6优良事件)
3.3模板DNA
根据Edwards等(Nucleic Acid Research,19,1349页,1991)，由叶打孔法制备模板DNA。当使用由其他方法制备的DNA时，应当进行使用不同量的模板的测试。通常50ng的基因组模板DNA可以得到最好的结果。
3.4指定的阳性和阴性对照
为了避免假阳性或阴性，应当将下列阳性和阴性对照包括在PCR程序中：
－主混合物对照(DNA阴性对照)。进行PCR反应时，其中不加入任何DNA。当观察到预期的结果——无PCR产物时，这表明PCR反应混合物没有被靶DNA污染。
－DNA阳性对照(已知包含转基因序列的基因组DNA样品)。该阳性对照的成功扩增表明PCR反应是在允许靶序列扩增的条件下进行的。
－野生型DNA对照。进行PCR反应时，提供的模板DNA是由非转基因植物制备的基因组DNA。当观察到预期的结果——无转基因PCR产物的扩增但有内源PCR产物的扩增时，这表明在基因组DNA样品中，没有可检测到的转基因背景扩增。
3.5PCR条件
在下列条件下得到最佳的结果：
－用于25μl反应物的PCR混合物含有：
2.5μl模板DNA
2.5μl10x扩增缓冲液(由Taq聚合酶的生产商提供)
0.5μl10mM dNTP
0.4μl GHI001(10pmoles/μl)
0.4μl GHI002(10pmoles/μl)
0.7μl GHI058(10pmoles/μl)
0.7μl GHI059(10pmoles/μl)
0.1μl Taq DNA聚合酶(5单位/μl)
加水至25μl
－用得到最佳结果而遵循的热循环程序是：
3.6琼脂糖凝胶分析
为了能最好地观察PCR结果，应当将10-20μl的PCR样品上样于1.5％琼脂糖凝胶(Tris-硼酸盐缓冲液)，并使用适当的分子量标记(例如：100bp序列梯PHARMACIA)。
3.7结果的验证
经过单一的PCR程序和单一的PCR混合物从转基因植物DNA样品得到的数据不应该被接受，除非：1)DNA阳性对照表现出预期的PCR产物(转基因和内源片段)；2)DNA阴性对照的PCR扩增是阴性的(无片段)；3)野生型DNA对照表现出预期的结果(内源片段扩增)。
当按照上述EE-GH6的PCR鉴定方案时，泳道显示可见量的预期大小的转基因和内源PCR产物，表明用于制备基因组模板DNA的对应植物遗传了EE-GH6优良事件。泳道没有显示可见量的转基因PCR产物而显示可见量的内源PCR产物，表明用于制备基因组模板DNA的对应植物不包含优良事件。泳道显示均不存在可见量的内源和转基因PCR产物的，表明基因组DNA的质量和/或数量不允许产生PCR产物。这些植物不能被评分。基因组DNA的制备应当重复，并利用适当对照进行新的PCR程序。
3.8使用鉴别PCR方案鉴定EE-GH6
在试图筛选未知物前，必须进行利用所有适当对照的测试程序。开发方案可能需要为实验室间不同的组分(模板DNA制备物，Taq DNA聚合酶，引物质量，dNTP，热循环仪等)进行优化。
内源序列的扩增在方案中起着关键作用。实验人员必须确定PCR和热循环的条件。运用这些条件，可以对已知转基因基因组DNA模板的内源和转基因序列进行等摩尔量的扩增。只要靶内源片段未被扩增，或靶序列未能扩增到相同的溴化乙锭染色强度(如根据琼脂糖凝胶电泳进行判断)，则PCR条件就需要优化。
根据上述方案，测试了来源于许多棉花植物的叶材料，其中一些含有EE-GH6。来源于优良事件EE-GH6和棉花野生型的样品分别用作阳性和阴性对照。
图2显示的是对许多棉花植物样品按照EE-GH6的优良事件PCR鉴定方案1得到的结果。发现泳道2-5的样品含有检测为189bp的条带的优良事件；而泳道6和7的样品不包含EE-GH6。泳道6和7包含其他棉花优良事件(包括包含不同抗虫嵌合基因的植物)；泳道8代表阴性对照样品(水)，泳道1和9代表分子量标记(100bp序列梯)。
4.使用特异整合片段作为检测含有EE-GH6的材料的探针
利用特异引物GHI058(SEQ ID No.3)和GHI059(SEQ ID No.4)通过PCR扩增，或通过化学合成，得到EE-GH6的特异整合片段，并对其进行标记。该整合片段用作检测生物样品中EE-GH6的特异探针。按照标准程序从样品中提取核酸。然后在经优化以允许形成杂交体的杂交条件下，将核酸与特异探针接触。然后检测杂交体的形成，以表明在样品中存在EE-GH6核酸。任选地，在与特异探针接触之前，先利用特异引物扩增样品中的核酸。备选地，在与特异探针(而非整合片段)接触之前，标记核酸。任选地，在接触样品之前，将特异探针附着于固体载体(例如但不仅限于：滤纸，测试条或珠子)。
5.基于PCR的用于确定EE-GH6棉花植物材料的接合性状态的方案
5.1引物
在插入优良事件前识别野生型基因座的核苷酸序列的两条引物是这样设计的：它们互相方向相对并在其间有插入位点。这组引物与互补于外源DNA序列并针对侧翼DNA的第三条引物一起，进行EE-GH6基因座和wt基因座的PCR扩增。
发现下列引物在对EE-GH6DNA进行接合性评分PCR反应中得到特别清晰和可再现的结果：
NEL1155’-ACT.gAT.ggC.TCA.ACg.gTT.AC-3’(SEQ ID No.:6)
(靶序列:5’侧翼序列上游的植物DNA)
DPA2865’-gAT.CgC.CAT.ggA.gCC.ATT-3’(SEQ ID No.:5)
(靶序列:插入DNA)
NEL1175’-AAA.TCA.CAg.gCA.gAg.ggA.Ag-3’(SEQ ID No.:7)
(靶序列:3’侧翼序列的植物DNA)
5.2扩增片段
PCR反应中预期的扩增片段是：
对于引物对GHI065–GHI066:451bp(野生基因座)
对于引物对GHI057–GHI065:197bp(EE-GH6基因座)
5.3模板DNA
根据Edwards等人(Nucleic Acid Research,19,1349页,1991)，模板DNA由叶打孔法制备。当使用由其他方法制备的DNA时，应当使用不同量的模板进行测试程序。通常50ng的基因组模板DNA可以产生最好的结果。
5.4指定的阳性和阴性对照
为了避免假阳性或阴性结果，应当将下列阳性和阴性对照包括在PCR程序中：
－主混合物对照(DNA阴性对照)。进行PCR反应时，其中不加入任何DNA。当观察到预期的结果——无PCR产物时，这表明PCR混合物没有被靶DNA污染。
－DNA阳性对照(已知包含转基因序列的基因组DNA样品)。该阳性对照的成功扩增表明PCR是在允许靶序列扩增的条件下进行的。
－野生型DNA对照。进行PCR反应时，提供的模板DNA是由非转基因植物制备的基因组DNA。当观察到预期的结果——无转基因PCR产物的扩增但有内源PCR产物的扩增时，这表明在基因组DNA样品中没有可检测到的转基因背景扩增。
.5PCR条件
最佳的结果是在下列条件下得到的：
－用于25μl反应物的PCR混合物含有：
xμl模板DNA(150ng)
2.5μl10x扩增缓冲液(由生产商随Taq聚合酶一起提供)
0.5μl10mM dNTP
0.5μl NEL115(10pmoles/μl)
0.5μl NEL117(10pmoles/μl)
0.2μl DPA286(10pmoles/μl)
0.1μl Taq DNA聚合酶(5单位/μl)
加水至25μl
－为达到最佳结果遵循的热循环程序是：
5.6琼脂糖凝胶分析
为了能最好地观察PCR结果，应当将10-20μl的PCR样品上样于1.5％琼脂糖凝胶(Tris-硼酸盐缓冲液)，并使用适当的分子量标记(例如：100bp序列梯PHARMACIA)。
5.7结果的验证
经单一的PCR程序和单一的PCR主混合物从转基因植物DNA样品中得到的数据不应该被接受，除非：
－阳性对照表现出预期的PCR产物(转基因靶序列扩增)
－野生型阳性DNA对照表现出预期的结果(野生型靶序列扩增)
－阴性对照的PCR扩增是阴性的(无片段)。
存在可见量的预期大小的转基因PCR产物而不存在可见量的野生型PCR产物的泳道表明对应的用于制备基因组DNA模板的植物对于转基因基因盒是纯合的。
存在可见量的预期大小的转基因和野生型PCR产物的泳道表明对应的用于制备基因组模板DNA的植物对于转基因基因盒是半合子的。存在可见量的野生型PCR产物而不存在可见量的转基因PCR产物的泳道表明对应的用于制备基因组模板DNA的植物没有遗传待检测的转基因序列，并且对于野生型基因座是纯合的。
均不存在可见量的转基因和野生型PCR产物的泳道表明基因组DNA的质量和/或数量不允许生成PCR产物。这些植物不能被评分。基因组DNA的制备应当重复，必须利用适当对照进行新的PCR程序。
5.8使用接合性评分方案对包含EE-GH6的植物中的接合性状态进行鉴定
图3显示的是对许多棉花植物样品进行EE-GH6的接合性评分PCR所得到的结果。发现泳道2和3的样品包含优良事件EE-GH6特征性的PCR片段(197bp)，而泳道4-7的样品包含wt基因座存在的特征性片段。泳道4-6包含两个片段。泳道2和3因此包含纯合形式的EE-GH6，泳道4-6包含半合子形式的EE-GH6，泳道7包含纯合形式的wt基因座(即对于EE-GH6不成对)。泳道8代表阴性对照样品(水)，泳道1和9代表分子量标记(100bp序列梯)。
6.EE-GH6向优选栽培种中的渐渗
通过反复回交，优良事件EE-GH6被引入到商业的棉花栽培种，例如但不仅限于：FM5013,FM5015,FM5017,FM989,FM832,FM966和FM958,FM989,FM958,FM832,FM991,FM819,FM800,FM960,FM966,FM981,FM5035,FM5044,FM5045,FM5013,FM5015,FM5017或FM5024。
观察的结果是，优良事件基因渐渗到这些栽培种没有明显影响它们的任何期望的表型或农学特征(没有连锁拖曳)，而转基因的表达(通过草铵膦耐受确定)达到了商业上可接受的水平。这证实了事件EE-GH6作为优良事件的状态。
优良品系可以有利地与市场上可得到的其他优良事件联合，特别是为了抗虫管理目的的其他优良事件抗虫基因，例如但不仅限于：事件3006-210-23(USDA aphispetition03-036-02p)；事件281-24-236(USDA aphis petition03-036-01p)；事件MON158985(USDA aphis petition00-342-01p)；事件MON531(USDA aphis petition94-308-01p)，事件COT102(＝Syngenta vip3A),USDA aphis petition03-155-01p，事件EE-GH5描述于欧洲专利申请07075299.3。优良事件EE-GH6也可以联合耐受除草剂的优良事件，例如，事件MON1445(USDA aphis petition95-045-01p)，或事件MON88913(USDA aphispetition04-086-01p)。
除非另外进行了明确的说明，用在下文权利要求中的术语―植物‖意在包含处于任意成熟阶段的植物组织，以及取自或源自任何这类植物的任何细胞、组织或器官，包括但不限于：任何种子、叶、茎、花、根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。
包含优良事件EE-GH6的参考种子于2007年4月19日以名称EE-GH6保藏在ATCC(10801University Blvd.,Manassas,VA20110-2209)，ATCC保藏号：PTA-8398。EE-GH6的备用名称是GBH119。
除非另外进行了明确的说明，用在下文权利要求中的术语―植物‖意在包含处于任意成熟阶段的植物组织，以及取自或源自任何这类植物的任何细胞、组织或器官，包括但不限于：任何种子、叶、茎、花、根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。
本发明的上述说明旨在进行说明而非限制。
所描述的实施方案的各种改变或修改是本领域技术人员可以想到的。在不偏离本发明主旨或范围的前提下，可以做出这些改变或修改。

Claims (11)

1.鉴定生物样品中下述外源DNA的存在的方法，所述外源DNA包含处于花椰菜花叶病毒35S启动子控制下，与Rubisco小亚基转运肽有效连接的经修饰cry2Ae基因的编码序列，所述外源DNA侧接5’侧翼区，所述5’侧翼区位于该外源DNA的紧上游区并与之相邻，所述5’侧翼区具有SEQ ID No 1的1-140位核苷酸的核苷酸序列，或SEQ ID No 11的1-463位核苷酸的核苷酸序列；所述外源DNA侧接3’侧翼区，所述3’侧翼区位于该外源DNA的紧下游区并与之相邻，所述3’侧翼区具有SEQ ID No 2的113-438的核苷酸序列的互补序列，其中侧接所述5’和3’侧翼区的所述外源DNA存在于以保藏号PTA-8398保藏在ATCC的参考种子中(“EE-GH6”)，该方法包括用特异识别EE-GH6的5’或3’侧翼区的特异引物或探针检测EE-GH6特异性区域，所述方法包括：
a)利用聚合酶链式反应用至少两种引物从存在于所述生物样品中的核酸扩增100到500bp的DNA片段，所述引物具有17-50长的核苷酸，其中
(i)所述引物之一由SEQ ID No 1的1-140位核苷酸的17-50个核苷酸的核苷酸序列的部分序列组成，或由SEQ ID No 11的1-463位核苷酸的17-50个核苷酸的核苷酸序列的部分序列组成；所述引物中的另外一条引物由SEQ ID No 1的141-192位核苷酸的互补核苷酸序列的17-50个核苷酸的部分序列组成，或
(ii)所述引物之一由SEQ ID No 2的113-438位核苷酸的17-50个核苷酸的互补核苷酸序列的部分序列组成；所述引物中的另外一条引物由SEQ ID No 2的1-112位核苷酸的17-50个核苷酸的核苷酸序列的部分序列组成；或
b)将生物样品的核酸与EE-GH6的特异探针杂交，其中所述特异探针由具有SEQ ID No1的120-160位核苷酸序列的SEQ ID No 1部分序列组成，或具有SEQ ID No 2的102-123位核苷酸的SEQ ID No 2部分序列组成。
2.用于鉴定生物样品中优良事件EE-GH6的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)由SEQ ID No 1的1-140位核苷酸的17-50个核苷酸的核苷酸序列的部分序列组成的一条引物，或由SEQ ID No 11的1-463位核苷酸的17-50个核苷酸的核苷酸序列的部分序列组成的一条引物；以及由SEQ ID No 1的141-192位核苷酸的互补核苷酸序列的17-50个核苷酸的部分序列组成的另外一条引物，或
(b)由SEQ ID No 2的113-438位核苷酸的17-50个核苷酸的互补核苷酸序列的部分序列组成一条引物；以及由SEQ ID No 2的1-112位核苷酸的17-50个核苷酸的核苷酸序列的部分序列组成的另外一条引物，
其中所述引物可以扩增100-500bp之间的DNA片段。
3.适合用于EE-GH6特异检测的引物对，所述引物对选自：
(a)由SEQ ID No 1的1-140位核苷酸的17-50个核苷酸的核苷酸序列的部分序列组成的一条引物，或由SEQ ID No 11的1-463位核苷酸的17-50个核苷酸的核苷酸序列的部分序列组成的一条引物；以及由SEQ ID No 1的141-192位核苷酸的互补核苷酸序列的17-50个核苷酸的部分序列组成的另外一条引物，和
(b)由SEQ ID No 2的113-438位核苷酸的17-50个核苷酸的互补核苷酸序列的部分序列组成一条引物；以及由SEQ ID No 2的1-112位核苷酸的17-50个核苷酸的核苷酸序列的部分序列组成的另外一条引物，
其中所述引物可以扩增100-500bp之间的DNA片段。
4.用于鉴定生物样品中优良事件EE-GH6的试剂盒，所述试剂盒包含由具有SEQ ID No1的120-160位核苷酸之间的序列的SEQ ID No 1部分序列组成的特异探针，或由具有SEQID No 2的102-123位核苷酸的SEQ ID No 2部分序列组成的特异探针。
5.用于鉴定生物样品中优良事件EE-GH6的特异探针，其中所述探针由具有SEQ ID No1的120-160位核苷酸之间的序列的SEQ ID No 1部分序列组成，或由具有SEQ ID No 2的102-123位核苷酸的SEQ ID No 2部分序列组成。
6.用于鉴定生物样品中优良事件EE-GH6的特异探针，所述探针的序列由SEQ ID No 1的120-161位核苷酸序列，SEQ ID No 2的92-123位核苷酸序列或其互补序列组成。
7.检测种子批次中EE-GH6存在与否的方法，其中该方法包括用特异识别EE-GH6的5’或3’侧翼区的特异引物或探针检测种子样品中EE-GH6特异性区域，所述方法包括：
a)利用聚合酶链式反应用至少两种引物从存在于所述种子样品中的核酸扩增100到500bp的DNA片段，其中
(i)所述引物之一由SEQ ID No 1的1-140位核苷酸的17-50个核苷酸的核苷酸序列的部分序列组成，或由SEQ ID No 11的1-463位核苷酸的17-50个核苷酸的核苷酸序列的部分序列组成；所述引物中的另外一条引物由SEQ ID No 1的141-192位核苷酸的互补核苷酸序列的17-50个核苷酸的部分序列组成，或
(ii)所述引物之一由SEQ ID No 2的113-438位核苷酸的17-50个核苷酸的互补核苷酸序列的部分序列组成；所述引物中的另外一条引物由SEQ ID No 2的1-112位核苷酸的17-50个核苷酸的核苷酸序列的部分序列组成；或
b)将所述种子样品的核酸与EE-GH6的特异探针杂交，其中所述特异探针由具有SEQ IDNo 1的120-160位核苷酸的序列的SEQ ID No 1部分序列组成，或具有SEQ ID No 2的102-123位核苷酸的SEQ ID No 2部分序列组成。
8.筛选种子中EE-GH6的存在的方法，其中该方法包括用特异识别EE-GH6的5’或3’侧翼区的特异引物或探针检测种子批次的样品中EE-GH6特异性区域，所述方法包括：
a)利用聚合酶链式反应用至少两种引物从存在于所述种子中的核酸扩增100到500bp的DNA片段，其中
(i)所述引物之一由SEQ ID No 1的1-140位核苷酸的17-50个核苷酸的核苷酸序列的部分序列组成，或由SEQ ID No 11的1-463位核苷酸的17-50个核苷酸的核苷酸序列的部分序列组成；所述引物中的另外一条引物由SEQ ID No 1的141-192位核苷酸的互补核苷酸序列的17-50个核苷酸的部分序列组成，或
(ii)所述引物之一由SEQ ID No 2的113-438位核苷酸的17-50个核苷酸的互补核苷酸序列的部分序列组成；所述引物中的另外一条引物由SEQ ID No 2的1-112位核苷酸的17-50个核苷酸的核苷酸序列的部分序列组成；或
b)将所述种子样品的核酸与EE-GH6的特异探针杂交，其中所述特异探针由具有SEQ IDNo 1的120-160位核苷酸的序列的SEQ ID No 1部分序列组成，或具有SEQ ID No 2的102-123位核苷酸的SEQ ID No 2部分序列组成。
9.确定包含优良事件EE-GH6的植物、植物材料或种子的接合性状态的方法，其中该方法包括利用聚合酶链式反应用至少三种长度为17-50个核苷酸的引物从存在于所述生物样品中的核酸扩增100到500bp的DNA片段，其中
(a)所述引物中的一条由SEQ ID No 1的1-140位核苷酸的17-50个核苷酸的核苷酸序列的部分序列组成，或由SEQ ID No 11的1-463位核苷酸的17-50个核苷酸的核苷酸序列的部分序列组成，所述引物中的另一条由SEQ ID No 2的113-438位核苷酸的互补核苷酸序列的17-50个核苷酸的部分序列组成；所述引物中的第三条引物由SEQ ID No 1的141-192位核苷酸的互补核苷酸序列的17-50个核苷酸的部分序列组成，或
(b)所述引物中的一条由SEQ ID No 2的113-438位核苷酸的17-50个核苷酸的互补核苷酸序列的部分序列组成，所述引物中的另一条由SEQ ID No 1的1-140位核苷酸的核苷酸序列的17-50个核苷酸的部分序列组成，或由SEQ ID No 11的1-463位的核苷酸序列的17-50个核苷酸的部分序列组成；所述引物中的第三条引物由SEQ ID No 2的1-112位核苷酸的17-50个核苷酸的核苷酸序列的部分序列组成。
10.通过与基本上互补的经标记核酸探针杂交来检测生物样品中优良事件EE-GH6的存在的方法，其中探针与靶核酸的比值通过靶核酸序列的回收而增大，所述方法包括：
a)将所述的靶核酸序列与长度为17-50个核苷酸，且包含SEQ ID No 1的141-158位核苷酸的核苷酸序列或其互补序列的第一核酸寡核苷酸杂交，或与包含SEQ ID No 2的95-112位核苷酸的核苷酸序列或其互补序列的所述的第一核酸寡核苷酸杂交；
b)将所述的靶核酸序列与长度为17-50个核苷酸，且包含SEQ ID No 1的123-140位核苷酸的核苷酸序列或其互补序列的第二核酸寡核苷酸杂交，或与包含SEQ ID No 2的113-130位核苷酸的核苷酸序列或其互补序列的所述经标记的核酸探针杂交；其中所述的第一和第二寡核苷酸至少重叠一个核苷酸，并且其中所述第一或第二寡核苷酸被标记为所述经标记的核酸探针；
c)用酶仅仅切割探针:靶核酸序列双链体内经标记的探针，所述酶引起选择性探针切割，导致双链体解离，留下完整的靶序列；
d)通过重复步骤(a)到(c)回收靶核酸序列；和
e)检测被切割的经标记探针，从而确定所述靶核酸序列的存在。
11.包含优良事件EE-GH6的棉花基因组DNA，其包含SEQ ID No 1和SEQ ID No 2的核苷酸序列，其中SEQ ID No 1在SEQ ID No 2的上游。
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